CN104263738A

CN104263738A - Fas ii抑制剂abx的生物合成基因簇

Info

Publication number: CN104263738A
Application number: CN201410468972.3A
Authority: CN
Inventors: 瞿旭东; 于明加; 邓子新
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2014-09-15
Filing date: 2014-09-15
Publication date: 2015-01-07

Abstract

本发明公开了一种作用于细菌FASII蛋白的活性天然产物ABX的生物合成基因簇，该基因簇包括了13个与ABX合成相关的特征基因。ABX具有很好的抗菌、降脂、降压活性，本发明所揭示的ABX生物合成基因簇，可以用于改造ABX的生物合成途径，实现ABX的结构改造和产量的提升，具有重要的经济实用价值。

Description

FAS II抑制剂ABX的生物合成基因簇

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及FAS II抑制剂ABX的生物合成基因簇。

背景技术

ABX是由默克公司从土壤细菌中发现的一小类II型芳香聚酮化合物(式1)，其包括(-)-ABX和(-)-BABX(产自Streptomyces sp.MA6657)。结构上，ABX具有两个罕见的芳环骨架，包括一个非连续共轭的苯环和一个手性氧杂桥环骨架，显著有别于典型的连续共轭芳环基础骨架(式2)；此外，该类化合物还具有一个独特的(氯化)偕二甲基蒽醌结构。在生物学活性上，ABX显示出优异的抗菌活性(Tetrahedron Lett.,1995,36,2013-2016)，其对包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、耐万古霉素屎肠球菌(Vancomycin-resistant Enterococcus,VRE)在内的革兰氏阳性菌具有很强的抗菌活性(J.Nat.Prod.,2005,68,1437-1440)，尤其是(-)-BABX对细菌脂肪酸合成酶II(FAS II)具有强烈的的抑制活性(J.Biol.Chem.,2005,280,1669-1677)；此外(-)-ABX具有优良的降胆固醇活性等(J.Nat.Prod.,2005,68,1437-1440)。最近研究表明氯化偕二甲基蒽醌结构(式1)是一类新型的高效抑制细菌FAS II蛋白的药效基团(J.Am.Chem.Soc.,2012,134,2981-2987)，此单元能特异性地结合FAS II蛋白的底物结合口袋，起到强烈地抑菌作用，其作用机制和著名的FAS II抑制剂平板霉素(platensimycin)非常相似(Nature,2006,441,358-361)。

其中虚框表示为细菌FAS II抑制剂的药效基团

目前研究发现临床上广泛使用的抗菌药物四环素(tetracycline)(Metab.Eng.,2009,11,69-75.)，抗肿瘤药物柔红霉素(daunorubicin)(Chem.Rev.,1997,97,2525-2536)和米拉霉素(mithramycin)(J.Bacteriol.,1999,181,642-647)也都为II型芳香聚酮类化合物，而这种II型聚酮的生物合成(Acc.Chem.Res.,2008,42,631-639)通常由酰基转移蛋白(AT)、酰基载体蛋白(ACP)和酮基合成酶(KS_αβ)组成的最小PKS单元以重复循环的方式合成出1,3二酮类型的聚酮中间体，而后在芳构化酶(ARO)和环化酶(CYC)催化下形成连续共轭的芳环基础骨架，最后经卤化、糖基化等后修饰过程形成各种结构类似物。芳环骨架形成的这种保守的酶学机制使得II型聚酮类化合物虽然数量巨大，但基础骨架类型却很少(J.Am.Chem.Soc.,2008,130,8307-8316)(式2，不包括通过后修饰氧化重排产生的骨架)。由于化合物的结构多样性对新药研发至关重要，因此寻找产生新结构的基因是II型芳香聚酮化合物组合生物合成研究的一个最重要的问题之一。ABX化合物具有两类全新的II型聚酮骨架，通过克隆其生物合成基因簇，利用其中编码新颖聚酮芳环基础骨架形成的相关功能基因，可以通过组合生物合成方式对其它的II型聚酮化合物生物合成途径进行修改，用于产生具有新颖骨架多样性的II型聚酮化合物。因此，本发明中阐明的ABX生物合成基因簇，对于ABX的结构改造，开发新型FASII抑制剂，以及用于其它II型芳香聚酮骨架的改造都具有重要的应用价值。

本发明根据基因序列的分析，推测ABX化合物的生物合成基因簇。通过Cosmid文库构建(David,R.et al.,(2006)EPICENTRE Forum 13(1),17)，克隆到了ABX化合物生物合成基因簇，并实现了在异源宿主菌S.albus中的异源表达。

发明内容

本发明涉及的可以产II型芳香聚酮化合物ABX的菌株Streptomyces sp.MA6657是由美国默克公司从土壤细菌中发现的。

本发明公开了链霉菌Streptomyces sp.MA6657(SEQ ID No 1)的生物合成基因簇，其基因簇主要包括13个和II型芳香聚酮化合物ABX合成的相关基因。具体为：

1)负责聚酮骨架形成的II型线性聚酮合成酶(PKS)基因，即abxA、abxB和abxC共3个基因：

abxA位于基因簇核苷酸序列第1-1227个碱基处，长度为1227个碱基对，序列如SEQ ID No 2所示，编码酮基合成酶，长度为408个氨基酸，序列如SEQID No 3所示；

abxB位于基因簇核苷酸序列第1230-2477个碱基处，长度为1248个碱基对，序列如SEQ ID No 4所示，编码酮基合成酶，长度为415个氨基酸，序列如SEQ ID No 5所示；

abxC位于基因簇核苷酸序列第2514-2753个碱基处，长度为240个碱基对，序列如SEQ ID No 6所示，编码酰基载体蛋白，长度为79个氨基酸，序列如SEQ ID No 7所示；

2)负责聚酮骨架成环的基因，即abxD、abxE和abxH共3个基因：

abxD位于基因簇核苷酸序列第2750-3241个碱基处，长度为492个碱基对，序列如SEQ ID No 8所示，编码聚酮环化酶，长度为163个氨基酸，序列如SEQID No 9所示；

abxE位于基因簇核苷酸序列第3238-3579个碱基处，长度为342个碱基对，序列如SEQ ID No 10所示，编码聚酮环化酶，长度为113个氨基酸，序列如SEQ ID No 11所示；

abxH位于基因簇核苷酸序列第6151-6921个碱基处，长度为771个碱基对，序列如SEQ ID No 16所示，编码酮基还原酶，长度为256个氨基酸，序列如SEQ ID No 17所示；

3)负责聚酮合成过程中缩酮氧桥基础骨架手性选择的基因，即abxJ基因：

abxJ位于基因簇核苷酸序列第8173-8901个碱基处，长度为729个碱基对，序列如SEQ ID No 20所示，编码醛酮变位酶，长度为242个氨基酸，序列如SEQ ID No 21所示；

4)负责后修饰的基因，即abxM、abxF和abxI共3个基因：

abxM位于基因簇核苷酸序列第11550-12299个碱基处，长度为750个碱基对，序列如SEQ ID No 26所示，编码甲基转移酶，长度为249个氨基酸，序列如SEQ ID No 27所示；

abxF位于基因簇核苷酸序列第3622-4899个碱基处，长度为1278个碱基对，序列如SEQ ID No 12所示，编码卤化酶，长度为425个氨基酸，序列如SEQ ID No 13所示；

abxI位于基因簇核苷酸序列第6996-8030个碱基处，长度为1035个碱基对，序列如SEQ ID No 18所示，编码甲基转移酶，长度为344个氨基酸，序列如SEQ ID No 19所示；

5)负责调节的基因，即abxG、abxK和abxL共3个基因：

abxG位于基因簇核苷酸序列第4908-6239个碱基处，长度为1332个碱基对，序列如SEQ ID No 14所示，编码调控因子，长度为443个氨基酸，序列如SEQ ID No 15所示；

abxK位于基因簇核苷酸序列第8972-10555个碱基处，长度为1584个碱基对，序列如SEQ ID No 22所示，编码调控因子，长度为527个氨基酸，序列如SEQ ID No 23所示；

abxL位于基因簇核苷酸序列第10636-11208个碱基处，长度为573个碱基对，序列如SEQ ID No 24所示，编码调控因子，长度为190个氨基酸，序列如SEQ ID No 25所示。

表1Fas II抑制剂ABX的生物合成主要功能基因簇

本发明还提供一种使用上述基因簇产生ABX化合物的方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下步骤：

1)首先将Streptomyces sp.MA6657来源的原始菌培养到OD值为1提取基因组DNA，通过Sau3AⅠ限制性内切酶对基因组DNA的部分酶切处理，待切到48kb大小DNA片段后对外源片段采用电洗脱的方法进行胶回收，之后将上述48kb大小的DNA目的片段与HpaI和BamHI限制性内切酶切处理好的载体pJTU2554连接进行后续的基因文库的包装、转染、效价测定及单菌落挑取并完成阳性Cosmid 4E10的筛选工作，筛选工作涉及到筛选引物ABX-L/R/M/S的确定，最终通过PCR的方法确定ABX化合物合成相关功能基因簇边界，从而确定ABX化合物合成的关键基因簇；所述pJTU2554的改造过程如下：

pSET152通过Xba I和Xho I双酶切后保留了阿泊拉抗性基因(aac(3)iv)、oriT接合转移位点区域、attp重组整合位点以及λ噬菌体的整合系统int区域；

pOJ446通过Pst I酶切后除去原有载体质粒的oriT接合转移位点区域构建成含有3个cos位点的pJTU2553载体质粒，最后通过Xba I和Xho I双酶切将3个cos位点区域与之前酶切好的pSET152保留部分连接成最终的pJTU2554改造后质粒；

2)将筛选得到的4E10Cosmid通过结合转移异源表达到S.albus宿主菌；

3)挑选该工程菌的单菌落进行培养并且大量发酵，得到了ABX化合物。

本发明对发酵得到的ABX化合物进行LC-MS和HPLC测定验证发酵主产物为(-)ABX和(-)BABX。ABX具有很好的抗菌、降脂、降压活性，本发明所揭示的ABX生物合成基因簇，可以用于改造ABX的生物途径，实现ABX的结构改造和产量的提升，具有重要的价值。

附图说明

图1是Streptomyces sp.MA6657提取的基因组脉冲场胶回收目的片段示意图。M：48kb marker；泳道1：10ul酶切少量的MA6657的DNA样品；泳道2：300ul酶切后准备回收用的MA6657的DNA样品。

图2是筛选得到阳性4E10Cosmid的示意图，即Streptomyces sp.MA6657筛选文库的部分结果，通过对文库的四对引物的PCR结果确定都能P出阳性条带最终筛选到阳性黏粒4E10。

图3是PCR验证结合转移孢子的示意图。左侧RSML分别为ABX-R、ABX-S、ABX-M、ABX-L的前后引物PCR验证的4E10cosmid胶图；右侧RSML分别为ABX-R、ABX-S、ABX-M、ABX-L的前后引物PCR验证的4E10cosmid转到S.albus宿主菌抽提基因组DNA的胶图。

图4是HPLC鉴定产物ABX的结果示意图，其中1是ABX化合物，2是BABX化合物。

图5是LC-MS鉴定产物ABX的结果示意图，其中1是ABX化合物。

图6是FAS II抑制剂ABX化合物的生物合成基因簇图，主要包括13个和II型芳香聚酮化合物ABX合成的相关基因的因簇。

具体实施方式

以下结合具体实施例子对本发明进行进一步说明。应理解，以下实施例子仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本发明以美国默克公司提供的Streptomyces sp.MA6657来源的原始菌为模板提取基因组DNA用于cosmid文库的构建。

本发明使用的酶和试剂：限制性内切酶由Takara公司购进，质粒提取试剂盒购自生工，T4连接酶由NEB公司购进，琼脂糖由生物技术有限公司购进，其他试剂均由国产或者进口分装。

1.本实验Streptomyces sp.MA6657基因组文库构建方法(图1)：

1.1基因组DNA片段的处理

将酶切好的大小为48kb的基因组DNA片段用SAP脱磷酶处理之后通过电洗脱方法回收。

附注：电洗脱方法

将切下的胶装入透析袋中，加入200μL(是胶体积的0.7倍)TAE(此过程用手套，手不能碰到透析袋，否则透析袋外层不干净，影响电泳)，进行电洗脱2-3小时(含胶的透析袋不能含有气泡，因气泡在电场下会氧化)电压120V，电流小于140mA，电洗脱后要反向电泳1min为了让样品进入缓冲液中，因为电洗脱会造成样品附于膜上，影响产量，然后再正向电泳30s，整个过程都要在冰上进行。洗脱结束后将透析袋内容物混匀，挤出胶，用枪吸出内液，置于4℃。将回收到的目的DNA胶回收片段沉淀溶于10-20ul的ddH₂O中。

1.2载体的处理

本发明使用的载体质粒由武汉大学药学院虞沂老师组提供的pJTU2554。

将载体用Hpa I和Bam HI限制性内切酶处理后回收用于和上述处理好的基因组DNA目的片段连接。

1.3总DNA回收片段与载体的连接

用NEB公司的T4连接酶将上述基因组DNA 48kb大小的片段和限制性内切酶处理后的pJTU2554连接。

2.基因文库的包装、转染、效价测定及单菌落挑取

通过购买的MaxPlax Lambda Packaging Extracts,EPI300-T1R PlatingStrain.Kit试剂盒完成基因文库的包装、转染、效价测定的工作，最后利用31个96孔板大约挑3000个点完成菌落挑选工作。

3.Streptomyces sp.MA6657基因组文库的筛选(图2和图3)

3.1文库筛选引物设计

设计了4对确定4E10Cosmid与ABX化合物合成相关基因簇筛选的引物：

ABX-L-for:5'-GATTCCTTCCCTGGTTCGGCA-3'(SEQ ID No 28)

ABX-L-rev:5'-GCCGAAGTGACCTCCACCGTG-3'(SEQ ID No 29)

ABX-M-for:5'-ATCGCGCTGGGCATTCCAGTAG-3'(SEQ ID No 30)

ABX-M-rev:5'-ATCGCACAGCGCGTGAAGAAGG-3'(SEQ ID No 31)

ABX-R-for:5'-GAGACGGACGTACTGATCGTCGG-3'(SEQ ID No 32)

ABX-R-rev:5'-CGAGAAGTACTCGTCGAACCACC-3'(SEQ ID No 33)

ABX-S-for:5'-GTACCAGTCGATCGCGTGGTTCTAC-3'(SEQ ID No 34)

ABX-S-rev:5'-CGAGTCGTAGTCGAGTGCGGTGTAG-3'(SEQ ID No 35)

附注：以上引物为筛选文库时所用确定文库Cosmid边界引物，并不包含在之后和ABX合成相关功能基因簇之中。

3.2通过上述引物利用PCR的方法确定ABX-L/M/R/S四对引物都能P出阳性条带的即为阳性结果，最终确定阳性结果为4E10质粒，即为文库的第4个96孔板E行第10列的位置。

4.Streptomyces sp.MA6657筛出阳性黏粒4E10的异源表达步骤：

将转到ET12567感受态细胞中的阳性黏粒4E10分别在S.albus孢子中做结合转移。

4.1E.coli供体菌的制备：

将含有目标质粒的E.coli ET12567转化好4E10质粒的平板上挑取单菌落接种至LB(含Apr、Kan和Cm)中培养过夜，吸取1mL的菌液接到50mL LB(含相应抗生素)中，置于37℃摇床中，250rpm培养至OD600＝0.3～0.5间。4℃，4000rpm离心10min，菌体用20mL LB洗涤两次，随后重悬于1mL LB，作为DNA供体。

4.2受体菌制备：

取出-80℃，20％甘油保存的孢子悬液(6.7x10⁹个/mL)一管，8000rpm离心3min后去除甘油，孢子用0.5mL TES缓冲液(0.05M，pH8.0)洗涤两次，随后用500μl TES重悬，并于50℃热休克10min，加入500μl TSB混匀后置于37℃温育3～5hr，8000rpm，4℃离心5min收集孢子，上清去除后用1.5mL LB重悬作为受体菌。

4.3接合转移：

将大肠杆菌和孢子按照10μl：90μl、100μl：100μl、90μl：10μl的比例混合后均匀涂布于MS(含10mM MgCl₂)平板上(各2块)；此外将100μl相同的孢子涂在MS(含有10mM的MgCl₂)上作为阴性对照。30℃培养12～16个小时。然后向每块平板上加入3mL无菌水，用推棒轻推至菌体表面被水均匀覆盖，之后用枪吸干。加盖1mL无菌水(含有相应浓度的抗生素及50μg/mL奈定酮酸)，30℃培养3～5天，待长出接合子即可在发酵培养基中发酵。

5.Streptomyces sp.MA6657的阳性黏粒4E10异源表达到S.albus中的接合子液体发酵过程

5.1发酵液体培养基配方(500ml锥形瓶+100ml发酵液体培养基+5％-10％TSB带有抗性中摇起的菌液)：

Soluble starch 2.0g/L,Glucose 1g/L,甘油1g/L,bacto-peptone 0.5g/L,黄豆饼粉1g/L,yeast extract 0.5g/L,CaCO₃0.5g/L溶于100ml的ddH₂O调节pH到7.0。

5.2发酵培养条件

28℃，220rpm培养7-12d收获。

5.3发酵液取样和萃取

之后过3天每天取一次菌液连续取到第七天，每次取10ml菌液加等体积丁酮萃取，超声1h，摇2h，5000rpm离心10min取上清悬蒸出萃取剂，最后将剩下的水分离心冻干除去溶于甲醇中0.45μm滤膜过滤到样品瓶中待做HPLC和LC-MS。

6.HPLC和LC-MS对Streptomyces sp.MA6657的阳性黏粒4E10异源表达到S.albus中的接合子发酵萃取液的鉴定条件(图4和图5)。

乙腈和水梯度洗脱-60min 55％-90％乙腈洗脱。

Claims

1.来自于细菌Streptomyces sp. MA6657，和II型芳香聚酮化合物ABX合成相关的基因簇，包括：

1）负责聚酮骨架形成的II型线性聚酮合成酶基因，即abxA、abxB和abxC共3个基因：

编码酮基合成酶的abxA位于基因簇核苷酸序列第1-1227个碱基处，序列如SEQ ID No 2所示；

编码酮基合成酶的abxB位于基因簇核苷酸序列第1230-2477个碱基处，序列如SEQ ID No 4所示；

编码酰基载体蛋白的abxC位于基因簇核苷酸序列第2514-2753个碱基处，序列如SEQ ID No 6所示；

2）负责聚酮骨架成环的基因，即abxD、abxE和abxH共3个基因：

编码聚酮环化酶的abxD位于基因簇核苷酸序列第2750-3241个碱基处，序列如SEQ ID No 8所示；

编码聚酮环化酶的abxE位于基因簇核苷酸序列第3238-3579个碱基处，序列如SEQ ID No 10所示；

编码酮基还原酶的abxH位于基因簇核苷酸序列第6151-6921个碱基处，序列如SEQ ID No 16所示；

3）负责聚酮合成过程中缩酮氧桥基础骨架手性选择的基因，即abxJ 基因，位于基因簇核苷酸序列第8173-8901个碱基处，序列如SEQ ID No 20所示；

4）负责后修饰的基因，即abxM、abxF和abxI共3个基因：

编码甲基转移酶的abxM位于基因簇核苷酸序列第11550-12299个碱基处，序列如SEQ ID No 26所示；

编码卤化酶的abxF位于基因簇核苷酸序列第3622-4899个碱基处，序列如SEQ ID No 12所示；

编码甲基转移酶的abxI位于基因簇核苷酸序列第6996-8030个碱基处，序列如SEQ ID No 18所示；

5）负责调节的基因，即abxG、abxK和abxL共3个基因：

编码调控因子的abxG位于基因簇核苷酸序列第4908-6239个碱基处，序列如SEQ ID No 14所示；

编码调控因子的abxK位于基因簇核苷酸序列第8972-10555个碱基处，序列如SEQ ID No 22所示；

编码调控因子的abxL位于基因簇核苷酸序列第10636-11208个碱基处，序列如SEQ ID No 24所示。

2.一种使用权利要求1所述基因簇产生ABX化合物的方法，包括如下步骤：

1）首先将Streptomyces sp. MA6657来源的原始菌培养到OD值为1提取基因组DNA，通过Sau3AⅠ限制性内切酶对基因组DNA的部分酶切处理，待切到48kb大小DNA片段后对外源片段采用电洗脱的方法进行胶回收，之后将上述48kb大小的DNA目的片段与Hpa I 和Bam HI限制性内切酶切处理好的载体pJTU2554连接进行后续的基因文库的包装、转染、效价测定及单菌落挑取并完成阳性Cosmid 4E10的筛选工作，筛选工作涉及到筛选引物ABX-L/R/M/S的确定，最终通过PCR的方法确定ABX化合物合成相关功能基因簇边界，从而确定ABX化合物合成的关键基因簇；所述pJTU2554的改造过程如下：

pSET152通过Xba I 和Xho I双酶切后保留了阿泊拉抗性基因、oriT接合转移位点区域、attp重组整合位点以及λ噬菌体的整合系统int区域；

pOJ446通过Pst I酶切后除去原有载体质粒的oriT接合转移位点区域构建成含有3个cos位点的pJTU2553载体质粒，最后通过Xba I 和Xho I双酶切将3个cos位点区域与之前酶切好的pSET152保留部分连接成最终的pJTU2554改造后质粒；

2）将筛选得到的4E10 Cosmid通过结合转移异源表达到S.albus宿主菌；

3）挑选该工程菌的单菌落进行培养并且大量发酵，得到了ABX化合物。