CN105200072B - 一种芳香聚酮类非典型角环素fluostatins的生物合成基因簇及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芳香聚酮类非典型角环素fluostatins的生物合成基因簇及其应用。本发明的来源于小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160(保藏编号为：CCTCC NO:M2012392)的fluostatins的生物合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1～40128位的碱基序列所示，包含32个基因。本发明所提供的基因及其蛋白质可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

Description

一种芳香聚酮类非典型角环素fluostatins的生物合成基因 簇及其应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种芳香聚酮类非典型角环素fluostatins的生物合成基因簇及其应用。

背景技术

Fluostatins是从一株南海稀有放线菌——小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160的培养物中分离到的芳香聚酮类化合物。从该菌中能制备多种抗生素，该菌已经申请专利，名称为“一种小单孢菌及利用该菌制备多种抗生素的方法”，申请专利号为：201210467946.X。已报道发现的fluostatins类化合物主要来源于放线菌，例如最早分离自链霉菌streptomyces sp.TA-3391的fluostatin A,B；研究发现该2种化合物具有酶抑制剂活性，其中fluostatinA还具有一定肿瘤细胞毒活性。随后从Streptomyces Strain Acta1383分到fluostatin C～E，最近的一个例子是从宏基因组文库筛选的2个cosmids拼接成的基因簇在S.albus中异源表达出fluostatin F～H，之后我们课题组从Micromonosporarosaria SCSIO N160中分到fluostatin I～K，及两个结构相关化合物rabelomycin,phenanthroviridone，且phenanthroviridone具有明显的肿瘤细胞毒活性。最近研究表明由fluostatins类似物kinamycin的单体形成的二聚体化合物lomaiviticin具有较强的细胞毒活性，其作用机制在于可以引起细胞中DNA双键断裂。

近十多年来发展起来的组合生物合成技术为改造复杂天然产物提供了新的思路和方法。在阐明了自然界的生物合成途径、克隆和鉴定微生物天然产物生物合成基因簇的基础上，采用组合生物合成技术对发现的生物合成基因、调控基因进行体内敲除、突变、置换和重组等操作，不但能够生产”非天然”的天然产物结构类似物，而且还可以提高天然产物的产量，或定向积累所需要的天然产物，为天然产物的发现和药物开发提供分子和活性多样性。

迄今为止，关于具体的fluostatins基因簇，及fluostatins类化合物中涉及到的开环重排机制，重氮原子的引入机制鲜有报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种芳香聚酮类非典型角环素fluostatins的生物合成基因簇，其来源于南海稀有放线菌——小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSION160。

本发明的fluostatins的生物合成基因簇，其特征在于，该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1～40128位的碱基序列所示，包含36个基因，具体为：

(1)负责聚酮链骨架合成及合成过程中进行修饰的基因，即flsD、flsE、flsC、flsB、flsA、flsI共6个基因：

flsD位于基因簇核苷酸序列第6028-6978个碱基处，长度为951个碱基对，编码芳香化酶，316个氨基酸；

flsE位于基因簇核苷酸序列第7005-7787个碱基处，长度为783个碱基对，编码酮基还原酶，260个氨基酸；

flsC位于基因簇核苷酸序列第7801-8076个碱基处，长度为276个碱基对，编码酰基载体蛋白，91个氨基酸；

flsB位于基因簇核苷酸序列第8119-9357个碱基处，长度为1239个碱基对，编码链延伸因子，412个氨基酸；

flsA位于基因簇核苷酸序列第9357-10625个碱基处，长度为1269个碱基对，编码酮脂酰合成酶，422个氨基酸；

flsI位于基因簇核苷酸序列第10622-10951个碱基处，长度为330个碱基对，编码聚酮环化酶，109个氨基酸；

(2)氧化还原相关基因，即flsO2、flsO3、flsL、flsO1、flsG、flsO4、flsP、flsO5共8个基因：

flsO2位于基因簇核苷酸序列第3059-4525个碱基处，长度为1467个碱基对，编码聚酮加氧酶，488个氨基酸；

flsO3位于基因簇核苷酸序列第4538-6031个碱基处，长度为1494个碱基对，编码聚酮加氧酶，497个氨基酸；

flsL位于基因簇核苷酸序列第12350-12751个碱基处，长度为402个碱基对，编码FMN结合的氧化相关的酶，133个氨基酸；

flsO1位于基因簇核苷酸序列第12877-14370个碱基处，长度为1494个碱基对，编码聚酮加氧酶，497个氨基酸；

flsG位于基因簇核苷酸序列第14412-15125个碱基处，长度为714个碱基对，编码单加氧酶，237个氨基酸；

flsO4位于基因簇核苷酸序列第17957-19447个碱基处，长度为1491个碱基对，编码聚酮加氧酶，496个氨基酸；

flsP位于基因簇核苷酸序列第19664-20896个碱基处，长度为1233个碱基对，编码FAD依赖的氧化还原酶，410个氨基酸；

flsO5位于基因簇核苷酸序列第24357-25847个碱基处，长度为1491个碱基对，编码聚酮加氧酶，496个氨基酸；

(3)编码调控子和转运子的基因，即flsR1、flsR2、flsR3共3个基因：

flsR1位于基因簇核苷酸序列第11354-11980个碱基处，长度为627个碱基对，编码反应调控蛋白，208个氨基酸；

flsR2位于基因簇核苷酸序列第25894-26919个碱基处，长度为1026个碱基对，编码StrR家族调控蛋白，341个氨基酸；

flsR3位于基因簇核苷酸序列第36470-37159个碱基处，长度为690个碱基对，编码反应调控蛋白regX3，229个氨基酸；

(4)与氮原子引入相关的基因，即flsN1、flsN2、flsT、flsS、flsN3、flsN4、flsV、flsU2共8个基因：

flsN1位于基因簇核苷酸序列第27274-28485个碱基处，长度为1212个碱基对，编码NO合酶氧化酶，403个氨基酸；

flsN2位于基因簇核苷酸序列第28492-29313个碱基处，长度为822个碱基对，编码碳氮水解酶，273个氨基酸；

flsT位于基因簇核苷酸序列第29303-29704个碱基处，长度为402个碱基对，编码乙酰基转移酶家族蛋白，133个氨基酸；

flsS位于基因簇核苷酸序列第29701-30975个碱基处，长度为1275个碱基对，编码腺苷酸基琥珀酸裂解酶，424个氨基酸；

flsN3位于基因簇核苷酸序列第31223-32602个碱基处，长度为1380个碱基对，编码谷氨酰胺氨基转移酶亚基A，459个氨基酸；

flsN4位于基因簇核苷酸序列第32610-34133个碱基处，长度为1524个碱基对，编码谷氨酰胺合成酶，507个氨基酸；

flsV位于基因簇核苷酸序列第34196-34582个碱基处，长度为387个碱基对，编码4Fe-4S结合的铁氧还蛋白，128个氨基酸；

flsU2位于基因簇核苷酸序列第34579-36447个碱基处，长度为1869个碱基对，编码未知功能蛋白，622个氨基酸；

(5)其他后修饰基因及功能未知基因，即flsF、flsK、flsU1、flsQ1、flsM、flsH、flsQ2共7个基因：

flsF位于基因簇核苷酸序列第1498-3057个碱基处，长度为1560个碱基对，编码羧基转移酶，519个氨基酸；

flsK位于基因簇核苷酸序列第15183-15734个碱基处，长度为552个碱基对，编码未知功能蛋白，183个氨基酸；

flsU1位于基因簇核苷酸序列第15934-17037个碱基处，长度为1104个碱基对，编码未知功能蛋白，367个氨基酸；

flsQ1位于基因簇核苷酸序列第17119-17889个碱基处，长度为771个碱基对，编码短链脱氢酶家族蛋白，256个氨基酸；

flsM位于基因簇核苷酸序列第20943-21950个碱基处，长度为1008个碱基对，编码氧甲基转移酶，335个氨基酸；

flsH位于基因簇核苷酸序列第22223-23002个碱基处，长度为780个碱基对，编码水解酶，259个氨基酸；

flsQ2位于基因簇核苷酸序列第23599-24354个碱基处，长度为756个碱基对，编码短链脱氢酶家族蛋白，251个氨基酸；

(6)在fluostatins生物合成基因簇的上下游基因，即orf(-2)、orf(-1)、orf1、orf2共4个基因：

orf(-2)位于基因簇核苷酸序列第1-1161个碱基处，长度为1161个碱基对，编码辅酶A转移酶III家族蛋白，386个氨基酸；

orf(-1)位于基因簇核苷酸序列第1307-1501个碱基处，长度为195个碱基对，编码未知功能蛋白，64个氨基酸；

orf1位于基因簇核苷酸序列第37835-38107个碱基处，长度为273个碱基对，编码未知功能蛋白，90个氨基酸；

orf2位于基因簇核苷酸序列第38869-40128个碱基处，长度为1260个碱基对，编码3-磷莽草酸-1-羧乙烯基转移酶，419个氨基酸；

SEQ ID NO.1的第1位到40128位的碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。SEQ ID NO.1的第1位到40128位的的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或DNA体外合成技术或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO.1的第1位到40128位中DNA序列的重组DNA载体的途径。

本发明还提供了产生fluostatins生物合成基因被中断或其他基因改造的途径，至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO.1的第1位到40128位中的核苷酸序列。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列SEQ ID NO.1的第1位到40128位的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与fluostatins生物合成基因簇相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从小单孢菌SCSIO N160基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有小单孢菌SCSIO N160基因组中邻近区域未克隆的DNA。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被体内体外修饰或进行突变，包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性物质或产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、小单孢菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并了解它们在宿主代谢中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成dehydrorabelomycin类化合物，进一步催化合成抗生素fluostatins。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组载体以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得其他新型生物合成途径或者产生新的化合物。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因DNA片段可以通过中断fluostatins生物合成的一个或几个步骤而得到新的fluostatins结构类似物或前体。包含DNA片段或基因可以用来提高fluostatins或其衍生物的产量，本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。

本发明的第二个目的是提供fluostatins的生物合成基因簇在制备芳香聚酮类非典型角环素fluostatins及其类似物中的应用，特别是在制备化合物1、3-10任一化合物中的应用；

本发明所提供的催化合成fluostatins类化合物的生物合成基因簇可用于合成difluostatins A衍生物。

本发明所提供的fluostatins骨架的后修饰基因或其他酶，提供了通过遗传修饰得到类似物的途径，所包含的催化difluostatin A类化合物生成或后修饰的其他应用。

本发明还提供了fluostatins的生物合成基因簇在制备difluostatin及其类似物中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种聚酮加氧酶基因flsO2，其核苷酸序列为如SEQID NO.1的第3059-4525位所示碱基序列的反向互补序列。

本发明还提供了一种由上述聚酮加氧酶基因flsO2编码的聚酮加氧酶FlsO2，其能以NAD(P)H为辅因子催化prejadomycin形成CR1进而自发氧化最终形成dehydrorabelomycin；因此，本发明还提供聚酮加氧酶FlsO2在催化式1所示的化合物prejadomycin形成式2所示的化合物CR1中的应用；

本发明还提供了缺失聚酮加氧酶基因flsO2的基因工程菌(以小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160为出发菌株)，以及其在累积制备中间体如式1所示的化合物prejadomycin中的应用。

总之，本发明所提供的包含fluostatins生物合成相关的所有基因和蛋白信息，可以帮助人们理解fluostatins家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

本发明的海洋来源的小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160，该菌于2012年10月08日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2012392；其公开于专利号为：ZL201210467946.X，发明名称为“一种小单孢菌及利用该菌制备多种抗生素的方法”的专利中。

本发明的链霉菌Streptomyces coelicolor YF11公开于文献：YiguangPengQinhengGuangtaoHaiboSumeiJianhuaWeimingand ChangshengIdentification of Caerulomycin A Gene ClusterImplicates a Tailoring Amidohydrolase.Org.Lett.,2012,14(11),pp 2666–2669中。该菌株本申请人也持有，保证自20年内向公众提供。

附图说明

图1是阳性克隆的相互重叠区示意图，包括了阳性克隆pCSG5000，pCSG5001，pCSG5002和pCSG5003，粗实线表示fluostatins的生物合成基因簇，虚线表示基因簇以外的部分，三角形所示为筛库引物flsFDTF/flsFDTR，flsGEF/flsGER，flsSEF/flsSER和ORF2EF/ORF2ER扩增片段的位置。

图2是基因遗传改造小单孢菌SCSIO N160中fluostatins的生物合成基因簇得到的突变株在N4发酵培养基中发酵的发酵产物的高压液相分析图：(i)敲除了orf(-1～-2)–分别编码未知功能蛋白和辅酶A转移酶III家族蛋白，获得的突变株Fls01发酵仍然能产生fluostatins及其相关化合物；(ii)敲除了flsB–链延伸因子基因，获得的突变株Fls05发酵不能产生fluostatins类化合物，同时也未积累其他化合物；(iii)敲除了flsI–聚酮环化酶基因，获得的突变株Fls06发酵无任何fluostatins及其相关化合物积累；(iv)敲除了orf(1～2)–分别编码未知功能蛋白和3-磷莽草酸-1-羧乙烯基转移酶，获得的突变株Fls27发酵仍然能产生fluostatins及其相关化合物；(v)野生型菌株小单孢菌SCSIO N160经发酵获得的fluostatins主产物及同系物。

图3是异源表达菌株S.YF11-3在4种不同海盐浓度N4培养基中发酵产物以及异源表达菌株S.YF11-1、S.YF11-2和S.YF11-4在N4培养基中发酵产物的高压液相分析图：(i)异源表达菌株S.YF11-3在加0％海盐N4发酵培养基中发酵7天的产物检测；(ii)异源表达菌株S.YF11-3在加1％海盐N4发酵培养基中发酵7天的产物检测；(iii)异源表达菌株S.YF11-3在加2％海盐N4发酵培养基中发酵7天的产物检测；(iv)异源表达菌株S.YF11-3在加3％海盐N4发酵培养基中发酵7天的产物检测；(v)异源表达菌株S.YF11-4在N4发酵培养基中发酵7天的产物检测；(vi)异源表达菌株S.YF11-1在N4发酵培养基中发酵7天的产物检测；(vii)异源表达菌株S.YF11-2在N4发酵培养基中发酵7天的产物检测，其中数字1、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表图4中的化合物1、3、4、5、6、7、8、9、10。

图4从异源表达菌株S.YF11-3发酵产物中分到的fluostatins类化合物结构。

图5是fluostatins生物合成基因簇的组织结构示意图和推测的fluostatins的生物合成途径。

图6是聚酮加氧酶FlsO2的体外酶反应：(A)FlsO2纯酶反应：(i)小单孢菌SCSION160野生型菌株在N4发酵培养基中发酵7天的产物检测；(ii)FlsO2-聚酮加氧酶基因敲除突变株Fls03在N4发酵培养基中发酵7天的产物检测；(iii)对照体系CK(包括：20μM Y2-1(化合物prejadomycin)和2mM NADPH)30℃反应8小时的HPLC检测结果；(iv)标准体系(包括：20μM Y2-1，2mM NADPH，5μM FlsO2)30℃反应1.5小时的HPLC检测结果；(v)标准体系(包括：20μM Y2-1，2mM NADPH，5μM FlsO2)30℃反应8小时的HPLC检测结果；(B)纯化蛋白FlsO2的蛋白电泳分析；(C)推测的FlsO2催化反应的示意图，图中的3、9分别代表图4中的化合物3、9，图中的12、13、14分别代表图6C中的化合物12、13、14。

图7是化合物prejadomycin的HR-ESI/MS结果。

图8是化合物prejadomycin的X-ray衍射晶体结构图。

图9是化合物fluostatin L(1)的HR-ESI-MS结果。

图10是化合物fluostatin L(1)的¹H核磁共振谱，The ¹H NMR spectrum offluostatin L(1)in(CD₃)₂CO.。

图11是化合物fluostatin L(1)的¹³C核磁共振谱，The ¹³C NMR spectrum offluostatin L(1)in(CD₃)₂CO.。

图12是化合物fluostatin L(1)的HSQC核磁共振谱，The HSQCspectrum offluostatin L(1)in(CD₃)₂CO.。

图13是化合物fluostatin L(1)的HMBC核磁共振谱，The HMBCspectrum offluostatin L(1)in(CD₃)₂CO.。

图14是化合物fluostatin L(1)的COSY核磁共振谱，The COSYspectrum offluostatin L(1)in(CD₃)₂CO.。

图15是化合物fluostatinL(1)的ECD谱，以化合物fluostatinC作为参照。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

1.小单孢菌SCSIO N160基因组序列扫描及fluostatins的生物合成基因簇序列分析和功能分析：

通过对小单孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160进行全基因组扫描和注释，在其中找到了40.128kb的fluostatins的生物合成基因簇，包含了36个开放阅读框(open reading frames,ORFs)(表1)。根据生物信息学分析，flsD、flsE、flsC、flsB、flsA、flsI 6个基因负责聚酮链骨架合成及合成过程中的修饰；flsO2、flsO3、flsL、flsO1、flsG、flsO4、flsP、flsO5共8八个基因编码氧化还原酶；flsR1、flsR2、flsR3共3个编码调控子和转运子的基因；flsN1、flsN2、flsT、flsS、flsN3、flsN4、flsV、flsU2共8个编码与氮原子引入有关的酶；flsF、flsK、flsU1、flsQ1、flsM、flsH、flsQ2共7个编码其他后修饰蛋白和未知功能蛋白。Fluostatins的生物合成途径初步推测如图5所示。

表1 fluostatins生物合成基因簇的基因及其功能分析

2.fluostatins的生物合成基因簇的克隆、分析及边界的确定：

根据基因组序列注释和生物信息学分析，以位于fluostatins主体基因簇中间的flsG单加氧酶基因的序列设计PCR筛选引物，从小单孢菌SCSIO N160的基因组文库3000个克隆中筛选，获得了13个阳性克隆，后用位于主体基因簇的上、下游基因：flsF羧基转移酶基因，flsS腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因及边界基因orf23-磷莽草酸-1-羧乙烯基转移酶基因的序列设计PCR筛选引物对上述所筛阳性克隆进行复筛并结合阳性克隆酶切分析及末端测序结果，确定了其中4个cosmids在基因簇中的相对位置，而且有1个cosmid(pCSG5003)(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)包含了整个fluostatins生物合成基因簇，其他3个cosmid(pCSG5000、pCSG5001、pCSG5002)包含部分基因簇(图1)。

生物信息学分析表明，orf(-2)基因编码辅酶A转移酶III家族蛋白，orf(-1)基因编码未知功能蛋白。通过建立小单孢菌SCSIO N160的遗传操作体系，构建了orf(-1)与orf(-2)同时进行基因灭活的突变株Fls01，该突变株经发酵仍旧能够生产fluostatins，产量与野生型相当，从而确证了orf(-1)与orf(-2)不参与fluostatins的生物合成。同时灭活编码未知功能蛋白基因orf1和编码3-磷莽草酸-1-羧乙烯基转移酶基因orf2，获得突变株Fls27发酵仍然能产生fluostatins及其相关化合物，产量与野生型相当，排除了orf1与orf2基因参与fluostatins生物合成的可能性。同时，通过对小单孢菌SCSIO N160全基因组扫描及对其中所包含的fluostatins基因簇序列比对分析，发现自orf1起找不到与报道的由宏基因组cosmids拼接构建的fluostatins基因簇中有相似的基因。这些结果表明orf1是fluostatins生物合成基因簇的右边界(图5)。因此，fluostatins的生物合成基因簇的边界的上游初步确定为flsF，下游为flsR3(图5)，该fluostatins的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1～40128位的碱基序列所示。

(1)Fluostatins的生物合成基因簇中各基因的功能分析

在克隆、分析了完整的fluostatins的生物合成基因簇，研究了各基因编码蛋白可能的功能的基础上，本发明对fluostatins的生物合成机制进行了探讨，采用PCR-targeting技术针对5个fluostatins基因簇基因(orf(-1～-2)、flsO2、flsB、flsI、orf(1～2))分别进行了灭活突变(灭活引物及检测引物参见表2)，对应获得了Fls01、Fls03、Fls05、Fls06、Fls27等5个突变株。

表2构建突变株所需的敲除引物，检测引物及蛋白表达引物名称和序列

我们通过对突变株进行发酵和代谢产物的分离鉴定，阐明了部分生物合成基因的功能，为进一步通过对生物合成基因簇进行遗传修饰获得fluostatins活性类似物提供了可能。(1)敲除了orf(-1～-2)–分别编码未知功能蛋白和辅酶A转移酶III家族蛋白，获得的突变株Fls01发酵仍然能产生fluostatins及其相关化合物(图2(i))；(2)敲除flsO2-聚酮加氧酶基因，获得的突变株Fls03发酵主要积累中间体化合物prejadomycin(化合物12)(如图6A和6C所示)；

(3)敲除了flsB–链延伸因子基因，获得的突变株Fls05发酵不能产生fluostatins类化合物，同时也未积累其他化合物(图2(ii))；(4)敲除了flsI–聚酮环化酶基因，获得的突变株Fls06发酵无任何fluostatins及其相关化合物积累(图2(iii))；(5)敲除了orf(1～2)–分别编码未知功能蛋白和3-磷莽草酸-1-羧乙烯基转移酶，获得的突变株Fls27发酵仍然能产生fluostatins及其相关化合物(图2(iv))。

(2)Fluostatins生物合成基因簇在模式菌株链霉菌YF11的异源表达

本发明使用分子生物学技术，构建了3个基于pSET152的载体：pCSG5031(源于pCSG5000，即将pCSG5000插入pSET152载体中)，pCSG5032(源于pCSG5001，即将pCSG5001插入pSET152载体中)和pCSG5033(源于pCSG5003，即将pCSG5003插入pSET152载体中)(图5)。pCSG5031的插入片段只包含主体基因簇中从flsF～flsG的13个基因(图5所示)，pCSG5032的插入片段只包含主体基因簇中从flsF～flsV的30个基因(图5所示)，pCSG5033的插入片段包含有主体基因簇中从flsF～flsR3所有32个基因(图5所示)。将pCSG5031、pCSG5032、pCSG5033及pSET152空载体分别转化链霉菌YF11获得了对应的链霉菌YF11转化子，分别命名为S.YF11-1、S.YF11-2、S.YF11-3和S.YF11-4。

与包含空载体pSET152的链霉菌转化子S.YF11-4相比，pCSG5033的链霉菌YF11转化子S.YF11-3成功异源表达了8个fluostatins类已知化合物(图4所示化合物3-10)及1个新化合物，经¹H、¹³C、HSQC、HMBC和COSY核磁共振谱和ECD谱结果确认该新化合物为fluostatin L(图4所示化合物1，图9-15所示)，pCSG5031的链霉菌YF11转化子S.YF11-1只表达出少量的rabelomycin(图4所示化合物10)，而pCSG5032的链霉菌YF11转化子S.YF11-2同对照组S.YF11-4一样，未能表达出fluostatins及结构相关化合物，该结果表明pCSG5033的插入片段包含完整的fluostatins生物合成基因簇，能够表达出fluostatins主产物及结构类似物，结果如图3所示。

本发明充分证实了fluostatins生物合成基因簇的完整性，并成功实现了fluostatins生物合成基因簇在异源细胞工厂YF11中生产fluostatins及其结构类似物，提供了创制fluostatins及其中间体化合物的新策略(图3)。

3.Fluostatins生物合成基因flsO2的生化功能鉴定及其应用：

携带fluostatins生物合成基因flsO2所编码的聚酮加氧酶FlsO2能将prejadomycin(化合物12，图6C所示)体外催化反应为CR1(化合物13，图6C所示)和dehydrorabelomycin(化合物14，图6C所示)，实验发现，化合物13为化合物12生成化合物14过程的中间产物(图6A)。

Fluostatins生物合成基因flsO2在大肠杆菌中获得了可溶性表达(图6B)，经过生化反应鉴定FlsO2为结合黄素的聚酮加氧酶，能以NAD(P)H为辅因子，催化化合物12进行C-4a,12b脱羟基反应及C-12位加羟基反应，形成化合物13，化合物13再通过自发氧化，最终形成dehydrorabelomycin(化合物14，图6C)。

以下进一步提供实施例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明的应用范围。

实施例1：Fluostatins及其相关化合物产生菌小单孢菌SCSIO N160基因组DNA的提取

将新鲜小单孢菌SCSIO N160的菌丝体按照5％的接种量接种于50mL的1^#培养基(淀粉10g，酵母粉4g，细菌学蛋白胨2g，海盐10g，加水定容至1L，pH 7.2-7.4)中，28-30℃，振荡培养约2-3天，4000rpm离心10分钟收集菌丝体。菌丝体用STE溶液(NaCl 75mM，EDTA25mM，Tris-Cl 20mM)洗涤两次，向洗涤后的菌丝体中加入30mL STE溶液和终浓度3mg/mL的溶菌酶，涡旋均匀，37℃温浴3小时，加入至终浓度0.1-0.2mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃温浴10分钟，加入至终浓度1-2％的SDS，混匀，放入55℃水浴约1小时，期间颠倒数次。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(V/V/V＝25:24:1)，混合均匀，置于冰上冷却30分钟。12000rpm，4℃离心10分钟，然后用剪过的大口径枪头小心吸取上清到新的离心管中，用同样的方法反复处理3次，然后用等体积的氯仿洗涤两次，12000rpm，4℃离心10分钟。用剪过的大口径枪头将水相吸出转移至新的离心管，加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，混匀后再加入等体积的异丙醇，混匀后冰上放置，沉淀DNA。小心地用玻璃棒将DNA纤维团转移至新的离心管中，用70％乙醇洗涤两次，将液体倾出，在37℃下略微烘干，加5mL TE溶解，并加入3-5U的RNA酶，由此得到小单孢菌SCSIO N160基因组DNA。

实施例2：Fluostatins生产菌小单孢菌SCSIO N160基因组文库的建立

首先通过一系列的稀释实验来确定限制性核酸内切酶Sau3A I的用量，在20μL体系中，含有17μL的小单孢菌SCSIO N160基因组DNA，2μL的10×反应缓冲液和1μL不同稀释度的Sau3A I，其终止反应为4μL 0.5mol/L EDTA和合适的上样缓冲液。通过摸索确定了0.025-0.05U的酶活单位比较合适。在此基础上通过大量部分酶切得到30～42kb的基因组DNA片段，用去磷酸化酶进行去磷酸化处理。

用于构建文库的载体SuperCos l质粒先用限制性核酸内切酶Xba I从两个cos序列中间切开，然后进行去磷酸化处理，再从多克隆位点处用限制性核酸内切酶Bam HI切开，获得两个臂。处理后的载体与之前制备的部分酶切的30～42kb的基因组DNA片段连接过夜，连接体系为10μL，含有1.25μg制备的基因组DNA片段和0.5μg处理后的SuperCos 1质粒，1μL的10×Buffer，0.3U的连接酶。连接产物于65℃处理15分钟，使连接酶失活。从-80℃冰箱中取出一管包装混合物(50μL)置于冰上，将包装混合物在指间迅速融化，小心吸取一半包装混合物(25μL)至一个新的离心管中，加入10μL热处理后的连接产物，其余包装混合物于-80℃保存。小心混匀，30℃温浴90分钟，加入另外一半包装混合物(25μL)，30℃温浴继续90分钟。加入500μL噬菌体稀释缓冲液(100mmol/L NaCl，10mmol/L MgCl₂，10mmol/L pH8.3Tris-HCl)，再加入25μL氯仿，轻轻混匀，于4℃保存。

将冻存于-80℃的菌株E.coli LM392MP涂布在LB培养基上复苏。包装反应前一天，挑取单克隆接种于LB培养基中(添加0.2％麦芽糖和10mM MgSO₄)，37℃振荡培养过夜，包装反应当天，取5mL过夜培养的菌液加入到50mL新鲜的LB培养基中(添加0.2％麦芽糖和10mMMgSO₄)，37℃，200rpm振荡至培养物OD₆₀₀达到0.8-1时，4℃保存备用。取100μL如上处理的宿主菌液和100μL适度稀释的包装液轻轻混匀，于37℃温浴15分钟，然后涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。将长出来的单个克隆子，用无菌牙签点种于30块含以上所述抗生素的LB培养基的96孔板上，37℃培养过夜，加入终浓度为20％的甘油，混合均匀，置于-80℃保存。由此得到Fluostatins生产菌小单孢菌SCSION160基因组文库。

实施例3：从fluostatins生产菌小单孢菌SCSIO N160基因组文库中筛选含有fluostatins合成的生物基因的阳性克隆子

将小单孢菌SCSIO N160基因组DNA送国家人类基因组南方研究中心进行全基因组扫描和注释，根据扫描和注释的结果，通过生物信息学分析，以位于fluostatins主体基因簇中间的flsG单加氧酶基因的序列设计PCR筛选引物flsGEF和flsGER(引物序列如表2所示)，从小单孢菌SCSIO N160的基因组文库3072个克隆中筛选，获得了13个阳性克隆，后用位于主体基因簇的上、下游基因设计PCR筛选引物：flsF羧基转移酶基因引物flsFDTF和flsFDTR，flsS腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因引物flsSEF和flsSER及边界基因orf2～3-磷莽草酸-1-羧乙烯基转移酶基因引物ORF2EF/ORF2ER(引物序列如表2所示)对上述所筛阳性克隆进行复筛并结合阳性克隆酶切分析及末端测序结果，确定了其中4个cosmids在基因簇中的相对位置，而且有1个cosmid(pCSG5003)包含了整个fluostatins生物合成基因簇，其他3个cosmid(pCSG5000、pCSG5001、pCSG5002)包含部分基因簇(图1)。所述的cosmid(pCSG5003)包含的插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该片段即为fluostatins的生物合成基因簇。

实施例4：Fluostatins产生菌小单孢菌SCSIO N160遗传转移系统的建立及基因中断突变菌株的获得：

flsO2-聚酮加氧酶基因敲除突变菌株(Fls03)的获得

利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株。根据获得的fluostatins的生物合成基因簇序列，参照文献报道的PCR-targeting系统，设计一对flsO2基因的敲除引物，引物序列见于表2中的flsO2敲除引物flsO2DF和flsO2DR。然后参照PCR-targeting的方法构建体外敲除质粒，之后转入到接合转移的供体菌中。具体步骤如下：(1)将含有fluostatins的生物合成基因簇基因的cosmid质粒pCSG5003转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中获得E.coliBW25113/pIJ790/pCSG5003，用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达，并将其制备成为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773，回收其中约1.4kb含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用flsO2DTF和flsO2DTR引物通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物，50μL的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer 5μL，dNTPs 0.5mmol/L，DMSO 2.5μL，引物各0.5μmol/L，DNA模板约1ng，加水补至50μL。PCR反应条件为：预变性94℃ 5min；扩增循环为94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。(3)将回收的1.4kb的PCR产物电转入(1)步骤中制备的感受态细胞使其发生重组，涂布于LB筛选平板(含100μg/mL氨苄青霉素,50μg/mL卡那霉素,50μg/mL阿泊拉霉素)上，37℃过夜培养。从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，重组质粒命名为pCSG5006，该质粒中的flsO2基因的部分片段被转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。(4)将构建好的重组突变质粒pCSG5006转化到E.coliET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG5006，作为接合转移的供体菌。

野生型小单孢菌SCSIO N160菌株在改良高氏一号培养基(淀粉20g，K₂HPO₄0.5g，MgSO4·7H₂O 0.5g，FeSO4·7H₂O 0.01g，KNO₃1g，海盐10g，琼脂18g，加水至1L，pH 7.2)平板中划线培养10-20天，长出的孢子用无菌竹签切下1cm×2cm琼脂块碾碎于含1％海盐的1#培养基(实施例1所述)中，28℃摇床，200rpm培养1～2天后，将含菌丝体的上清液按5％～10％的比例再次转接至1％海盐的1^#培养基中继续培养2～3天后，于4000rpm，离心10min收集菌丝体，菌丝体用1％海盐的1^#培养基洗涤2次后作为接合转移的受体菌。供体菌E.ColiET12567/pUZ8002/pCSG5006在50mL含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和50μg/mL阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD₆₀₀值约为0.8时，离心收集菌体(4000rpm，10min)，用LB清洗菌体3遍，悬浮于1ml LB培养基中，作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400μL和供体菌200μL混合均匀，涂布于不含任何抗生素的ISP4固体培养基上，吹干后，于28℃培养20-24h。然后将平板取出，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为50μg/mL阿泊拉霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶，吹干后，置于28℃培养箱中，培养14-21天后观察。

当接合转移平板上长出小菌落后，用无菌牙签将其转接到含有50μg/mL阿泊拉霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶的高氏一号平板上，28℃培养10-14天后，抽取各个突变株的基因组DNA，利用flsO2的检测引物flsO2DTF和flsO2DTR(引物序列见于表2)通过PCR检测获得阳性克隆，即获得flsO2-聚酮加氧酶双交换突变菌株Fls03。

其他各个基因的灭活引物和检测引物参见表2，参照上述方法，利用PCR-targeting技术获得各个基因敲除的突变菌株。

具体如下：

敲除了orf(-1～-2)–分别编码未知功能蛋白和辅酶A转移酶III家族蛋白，所用orf(-1～-2)敲除引物为fls(-1～-2)DF和fls(-1～-2)DR，orf(-1～-2)检测引物为fls(-1～-2)DTF和fls(-1～-2)DTR，获得突变株Fls01；敲除了flsB–链延伸因子基因，所用flsB敲除引物为flsBDF和flsBDR，flsB检测引物为flsBDTF和flsBDTR，获得突变株Fls05；敲除了flsI–聚酮环化酶基因，所用flsI敲除引物为flsIDF和flsIDR，flsI检测引物为flsIDTF和flsIDTR，获得突变株Fls06；敲除了orf(1～2)–分别编码未知功能蛋白和3-磷莽草酸-1-羧乙烯基转移酶，所用orf(1～2)敲除引物为fls(1～2)DF和fls(1～2)DR，orf(1～2)检测引物为fls(1～2)DTF和fls(1～2)DTR，获得突变株Fls27。

实施例5：Fluostatins及其衍生物的生物发酵与检测

将小单孢菌SCSIO N160野生菌或突变株活化后，按5％的接种量分别接入到50mL发酵培养基N4(鱼蛋白胨4g，淀粉10g，玉米粉6g，细菌学蛋白胨2g，甘油5g，CaCO₃2g，海盐30g，加水定容至1L，pH 7.2～7.4)中，于28℃培养6-8天后，加入等体积的丁酮，超声30min破碎细胞，搅拌30min，然后静置分层。将丁酮萃取液与水相分离，用旋转蒸发仪将丁酮蒸干，残留物溶解于二甲基亚砜(DMSO)形成样品，进行高效液相色谱(HPLC)检测，检测条件为：Phenomex C184.6×150mm反相柱，流动相A相为10％乙腈(含0.1％甲酸)，流动相B相为90％乙腈；流速为1mL/min，检测波长为430nm。HPLC程序：0-20min，5％-80％B相；20-21min，80％-100％B相；21-24min，100％B相；24-25min，100％-5％B相；25-30min为5％B。

实施例6：Fluostatins的生物合成基因簇的应用-对生物合成基因的遗传修饰获得结构类似物：

通过实施例4和实施例5中所描述的方法，对fluostatins的生物合成基因簇中的部分基因进行了敲除，获得了中间体prejadomycin——化合物12(图7-8)，结果如下：

(1)野生型菌株小单孢菌SCSIO N160经发酵获得的fluostatins主产物及同系物(图2(v))；

(2)敲除了orf(-1～-2)–分别编码未知功能蛋白和辅酶A转移酶III家族蛋白，获得的突变株Fls01发酵仍然能产生fluostatins及其相关化合物(图2(i))；

(3)敲除flsO2-聚酮加氧酶基因，获得的突变株Fls03发酵仍然能产少量的fluostatins类化合物，但同时主要积累其他中间体化合物(图6A)，如prejadomycin 12(如图7-8所示)；

(4)敲除了flsB–链延伸因子基因，获得的突变株Fls05发酵不能产生fluostatins类化合物，同时也未积累其他化合物(图2(ii))；

(5)敲除了flsI–聚酮环化酶基因，获得的突变株Fls06发酵无任何fluostatins及其相关化合物积累(图2(iii))；

(6)敲除了orf(1～2)–分别编码未知功能蛋白和3-磷莽草酸-1-羧乙烯基转移酶，获得的突变株Fls27发酵仍然能产生fluostatins及其相关化合物(图2(iv))。

实施例7：聚酮加氧酶FlsO2的高效表达工程菌的构建

应用PCR方法从筛库cosmid pCSG5001的核苷酸序列中扩增获取了flsO2基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的3059-4525位碱基的反向互补序列所示)，采用高保真酶fastPFU和引物FlsO2EF：5'-GGCAGACCATATGGACACCGATGTCATCGTGGT-3'(NdeI)，FlsO2ER：5'-GACGGGATCCTCACTGCCCGGCCGGCGCCG-3'(BamHI)。PCR产物用限制性核酸内切酶NdeI和BamHI双酶切回收后，连接到用同样的酶处理的表达载体pET28a上，构建成表达质粒pCSG5102。将构建成的表达载体质粒pCSG5102转入大肠杆菌DH5a保存。再将该质粒从其所在的DH5a菌株中提出，转入大肠杆菌BL21(DE3)作为诱导蛋白表达的出发菌株。

实施例8：聚酮加氧酶FlsO2的体外活性研究

含有pCSG5102质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中于37℃培养至OD₆₀₀为0.7左右，然后加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，在16℃继续培养18-20小时诱导蛋白表达。离心收集细胞，重悬于缓冲液(50mMTris-HCl,pH 8.0)中，利用超声波破碎法释放内容物。重组FlsO2的分离纯化利用快速蛋白质液相色谱层析法完成，纯化后的蛋白，其电泳图如图6B所示。具体而言，细胞破碎后的上清液加入到1mL规格的HisTrap柱中，然后用250mM的咪唑溶液洗脱。纯化后的蛋白通过PD-10柱脱盐，于-80℃保存在酶贮存缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8.0；100mM NaCl；10％甘油)中。

100μL的FlsO2的反应液一般包括：20μM prejadomycin，2mM NADPH，5μM FlsO2，在30℃反应1.5小时。对照组的反应体系中不加FlsO2。反应液用等体积的甲醇终止后，于4℃，13500rpm离心10min，上清液利用高压液相分析，分析条件如下：Phenomex C184.6×150mm反相柱，流动相A相为10％乙腈，含0.8％TFA，流动相B相为90％乙腈；流速为1mL/min，检测波长为430nm。HPLC程序：0-20min，5％-80％B相；20-21min，80％-100％B相；21-24min，100％B相；24-25min，100％-5％B相；25-30min为5％B。结果表明，如图6A所示，FlsO2能以NAD(P)H为辅因子，催化化合物12进行C-4a,12b脱羟基反应及C-12位加羟基反应，形成化合物13，化合物13再通过自发氧化，最终形成dehydrorabelomycin，化合物14(图6C)；在缺乏NAD(P)H时，反应不能进行。

Claims (9)

1.一种芳香聚酮类非典型角环素fluostatins的生物合成基因簇，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1～40128位的碱基序列所示。

2.权利要求1所述的芳香聚酮类非典型角环素fluostatins的生物合成基因簇在制备芳香聚酮类非典型角环素fluostatins中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是在制备化合物1、3-10任一化合物中的应用

4.一种聚酮加氧酶基因flsO2，其特征在于，其核苷酸序列为如SEQ ID NO.1的第3059-4525位所示碱基序列的反向互补序列。

5.一种权利要求4所述的聚酮加氧酶基因flsO2编码的聚酮加氧酶FlsO2。

6.权利要求5所述的聚酮加氧酶FlsO2在催化式1所示的化合物prejadomycin形成式2所示的化合物CR1中的应用

7.一种缺失权利要求4所述的聚酮加氧酶基因flsO2的基因工程菌。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌为小单孢菌Micromonospora rosaria SCSIO N160，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2012392。

9.权利要求7所述的基因工程菌在制备式1所示的化合物prejadomycin中的应用