CN102911957B - 灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇及其应用。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第13530～118200位所示，包含36个基因，负责灰绿霉素大环内酯骨架合成和后修饰的基因；负责绿灰霉素环脂肽骨架合成的基因；编码γ-丁内酯类化合物合成蛋白和受体蛋白的相关基因；编码调控子蛋白和转运子的基因；编码绿灰霉素前体合成蛋白的基因；编码脱氢酶相关基因；编码灰绿霉素和绿灰霉素生物合成过程修复与绿灰霉素调节基因；其它功能尚未明确的蛋白。

Description

灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇及其应用

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一组链阳菌素（streptogramin），灰绿霉素（griseoviridin）和绿灰霉素（viridogrisein）生物合成基因簇及其应用。

背景技术：

链阳菌素类化合物是一类主要由链霉菌代谢合成的抗生素，与临床上常见的许多抗生素不同，这类型抗生素主要由两种结构上完全不同的化合物协同发挥功效，它们分别命名为类型A和类型B，其中A型抗生素是一类环状不饱和大环内酯而B型抗生素是一类六元或七元环脂肽。最早人们发现陆生灰绿链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427产生一组链阳菌素类化合物，它们分别是属于A类型的灰绿霉素，其结构式如图1所示和B类型的绿灰霉素，其结构式如图1所示，后者又叫做宜它霉素（etamycin）。单一的A型或B型抗生素仅具有一定程度的抑菌效果，但当二者联合应用后，能表现出明显的协同效应且具有广谱抗菌效果。它们的抗菌机制为：作用于细菌的50S核糖体亚基的不同位点，干扰细菌蛋白合成的延伸阶段，其中A类抗生素抑制氨酰tRNA与核糖体的结合，同时抑制肽键的形成；而B类抗生素加速肽酰tRNA的释放从而阻断了多肽链的进一步合成。当细菌翻译过程中，A类抗生素结合于核糖体大亚基后，会促进核糖体的构型变化增强B类抗生素的亲和力，因此AB两类化合物的协同作用活性能比单独作用提高100倍以上。链阳菌素类抗生素能够对抗一些极端抗药菌，越来越引起人们的重视。

药物合成化学家已经开展了对链阳菌素类抗生素的化学合成和结构修饰工作，已经完成了灰绿霉素,维及霉素M₂（virginiamycin M₂）和马杜霉素Ⅱ（madumycin Ⅱ）这一类具有挑战性的聚酮-聚肽类大环内酯化合物的化学全合成研究，但收率较低。另外通过化学修饰原霉素ⅠA和原霉素ⅡA获得的奎奴普丁（quinupristin）和达福普汀（dalfopristin），已经开发成药物，二者协同应用能够有效的抑制一些万古霉素（vancomycin）抗性菌及其他一些革兰氏阳性菌，使得链阳菌素类抗生素的研究得到不断深入而成为新药开发的一大热点。

生物合成和组合生物合成是上世纪末发展起来的重要的生物技术，近年来随着基因组学研究的快速进步，新的高通量基因测序技术的出现，λ-RED基因重组技术和高效异源表达技术的发展，组合生物合成技术获得迅速发展，给化学学科创造新化合物等方面带来新的契机。抗生素的生物合成基因通常位于染色体DNA或者巨型质粒上，主要由结构基因、调控基因和抗性基因组成，往往成簇排列，少有例外。组合生物合成是实现化合物结构多样化的重要途径，通过分析相关的生物合成基因簇，获得相应代谢途径信息，了解关键酶，底物和产物，可以较为系统的获得相关化合物的代谢信息。再通过遗传操作进行基因阻断、置换或重组，有目的地对基因簇进行改造，从而利用生物技术手段生产“非天然”的天然化合物，为新药开发提供化学实体。获得的微生物突变株可以开发成优良的工程菌，为日后的工业化生产打下坚实的基础。利用不断发展的生物合成和组合生物技术，人们对越来越多的复杂抗生素进行了结构修饰和改造，获得了一系列新结构衍生物，有些生物活性优于或跟母体化合物相当。近年来随着微生物基因组测序、生物信息学分析及信息数据库的发展，大大缩短了抗生素生物合成和组合生物合成的研究周期及成本。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇。

本发明的灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇来源于链霉素Streptomyces griseoviridisNRRL 2427，其特征在于该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第13530~118200位的碱基序列所示，包含36个基因，具体为：

(1)负责灰绿霉素大环内酯骨架合成和后修饰的基因，即sgvE1、sgvE2、sgvE3、sgvE4、sgvE5、sgvE6、sgvQ和sgvP共8个基因：

sgvE1位于基因簇核苷酸序列（SEQ ID NO.1，下同）第64158-77825个碱基处，长度为13668个碱基对，编码杂合的聚酮合酶与非核糖体肽合成酶，4555个氨基酸；

sgvE2位于基因簇核苷酸序列第77828-84568个碱基处，长度为6741个碱基对，编码杂合的聚酮合酶与非核糖体肽合成酶，2246个氨基酸；

sgvE3位于基因簇核苷酸序列第84740-91246个碱基处，长度为6507个碱基对，编码杂合的聚酮合酶与非核糖体肽合成酶，2168个氨基酸；

sgvE4位于基因簇核苷酸序列第91257-99092个碱基处，长度为7836个碱基对，编码杂合的聚酮合酶与非核糖体肽合成酶，2611个氨基酸；

sgvE5位于基因簇核苷酸序列第99089-104953个碱基处，长度为5865个碱基对，编码杂合的聚酮合酶与非核糖体肽合成酶，1954个氨基酸；

sgvE6位于基因簇核苷酸序列第105894-108320个碱基处，长度为2427个碱基对，编码非核糖体肽合成酶，808个氨基酸；

sgvQ位于基因簇核苷酸序列第104950-105900个碱基处，长度为951个碱基对，编码酰基转移酶，316个氨基酸；

sgvP位于基因簇核苷酸序列第62773-63963个碱基处，长度为1191个碱基对，编码P450家族的单氧化酶，396个氨基酸；

(2)负责绿灰霉素环脂肽骨架合成的基因，即sgvD1、sgvD2、sgvD3、sgvD4共4个基因：

sgvD1位于基因簇核苷酸序列第29782-31404个碱基处，长度为1623个碱基对，编码3-羟基吡啶甲酸AMP连接酶，540个氨基酸；

sgvD2位于基因簇核苷酸序列第19073-26989个碱基处，长度为7917个碱基对，编码非核糖体肽合成酶，2638个氨基酸；

sgvD3位于基因簇核苷酸序列第51851-56554个碱基处，长度为4704个碱基对，编码非核糖体肽合成酶，1567个氨基酸；

sgvD4位于基因簇核苷酸序列第34683-51854个碱基处，长度为17172个碱基对，编码非核糖体肽合成酶，5723个氨基酸；

(3)编码γ-butyrolactone(GBL)γ-丁内酯类化合物合成蛋白和受体蛋白的相关基因，即sgvA、sgvB、sgvC、sgvK共4个基因：

sgvA位于基因簇核苷酸序列第115710-116678个碱基处，长度为969个碱基对，编码AfsA类γ-丁内酯生物合成蛋白，322个氨基酸；

sgvB位于基因簇核苷酸序列第116703-117386个碱基处，长度为684个碱基对，编码γ-丁内酯受体蛋白，227个氨基酸；

sgvC位于基因簇核苷酸序列第117511-118200个碱基处，长度为690个碱基对，编码磷酸酶，229个氨基酸；

sgvK位于基因簇核苷酸序列第114756-115520个碱基处，长度为765个碱基对，编码酮体还原酶，254个氨基酸。

(4)编码调控子蛋白和转运子的基因，即sgvR1、sgvR2、sgvR3、sgvT1、sgvT2、sgvT3共6个基因：

sgvR1位于基因簇核苷酸序列第113627-114274个碱基处，长度为648个碱基对，编码TetR家族的转录调控蛋白，215个氨基酸；

sgvR2位于基因簇核苷酸序列第112395-113237个碱基处，长度为843个碱基对，编码SARP家族的转录调控蛋白，280个氨基酸；

sgvR3位于基因簇核苷酸序列第13530-14696个碱基处，长度为1167个碱基对，编码SARP家族的转录调控蛋白，388个氨基酸；

sgvT1位于基因簇核苷酸序列第14816-16408个碱基处，长度为1593个碱基对，编码主要协助转运蛋白，530个氨基酸；

sgvT2位于基因簇核苷酸序列第60959-62614个碱基处，长度为1656个碱基对，编码ABC家族转运蛋白，551个氨基酸；

sgvT3位于基因簇核苷酸序列第108570-109964个碱基处，长度为1395个碱基对，编码EmrB/QacA亚家族药物抗性转运蛋白，464个氨基酸；

(5)编码绿灰霉素前体合成蛋白的基因，包括sgvG、sgvM、sgvL、sgvN4个基因：

sgvG位于基因簇核苷酸序列第16726-17847个碱基处，长度为1122个碱基对，编码支链氨基酸氨基转移酶，373个氨基酸；

sgvM位于基因簇核苷酸序列第17916-18935个碱基处，长度为1020个碱基对，编码甲基转移酶，339个氨基酸；

sgvL位于基因簇核苷酸序列第31408-32709个碱基处，长度为1302个碱基对，编码L-赖氨酸2-氨基转移酶，433个氨基酸；

sgvN位于基因簇核苷酸序列第33036-34343个碱基处，长度为1308个碱基对，编码苯乙酰辅酶A双氧化酶，435个氨基酸；

(6)编码脱氢酶相关基因，包括sgvH1、sgvH2、sgvH3共3个基因：

sgvH1位于基因簇核苷酸序列第57108-58265个碱基处，长度为1158个碱基对，编码支链α酮酸脱氢酶E1α亚基，385个氨基酸；

sgvH2位于基因簇核苷酸序列第58262-59317个碱基处，长度为1056个碱基对，编码支链α酮酸脱氢酶E1β亚基，351个氨基酸；

sgvH3位于基因簇核苷酸序列第59323-60720个碱基处，长度为1398个碱基对，编码支链α酮酸脱氢酶E2，465个氨基酸；

(7)编码灰绿霉素和绿灰霉素生物合成过程修复与绿灰霉素调节基因，sgvI和sgvJ共2个基因：

sgvI位于基因簇核苷酸序列第27311-28057个碱基处，长度为747个碱基对，编码II型硫酯酶，248个氨基酸；

sgvJ位于基因簇核苷酸序列第34358-34609个碱基处，长度为252个碱基对，编码含MbtH结构域的蛋白，83个氨基酸；

(8)其它功能尚未明确的蛋白，sgvF、sgvU、sgvO、sgvY、sgvS等5个基因：

sgvF位于基因簇核苷酸序列第28052-29134个碱基处，长度为1083个碱基对，编码含FAD（黄素）依赖的氧化还原酶，360个氨基酸；

sgvU位于基因簇核苷酸序列第29368-29613个碱基处，长度为246个碱基对，编码未知功能蛋白，81个氨基酸；

sgvO位于基因簇核苷酸序列第32763-32951个碱基处，长度为189个碱基对，编码4-草酰巴豆酯互变异构酶，62个氨基酸；

sgvY位于基因簇核苷酸序列第109996-110889个碱基处，长度为894个碱基对，链阳菌素B裂合酶，297个氨基酸；

sgvS位于基因簇核苷酸序列第111137-112285个碱基处，长度为1149个碱基对，编码肌氨酸氧化酶，382个氨基酸。

(9)灰绿霉素和绿灰霉素生物合成基因簇的上下游基因，即orf(-10)至orf(-1)和orf(+1)orf(+4)共14个基因：

orf(-10)位于基因簇核苷酸序列第1-669个碱基处，长度为669个碱基对，编码TetR家族的转录调控蛋白，222个氨基酸；

orf(-9)位于基因簇核苷酸序列第800-1558个碱基处，长度为759个碱基对，编码短链脱氢酶，252个氨基酸；

orf(-8)位于基因簇核苷酸序列第3674-5158个碱基处，长度为1485个碱基对，编码内-1,4-β-木聚糖酶，494个氨基酸；

orf(-7)位于基因簇核苷酸序列第5768-6094个碱基处，长度为327个碱基对，编码转座酶，108个氨基酸；

orf(-6)位于基因簇核苷酸序列第6130-6621个碱基处，长度为492个碱基对，编码HxlR家族转录调控蛋白，163个氨基酸；

orf(-5)位于基因簇核苷酸序列第6722-7213个碱基处，长度为492个碱基对，编码未知蛋白，163个氨基酸；

orf(-4)位于基因簇核苷酸序列第8067-8699个碱基处，长度为633个碱基对，编码TetR家族转录调控蛋白，210个氨基酸；

orf(-3)位于基因簇核苷酸序列第8820-10439个碱基处，长度为1620个碱基对，编码ABC家族的转运蛋白，539个氨基酸；

orf(-2)位于基因簇核苷酸序列第10516-11322碱基处，长度为807个碱基对，编码植烷辅酶A双氧化酶，268个氨基酸；

orf(-1)位于基因簇核苷酸序列第11746-13152个碱基处，长度为1407个碱基对，编码HflX家族GTP结合蛋白，468个氨基酸；

orf(+1)位于基因簇核苷酸序列第118937-119581个碱基处，长度为645个碱基对，编码LuxR家族的双组分系统转录调控蛋白，编码214个氨基酸；

orf(+2)位于基因簇核苷酸序列第119572-121527个碱基处，长度为1956个碱基对，编码膜内信号传导组氨酸激酶，编码651个氨基酸；

orf(+3)位于基因簇核苷酸序列第121673-122668个碱基处，长度为996个碱基对，编码BN家族的核糖核酸酶，编码331个氨基酸；

of(+4)位于基因簇核苷酸序列第122820-123563个碱基处，长度为744个碱基对，编码2，3-双羟苯甲酸AMP连接酶，编码247个氨基酸。

SEQ ID NO.1（序列表）所示序列的第13530~118200位的碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。且第13530~118200位的的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或DNA体外合成技术或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO.1所示序列的第13530~118200位中DNA序列的重组DNA载体的途径。

本发明还提供了产生灰绿霉素和绿灰霉素生物合成基因被中断或其他基因改造的途径，至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO.1所示序列的第13530~118200位中的核苷酸序列。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明SEQ ID NO.1所示序列的第13530~118200位的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有Streptomyces griseoviridis NRRL 2427基因组中邻近区域未克隆的DNA。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被体内体外修饰或进行突变，包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性物质或产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、小单孢菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并了解它们在宿主代谢中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组载体以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得其他新型生物合成途径或者产生新的化合物。

包含DNA片段或基因可以用来提高灰绿霉素和绿灰霉素或其衍生物的产量，本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。

本发明还提供了灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇在制备灰绿霉素或/和绿灰霉素及其类似物中的应用。

总之，本发明所提供的包含灰绿霉素和绿灰霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息，可以帮助人们理解厦霉素家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

本发明的灰绿链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427属于现有技术中的已知菌株，在美国专利（U.S3,023,204）公开过，该菌株保藏于美国农业研究菌种保藏中心（AgriculturalResearch Service Culture Collection，NRRL），保藏号为：NRRL 2427。

附图说明：

图1是灰绿霉素（GV）和绿灰霉素（VG）的化学结构式。

图2是Streptomyces griseoviridis NRRL 2427中灰绿霉素和绿灰霉素生物合成基因簇：Regulation/repari调控和修复基因；Resistance抗性基因；Gamma-butyrolactone biosynthesis γ-丁内酯类化合物生物合成基因；VG biosynthesis NRPS绿灰霉素生物合成中非核糖体肽合成酶；GV biosynthesis Hybird PKS/NRPS灰绿霉素生物合成中的杂合的聚酮合酶和非核糖体肽合成酶；VG biosynthesis precursor biosynthesis绿灰霉素生物合成前体单元生物合成基因；GVbiosynthesis tailor enzyme灰绿霉素环内C-S键催化酶；Boundary边界基因；Unknown未知功能基因。

图3是灰绿霉素推测的生物合成途径。

图4是绿灰霉素推测的生物合成途径。

图5是Streptomyces griseoviridis NRRL 2427内γ-丁内酯类化合物推测的生物合成途径。

图6是部分基因遗传改造后链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427中灰绿霉素和绿灰霉素生物合成基因簇得到的突变株在发酵培养基中发酵的发酵产物的HPLC分析图：I野生型Streptomyces griseoviridis NRRL 2427；II突变株△sgvD1；III突变株△sgvL；IV突变株△sgvN；V突变株△sgvJ；VI突变株△sgvI；VII突变株△sgvE5；VIII突变株△sgvQ；IX突变株△sgvE6；X突变株△sgvY。◆表示灰绿霉素，▲表示绿灰霉素。

图7是灰绿霉素和绿灰霉素生物合成调控相关的基因遗传改造后得到的突变株，及sgvA基因失活突变株和回补菌株在发酵培养基中发酵的发酵产物的HPLC分析图：I野生型Streptomyces griseoviridis NRRL 2427；II突变株△sgvA；III突变株△sgvA遗传回补菌株△sgvA-C；IV突变株△sgvB；V突变株△sgvC；VI突变株△sgvK；VII突变株△sgvR1；VIII突变株sgvR2；IX突变株△sgvR3。◆表示灰绿霉素，▲表示绿灰霉素。

图8是sgvN基因遗传得到的突变株发酵培养基中发酵及喂养后的HPLC分析图：I突变株△sgvN；II突变株△sgvN喂养了L-Phg；III突变株△sgvN喂养了D-Phg；IV突变株△sgvD1喂养了L-Phg；V突变株△sgvD1喂养了D-Phg；VI野生型Streptomyces griseoviridis NRRL2427。◆表示灰绿霉素，▲表示绿灰霉素。

图9是链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427野生菌或突变株RNA抽提及RT-PCR分析。Wild type野生型Streptomyces griseoviridis NRRL 2427。◆表示灰绿霉素，▲表示绿灰霉素。

图10是灰绿霉素和绿灰霉素生物合成合成基因簇边界基因的确定：I野生型Streptomycesgriseoviridis NRRL 2427；II突变株△orf(-10)；III突变株△orf(-9)；IV突变株△orf(-8)；V突变株△orf(-6)；VI突变株△orf(-5)；VII突变株△orf(-4)；VIII突变株△orf(-3)；IX突变株△orf(-2)；X突变株△orf(+1)；XI突变株△orrf(+2)；XII突变株△orf(+3)；XIII突变株△orf(+4)。◆表示灰绿霉素，▲表示绿灰霉素。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

1.链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427基因组序列扫描及灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇序列分析和功能分析：

通过对链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427进行全基因组扫描和注释，在其中找到了105kb的灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇，包含了36个开放阅读框(open readingframes,ORFs)（表1）。根据生物信息学分析，其中sgvE1、sgvE2、sgvE3、sgvE4、sgvE5、sgvE6、sgvQ和sgvP共8个基因可能参与灰绿霉素合成，灰绿霉素的生物合成途径初步确定如下（图3）。sgvD1、sgvD2、sgvD3、sgvD4共4个基因负责绿灰霉素的生物合成，其合成途径初步确定如下（图4）。sgvA、sgvB、sgvC、sgvK共4个基因负责编码调控灰绿霉素和绿灰霉素生产的γ-丁内酯类化合物的合成基因，其相关合成途径确定如下（图5）。sgvR1、sgvR2、sgvR3、sgvT1、sgvT2、sgvT3这六个基因负责编码灰绿霉素和绿灰霉素的生产调控基因和相关的转运蛋白。sgvG、sgvM、sgvL、sgvN共4个基因负责绿灰霉素骨架的前体单元的合成基因的编码。此外还有一系列催化酶的编码基因，包括三个脱氢酶的编码基因sgvH1、sgvH2、sgvH3，和五个其它蛋白编码基因sgvF、sgvU、sgvO、sgvY、sgvS。另外还发现了负责调节绿灰霉素生产的sgvJ和编码对灰绿霉素和绿灰霉素生物合成中进行修复调节蛋白的基因sgvI。

表1：灰绿霉素和绿灰霉素生物合成基因簇的基因及其功能分析

a氨基酸数目；b括号中包含了同源蛋白的GeneBank登录号；c一致性/相似性（identity/similarity）。

2.灰绿霉素和绿灰霉素霉素的生物合成基因簇的边界的确定：

根据基因组序列注释和生物信息学分析，设计了5对PCR筛选引物（表4），从链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427的基因组文库2400个克隆中筛选，获得了16个阳性克隆。

生物信息学分析表明，orf(-10)至orf(-1)，orf(+1)至orf(+4)编码的基因与灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成无关（表1）。通过建立链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427的遗传操作体系，构建了orf(-10)至orf(-2)这个9个基因的灭活突变株，同时也构建了orf(+1)至orf(+4)等4个基因的灭活突变株，通过对突变菌株进行发酵和代谢产物的HPLC分析鉴定，我们发现相关的13个突变菌株灰绿霉素和绿灰霉素的生产与链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL2427野生型对照菌株一致，可见这相关的13个基因不是灰绿霉素和绿灰霉素生物合成的相关基因（图10）。此外对orf(-1)基因进行系统的生物信息分析发现该基因编码的是HflX家族GTP结合蛋白不是一个组合生物合成催化酶，同时也非相关的调控蛋白，与灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成无关，因此灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇的边界定位于orf(-1)与orf(+1)之间，该灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的第13530~118200位的碱基序列所示。

3.灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇中各基因的功能分析

在分析了完整的灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇，研究了各基因编码蛋白可能的功能的基础上，本发明对灰绿霉素和绿灰霉素霉素的生物合成机制进行了探讨，采用PCR-targeting技术针对16个生物合成基因，进行了灭活突变（检测引物参见表2，灭活引物参见表3），获得了相关突变株。

表2：构建突变株所需的检测引物名称和序列

表3：构建突变株所需的灭活引物名称和序列

我们通过对突变株进行发酵和代谢产物的分析鉴定，阐明了部分生物合成基因的功能，为进一步通过对生物合成基因簇进行遗传修饰获得灰绿霉素和绿灰霉素活性类似物提供了可能：

（1）敲除了sgvD1-3-羟基吡啶甲酸基因，获得的突变株△sgvD1发酵仍然能产生化合物灰绿霉素和但是已经不能生产绿灰霉素；（2）敲除了sgvL-L-赖氨酸2-氨基转移酶基因，获得的突变株△sgvL发酵仍然能产生化合物灰绿霉素和绿灰霉素；（3）敲除了sgvN-苯乙酰辅酶A双氧化酶基因，获得的突变株△sgvN发酵仍然能产生化合物灰绿霉素，但不能够生产绿灰霉素；（4）敲除了sgvJ-MbtH结构域含有蛋白基因，获得的突变株△sgvJ发酵仍然能产生化合物灰绿霉素，但不能够生产绿灰霉素；（5）敲除了sgvI-II型硫酯酶基因，获得的突变株△sgvI发酵仍然能产生了化合物灰绿霉素和绿灰霉素，但二者产量大幅度降低；（6）敲除了sgvE5-杂合的聚酮合酶与非核糖体肽合成酶基因，获得的突变株△sgvE5发酵仍然能产生化合物绿灰霉素，但不能生产灰绿霉素；（7）敲除了sgvQ-酰基转移酶基因，获得的突变株△sgvQ仍然能产生绿灰霉素，但不能生产灰绿霉素；（8）敲除了sgvE6-杂合的聚酮合酶与非核糖体肽合成酶基因，获得的突变株△sgvE6失去了产生灰绿霉素的能力，但然而可以继续生产绿灰霉素；（9）敲除了sgvY-链阳菌素B裂合酶基因，获得的突变株△sgvY发酵仍然能产生化合物灰绿霉素和绿灰霉素；（10）敲除了sgvA-AfsA类γ-丁内酯生物合成蛋白基因，获得的突变株△sgvA失去了产生灰绿霉素和绿灰霉素的能力；（11）敲除了sgvB-丁内酯受体蛋白基因，获得的突变株△sgvB发酵能产生化合物灰绿霉素和绿灰霉素且产量提高；（12）敲除了sgvC-磷酸酶基因，获得的突变株△sgvC失去了产生灰绿霉素和绿灰霉素的能力；（13）敲除了sgvK-酮体还原酶基因，获得的突变株△sgvK发酵能产生化合物灰绿霉素和绿灰霉素，但是产量降低；（14）敲除了sgvR1-TetR家族转录调控蛋白基因，获得的突变株△sgvR1发酵仍然能产生化合物灰绿霉素和绿灰霉素，且产量提高明显；（15）敲除了sgvR2-SARP家族转录调控蛋白基因，获得的突变株△sgvR2失去了产生灰绿霉素和绿灰霉素的能力；（16）敲除了sgvR3-聚异戊二烯合成酶基因，获得的突变株△sgvR3失去了产生灰绿霉素和绿灰霉素的能力（图6，图7）。

为了进一步确定以下基因在灰绿霉素和绿灰霉素生物合成途径中的功能，分别针对sgvA基因的突变株△sgvA进行回补实验和sgvN基因的突变株△sgvN进行对应底物的喂养实验。针对sgvA负责合成的γ-丁内酯类化合物对灰绿霉素和绿灰霉素调控基因和结构基因的影响以及sgvR1,sgvR2,sgvR3三个调控基因对灰绿霉素和绿灰霉素生物合成相关基因的表达影响进行了以转录PCR分析，具体结果如下：

（1）敲除了sgvA-AfsA类γ-丁内酯生物合成蛋白基因，获得的突变株△sgvA失去了产生灰绿霉素和绿灰霉素的能力。针对这个突变菌株，通过遗传操作导入克隆有sgvA基因的外源质粒，通过基因重组可以整合在菌株的基因组DNA上，并利用自身携带的强启动子表达相关蛋白，通过对相关回补菌株△sgvA-C的发酵分析，发现它能够恢复生产灰绿霉素和绿灰霉素的能力(图7)。

（2）敲除了sgvN-苯乙酰辅酶A双氧化酶基因，获得的突变株△sgvN发酵仍然能产生化合物灰绿霉素，但不能够生产绿灰霉素。通过对这个基因生物信息学分析发现它负责绿灰霉素结构中的苯基甘氨酸（Phg）生物合成。通过在突变株△sgvN发酵中分别添加0.3mg的D/L型Phg，发酵检测中均能发现绿灰霉素，因此可以确定sgvN的确是负责Phg的生物合成，且发现链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427及其相关突变菌株都能利用D/L型，两种构型的Phg（图8）。

（3）敲除了sgvA-AfsA类γ-丁内酯生物合成蛋白基因，获得的突变株△sgvA失去了产生灰绿霉素和绿灰霉素的能力；敲除了sgvB-γ-丁内酯受体蛋白基因，获得的突变株△sgvB发酵能产生化合物灰绿霉素和绿灰霉素且产量提高；敲除了sgvR1-TetR家族转录调控蛋白基因，获得的突变株△sgvR1发酵仍然能产生化合物灰绿霉素和绿灰霉素，且产量提高明显；敲除了sgvR2-SARP家族转录调控蛋白基因，获得的突变株△sgvR2失去了产生灰绿霉素和绿灰霉素的能力；敲除了sgvR3-聚异戊二烯合成酶基因，获得的突变株△sgvR3失去了产生灰绿霉素和绿灰霉素的能力。通过对这些相关的突变菌株进行培养并抽提相关的RNA进行逆转录PCR（RT-PCR）分析，并选取以上5个基因和sgvD1,sgvD4,sgvE2,sgvQ和转运蛋白sgvT2的表达情况作为参照。电泳分析发现突变株△sgvA中除了sgvB和sgvR1外其余均不表达，这与突变株本身不能够合成灰绿霉素和绿灰霉素的表型一致；突变株△sgvB中，除sgvB基因外其余均正常表达；而突变株△sgvR1中除sgvR1基因外其余均正常表达；而对于突变株△sgvR2和突变株△sgvR3，除本身基因因为失活不表达外，二者负责灰绿霉素合成的sgvD1和sgvD4以及负责绿灰霉素生物合成的sgvE2和sgvQ这四个基因均不表达，而其余基因表达正常，与它们不能够合成灰绿霉素和绿灰霉素的表型一致。通过生物信息学和基因的失活及RT-PCR分析，我们发现由sgvA，sgvC及sgvK这些γ-丁内酯类化合物合成基因和相关的受体基因sgvB负责合成相关γ-丁内酯类活性物质并与受体一起控制着灰绿霉素和绿灰霉素生物合成的起始，而sgvR1是灰绿霉素和绿灰霉素生物合成中的负调控基因同时sgvR2和sgvR3则是灰绿霉素和绿灰霉素生物合成中的正调控基因（图9）。

以下进一步提供实施例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明的应用范围。

实施例1

灰绿霉素和绿灰霉素素产生菌链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427基因组DNA的提取：

将新鲜链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427的孢子按照5％的接种量接种于50mL的TSB培养基（胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，加水至1L，pH 7.2-7.4）中，28-30℃，振荡培养约2天，4000rpm离心10分钟收集菌丝体。菌丝体用STE溶液(NaCl 75mM，EDTA 25mM，Tris-Cl 20mM)洗涤两次，向洗涤后的菌丝体中加入30mL STE溶液和终浓度3mg/mL的溶菌酶，涡旋均匀，37℃温浴3小时，加入至终浓度0.1-0.2mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃温浴10分钟，加入至终浓度1-2％的SDS，混匀，放入55℃水浴约1小时，期间颠倒数次。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（V/V/V=25:24:1），混合均匀，置于冰上冷却30分钟。12000rpm，4℃离心10分钟，然后用剪过的大口径枪头小心吸取上清到新的离心管中，用同样的方法反复处理3次，然后用等体积的氯仿洗涤两次，12000rpm，4℃离心10分钟。用剪过的大口径枪头将水相吸出转移至新的离心管，加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，混匀后再加入等体积的异丙醇，混匀后冰上放置，沉淀DNA。小心地用玻璃棒将DNA纤维团转移至新的离心管中，用70％乙醇洗涤两次，将液体倾出，在37℃下略微烘干，加5mL TE溶解，并加入3-5U的RNA酶，由此得到链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427基因组DNA。

实施例2

灰绿霉素与绿灰霉素生产菌链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427基因组文库的建立：

首先通过一系列的稀释实验来确定限制性核酸内切酶Sau3A I的用量，在20μL体系中，含有17μL的链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427基因组DNA，2μL的10×反应缓冲液和1μL不同稀释度的Sau3A I，其终止反应为4μL0.5mol/L EDTA和合适的上样缓冲液。通过摸索确定了0.025-0.05U的酶活单位比较合适。在此基础上通过大量部分酶切得到略大于40kb的基因组DNA片段，用去磷酸化酶进行去磷酸化处理。

用于构建文库的载体SuperCos l质粒先用限制性核酸内切酶Xba I从两个cos序列中间切开，然后进行去磷酸化处理，再从多克隆位点处用限制性核酸内切酶Bam HI切开，获得两个臂。处理后的载体与之前制备的部分酶切的约40kb的基因组DNA片段连接过夜，连接体系为10μL，含有1.25μg制备的基因组DNA片段和0.5μg处理后的SuperCos 1质粒，1μL的10×Buffer，0.3U的连接酶。连接产物于65℃处理15分钟，使连接酶失活。从-80℃冰箱中取出一管包装混合物(50μL)置于冰上，将包装混合物在指间迅速融化，小心吸取一半包装混合物(25μL)至一个新的离心管中，加入10μL热处理后的连接产物，其余包装混合物于-80℃保存。小心混匀，30℃温浴90分钟，加入另外一半包装混合物(25μL)，30℃温浴继续90分钟。加入500μL噬菌体稀释缓冲液（100mmol/L NaCl,10mmol/L MgCl₂,10mmol/L pH 8.3Tris-HCl），再加入25μL氯仿，轻轻混匀，于4℃保存。

将冻存于-80℃的菌株E.coli LM392布在LB培养基上复苏。包装反应前一天，挑取单克隆接种于LB培养基中（添加0.2％麦芽糖和10mM MgSO₄)，37℃振荡培养过夜，包装反应当天，取5mL过夜培养的菌液加入到50mL新鲜的LB培养基中（添加0.2％麦芽糖和10mMMgSO₄)，37℃，200rpm振荡至培养物OD₆₀₀达到0.8-1时，4℃保存备用。取100μL如上处理的宿主菌液和100μL适度稀释的包装液轻轻混匀，于37℃温浴15分钟，然后涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。将长出来的单个克隆子，用无菌牙签点种于25块含以上上述抗生素的LB培养基的96孔板上，37℃培养过夜，加入终浓度为20％的甘油，混合均匀，置于-80℃保存。

实施例3

从灰绿霉素和绿灰霉素生产菌链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427基因组文库中筛选含有灰绿霉素和绿灰霉素合成的生物基因的阳性克隆子：

将链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427基因组DNA送韩国Macrogen公司进行全基因组扫描和注释，根据扫描和注释的结果，通过生物信息学分析，初步确定灰绿霉素和绿灰霉素生物合成基因簇的具体位置，并设计了5对筛选引物（表4），通过PCR对2400个克隆子进行筛选，获得16个阳性克隆，确定包含灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇的阳性克隆，并进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的第13530~118200位的碱基序列所示。

表4：文库筛选引物

实施例4

灰绿霉素和绿灰霉素产生菌链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427遗传转移系统的建立及基因中断突变菌株的获得，以敲除sgvD1-3-羟基吡啶甲酸基因而获得的突变菌株△sgvD1的获得为例：

利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株。根据获得的灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇序列，参照文献报道的PCR-targeting系统，设计一对sgvD1基因的敲除引物，引物序列见于表3中的sgvD1敲除引物。然后参照PCR-targeting的方法构建体外敲除质粒然后转入到接合转移的供体菌中。具体步骤如下：(1)将含有灰绿霉素和绿灰霉素霉素的生物合成基因簇的cosmid质粒转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中获得含有目的质粒的E.coliBW25113/pIJ790菌株，用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达，并将其制备成为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773，回收其中约1.4kb含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用sgvD1delF和sgvD1delR引物通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物，50μL的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer 5μL，dNTPs 0.5mmol/L，DMSO 2.5μL，引物各0.5μmol/L，DNA模板约1ng，加水补至50μL。PCR反应条件为：预变性94℃5min；扩增循环为94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。（3）将PCR产物电转入（1）步骤中制备的感受态细胞使其发生重组，涂布于LB筛选平板(含100μg/mL氨苄青霉素,50μg/mL卡那霉素,50μg/mL阿泊拉霉素)上，37℃过夜培养。从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，重组质粒命名为delsgvD1，该质粒中的sgvD1基因的部分片段被转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。(4)将构建好的重组突变质粒delsgvD1转化到E.coli ET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/delsgvD1，作为接合转移的供体菌。

野生型链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427菌株在ISP2培养基（麦芽提取物4g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，加水至1L，pH 7.2）平板中划线培养3-5天，长出的孢子用无菌棉签收集于的TSB培养基中，涡旋振荡，使孢子分散。过滤分离菌丝体和孢子，孢子悬浮于5mL的TSB培养基中，50℃热激10min，然后于28℃萌发2-4小时，作为接合转移的受体菌。供体菌E.coli ET12567/pUZ8002/delsgvD1在50mL含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和50μg/mL阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD₆₀₀值约为0.8时，离心收集菌体（4000rpm，10min），用LB清洗菌体3遍，悬浮于300μL LB培养基中，作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400μL和供体菌100μL混合均匀，涂布于不含任何抗生素的M-ISP4固体培养基（可溶性淀粉10g，酵母提取物0.5g，蛋白胨1g，NaCl1g，MgSO₄·7H₂O1g，(NH₄)₂SO₄2g，K₂HPO₄1g，CaCO₃2g，微量元素适量，加水至1L，pH 7.2）上，吹干后，于28℃培养18-20h。然后将平板取出，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为35μg/mL阿泊拉霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶，吹干后，置于28℃培养箱中，培养3-4天后观察。

当接合转移平板上长出小菌落后，用无菌牙签将其转接到含有35μg/mL阿泊拉霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶的M-ISP4平板上，28℃培养2-3天后，抽取各个突变株的基因组DNA，利用检测引物（引物序列见于表2中的sgvD1的检测引物序列）通过PCR检测获得阳性克隆，即获得sgvD1-3-羟基吡啶甲酸基因敲除双交换突变菌株（△sgvD1）。

其他各个基因的灭活引物和检测引物参见表3和表2，参照上述方法，利用PCR-targeting技术获得各个基因敲除的突变菌株。

具体如下：

（1）敲除了sgvD1-3-羟基吡啶甲酸基因，获得的突变株△sgvD1发酵仍然能产生化合物灰绿霉素和但是已经不能生产绿灰霉素；（2）敲除了sgvL-L-赖氨酸2-氨基转移酶基因，获得的突变株△sgvL发酵仍然能产生化合物灰绿霉素和绿灰霉素；（3）敲除了sgvN-苯乙酰辅酶A双氧化酶基因，获得的突变株△sgvN发酵仍然能产生化合物灰绿霉素，但不能够生产绿灰霉素；（4）敲除了sgvJ-MbtH结构域含有蛋白基因，获得的突变株△sgvJ发酵仍然能产生化合物灰绿霉素，但不能够生产绿灰霉素；（5）敲除了sgvI-II型硫酯酶基因，获得的突变株△sgvI发酵仍然能产生了化合物灰绿霉素和绿灰霉素，但二者产量大幅度降低；（6）敲除了sgvE5-杂合的聚酮合酶与非核糖体肽合成酶基因，获得的突变株△sgvE5发酵仍然能产生化合物绿灰霉素，但不能生产灰绿霉素；（7）敲除了sgvQ-酰基转移酶基因，获得的突变株△sgvQ仍然能产生绿灰霉素，但不能生产灰绿霉素；（8）敲除了sgvE6-杂合的聚酮合酶与非核糖体肽合成酶基因，获得的突变株△sgvE6失去了产生灰绿霉素的能力，但然而可以继续生产绿灰霉素；（9）敲除了sgvY-链阳菌素B裂合酶基因，获得的突变株△sgvY发酵仍然能产生化合物灰绿霉素和绿灰霉素；（10）敲除了sgvA-AfsA类γ-丁内酯生物合成蛋白基因，获得的突变株△sgvA失去了产生灰绿霉素和绿灰霉素的能力；（11）敲除了sgvB-丁内酯受体蛋白基因，获得的突变株△sgvB发酵能产生化合物灰绿霉素和绿灰霉素且产量提高；（12）敲除了sgvC-磷酸酶基因，获得的突变株△sgvC失去了产生灰绿霉素和绿灰霉素的能力；（13）敲除了sgvK-酮体还原酶基因，获得的突变株△sgvK发酵能产生化合物灰绿霉素和绿灰霉素，但是产量降低；（14）敲除了sgvR1-TetR家族转录调控蛋白基因，获得的突变株△sgvR1发酵仍然能产生化合物灰绿霉素和绿灰霉素，且产量提高明显；（15）敲除了sgvR2-SARP家族转录调控蛋白基因，获得的突变株△sgvR2失去了产生灰绿霉素和绿灰霉素的能力；（16）敲除了sgvR3-聚异戊二烯合成酶基因，获得的突变株△sgvR3失去了产生灰绿霉素和绿灰霉素的能力（图6，图7）。

实施例5

灰绿霉素及绿灰霉素的生物发酵与检测：

将链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427野生菌或突变株活化后，按5％的接种量分别接入到250mL三角瓶的50mL发酵培养基（可溶性淀粉10g，玉米粉3g，酵母抽提物5g，细菌学蛋白胨2g，NaCl 5g，MgSO₄·7H₂O 1g，(NH₄)₂SO₄2g，K₂HPO₄1g，CaCO₃2g，加水至1L，pH 7.0）中，于28℃培养6天后，加入等体积的乙酸乙酯，超声30min破碎细胞，然后静置分层。将乙酸乙酯萃取液与水相分离，用旋转蒸发仪将乙酸乙酯蒸干，残留物溶解于甲醇形成样品，进行HPLC检测，检测条件为：Phenomex C184.6×150mm反相柱，流动相A相为15％乙腈，含0.1％乙酸，流动相B相为85％乙腈，含0.1％乙酸；流速为1mL/min，检测波长为215nm和306nm。HPLC程序：0-20min，0％-80％B相；20-21min，100％B相；21-25min，100％-0％B相，25-30min为0％B。

实施例6

突变株△sgvN发酵中D/L-Phg的喂养：

将突变株△sgvN活化后，按5％的接种量分别接入到250mL三角瓶的50mL发酵培养基，待发酵约1d后，分别往发酵液中加入0.3mg的D-Phg和L-Phg，这0.3mg的样品均是溶解在6ml浓度为1N的NaOH并用约4ml浓度为1N的HCl中和过多的NaOH。于28℃继续培4天后，发酵物加入等体积的乙酸乙酯，超声30min破碎细胞，然后静置分层。将乙酸乙酯萃取液与水相分离，用旋转蒸发仪将乙酸乙酯蒸干，残留物溶解于甲醇形成样品，进行高效液相色谱（HPLC）检测，检测条件同实施例5。

实施例7

突变株△sgvA失活基因sgvA回补，具体步骤如下：

（1）设计了一对引物sgvA-F:5′-CAT ATG GTG ATG TCG GGG GCC CCG TAC AGC-3′，sgvA-R:5′-TCT AGA GGA TCC TCA CAG GGG CAC CGG GGC-3′扩增sgvA基因，50μL的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer 5μL，dNTPs 0.5mmol/L，DMSO 2.5μL，引物各0.5μmol/L，DNA模板约1ng，加水补至50μL。PCR反应条件为：预变性94℃5min；扩增循环为94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将扩增的长度约969bp的sgvA基因片段回收后连接与pCR2.1载体连接并导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性克隆子后抽提相关质粒并测序。

（2）选择测序正确的质粒用内切酶Nde I和Xba I酶切并与相同酶切处理过的pSET152AKE质粒载体连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得正确的阳性克隆子。并抽提相关正确的克隆质粒pSET152AKE-sgvA。

（3）将质粒pSET152AKE-sgvA转化到E.coli ET12567/pUZ8002中，构建成E.coliET12567/pUZ8002/pSET152AKE-sgvA，作为接合转移的供体菌。

（4）突变菌株△sgvA在ISP2培养基（麦芽提取物4g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，加水至1L，pH 7.2）平板中划线培养3-5天，长出的孢子用无菌棉签收集于的TSB培养基中，涡旋振荡，使孢子分散。过滤分离菌丝体和孢子，孢子悬浮于5mL的TSB培养基中，50℃热激10min，然后于28℃萌发2-4小时，作为接合转移的受体菌。供体菌E.coliET12567/pUZ8002/pSET152AKE-sgvA在50mL含50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中于37℃生长至OD₆₀₀值约为0.8时，离心收集菌体（4000rpm，10min），用LB清洗菌体3遍，悬浮于300μL LB培养基中，作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400μL和供体菌100μL混合均匀，涂布于不含任何抗生素的M-ISP4固体培养基（可溶性淀粉10g，酵母提取物0.5g，蛋白胨1g，NaCl1g，MgSO₄·7H₂O 1g，(NH₄)₂SO₄2g，K₂HPO₄1g，CaCO₃2g，微量元素适量，加水至1L，pH 7.2）上，吹干后，于28℃培养18-20h。然后将平板取出，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为50μg/mL卡那霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶，吹干后，置于28℃培养箱中，培养2-3天后观察。

当接合转移平板上长出小菌落后，用无菌牙签将其转接到含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶的M-ISP4平板上，28℃培养2-3天后，抽取各个突变株的基因组DNA，利用sgvA-F和sgvA-R引物配对进行PCR验证，并获得正确的回补菌株△sgvA-C。并且通过发酵和HPLC分析发现灰绿霉素和绿灰霉素的生产得以恢复（图7）。

实施例8

链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427野生菌或突变株RNA抽提及RT-PCR分析：

将链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427野生菌或突变株接种于TSB液体培养基，经过36h培养后，收集菌体并用液氮碾磨。随后的操作具体步骤如下：（1）选用Promega公司的SV总RNA提取和纯化试剂盒，先用是集合中的裂解缓冲液将碾磨后菌体样品混匀；（2）随后用DnaseI处理之前已经混匀的样品以消除残留的DNA样品带来的污染；（3）提取纯净的RNA后利用Invitrogen公司的SuperScript^TM III反转录试剂盒进行第一链cDNA；（4）互补链DNA的扩增利用Taq酶，PCR反应条件为：预变性94℃5min；扩增循环为94℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸8min。扩增引物参照（表5），同时利用抽提的RNA样品直接参照上述PCR条件进行扩增，以检验是否有DNA残留污染。

表5：RT-PCR分析用引物

Claims (2)

1.一种灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第13530～118200位的碱基序列所示。

2.权利要求1所述的灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇在制备灰绿霉素或/和绿灰霉素中的应用。

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