CN101260380A - 定向积累杀念菌素单一组份fr-008-iii的基因工程菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种生物医药技术领域的定向积累杀念菌素单一组份FR－008－III(Candicidin D)的基因工程菌株。在染色体上引入基因突变，从而导致杀念菌素生物合成途径中的位于聚酮合酶FscF上的功能域KR21和位于聚酮合酶FscE上的功能域DH18的催化活性位点均发生了突变，KR21突变为：第1526位酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)；DH18突变为：第3084位组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)以及第3083位天冬氨酸(D)突变为缬氨酸(V)。本发明定向生产杀念菌素单一组份FR－008－III，其产量是野生型菌株该组份产量的120－130％，而FR－008－III是杀念菌素3个主要组分中最具药用价值的成份。通过该工程菌可以大规模生产高纯度的杀念菌素有效组份。

Description

定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III的基因工程菌株

技术领域

本发明涉及的是一种生物医药技术领域的菌株，特别是一种定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III(Candicidin D)的基因工程菌株。

背景技术

链霉菌属原核生物界放线菌目链霉菌科，是土壤中主要的微生物类群之一。很多聚酮类抗生素产生于这类细菌，并且已广泛应用于医用、兽用及农用，这包括红霉素(抗菌)，制霉菌素(抗真菌)，阿维菌素(抗寄生的)和纳巴霉素(免疫抑制剂)等。

聚酮合酶(PKS)是可以催化合成一大类长度、功能基团和环化状态不同的聚酮大环内酯类天然产物的多功能酶类。PKS催化模式类似于经典的脂肪酸合成酶(FAS)的功能模式。聚酮合酶分为I型(Type I PKS)和II型(Type II PKS)两类。大环内酯类化合物如杀念菌素、红霉素以及夹竹桃霉素等由I型聚酮合酶负责合成。I型聚酮合酶体系由几个多功能酶组成，每个多功能酶都包含参与聚酮生物合成过程所需的各种催化功能域，这包括：酰基转移酶(AT)、酮基合成酶(KS)、酰基载体蛋白(ACP)、酮基还原酶(KR)、脱水酶(DH)或烯醇还原酶(ER)。其中KS、AT、ACP是负责聚酮链延伸所必须的功能域，其余非必须的功能域(KR、DH、ER)则负责聚酮链上功能基团(酮基，羟基，碳碳单键或双键)的变化。由于每一功能域只参与整个聚酮碳链合成中的一步生化反应，这样聚酮链的长短以及功能团的变化便取决于聚酮合酶上功能域的数量，种类及其排列组合。II型聚酮合酶与I型聚酮合酶的差别仅在于前者的功能域在聚酮链延伸的反应步骤中被重复使用。

七烯大环内酯类抗生素杀念菌素(FR-008/Candicidin)由链霉菌FR-008(Streptomyces sp.FR-008)产生，其合成机制已被阐明，属于典型的I型聚酮合酶工作模式。文献报道七烯大环内酯类抗生素对真菌细胞膜中数量最大的固醇麦角固醇具有很大的亲和性，从而对真菌细胞具有选择性的毒性。杀念菌素是治疗人类严重系统性真菌感染最重要的抗生素之一。杀念菌素复合物的主要包含三个组份：FR-008-III(Candicidin D)、FR-008-V和FR-008-VI，其中以FR-008-III(Candicidin D)为主要活性组份。

根据杀念菌素生物合成模型以及杀念菌素3个组份的结构差异，推测杀念菌素生物合成过程中的两个催化功能域(KR21和DH18)的非完全活性可能导致了杀念菌素3个组份的同时生成。通过在染色体上定点突变的方法使KR21和DH18功能域失去催化活性，从而得到相应的突变株。对突变株发酵产物的高压液相和质谱分析(LC-MS)结果印证了这一推论，即KR21功能域的突变失活导致了FR-008-V的丢失；DH18功能域的突变失活导致了FR-008-VI的丢失；KR21和DH18功能域均突变失活后，仅定向积累FR-008-III(Candicidin D)。

发明内容

本发明的目是获得能单一积累杀念菌素复合物中最具药用价值的定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III的基因工程菌株，使得本发明可以大规模生产高纯度的杀念菌素有效组份。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明在杀念菌素产生菌链霉菌FR-008染色体上引入基因突变，从而导致杀念菌素生物合成途径中的位于聚酮合酶FscF上的功能域KR21和位于聚酮合酶FscE上的功能域DH18的催化活性位点均发生了突变，KR21突变为：聚酮合酶FscF第1526位酪氨酸突变为苯丙氨酸；DH18突变为：聚酮合酶FscE第3084位组氨酸突变为酪氨酸以及第3083位天冬氨酸突变为缬氨酸。该基因改造所得到的工程菌株ZYJ-6仅生产杀念菌素活性组份FR-008-III，而不再积累原始组份FR-008-V和FR-008-VI。

该基因工程菌株的构建方法：

(一)确定功能域KR21(存在于聚酮合酶FscF)和DH18(存在于聚酮合酶FscE)的催化活性位点。(二)设计并构建分别用于对KR21和DH18的催化活性位点进行突变的同源重组载体pJTU573和pJTU572。(三)把pJTU573通过接合转移导入菌链霉菌FR-008进行同源重组。(四)首先通过硫链丝菌素抗性影印筛选，进而通过PCR以及对PCR产物酶切验证和测序验证的方法最终筛选到KR21突变株。(五)同样方法，把pJTU572导入KR21突变株进行同源重组，最终筛选到KR21和DH18双突变株ZYJ-6。

本发明定向生产杀念菌素单一组份FR-008-III，其产量是野生型菌株该组份产量的120-130％，而FR-008-III是杀念菌素3个主要组分中最具药用价值的成份。通过该工程菌可以大规模生产高纯度的杀念菌素有效组份，所以具有显著的工业应用价值。

本发明定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III的基因工程菌株，其工程菌ZYJ-6已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏登记编号为CGMCC NO.2394，保藏期限为2008.03.07日起的30年。

附图说明

图1：突变株ZYJ-6和野生型菌株(链霉菌FR-008)之间的衍生关系。KR21属于聚酮合酶FscF的一个功能域。聚酮合酶FscF第1526位酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)，从而导致功能域KR21活性位点发生了突变。DH18属于聚酮合酶FscE的一个功能域。聚酮合酶FscF第3084位组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y)以及第3083位天冬氨酸(D)突变为缬氨酸(V)，从而导致功能域DH18活性位点发生了突变。突变株ZYJ-6则包含了上述功能域KR21和DH18的双突变。星号表示突变后的功能域。ApoI和BsrGI分别代表突变后引入的限制性酶切位点。方框内的碱基序列表示限制性酶识别序列。

图2：突变株ZYJ-6和链霉菌FR-008野生型菌株发酵产物的HPLC(高压液相)检测结果。V，III以及VI分别代表FR-008-V，FR-008-III和FR-008-VI。ZYJ-6突变株仅生产FR-008-III，而不再积累原始组份：FR-008-V和FR-008-VI。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例一：通过先引入KR21突变后再引入DH18的突变从而获得双突变株ZYJ-6

(一)质粒的构建(用于导入宿主并和染色体发生同源重组以便获得目标突变)

(1)用于KR21功能域突变的质粒构建：

EcoRI和KpnI酶解链霉菌FR-008文库柯斯质粒pHZ220后回收3615-bpEcoRI-KpnI DNA片段作为PCR模板，引物P1和P3用来扩增528-bp DNA片段；P4和P2用来扩增618-bp DNA片段。P3和P4有18-bp的重叠，在该重叠区域引入突变位点(Y1526F)，同时引入DNA限制性酶切位点(ApoI)以便该突变的筛选(如图1所示)。通过第二次PCR(引物为P1和P2；模板为琼脂糖胶回收后的两个PCR产物各取1/100加入PCR体系)得到1146-bp DNA片段。1146-bp DNA片段被克隆在T-vector(得到质粒pJTU566)上并经过测序确认正确后又被酶解成849-bp SacI-SfiI DNA片段。849-bp SacI-Sfi IDNA片段被用来替换3615-bpEcoRI-KpnI DNA片段(由EcoRI-KpnI酶解pHZ220后回收得到，并克隆在pIJ2925载体上而得到质粒pJTU569)内部对应的区域从而得到质粒pJTU571。重组后的3615-bp EcoRI-KpnI DNA片段包含了目标突变位点和分布于突变位点两边的用于和染色体发生同源交换的两个臂(分别为：1948-bp和1667-bp)。该3615-bpDNA重组片段最终被克隆在pHZ1358(大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒)BamHI位点，从而得到用于和染色体发生同源重组的质粒pJTU573。

PCR反应：

引物：

P1，5’-CCGCCTCACCCAACTGCC-3’

P3，5’-GCGACGAAATTTGCCTGGCCG-3’

P4，5’-CCA GGCAAATTTCGTCGCCGC-3’

P2，5’-GGGGAG CCGCTGTCGTAGA-3’(下划线表示引入的限制性酶切位点ApoI)

PCR反应体系：0.1μg模板DNA，引物各50pmol，4μl DMSO，2μl Mg²⁺，5μl dNTP，5μl缓冲液和1个单位KOD DNA聚合酶(TOYOTA)，加纯水到50μl。PCR反应的循环条件为：95℃(5分钟)；32个循环的95℃(30秒)，60℃(30秒)和68℃(36秒)；最后是68℃5分钟。(注：引物为P1和P2的第二轮PCR延伸时间为66秒)。

PCR产物末端加A(以便于克隆在T-Vector)碱基的条件为：50μg PCR产物，5μl dATP，2个单位Tag DNA聚合酶，5μl缓冲液，2μl Mg²⁺，加纯水至50μl. 72℃ 20分钟。

(2)用于DH18功能域突变的质粒构建：

用于DH18功能域活性位点相应编码碱基突变的两个同源交换臂分别由PCR扩增获得。PCR模板为链霉菌FR-008文库柯斯质粒pHZ220的DNA。扩增1475-bpDNA片段所用引物为：DH18P1和DH18P2；扩增1203-bp DNA片段所用引物为：DH18P3和DH18P4。突变位点分别通过引物DH18P2和DH18P3引入，同时又引入限制性酶切位点BsrGI以便于突变筛选(如图1所示)。1475-bp PCR产物插入pBluescript II SK(+)EcoRV位点后得到质粒pJTU568，并进行了测序验证。1203-bp PCR产物克隆在T-Vector上而得到质粒pJTU565，并进行了测序验证。从pJTU565酶解得到的1.2kb BsrGI-KpnI DNA片段被插入到pJTU568相应位点后得到质粒pJTU570，从而使得两个同源交换臂在BsrGI位点拼接.该2.6kb重组片段又被BamHI从pJTU570上切出，进而又插入到pHZ1358载体BamHI位点而得到同源重组质粒pJTU572。

PCR引物：

DH18P1，5’-GACACGGAGTCCCCCGAGCCCCAGG-3’

DH18P2，5’-CCG ACGGTGTACACGGCGAGCCAGG-3’

DH18P3，5’-CCTGGCTCGCCGTGTACACCGTCGG-3’

DH18P4，5’-CGCCCGAGAGCGGACCGAGGAGTTG-3’(下划线表示引入的限制性酶切位点BsrGI)

PCR条件：

1475-bp PCR产物(引物为：DH18P1和DH18P2)由KOD DNA聚合酶(TOYOTA)扩增。PCR反应体系同上。PCR反应的循环条件为：95℃(5分钟)；32个循环的95℃(30秒)，57℃(30秒)和68℃(90秒)；最后是68℃5分钟。

1203-bp PCR产物(引物为：DH18P3和DH18P4)由Tag DNA聚合酶扩增。PCR条件：PCR反应体系：0.1μg模板DNA，引物各40pmol，3μl DMSO，2μl Mg²⁺，3μl dNTP，4μl缓冲液和1个单位Tag DNA聚合酶，加纯水到40μl。PCR反应的循环条件为：95℃(5分钟)；32个循环的95℃(30秒)，60℃(30秒)和72℃(20秒)；最后是72℃5分钟。

(二)把用于和染色体发生同源重组的质粒导入野生型宿主：

通过电转把pHZ1358衍生质粒(pJTU572或pJTU573)分别导入大肠杆菌ET12567(携带接合转移辅助质粒pUZ8002)中，以便于pJTU572或pJTU573在辅助质粒pUZ8002的协助，通过接合转移进入受体链霉菌FR-008细胞中。先在合适的抗生素存在下培养携带pUZ8002和待转移质粒的大肠杆菌，12小时后收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用。作为受体的链霉菌孢子需经热激和预萌发处理。将链霉菌孢子悬浮于TES缓冲液(5ml 0.05mol/L，pH8.0)中，在50℃水浴中热激5min，冷却至室温后加入等体积2×孢子预萌发培养基(Difco酵母粉1％，Difco酪蛋白氨基酸1％，CaCl₂ 0.01mol/L)，37℃摇床(250rpm)培养2h，离心收集孢子并重新均匀悬浮于适量的LB培养基中，按10⁸∶10⁸与大肠杆菌细胞等量混合后涂在培养平板(2％琼脂糖，2％甘露醇，2％黄豆饼粉，pH7.2～7.5)上，进行细菌双亲接合转移。11小时后用含萘啶酮酸(抑制大肠杆菌的生长)和硫链丝菌素(导入质粒带有此抗性)的1ml无菌水覆盖平板(终浓度：萘啶酮酸50ng/mL；硫链丝菌素25ng/mL)，置30℃培养3天后即可看到转移接合子。

(三)突变株的筛选和验证：

从覆盖板上挑选单个接合转移子接种到抗性(硫链丝菌素)平板上进一步确认抗性，再转接到不加抗生素(硫链丝菌素)的平板上进行松弛培养，进而通过抗性平板和非抗平板影印实验筛选到若干硫链丝菌素敏感的菌株(突变株的备选株)。以备选株总DNA作为PCR模板；引物P1和P4用于KR21突变的筛选，1146-bp源自于突变株KR21突变的PCR产物可以被ApoI酶解为528-bp和618-bpDNA片段，而源自于野生型的同样大小PCR产物不能被ApoI酶解；引物DH-test-L和DH-test-R用于DH18突变的筛选，706-bp源自于DH18突变的PCR产物可以被BsrGI酶解为244-bp和462-bp DNA片段，而源自于野生型的PCR产物不能被BsrGI酶解。源自于KR21突变和DH18突变的PCR产物被分别克隆在T-Vector上进行测序验证，从而最终确证了目标突变的正确性。

KR21突变株PCR筛选条件：

引物：P1和P4。

PCR反应体系：0.05μg模板DNA，引物各20pmol，1μl DMSO，1μl Mg²⁺，2μl dNTP，2μl缓冲液和0.5个单位Tag DNA聚合酶，加纯水到20μl。PCR反应的循环条件为：95℃(5分钟)；32个循环的95℃(30秒)，60℃(30秒)和72℃(22秒)；最后是72℃5分钟。

DH18突变株PCR筛选条件：

引物：DH-test-L，5’-GCTCTACCGTCCGCTTCGCC-3’

DH-test-R，5’-CTGTGTCCAGGTGGCGTCCG-3’

PCR反应条件：复性64℃，延伸15秒.其余同KR21突变株筛选.

(四)双突变株(ZYJ-6)的获得

先把同源重组质粒pJTU573通过接合转移导入链霉菌FR-008细胞中发生同源重组，筛选并得到KR21突变株。再把质粒pJTU572导入KR21突变株细胞内通过同源重组对DH18进行突变，最终筛选得到KR21和DH18双突变菌株ZYJ-6。

(五)突变菌株的发酵培养

平板发酵【2％琼脂糖，2％甘露醇，2％黄豆饼粉(煮沸熬制后过滤去渣)，pH7.2～7.5】，孢子接种，30℃，6天。

(六)抗生素的分离纯化：

刮取平板孢子，称量后用10倍体积甲醇超声萃取3次。合并萃取液40℃旋转蒸干后重溶于少量体积甲醇，0.25uM滤膜过滤后-20℃避光保存以备检测。

(七)LC-MS对发酵产物检测：

高压液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测结果表明突变株ZYJ-6仅生产FR-008-III(Candicidin D)，而不再积累原始组份：FR-008-V和FR-008-VI。HPLC检测结果如图2所示。

LC-MS是在安捷伦公司的Agilent 1100 series LC/MSD Trap system上进行。高压液相工作条件为：柱子(agilent Eclipse XDB-C18，4.6×250mm)；流速0.6ml/min；流动相：45％乙晴和55％ 5.5mM NH4AC(pH 4.5)；检测波长：380nm；柱温：25℃。

质谱工作条件：负离子模式；干燥气流：10l/min；喷雾器压力：50psi；干燥气温：350℃；轰击电压：1.0-1.8V。

实施例二

先把同源重组质粒pJTU572通过接合转移导入链霉菌FR-008细胞中发生同源重组，筛选并得到DH18突变株。再把质粒pJTU573导入DH18突变株细胞内通过同源重组对KR21进行突变，最终筛选得到KR21和DH18双突变菌株ZYJ-6。

Claims (3)

1.一种定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III的基因工程菌株，其特征在于，在杀念菌素产生菌链霉菌FR-008染色体上引入基因突变，从而导致杀念菌素生物合成途径中的位于聚酮合酶FscF上的功能域KR21和位于聚酮合酶FscE上的功能域DH18的催化活性位点均发生了突变，所述的菌种保藏编号为CGMCC NO：2394。

2.根据权利要求1所述的定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III的基因工程菌株，其特征是，所述的KR21突变为：聚酮合酶FscF上第1526位酪氨酸突变为苯丙氨酸。

3.根据权利要求1所述的定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III的基因工程菌株，其特征是，所述的DH18突变为：聚酮合酶FscE上第3084位组氨酸突变为酪氨酸以及第3083位天冬氨酸突变为缬氨酸。

Images