CN101805742A - 透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列及其质粒和制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物工程技术领域的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列及其质粒和制备方法，通过在作为宿主细胞的链霉菌的vgb核苷酸序列的两端分别引入NdeI和EcoRI的酶切位点获得。并另外通过将NdeI和EcoRI将pJTU4405上的vgbS核苷酸序列切下，插入载体pIB139的对应位点，产生质粒pJTU4406。本发明涉及的vgbS核苷酸序列所表达产生蛋白的氨基酸序列与天然透明颤菌血红蛋白的完全一致，可提高链霉菌对氧的利用效率、促进菌体生长速度和提高抗生素产量。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的基因序列及其质粒和制备方法，具体是一种人工合成的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列及其质粒和制备方法。
背景技术
在大规模细胞培养或高密度发酵如补料分批培养和固定化细胞系统中，如何供氧是尤其要注意。解决该问题的传统方法一般是提高细胞生长环境中的氧气传递，包括：通入纯氧，使用通气/搅拌优化配置以及通过加入化学物质如正十二烷或全氟碳来增加液相中氧气的溶解度。解决问题的另一途径则是利用基因工程技术来提高细胞自身对氧气的利用率，其中最常考虑的就是透明颤菌血红蛋白基因。
透明颤菌是一种革兰氏阴性细菌，具有无色、丝状、滑动、微好氧等特点。1870年透明颤菌被发现，1949年人们对其进行了系统地培养和观察，1986年根据透明颤菌细胞壁的成份等对其进行分类。透明颤菌血红蛋白是Dale AWebster在1974-1977年作为一种细胞色素O和细胞膜上电子传递链终端氧化酶分离得到。1986年，Wakabayashi S对其蛋白序列进行测定，并对生化特性进行了研究，证明其是类似于真核生物的血红蛋白，因此被重新命名为透明颤菌血红蛋白VHb(Vitreoscilla haemoglobin)。1988年透明颤菌血红蛋白的基因vgb被克隆，并在大肠杆菌中得到表达。透明颤菌血红蛋白是一个二聚体，由两个相同的亚基组成。每个亚基有146个氨基酸，含有一个b型血红素，相对分子量为15.775kD，透明颤菌血红蛋白在氨基酸序列和空间结构上与真核生物血红蛋白有很多不同，这些不同造成透明颤菌血红蛋白不能与氧稳定结合，其与氧结合的常数78μM-1s-1远小于与氧的解离常数5000s-1，从而促进氧的传递。透明颤菌血红蛋白基因vgb的转录受到细胞内氧含量的调控，只有在氧不足的情况下，基因才会转录和表达。
限氧条件下，透明颤菌血红蛋白会促进宿主的生长，蛋白的分泌，代谢物的产生，以及增强宿主的抗压性，因此VHb经常被引入各种工业微生物以及各种植物中。在微生物代谢工程中，VHb可以促进菌体生长和提高抗生素产量，例如含有VHb的糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)的红霉素(erythromycin)产量提高60％，VHb可以提高肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)中莫能菌素(monensin)的产量和金色链霉菌(S.aureofaciens)中氯四环素(chlortetracycline)的产量，提高顶头孢霉菌(Acremoniumchrysogenum)头孢霉素C(cephalosporin C)的产量。VHb还可以提高蛋白产量，例如提高大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)α-淀粉酶(α-amylase)的产量。VHb还可以提高一些化合物的产量，例如丝状放线菌Nocardia amarae生物表面活性剂(biosurfactant)的产量，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)3-羟基-2-丁酮(acetoin)和丁二醇(butanediol)的产量，大肠杆菌聚β羟基丁酸酯(poly-beta-hydroxybutyrate，PHB)的产量，酵母D-阿拉伯糖醇(D-Arabitol)的产量。VHb还可以提高一些微生物的生物修复能力，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的2，4-二硝基甲苯(2，4-dinitrotoluene)降解能力，伯克霍尔德菌(Burkholderia)的苯甲酸(benzoic acid)、2，4-二硝基甲苯降解能力和2-氯苯甲酸(2-chlorobenzoate)的降解能力。VHb在植物中的表达会导致许多生理效应，例如全面改善生长特性，加快萌芽以及开花，增强一些需氧的代谢途径，提高抗涝能力，加强对亚硝化压力的抗性等。
链霉菌是一种革兰氏阳性细菌，目前世界上70％的抗生素是来自于链霉菌的次级代谢产物。来源于链霉菌次级代谢产物的抗生素在生物合成过程中对氧的供应敏感，然而在大规模的发酵中供氧矛盾成了抗生素产量的限制因素。在发酵过程中由于液相介质中氧的溶解度和链霉菌菌丝体的致密性和高粘性，常导致溶氧不足，造成抗生素产量的降低，传统提高溶氧方法增加了发酵的成本。
现有的利用vgb基因提高链霉菌以及相近放线菌的抗生素产量有三例。第一，VHb更够提高糖多孢红霉菌中红霉素产量只有60％(Peter Brunker，Wolfgang Minas，Pauli T.Kallio andJames E.Bailey，Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea forstable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene(vhb)，Microbiology(1998)，144，2441-2448)。第二，VHb在限氧条件下提高肉桂地链霉菌中莫能菌素(monensin)产量不到30％，氧气充足时没有任何作用(文莹，宋渊，李季伦，透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对其细胞生长和抗生素合成的影响，生物工程学报，2001年1月，17卷1期)。第三VHb在限氧条件下只能提高金色链霉菌中四环素和氯四环素的产量的不到15％(孟春，叶勤，邱荔，石贤爱，苏文金，郭养浩，透明颤菌血红蛋白基因表达对金色链霉菌生长代谢的影响，微生物学报，2002年8月，42卷4期)。链霉菌DNA中GC含量高达70％以上，是一种高GC含量的微生物。相对来讲，透明颤菌DNA上的GC含量偏低。基因vgb为441bp，GC含量只有45.4％。根据NCBI公布的到目前链霉菌属基因组序列测序完成的22个种(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，以及它们的密码子使用频率表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)，基因vgb超过50％的密码子是在链霉菌中使用频率很低的密码子。可以合理推测链霉菌和透明颤菌在密码子使用偏向性的差异会使原始的vgb基因转入链霉菌后，在翻译水平上受到限制，从而限制Vhb有效提高抗生素产量。也就可以合理推测VHb提高链霉菌抗生素产量的能力在目前的技术中并没有被最大程度发挥，还有可以进一步优化的空间。因此根据链霉菌密码子使用的偏向性改变vgb的核苷酸序列，将vgb含有的在链霉菌中使用频率很低的密码子改为在链霉菌中使用频率高的简并密码子，以提高基因vgb的翻译效率，增加VHb的蛋白表达量，进一步提高抗生素产量。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列及其质粒和制备方法，通过构建链霉菌表达质粒，在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白。本发明可提高链霉菌对氧的利用效率、促进菌体生长速度和提高抗生素产量等。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种人工合成的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列，如SEQ ID No.1所示，该序列具体通过在作为宿主细胞的链霉菌的vgb核苷酸序列的两端分别引入NdeI和EcoRI的酶切位点从而获得。
所述的vgbS核苷酸序列的长度为441bp，G+C的百分含量为67.1％，使用的密码子均为天蓝色链霉菌中使用频率最高的密码子。
所述的密码子的位置具体如下：
表1透明颤菌血红蛋白vgbS密码子替换表
| 密码子位置 | 所编码的氨基酸 | vgb使用的密码子 | vgbS使用的密码子 |
| 2 | L | TTA | CTG |
| 5 | Q | CAA | CAG |
| 7 | I | ATT | ATC |
| 11 | K | AAA | AAG |
| 13 | T | ACT | ACC |
| 14 | V | GTT | GTC |
| 15 | P | CCT | CCG |
| 16 | V | GTA | GTC |
| 17 | L | TTG | CTG |
| 20 | H | CAT | CAC |
| 22 | V | GTT | GTC |
| 24 | I | ATT | ATC |
| 27 | T | ACT | ACC |
| 28 | F | TTT | TTC |
| 29 | Y | TAT | TAC |
| 30 | K | AAA | AAG |
| 32 | L | TTG | CTG |
| 33 | F | TTT | TTC |
| 35 | K | AAA | AAG |
| 密码子位置 | 所编码的氨基酸 | vgb使用的密码子 | vgbS使用的密码子 |
| 37 | P | CCT | CCG |
| 38 | E | GAA | GAG |
| 39 | V | GTA | GTC |
| 40 | R | CGT | CGC |
| 41 | P | CCT | CCG |
| 42 | L | TTG | CTG |
| 43 | F | TTT | TTC |
| 44 | D | GAT | GAC |
| 46 | G | GGT | GGC |
| 48 | Q | CAA | CAG |
| 49 | E | GAA | GAG |
| 50 | S | TCT | TCC |
| 51 | L | TTG | CTG |
| 54 | P | CCT | CCG |
| 56 | A | GCT | GCC |
| 57 | L | TTG | CTG |
| 61 | V | GTA | GTC |
| 62 | L | TTG | CTG |
| 64 | A | GCA | GCC |
| 66 | Q | CAA | CAG |
| 68 | I | ATT | ATC |
| 69 | E | GAA | GAG |
| 密码子位置 | 所编码的氨基酸 | vgb使用的密码子 | vgbS使用的密码子 |
| 70 | N | AAT | AAC |
| 71 | L | TTG | CTG |
| 72 | P | CCA | CCG |
| 73 | A | GCT | GCC |
| 74 | I | ATT | ATC |
| 75 | L | TTG | CTG |
| 76 | P | CCT | CCG |
| 79 | K | AAA | AAG |
| 80 | K | AAA | AAG |
| 81 | I | ATT | ATC |
| 82 | A | GCA | GCC |
| 84 | K | AAA | AAG |
| 85 | H | CAT | CAC |
| 86 | C | TGT | TGC |
| 87 | Q | CAA | CAG |
| 88 | A | GCA | GCC |
| 91 | A | GCA | GCC |
| 92 | A | GCA | GCC |
| 94 | H | CAT | CAC |
| 95 | Y | TAT | TAC |
| 97 | I | ATT | ATC |
| 99 | G | GGT | GGC |
| 密码子位置 | 所编码的氨基酸 | vgb使用的密码子 | vgbS使用的密码子 |
| 100 | Q | CAA | CAG |
| 101 | E | GAA | GAG |
| 102 | L | TTG | CTG |
| 103 | L | TTG | CTG |
| 104 | G | GGT | GGC |
| 106 | I | ATT | ATC |
| 107 | K | AAA | AAG |
| 108 | E | GAA | GAG |
| 109 | V | GTA | GTC |
| 110 | L | TTG | CTG |
| 112 | D | GAT | GAC |
| 114 | A | GCA | GCC |
| 116 | D | GAT | GAC |
| 118 | I | ATT | ATC |
| 119 | L | TTG | CTG |
| 125 | A | GCT | GCC |
| 126 | Y | TAT | TAC |
| 129 | I | ATT | ATC |
| 130 | A | GCA | GCC |
| 131 | D | GAT | GAC |
| 133 | F | TTT | TTC |
| 134 | I | ATT | ATC |
| 密码子位置 | 所编码的氨基酸 | vgb使用的密码子 | vgbS使用的密码子 |
| 135 | Q | CAA | CAG |
| 137 | E | GAA | GAG |
| 138 | A | GCA | GCC |
| 139 | D | GAT | GAC |
| 140 | L | TTG | CTG |
| 142 | A | GCT | GCC |
| 143 | Q | CAA | CAG |
| 145 | V | GTT | GTC |
| 146 | E | GAA | GAG |
| 147 | 终止密码子 | TAA | TGA |
所述的vgbS核苷酸序列编码所表达产生蛋白含有146个氨基酸残基，与天然透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列完全一致。
所述的链霉菌为天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌、阿维链霉菌、灰色链霉菌、红色糖多孢菌或珍贵橙色束丝放线菌。
本发明涉及一种人工合成的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列的质粒的制备方法，通过将NdeI和EcoRI将pJTU4405上的vgbS核苷酸序列切下，插入载体pIB139的对应位点，产生质粒pJTU4406。
所述的载体pIB139是一个含有红霉素抗性基因强启动子PermE＊的链霉菌整合型载体，pJTU4406上的基因vgbS处于PermE＊强启动之下，解除了氧对其转录的限制。
所述的载体pIB139具有在链霉菌中表达的启动子。
本发明利用透明颤菌血红蛋白可以提高细菌氧气利用率，从而提高细菌生长量和抗生素产量。同时由于不同生物的遗传密码子使用频率不同，基因表达高低在翻译水平上受到所在宿主密码子使用频率的调节。依据以上原理，修改透明颤菌血红蛋白基因的核苷酸序列，将其链霉菌中极少使用密码子改为链霉菌经常使用的密码子，提高基因表达水平，更为有效地提高链霉菌抗生素产量。
本发明具有如下有益效果：获得可以在链霉菌中高效表达的新的透明颤菌血红蛋白基因vgbS核苷酸序列，人工合成了此基因。并将此基因转入灰色链霉菌FR-008的杀念菌素D单组分突变株ZYJ6中，杀念菌素D产量提高2-3倍，明显高于已有文献中报道的15％-60％。因此可预见vgbS能够成为用来提高各种链霉菌中抗生素产量的有效手段。
附图说明
图1为本发明质粒pJTU4406。
图2为实施例引物pSET152F/R的序列。
图3为实施例菌株ZYJ6::pJTU4406的PCR验证。
图4为HPLC分析菌株ZYJ6和ZYJ6::pJTU4406杀念菌素D产量变化。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施方式为了验证PermE＊启动下的基因vgbS是否能够提高抗生素产量进行了以下实验。选取衍生于灰色链霉菌FR-008的杀念菌素D单组分突变株ZYJ6为宿主，检测杀念菌素D产量的变化。通过接合转移的方法将pJTU4406转入灰色链霉菌ZYJ6，挑选接合转移子ZYJ6::pJTU4406。将菌种ZYJ6和三个独立的接合转移子ZYJ6::pJTU4406发酵，检测杀念菌素D产量。与ZYJ6相比，菌株ZYJ6::pJTU4406杀念菌素D的产量增加200％-300％，进而可以证明化学合成的基因vgbS可以在PermE＊的启动下正常转录和表达，并行使功能，提高抗生素表达。
实施例
步骤一，基因vgb密码子修改和新基因vgbS的全合成
依据天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)基因组中密码子的使用频率，其中使用频率的出处地址为：
http://www.cbs.dtu.dk/services/GenomeAtlas/show-codon.php？&segmentid＝Scoelicolor_A3_Main Codon Usage in Streptomyces coelicolor strain A3。
检查基因vgb天然序列中的每一个密码子，将在链霉菌中使用频率不高的密码子改为在链霉菌中使用频率最高的密码子，保持氨基酸序列不变，产生新的基因vgbS。为了后期的DNA操作的方便，在基因vgbS两端分别引入NdeI和EcoRI的酶切位点，其中在vgbS核苷酸序列的5’端添加7个核苷酸，形成限制性内切酶NdeI位点和保护碱基，在vgbS核苷酸序列的3’端添加8个核苷酸，形成限制性内切酶EcoRI位点和保护碱基。将vgbS全基因合成，合成的这一段DNA被插在载体pGH的SmaI位点，产生质粒pJTU4405，测序证明合成无误。其中基因全合成、插入载体、测序验证由上海美季生物技术有限公司完成。
步骤二，质粒的构建
本实施例涉及的载体pIB139由Dr.Peter F.Leadlay赠送。pIB139是一个含有红霉素抗性基因强启动子PermE＊的链霉菌整合型载体，可以通过大肠杆菌和链霉菌之间的两亲本接合转移进入链霉菌，发生位点特异性重组后整合在链霉菌的染色体上，随着染色体一起复制和遗传。用NdeI和EcoRI将pJTU4405上的基因vgbS切下，插入载体pIB139的对应位点，产生质粒pJTU4406。pJTU4406上的基因vgbS处于启动子PermE＊强启动之下，解除了氧对其转录的限制。图1为质粒pJTU4406示意图。
步骤三，把质粒导入链霉菌宿主以及接合转移子的筛选和验证
本实施例中涉及的菌株灰色链霉菌FR-008为Dr.Jose Gil赠送，灰色链霉菌ZYJ6由周永军博士构建，未发表。菌株大肠杆菌DH10B从GIBCO-BRL公司获得，大肠杆菌ET12567/pUZ8002已在(Paget，M.S.，Chamberlin，L.，Atrih，A.，Foster，S.J.，and Buttner，M.J.(1999).Evidence that the extracytoplasmic function sigma factor sigmaE is required for normalcell wall structure in Streptomyces coelicolorA3(2).J.Bacteriol.181，204-211.)文献中公开。
灰色链霉菌FR-008可以合成含有多种组分的多烯化合物FR-008，与灰色链霉菌IMRU3570中合成的杀念珠菌素Candicidin非常相似。对野生型菌株中负责合成FR-008基因簇中的fscE基因中的结构域DH18和fcsF基因中的结构域KR21进行双突变长生了突变株ZYJ6。突变株ZYJ6与野生型菌株相比，这个突变株只产生抗生素FR-008组分中的III组分，即杀念菌素D(Candicidin D)。这里我们以菌株ZYJ6作为宿主，以FR-008III组分的产量作为检测标准。
质粒pJTU4406必须在辅助质粒pUZ8002的协助下才能通过接合转移导入到受体链霉菌FR-008细胞中。在液体LB培养基内培养携带待转移质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，该液体LB培养基内存在有终浓度为25μg/μL的氯霉素，100μg/μL的氨苄青霉素和30μg/μL的阿泊拉霉素。12小时后收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用。作为受体的链霉菌孢子需经热激和预萌发处理。将链霉菌孢子悬浮于5mL TES缓冲液中，该缓冲液浓度为0.05mol/L，pH值为8.0。然后在50℃水浴中热激5min，冷却至室温后加入等体积2×孢子预萌发培养基，该培养基组分分别为：Difco酵母粉1％(m/v)，Difco酪蛋白氨基酸1％(m/v)，CaCl20.01mol/L。在37℃，250rpm条件下，摇床培养2h，离心收集孢子并重新均匀悬浮于适量的LB培养基中，按108∶108与大肠杆菌细胞等量混合后涂在培养平板上，该培养平板组分为：2％琼脂糖(m/v)，2％甘露醇(m/v)，2％黄豆饼粉(m/v)，培养平板pH值为7.2～7.5，进行细菌双亲接合转移。12小时后用含萘啶酮酸和阿泊拉霉素的1mL无菌水覆盖平板，平板上萘啶酮酸的终浓度为50ng/mL；阿泊拉霉素为30ng/mL，置30℃培养3天后即可看到转移接合子。
从覆盖板上挑选单个接合转移子接种到阿泊拉霉素抗性平板上进一步确认抗性。以备选株总DNA作为PCR模板；位于载体上的引物pSET152F和pSET152R用于ZYJ6::pJTU4406筛选，菌株ZYJ6::pJTU4406的PCR产物723bp，而菌株ZYJ6得不到同样大小PCR产物。图2PCR验证使用的引物pSET152F/R；图3表示使用引物pSET152F/R对菌株ZYJ6::pJTU4406的PCR验证，1为marker，2、3和4为以三个独立的菌株ZYJ6::pJTU4406的染色体为模板可以扩增得到723bp扩增带，5为作为对照的ZYJ6，得不到相应大小的扩增带。
引物序列：
pSET152F：5′-CCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3’，
pSET152R：5′-ACAGGAAACAGCTATGACATGAT-3’。
PCR反应体系：0.1μg模板DNA，引物各50pmol，4μL DMSO，2μL Mg2+，5μL dNTP，5μL缓冲液和1个单位KOD DNA聚合酶，该聚合酶为日本TOYOBO公司产品，加纯水到50μL。PCR反应的循环条件为：95℃5分钟；95℃30秒30个循环，60℃30秒和68℃45秒；最后是68℃5分钟。
步骤四，菌株发酵以及抗生素的提取和检测
将菌种ZYJ6和三个独立的接合转移子ZYJ6::pJTU4406分别在SFM平板上活化，30℃下培养6天，该平板组分为：2％琼脂糖(m/v)，2％甘露醇(m/v)，2％黄豆饼粉(m/v)，平板pH值为7.2～7.5。然后接种在20mL液体培养基YEME中，其中液体培养基YEME的制备方法为：取Difco酵母粉3g，Difco蛋白胨5g，Oxoid麦芽粉3g，蔗糖103g，葡萄糖10g，然后定容至1000mL，灭菌，使用前补加2.5M的MgCl2·6H2O 2mL。30℃摇床培养24小时，取样，离心，收菌体，烘干，称干重，确定各菌种之间菌体密度的差异，调整到一致。按大约1/100体积比接种到等量液体培养基YEME中，30℃摇床培养60小时。
取25mL发酵液离心，收集菌体，加入5mL DMSO，将菌体中的抗生素浸泡出来，离心，取上清，0.25μM滤膜过滤后-20℃避光保存以备检测。
高压液相色谱-质谱联用(LC/MS)是在安捷伦公司的Agilent 1100series LC/MSD Trapsystem上进行。高压液相工作条件为：柱子具体为：agilent Eclipse XDB-C18，4.6mm×250mm；流速0.6mL/min；流动相含有体积分数分别为45％的乙晴和55％的NH4AC，其中NH4AC原溶液浓度为5.5mM，流动相pH值为4.5；检测波长：380nm；柱温：25℃。
质谱工作条件：负离子模式；干燥气流：10L/min；喷雾器压力：50psi；干燥气温：350℃；轰击电压：1.0V-1.8V。
图4为菌株ZYJ6和ZYJ6::pJTU4406产生的杀念菌素HPLC的分析，统计分析ZYJ6和ZYJ6::pJTU4406杀念菌素产量比例，以ZYJ6杀念菌素产量为一个单位。与ZYJ6相比，菌株ZYJ6::pJTU4406杀念菌素D的产量大约升高200％-300％。可以证明化学合成的基因vgbS可以在链霉菌中由启动子PermE＊的启动，正常转录、翻译、表达并行使功能，提高抗生素表达。
Claims (9)
1.一种人工合成的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列，其特征在于，如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的人工合成的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列，其特征是，所述的vgbS核苷酸序列的长度为441bp，G+C的百分含量为67.1％，使用的密码子均为天蓝色链霉菌中使用频率最高的密码子。
3.根据权利要求2所述的人工合成的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列，其特征是，所述的密码子的位置具体如下：
4.根据权利要求1所述的人工合成的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列，其特征是，所述的vgbS核苷酸序列编码所表达产生蛋白含有146个氨基酸残基，与天然透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列完全一致。
5.一种根据权利要求1所述的人工合成的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列的制备方法，其特征在于，通过在作为宿主细胞的链霉菌的vgb核苷酸序列的两端分别引入NdeI和EcoRI的酶切位点获得。
6.根据权利要求5所述的人工合成的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列的制备方法，其特征是，所述的链霉菌为天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌、阿维链霉菌、灰色链霉菌、红色糖多孢菌或珍贵橙色束丝放线菌。
7.一种根据权利要求1所述的人工合成的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列的质粒的制备方法，其特征在于，通过将NdeI和EcoRI将pJTU4405上的vgbS核苷酸序列切下，插入载体pIB139的对应位点，产生质粒pJTU4406。
8.根据权利要求7所述的人工合成的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列的质粒的制备方法，其特征是，所述的载体pIB139是一个含有红霉素抗性基因强启动子PermE＊的链霉菌整合型载体，pJTU4406上的基因vgbS处于PermE＊强启动之下，解除了氧对其转录的限制。
9.根据权利要求7或8所述的人工合成的透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列的质粒的制备方法，其特征是，所述的载体pIB139具有在链霉菌中表达的启动子。
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| CN 201010148837 CN101805742A (zh) | 2010-04-17 | 2010-04-17 | 透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列及其质粒和制备方法 |
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Cited By (7)
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 《中国农业科学》 20041231 吴巧雯等 透明颤菌血红蛋白基因的植物化改造合成及其在大肠杆菌中功能的鉴定 第1439-1443页 1-9 第37卷, 第10期 2 * |
| 《中国酿造》 20081231 王清路等 透明颤菌血红蛋白基因（vgb）与monellin 基因在毕赤酵母中的联合表达 第37-40页 1-9 , 第15期 2 * |
| 《沈阳药科大学学报》 20090831 杨洪涛等 透明颤菌血红蛋白基因的克隆及其在林可链霉菌中的表达 第657-662页 1-9 第26卷, 第8期 2 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012119484A1 (zh) * | 2011-03-08 | 2012-09-13 | 上海交通大学 | 质粒及利用质粒提高链霉菌抗生素产量的方法 |
| CN102703495A (zh) * | 2011-03-08 | 2012-10-03 | 上海交通大学 | 提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒 |
| CN103243062A (zh) * | 2013-05-08 | 2013-08-14 | 中国计量学院 | 产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌、构建方法及用途 |
| CN103289946A (zh) * | 2013-05-08 | 2013-09-11 | 中国计量学院 | 淀粉酶产色链霉菌表达体系的建立方法 |
| CN103484386A (zh) * | 2013-09-09 | 2014-01-01 | 华中农业大学 | 重组淡紫拟青霉菌株pnvt8及其应用 |
| CN110106191A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-08-09 | 枣庄市杰诺生物酶有限公司 | 人工合成的透明颤菌血红蛋白基因及相应工程菌株和应用 |
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