一种提高聚酮类化合物发酵产量的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种提高聚酮类化合物发酵产量的方法。
背景技术
聚酮类化合物是一类重要的次级代谢产物,它是由简单脂肪酸经过类似长链脂肪酸的合成途径生成的,所得的化合物具有一系列复杂的结构,结构的多样性导致了生物活性的多样性。在自然界中已发现的天然聚酮物质约有2万种,大多数抗生素和一些其他的重要药物如抗癌药、免疫抑制剂等均属于这个大家族。作为治疗药用途的这类化合物包括临床上应用的红霉素、四环素、利福霉素、两性霉素、阿霉素、洛伐他丁、雷帕霉素等重要抗生素,以及农牧业用的阿弗菌素和莫能星、泰乐菌素等。
许多有生物活性的聚酮类化合物由于其宿主不能进行大规模发酵生产而受到限制(如海绵和腰鞭毛虫的共生菌),或由于宿主菌难于培养而产率很低。目前有研究将这些生物中合成聚酮类化合物的途径转入合适的宿主,以提高目的产物的产率,常用的宿主如大肠杆菌、链霉菌以及植物等。
但是,生物代谢通路在异源宿主中的复制并非一个简单的技术问题,为了进一步提高聚酮类化合物的发酵产量,有必要对其进行进一步研究,开发新的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有的聚酮类化合物的发酵产量不够高,难以满足实际应用需求的现状,提供一种提高聚酮类化合物发酵产量的方法。本发明通过基因工程技术改造放线菌,使之能够利用廉价的原料增加胞内酰基辅酶A的含量,为聚酮类次级代谢产物的合成提供前体,从而大大提高聚酮类化合物的发酵产量。
本发明提供的技术方案之一是:一种提高聚酮类化合物发酵产量的方法,其包括步骤:在添加了天然油脂的培养基中培养过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因工程菌,从发酵产物中提取聚酮类化合物,所述的基因工程菌为将含有表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达载体的重组大肠杆菌接合转移放线菌制得的过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达转化体。
本发明中,所述的过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因工程菌能够过表达外源的酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白,使所述基因工程菌能够利用廉价的原料增加胞内乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的含量,从而丰富聚酮类化合物的直接合成前体,提高聚酮类化合物的产量。
本发明中,所述的提高聚酮类化合物发酵产量的方法还包括所述的基因工程菌的制备步骤:将表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达载体转化大肠杆菌,然后将所得的重组大肠杆菌接合转移放线菌,所得的过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达转化体即为所述的基因工程菌。
本发明中,所述的酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白优选来源于玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)的酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白,其分别由来源于玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)的DptE和DptF基因编码,所述的玫瑰孢链霉菌更优选玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌株。其中,所述的来源于玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)的酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的氨基酸序列分别优选如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。所述的来源于玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)的DptE和DptF基因的核苷酸序列分别优选如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。
对于上述氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白,本领域技术人员知晓,与其具有一定的同源性(较佳地为同源性大于85%)的同源蛋白应当能够实现与其相同或基本相同的功能。对于上述核苷酸序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO.4所示的DptE和DptF基因,本领域技术人员知晓,与其具有一定的同源性(较佳地为同源性大于85%)的同源基因应当能够实现与其相同或基本相同的功能。
本发明中,所述的重组表达载体可通过本领域的常规方法获得,即:将编码所述酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因连接于表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规,所述表达载体较佳地包括:各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等,优选放线菌常用的各种整合型或复制型载体,所述的整合型载体包括各种噬菌体整合位点适用的载体,如pSET152、pSOK804,pSAM2等,所述的复制型载体优选pWhm3等,本发明中所述的表达载体最优选为质粒pSET152,即所述的重组表达载体最优选通过将编码所述酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因连接于质粒pSET152构建而成。
其中,在所述的重组表达载体中,启动编码所述酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因表达的启动子可以为常规,只要其能启动目标基因表达即可,较佳地,所述的启动子为红霉素抗性基因启动子erm*E,其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明中,所述的放线菌为本领域常规所述,只要其存在聚酮类化合物或聚酮NRPS杂合化合物的合成途径,且能满足使所述的重组表达载体稳定地自行复制,使所述重组表达载体携带的编码酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因能被有效表达即可。其中较佳地,所述放线菌为游动放线菌(Actinoplanes sp.)或者吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus),更优选游动放线菌(Actinoplanes sp.)N902-109(FERM BP-3832)菌株或者吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)ATCC29253菌株。将前述重组表达载体转化至上述菌株中,即可得本发明优选的基因工程菌株。
本发明中,所述的培养基为本领域常规的适合放线菌生长的培养基。所述的天然油脂为本领域常规,更佳的是天然植物油脂,优选豆油、玉米油和花生油中的任一种或多种。
本发明中,所述的聚酮类化合物为本领域常规所述,优选雷帕霉素。
本发明提供的技术方案之二是:一种生产雷帕霉素的基因工程菌,其为将含有表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达载体的重组大肠杆菌接合转移放线菌制得的过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达转化体。
所述的放线菌为本领域常规所述,只要其存在雷帕霉素的合成途径,且能满足使编码所述的酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因被有效表达即可。其中较佳地,所述放线菌为游动放线菌(Actinoplanes sp.)或者吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus),更优选游动放线菌(Actinoplanes sp.)N902-109(FERM BP-3832)菌株或者吸水链霉菌ATCC29253菌株。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料除特别说明之外,均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:本发明的特点在于提供了一种新的提高聚酮类化合物发酵产量的方法。本发明的方法在于通过基因工程技术在聚酮类化合物的产生菌中过量表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白,使之利用廉价的天然油脂为培养基原料,过量合成聚酮类化合物的上游合成底物乙酰辅酶A和丙酰辅酶A,从而大幅度提高聚酮类化合物的发酵产量。本发明的方法尚属首创,目前为止未见有公开文献报道过。本发明的操作方法简单易行,且利用廉价的天然油脂为聚酮类化合物的合成提供前体物质,成本很低,具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的质粒构建图谱。
图2显示过表达DptE和DptF基因对雷帕霉素产量的影响,左边为野生型的游动放线菌(Actinoplanes sp.)N902-109(FERM BP-3832)菌株,右边为本发明过表达DptE和DptF基因的基因工程菌。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
下述实施例中使用的菌株和质粒信息如下:
大肠杆菌DH5α(购自TaKaRa公司),玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)NRRL11379(购自NRRL);大肠杆菌ET12567(pUZ8002)(购自Biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)、质粒pSET152(购自Biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)、pIB139(购自Biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心),pACK4aBS载体(购自盘古基因有限公司)。游动放线菌(Actinoplanes sp.)N902-109(FERM BP-3832)菌株,购自日本IPOD国际专利菌种保藏中心(NITE),其保藏编号是FERM BP-3832。
Kod NEO plus DNA聚合酶购自Toyobo公司;
限制性内切酶购自TaKaRa公司或Fermentas公司;
T4DNA连接酶购自TaKaRa公司;
Axygengel纯化试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自Axygen公司;
EasyTaq DNA聚合酶购自全式金生物工程有限公司;
其它常规试剂均为国产或进口分装。
PCR仪为Bio-rad PTC200。
实施例1玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)基因组的抽提
基因组抽提包括下述步骤:
(1)玫瑰孢链霉菌的培养:将玫瑰孢链霉菌接种于50ml液体YEME培养基中,所述YEME培养基包括:0.3%酵母提取物、0.5%蛋白胨、0.3%麦芽糖提取物、1%葡萄糖、10%蔗糖和5mM MgCl2,所述的百分比为质量体积百分比(W/V),28℃(300rpm)培养,使菌体生长至对数中后期。
(2)玫瑰孢链霉菌的收集:取1ml培养物于1.5ml EP管中,室温、8000rpm离心5min,弃上清,沉淀重新悬浮于1ml TE(pH8.0)缓冲液中。
(3)菌体裂解:加入6μl50mg/ml的溶菌酶,37℃作用30分钟。再加2mol/LNaCl50μl,10%SDS110μl,20mg/ml的蛋白酶K3μl,50℃作用3h或37℃过夜(此时菌液应为透明粘稠液体)。
(4)抽提:菌液均分到两个1.5ml EP管,加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,室温放置5~10min。12000rpm离心10min。抽提两次。
(5)沉淀:加0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温放置10min。12000rpm离心10min。
(6)洗涤:沉淀用75%的乙醇洗涤。
(7)抽(晾)干后,溶于50μl ddH2O中,取25μl电泳,结果显示所提取的菌体基因组质量良好,适合作PCR模板用。
实施例2重组表达载体pSET152erm*E-DptEF的构建:
1、DptEF基因的克隆:
以实施例1所得的玫瑰孢链霉菌基因组为模板,利用引物p1和p2进行高保真PCR扩增,得到约2461bp的片段,该片段包含完整的DptE和DptF基因,其完整序列如SEQ ID NO.6所示。其中,引物p1和p2的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
(1)反应体系(50μl)包括:5μl10×KOD NEO plus缓冲液,3μl25mM MgCl2,1.5μl2.5mmol/L dNTP溶液,2.5μl DMSO,30pmol P1,30pmol P2,1U KOD NEO plus DNA聚合酶,50ng基因组,加双蒸水至50μl。
(2)PCR反应程序为:95℃5min,30个循环(94℃30s,56℃30s,72℃120s),72℃10min。
PCR片段经过琼脂糖凝胶电泳,胶回收试剂盒纯化回收。
将1μL pACK4aBS载体与3μL纯化片段混合,37℃孵育15分钟,置冰上1~2分钟,转化大肠杆菌DH5α,涂布氨苄LB平板。以引物p1和p2进行菌落PCR验证,能够扩增出相应条带(2461bp)的菌落为阳性菌落。挑取阳性菌落经过LB液体培养,抽提质粒,并经过限制性内切酶(NdeI,XbaI)酶切验证并测序,获得正确的pACK4aBS-DptEF克隆。
2、红霉素启动子erm*E的克隆:
以pIB139质粒为模板,利用引物p3和p4进行高可信度PCR扩增,得到约190bp片段,其中,引物p3和p4的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
(1)反应体系(50μl)包括:5μl10×KOD NEO plus缓冲液,3μl25mM MgCl2,1.5μl2.5mmol/L dNTP溶液,2.5μl DMSO,30pmol P3,30pmol P4,1U KOD NEO plus DNA聚合酶,50ng基因组,加双蒸水至50μl。
(2)PCR反应程序为:95℃5min,30个循环(94℃30s,56℃30s,72℃120s),72℃10min。
PCR片段经过琼脂糖凝胶电泳,胶回收试剂盒纯化回收。
将1μL pACK4aBS载体与3μL纯化片段混合,37℃孵育15分钟,置冰上1-2分钟,转化大肠杆菌DH5a,涂布氨苄LB平板,以引物p3和p4进行菌落PCR验证,能够扩增出相应条带(190bp)的菌落为阳性菌落。挑取阳性菌落经过LB液体培养,抽提质粒,并经过限制性内切酶(BamHI,NdeI)酶切和测序验证,获得正确的pACK4aBS-ermE克隆。
3、构建重组载体pSET152erm*E-DptEF:
将克隆有红霉素启动子的重组质粒pACK4aBS-erm*E以BamHI,NdeI酶切得到启动子片段约190bp,将pSET152质粒以BamHI、XbaI酶切获得载体片段约5.7kb,将重组质粒pACK4aBS-DptEF以NdeI、XbaI酶切获得DptEF片段约2.46kb,分别进行凝胶纯化,三个片段以摩尔比5:1:5的比例在T4DNA连接酶的作用下16℃连接过夜。取连接液5μL转化DH5a感受态细胞,之后涂布终浓度50μg/mL浓度的安普霉素LB平板,长出的单克隆通过液体LB培养,抽提质粒,并利用NdeI,XbaI酶切,得到预期大小的载体条带和DptEF插入片段条带,进一步通过测序,验证得到正确的pSET152erm*E-DptEF质粒。本发明的载体构建过程如图1所示。
实施例3.向游动放线菌中转化pSET152erm*E-DptEF:
制备游动放线菌孢子悬液:在结合转移前5天左右,将游动放线菌甘油保藏液取3μl涂布I-Isp2固体培养基,所述的I-Isp2固体培养基包括1%麦芽糖提取物、0.4%酵母抽提物yeast extract、0.4%葡萄糖,2%琼脂粉,所述的百分比为质量体积百分比(W/V),其pH为7.0。28℃培养120小时左右,用无菌刮棒刮取表面菌体,用15-20ml无菌水洗并通过玻璃珠在旋涡振荡器上震荡10次,每次10秒钟后,将悬液通过棉花塞的无菌注射器针筒,滤出液经过7000转/分离心后,弃去上清,用适量0.4-1.0ml无菌水重悬即可得到孢子悬液。
将重组表达载体pSET152erm*E-DptEF通过电击法转化入大肠杆菌ET12567(pUZ8002),涂布在含有终浓度50μg/mL卡那霉素、50μg/mL安普霉素、25μg/mL氯霉素的LB平板上,37℃培养过夜,得到的的阳性克隆为重组大肠杆菌,以ET12567(pSET152erm*E-DptEF,pUZ8002)表示。
接合转移前一天,接种ET12567(pSET152erm*E-DptEF,pUZ8002)重组大肠杆菌单菌落到3mL LB试管中,加入抗生素卡那霉素(50μg/mL),安普霉素(50μg/mL),氯霉素(25μg/mL)培养过夜,次日以1%接种量接入含有同浓度的三种抗生素的10mL LB三角瓶中,37℃培养至OD0.4-0.6。保持无菌状态,4500rpm,4℃离心收集菌体,弃上清,用同体积无菌LB洗涤一次,重复离心和洗涤一次,重悬在约200μL LB中。将大肠杆菌菌液与制备好的游动放线菌孢子悬液50μL充分混合,涂布1-2块含有终浓度10mMMgCl2的MS平板上,所述MS平板的组成为:2%甘露醇、2%豆饼粉、2%琼脂粉,所述的百分比为质量体积百分比(W/V)。
28℃培养20小时后,每板均匀平铺混合了0.7ml无菌水、15μl萘啶酮酸(50mg/ml溶解于0.1N的NaOH中)和15μl安普霉素(50mg/ml)的溶液。28℃继续培养5-10天至单克隆长出。将单克隆在接合转移平板上划线分单菌落,使之与混杂的大肠杆菌分离,得到纯化后的重组单克隆菌株。将菌株接种I-Isp2液体培养基,所述的I-Isp2液体培养基包括1%麦芽糖提取物、0.4%酵母抽提物yeast extract、0.4%葡萄糖,其pH为7.0。28℃培养48-72小时后,抽提基因组,利用引物p1和p2进行PCR验证重组单克隆的正确性,结果能够扩增出预期的2.46kb DptEF条带,确认为整合了重组载体的重组表达转化子。
引物序列
引物名称 |
引物序列(5'-3') |
P1 |
CATATGGATCGTCCCTGCCGGGACCCAT |
P2 |
TCTAGATCAGGTGCGGTCGGCCAACTGG |
P3 |
AGGATCCTGCATGCGAGTGTCCGT |
P4 |
ACATATGTCGATCCTACCAACCGGC |
实施例4游动放线菌的雷帕霉素发酵:
(一)培养基成分
(1)斜面组成:
葡萄糖2%、可溶性淀粉4%、酵母提取物0.5%、酶水解干酪素0.5%、CaCO30.1%和琼脂1.6%,所述的百分比为质量体积百分比(W/V),调pH至7.0-7.2。
(2)一级种子液的组成:
可溶性淀粉3%、葡萄糖2%、干酵母0.5%、玉米浆干粉0.5%、花生粕0.5%和CaCO30.2%,所述的百分比为质量体积百分比(W/V),调pH至7.0,分装30mL/250mL。
(3)二级种子液的组成:
可溶淀粉3%、葡萄糖4%、玉米浆干粉0.8%、棉子蛋白粉0.8%、CaCO30.3%、泡敌0.2%、MgSO4.7H2O0.00025%、CoCl2.6H2O0.0001%、VB10.02%、VB120.00002%和叶酸0.0025%,所述的百分比为质量体积百分比(W/V),调pH至6.9,分装30mL/250mL,八层纱布堵口。
(4)发酵瓶配方:同二级种子液的组成;加豆油0.4%或不添加油脂。
(二)培养条件
(1)斜面及平板培养条件:
培养温度28℃,培养时间7-9天。
(2)一级种子培养条件:
培养温度28℃,装量30ml/250ml,摇床转速220rpm,培养时间4-5天。
(3)二级种子培养条件:
培养温度28℃,装量30ml/250ml,摇床转速220rpm,接种量10%,培养时间3-4天。
(4)发酵培养条件:
培养温度28℃,装量30ml/250ml,摇床转速220rpm,接种量7.5%-10%,培养时间9-10天。
(三)发酵工艺:
(1)斜面培养
菌种在斜面培养基上培养成熟后,用棉塞和纱布密封,置于25℃培养箱保存不超过20天。
(2)甘油管保藏
用30%的无菌甘油洗下孢子,制备孢子悬液甘油管,置于-20℃冰箱保存。
(3)发酵过程
将3滴或1瓶30%甘油管孢子液滴接入空白斜面,用接种棒涂布均匀,28℃恒温培养7-9天后为一代斜面。挑取一代斜面的正常型菌落接入空白斜面,用接种棒或化线涂布均匀,28℃恒温培养7-9天后为二代斜面。用接种铲刮取1/8—1/6中管斜面或平板斜面1×2mm孢子接入一级种子瓶(装量30ml)中,28℃摇床转速220转恒温培养4-5天后按接种量10%接到二级种子瓶,28℃恒温培养3-4天,摇床转速220转/分,再按接种量7.5%-10%接到发酵瓶中28℃恒温培养10天,摇床转速220转/分。发酵过程结束。
实施例5发酵液中雷帕霉素的含量测定
(一)发酵液预处理
(1)将整瓶发酵液用等体积丙酮浸泡24小时,用移液器取1ml放EP管中1200r/min离心5分钟,上清液经0.2μm一次性滤膜过滤。进行HPLC检测。
(二)HPLC分析条件
仪器:Agilent Technologies1200series型高效液相色谱仪;
色谱柱:公司:Waters品名:NaVa-PaK C8柱,规格:(3.9mm×150mm,5μm);
检测器:紫外可见检测器;
进样量:20μl;
检测波长:278nm;
流动相:乙腈:56%;
流速:1.0ml/min;
柱温:50℃;
上样量:20μl;
出峰时间:9分钟左右。
(三)结果
过表达DptEF的菌株相对于野生型菌株在添加油脂和不添加油脂条件下的雷帕霉素产量变化结果如图2所示。在野生型菌株发酵时,添加油脂和不添加油脂两种情况对于雷帕霉素的产量没有明显影响。而当以过表达DptE和DptF的基因工程菌株发酵时,添加油脂相对野生型菌株,雷帕霉素产量能够提高40%。