CN102191208A - 高产多杀菌素的基因工程菌及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产多杀菌素的基因工程菌及其制备方法。该基因工程菌是在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)野生菌株的基因组中整合有NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒和NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的基因的表达盒的工程菌。通过发酵验证，该基因工程菌的多杀菌素的发酵单位较野生菌株提高三倍以上。

Description

高产多杀菌素的基因工程菌及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种高产多杀菌素的基因工程菌及其制备方法。

背景技术

多杀菌素是一种新型的绿色广谱生物杀虫剂，属于微生物源生物化学农药。多杀菌素兼有生物农药的安全性和化学合成农药的快速效果，喷药后当天即可见效，中国和美国农业部登记的安全采收期都只是一天，最适合无公害蔬菜的生产。因其低毒、低残留、对昆虫的天敌安全，自然分解快而获美国“总统绿色化学品挑战奖”。在日益注重环保和安全意识的今天，多杀菌素作为一种优质的绿色生物农药，有着巨大的发展和应用前景。目前多杀菌素生产主要采用生物发酵的方法，使用传统的自然选育，诱变育种等多种方法对多杀菌素产量的提高相对有限。

多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵产生的。多杀菌素分子结构中的两个糖基，即鼠李糖及福勒糖胺，它们有共同的前体NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖。该共同前体的合成步骤是多杀菌素的生物合成途径的限速步骤。并且该共同前体的糖基合成基因——包括NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶(gtt)基因和NDP-葡萄糖还原酶(gdh)基因——与刺糖多孢菌细胞壁中鼠李糖合成共用一套基因，不在多杀菌素PKS(polyketide synthases)基因簇中。陶氏益农公司的Krishnamurthy教授通过同源探针，倍增了这个共同前体的整个cosmid合成基因，在野生菌株的基础上，多杀菌素的产量有了显著的提高，但同时有一半的菌株由于大片段的转入，对多杀菌素PKS产生影响，导致不产生多杀菌素。而在国内主要通过自然选育等传统方法提高其产量，在分子育种方面尚无突破性进展的文章。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的多杀菌素产生菌多杀菌素产量低的不足，提供一种多杀菌素产量更高的基因工程菌及其制备方法。

本发明人经过广泛的研究和反复的试验，发现多杀菌素分子结构中的鼠李糖和福勒糖胺的共同合成前体的合成步骤是多杀菌素的生物合成途径的限速步骤。因此，本发明人将该共同合成前体的两个合成酶基因——gtt基因及gdh基因，作为外源基因插入多杀菌素产生菌刺糖多孢菌的基因组中，并且使它们高效表达，惊喜的发现，这样得到的刺糖多孢菌突变株的多杀菌素产量大大提高，可见gtt基因及gdh基因的插入使所述的共同合成前体的合成步骤是不在是多杀菌素的生物合成途径的限速步骤，从而提高了多杀菌素的产量，完成了本发明。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种高产多杀菌素的基因工程菌，其是在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)野生菌株的基因组中整合有NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒和NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的基因的表达盒的工程菌。

在基因组中整合入外源基因的表达盒，从而使插入的外源基因表达是现有技术，一般是让该外源基因用启动子启动转录，终止子终止转录即可。本发明中整合入了gtt及gdh基因两个外源基因，可以使用同一个表达盒表达该两个外源基因，但是优选该两外源基因分别有自己的表达盒，这样表达更高效。因此根据本发明，如本领域常规的一样，所述的NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒较佳的依次含有启动子序列、gtt基因的编码序列和终止子。所述的NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的表达盒较佳的依次含有启动子序列、gdh基因的编码序列和终止子。

启动子可以启动基因的转录，从而使基因表达。强启动子的启动效率更高。因此，本发明中，所述的启动子可以采用现有技术中任何可以在刺糖多孢菌中启动转录的启动子，优选刺糖多孢菌的强启动子，较佳的如红霉素抗性基因启动子ErmEP，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明中，所述的基因gtt可以是任何编码NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶的基因；所述的基因gdh可以是任何编码NDP-葡萄糖还原酶的基因。较佳的是来源于刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa的gtt基因和gdh基因。可以是已知基因，如基因gtt是GenBank登录号AF355467中的基因，即其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的第238～1116位所示的序列，基因gdh是GenBank登录号AF355468中的基因，即其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.3的第88～1074位所示的序列。

本发明中，所述的基因gtt和基因gdh的表达盒在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)野生菌株的基因组中的整合位点可以是基因组中的任何位点，较佳的是整合位点是基因gtt或者基因gdh。

本发明中，所述的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)野生菌株可以是任何Saccharopolyspora spinosa属的野生菌株，都可以达到本发明的效果，优选刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)NRRL 18395。

本发明还提供一种重组载体，其含有NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒和NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的基因的表达盒。

本发明中，所述的gtt及gdh基因两个外源基因，可以使用同一个表达盒表达，但是优选该两外源基因分别有自己的表达盒，这样表达更高效。因此根据本发明，如本领域常规的一样，所述的NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒较佳的依次含有启动子序列、gtt基因的编码序列和终止子。所述的NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的表达盒较佳的依次含有启动子序列、gdh基因的编码序列和终止子。所述的启动子可以采用现有技术中任何可以在刺糖多孢菌中启动转录的启动子，优选刺糖多孢菌的强启动子，较佳的如红霉素抗性基因启动子ErmEP，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的序列。所述的基因gtt可以是任何编码NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶的基因；所述的基因gdh可以是任何编码NDP-葡萄糖还原酶的基因。较佳的是来源于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)的gtt基因和gdh基因。可以是已知基因，如基因gtt是GenBank登录号AF355467中的基因，即其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的第238～1116位所示的序列，基因gdh是GenBank登录号AF355468中的基因，即其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.3的第88～1074位所示的序列。

在本发明的重组载体中，所述的基因gtt和基因gdh较佳的是串联在一起的。本发明所述的重组载体的骨架可以是本领域的常规载体，优选质粒pOJ260。质粒pOJ260是穿梭质粒，可以在大肠杆菌中复制，也可以穿梭于放线菌刺糖多孢菌中。

本发明的重组载体的制备方法可以采用本领域的常规的方法，将基因gtt和基因gdh构建到表达盒中，克隆入载体即可。

本发明还提供一种转化子，其含有本发明所述的重组载体。该转化子的宿主细胞可以是本领域的常规宿主，优选大肠杆菌S17-1或者DH5α。

本发明还提供一种制备所述的高产多杀菌素的基因工程菌的方法，包括将所述的转化子与刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)接合，挑选同源单交换接合子。所述的转化子优选宿主为大肠杆菌S17-1。转化子中含有的重组载体的骨架优选质粒pOJ260。所述的刺糖多孢菌优选刺糖多孢菌NRRL18395。转化子含有的重组质粒中的gtt基因或者gdh基因可以和刺糖多孢菌基因组中的gtt基因或者gdh基因发生同源重组，其中的同源单交换重组可以将质粒中gtt基因表达盒和gdh基因的表达盒整合插入基因组中，使gtt基因和gdh基因的倍增，从而高效表达gtt和gdh，提高多杀菌素的产量。

本发明还提供一种制备多杀菌素的方法，包括培养如上所述的任一项基因工程菌，从培养物中获得多杀菌素。其中培养方法、从培养物中获得多杀菌素的方法都是采用现有的常规方法。

本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明通过在基因组中倍增串联连接的gtt基因和gdht基因的策略达到提高多杀菌素产量的效果，从而提高多杀菌素的产量，避免现有技术中整个cosmid质粒大片段的转入方式可能导致对多杀菌素整个PKS的影响。使用多杀菌素本身的启动子达到倍增的效果较差，而本发明中使用了红霉素抗性基因强启动子，并且分别在这两个酶前面连接红霉素抗性基因启动子。红霉素抗性基因启动子是在刺糖多孢菌中能够组成型表达的强启动子，能提高多杀菌素的产量。本发明得到的基因工程菌经过发酵验证，多杀菌素的发酵单位较野生菌株提高三倍以上，并且经过多次传代，发酵单位稳定。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是突变株重组质粒构建过程。

图2是多杀菌素产生菌株两种同源交换方式。

图3是多杀菌素野生菌株与多杀菌素基因工程菌发酵结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究和反复的试验，发现将多杀菌素分子结构中的鼠李糖和福勒糖胺的共同合成前体的两个合成酶基因——NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶(gtt)基因及NDP-葡萄糖还原酶(gdh)基因——串联连接，并且在前面分别连接一个刺糖多孢菌的强启动子——红霉素抗性基因启动子，导入多杀菌素产生菌刺糖多孢菌中，可以大大提高其多杀菌素的产量。因此，本发明在已有多杀菌素产生菌野生菌的基础上通过基因改造构建一株产量更高的多杀菌素基因工程菌，提高多杀菌素的产量。

首先克隆gtt基因和gdh基因，同样克隆红霉素抗性基因启动子(ErmEP)。gtt基因、gdh基因和红霉素抗性基因启动子(ErmEP)都是已知基因，可用常规的方法克隆得到。

接着构建用于定点单交换插入的重组质粒，采用穿梭质粒，如质粒pOJ260串联连接的gtt基因和gdh基因，并且在这两个基因前面分别连接红霉素抗性基因启动子，后面链接终止子，构建成表达盒。

然后用该重组质粒转化大肠杆菌S17-1，获得转化子。该转化子菌株和多杀菌素产生菌野生菌株共培养，发生接合，该重组质粒和多杀菌素产生菌野生菌的基因组发生同源单交换，筛选阳性的接合子，即得到基因组中倍增了高效表达的gtt基因和gdh基因的多杀菌素产生菌突变株，可以高产多杀菌素。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

所使用的工具酶和DNA分子量Marker均购自Takara公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。

所使用的胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，使用方法参考商品说明书。

实施例1 gtt及gdh基因序列及红霉素抗性基因启动子(ErmEP)的克隆

首先根据已经发表的S.spinosad相应序列(GenBank登录号：AF355467及AF355468)设计引物，分别为，扩增gtt的引物是：上游5’-AAATCTAGACGGCAAGAAGAAGG-3’；下游5’-AAATCTAGACCGACCGCATTCG-3’。扩增gdh的引物是：上游5’-AAAAAGCTTCCTGCTTCGTAGCTC-3’；下游5’-AAAAAGCTTACCAAGCCCTGACC-3’。分别以刺糖多孢菌NRRL 18395[购自美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)]的总基因组为模板，使用宝生物公司的primer star高保真聚合酶来进行片段的克隆。PCR条件为：98℃，10s、68℃，15s、72℃，2min。PCR产物电泳后，回收目的条带。PCR产物1、2全长分别为1131bp及2259bp。回收的片段与质粒进行连接，gtt通过PCR产物1(XbaI/XbaI)连接入购自Takara公司的质粒pSP72(XbaI/XbaI)，并测序；gdh通过PCR产物2(HindIII/HindIII)连接入质粒pPS72(HindIII/HindIII)，并测序，两段序列与网上序列(GenBank登录号：AF355467及AF355468)比对同源性均为100％。

以红霉素产生菌株S.erythraea HL 3168E3(购自ATCC)的基因组为模板，上游引物5’-AAACTTAAGAGCCCGACCCGAGCA-3’，下游引物5’-AAACCTAGGTCCGGAGGTCGCACC-3’，进行PCR，所得PCR产物纯化后连接在质粒pSP72(购自promega公司)上，得到质粒pHNJ-III-3，即含有红霉素抗性基因启动子的重组载体。直接酶切质粒pHNJ-III-3得到红霉素抗性基因启动子ErmEP 1(BamHI/EcoRI)。随后以质粒pHNJ-III-3为模板，设计相应的引物(上游引物：5’-AAATCTAGAAGCCCGACCCGAGCA-3’；下游引物：5’-AAAAAGCTTTCCGGAGGTCGCACC-3’)，进行PCR，所得PCR产物纯化后连接在质粒pGEM-3zf(购自上海生工)上，得到质粒pSL-HM-312。直接酶切质粒pSL-HM-312得到红霉素抗性基因启动子ErmEP2(XbaI/HindIII)。

实施例2单交换定点插入质粒的构建、接合转移

ErmEP 1(BamHI/EcoRI)连接入购自Takara公司的质粒pOJ260(BamHI/EcoRI)，得到质粒pYG-1154。ErmEP2(XbaI/HindIII)连接入pYG-1154(XbaI/HindIII)，得到质粒pYG-1157。gtt(XbaI/XbaI)正向连接入pYG-1157(XbaI/XbaI，脱磷处理)，得到质粒pYG-1158。gdh(HindIII/HindIII)正向连接入pYG-1158((HindIII/HindIII)，脱磷处理)，得到质粒pYG-1159。此重组质粒即为倍增了gtt和gdh基因的整合质粒，用此重组质粒转化大肠DH5α，调取转化子在LB中培养，提取质粒进行酶切和PCR验证，最终构建成单交换定点插入质粒pYG-1159。上述质粒构建过程示意图见图1。

斜面培养高产多杀菌素产生菌——刺糖多孢菌NRRL 18395。从斜面挑取适量菌体于50ml TSB中培养72小时左右达到对数生长期，1％接种量转接于50ml TSB培养45小时左右使菌液达到对数生长后期，离心倒去上清得到菌丝体。菌丝体用20ml的LB液体洗涤2次(4000rpm，10min，4℃)，最后重悬于20ml LB，待用。用pYG-1159转化感受态大肠杆菌S17-1(购自Takara公司)，挑转化子至4ml LB(Am 100μg/ml)的小试管中37℃振荡培养12小时，S17-1菌株2％接种于50ml LB的250ml三角瓶，37℃振荡培养2小时左右，使菌液OD值在0.4～0.6之间，将菌液移入50ml的无菌塑料离心管，离心(4000rpm，10min，4℃)，倒去上清，菌体用20ml LB洗涤2次(4000rpm，10min，4℃)，最后重悬于1～2ml LB中，将大肠杆菌菌液与之前的菌丝体按体积比(10∶1、1∶1、1∶10)于EP管中混匀。将混合菌液涂R6平板，用涂棒充分混匀菌液，28℃恒温箱培养。R6平板培养基成分(g/l)：蔗糖200.0，糊精10.0，酪蛋白氨基酸1.0，MgSO₄·7H₂O 0.05，*谷氨酸钠盐11.0，K₂SO₄0.1，*CaCl₂·2H₂O 7.0，*MOPS(0.1mol/l，pH7.2)100.0，*微量元素(ml)1.0ml，琼脂(sigma agar)20.0。注：标示*的部分均分开灭菌，灭后在合并。微量元素组成(mg/l)：ZnCl₂40，FeCl₃·6H₂O 200，CuCl₂·2H₂O 10，MnCl₂·4H₂O 10，Na₂B₄O₄·10H₂O 10，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O10。培养20小时后，取出平板，涂抗生素(940μl ddH₂O+100μl Am+50μlNc/10平板)，再于30℃恒温箱培养。培养一周后出现接合子。

实施例3单交换工程菌的筛选

挑取接合子于含有阿伯拉霉(50μg/ml)的TSB中培养，然后菌液涂于含有阿伯拉霉素(50μg/ml)的斜面培养基(葡萄糖0.3％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，琼脂2.7％，pH 7.0)，在28℃培养。因为pOJ260是自杀型质粒，只有通过同源单交换出来的整合子才具有阿伯拉霉素抗性，才能生长。该接合子可以由两种同源单交换方式得到，示意图见图2。挑取该接合子于4ml TSB的小试管中(Am 50μg/ml、试管中加入2～3粒玻璃珠)，30℃振荡培养，抽提其总DNA。在pOJ260质粒及ErmEP2上设计引物(上游引物：5’-AAATCTAGAAGCCCGACCCGAGCA-3’；下游引物：5’-AAAAAGCTTTCCGGAGGTCGCACC-3’)。该引物从野生菌株——刺糖多孢菌NRRL 18395的基因组扩增不出条带，而从接合子基因组可扩增出500bp或者2.0kb的片段，从而验证得到的扩增出500bp或者2.0kb片段的接合子是的发生了单交换的基因工程菌株。

实施例4产多杀菌素的工程菌的发酵验证

挑取实施例3中能扩增出500bp片断的突变株于斜面培养基(葡萄糖0.3％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，琼脂2.7％，pH 7.0)28℃培养，培养8天后，接种于种子培养液(葡萄糖3.0％，可溶性淀粉1.0％，棉籽饼粉2.0％，黄豆饼粉0.2％，酵母粉0.2％，玉米浆1.0％，碳酸钙0.5％，pH自然)，28℃培养3天后转接于发酵培养基(葡萄糖6.0％，可溶性淀粉3.0％，葵花油0.1％，棉籽饼粉2.0％，鱼粉蛋白胨1.0％，酵母粉0.2％，玉米浆1.0％，碳酸钙0.5％，pH自然)(15％的接种量)。25℃，240r/m培养9天后放瓶，发酵液用草酸调pH至5左右，再加2倍体积的丙酮混匀浸泡5小时以上，离心后取上清做HPLC分析。HPLC条件，流动相：0.2％乙酸铵∶甲醇＝10∶90；流速：1ml/min；柱温：40℃；检测波长：254nm；进样量：5μl；分析柱：Agilent C18。另外，多杀菌素主要由多杀菌素A及D组成，出峰时间分别为约6.5min，7.5min。HPLC分析结果见图3。可见，通过单交换定点插入的工程菌发酵产物中多杀菌素的产量较野生菌株提高三倍以上，发酵单位达到799μg/ml，并且均未出现突变株不产多杀菌素的情况。

实施例5产多杀菌素的工程菌的传代稳定性

挑取实施例3中能扩增出500bp片断的突变株，经过三次传代，在与实施例4相同的斜面培养基中培养，经过与实施例4相同的种子培养基及发酵培养基发酵验证，发酵单位稳定在750μg/ml。说明本发明中构建的多杀菌素产生工程菌具有传代稳定性。

序列表

<110>上海医工院医药科技有限公司，上海医药工业研究院

 

<120>高产多杀菌素的基因工程菌及其制备方法

 

<130>P4-101143C

 

<160>3

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>491

<212>DNA

<213>Saccharopolyspora erythraea

 

<400>1

aggatccccg ggtaccgagc tctccggagg tcgcacccac cgacgacggc gtcagcaggg    60

cgcgggtgct gcccccctgc cggtgactgg gcgccacact ggacatggcg atcttggcgg   120

cggctgccac ggtctgttct ccttcgtgct gagcggtggt cacggatggc cggcggtcag   180

gagtcggggg cggtccagag cttggctgca gatcctacca accggcacga ttgtgcccac   240

aacagcatcg cggtgccacg tgtggaccgc gtcggtcaga tcctccccgc acctctcgcc   300

agccgtcaag atcgaccgcg tgcacctgcg atcgccgatc aaccgcgact agcatcgggc   360

gcaagccgcc actcgaacgg acactcgcat ggacgtcccc ttcctggacc tgcaagccgc   420

gtacctcgaa ctccggtccg acatcgacca ggcgtgccgg cgcgtgctcg ggtcgggctg   480

gtaccgaatt c                                                        491

 

<210>2

<211>1270

<212>DNA

 

<213>刺糖多孢菌(Saccharopolyspora sp.)

 

<400>2

aaggccaccg gcaaggtcgt gcagggcatc tcgcaggacg tcgcgaagaa gatctccaag   60

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cggcgggtgc                                                         1270

 

<210>3

<211>2311

<212>DNA

 

<213>刺糖多孢菌(Saccharopolyspora sp.)

 

<400>3

ggatcctgct tcgtagctcg gtgtgtcatg ccagactgcg cacgcggacc tgcagcgggc    60

cgcgaaatcc cggcgaggaa gggcgcgatg cggattctgg tcaccggcgg agccggtttc   120

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accgaccgca agggccacga ccgccgctac tcggtggacc acagcaagat cgtcgaggaa   960

ctggggtacg cgccgcaggt cgacttcgag accgggctgc gcgagacaat ccgctggtac  1020

caggacaacc gggactggtg ggagccgctg aaggcccgat cggcggtggc tcgatgagtc  1080

gcctcgccgt gctggtgccc ggcggccgcg gccagctggg ctcggagctg gcccggatcc  1140

tcgccgcgcg gacgggggcg ctggtgcacc ggccgggttc cggggaactg gacgtcaccg  1200

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ggccgtacga gccgacggac ccgaccgggc cgcgatcggt ctacgggcgc accaagctcg    1500

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gccgtcgggt cgccgtgggg gaagcggatc c                                   2311

Claims (10)

1.一种高产多杀菌素的基因工程菌，其特征在于，其是在刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa野生菌株的基因组中整合有NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒和NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的基因的表达盒的工程菌。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒依次含有启动子序列、gtt基因的编码序列和终止子；所述的NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的表达盒依次含有启动子序列、gdh基因的编码序列和终止子。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的启动子是红霉素抗性基因启动子ErmEP，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的序列；所述的NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的编码序列是序列表中SEQ ID NO.2的第238～1116位所示的序列；所述的NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的编码序列是序列表中SEQ ID NO.3的第88～1074位所示的序列。

4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa野生菌株是刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosaNRRL 18395。

5.一种重组载体，其特征在于，含有NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒和NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的基因的表达盒。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述的NDP-4-酮-6-脱氧-D葡萄糖的NDP-葡萄糖合成酶基因gtt的表达盒依次含有启动子序列、gtt基因的编码序列和终止子；所述的NDP-葡萄糖还原酶基因gdh的表达盒依次含有启动子序列、gdh基因的编码序列和终止子。

7.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体的骨架是质粒pOJ260。

8.一种转化子，其特征在于，其含有权利要求5～7任一项所述的重组载体。

9.一种制备如权利要求1～4任一项所述的高产多杀菌素的基因工程菌的方法，其特征在于，包括将权利要求8所述的转化子与刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa接合，挑选同源单交换接合子。

10.一种制备多杀菌素的方法，包括培养如权利要求1～4任一项所述的基因工程菌，从培养物中获得多杀菌素。

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