CN101880696B - 发酵生产l-乳酸的方法及该方法所用的菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种L-乳酸发酵生产菌和通过该生产菌发酵生产L-乳酸的方法，本发明提供的L-乳酸发酵生产菌是鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NO：M2010094，具有耐高温高糖的特性，可以大幅度提高L-乳酸的产量。

Description

发酵生产L-乳酸的方法及该方法所用的菌株

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及发酵生产L-乳酸的菌株和发酵生产L-乳酸的方法。

背景技术

乳酸(α-羟基-丙酸)广泛存在于人体、动物及微生物代谢之中，也存在于与人们生活密切相关的多种食品中。乳酸可用于食品、饮料、医药塑料、饲料、农药、日用化工、造纸及电子工业等领域。在食品、饮料工业上，乳酸用作酸味剂、强化剂、防腐剂，是绝对安全的添加剂。乳酸衍生物，如乳酸钙、乳酸锌、乳酸亚铁是食品、饮料、保健品的强化剂，乳酸类乳酸乙酯是多种名酒的主香成分。在医药工业中，乳酸及其衍生物(如乳酸钠)可与氯化钠、氨基酸等配伍，生产治疗高钾血症或酸中毒的大输液，乳酸还被用于罗弗沙星等药物的生产。乳酸酯又是良好的有机溶剂，可用于生产醇酸树脂、油墨和涂料等化工产品。近年来，国际上以L-乳酸开发的聚乳酸PLA是一种新型聚酯材料，其能胜任其他合成塑料的用途，而且具有良好的生物可降解性。比起石油化学合成树脂，其具有独特优异的性能。

目前世界乳酸生产大部分采用发酵法生产，而应用发酵法生产乳酸常用的微生物仅有两大类，一类为细菌，多采用乳酸菌(Lactic acid bacteria)；另一类为霉菌，多采用根霉(Rhizopus)。我国的乳酸发酵工业经过了几十年的发展，工艺上多数采用米根霉发酵大米糖化液进行生产。根霉是好氧真菌，营养要求简单，可以直接以淀粉为碳源，理论转化率为75％。由于生产设备简陋，发酵工艺粗放，电耗、水耗和能耗均较高，而且发酵的转化率偏低，成本难以同国外进口的同类产品竞争。特别是近年来，随着国内粮食和煤炭等重要工业原料价格的大幅度上涨，乳酸行业的成本也随之上升，使许多乳酸企业的生产难以为继。

近年来，采用细菌发酵生产乳酸技术受到重视。常用的菌种有德氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。乳酸菌属于化能异养型微生物，可以在兼性厌氧条件下发酵，设备投资和动力消耗显著降低。乳酸发酵的理论转化率可达100％。一般乳酸细菌最适发酵温度在37～42℃，提高发酵温度后，其产量会大幅度减少。在乳酸生产中，提高乳酸菌的发酵温度可以大大减少工厂生产中冷却水的消耗，降低发酵成本；同时，提高发酵温度可以减少杂菌污染的机会，提高乳酸的纯度，减少倒罐几率等，所以如何改良细菌的高温耐受性逐渐引起了许多国内外研究者的关注。

另外，乳酸发酵生产中，高浓度的葡萄糖和乳酸对乳酸菌的生长和乳酸合成都有强烈的抑制作用，是影响乳酸发酵单位产量的技术瓶颈。如果能通过菌种的选育，实现高葡萄糖浓度、高乳酸浓度的发酵，就可以提高乳酸发酵的强度，达到提高乳酸生产率的目的。

全局转录机制工程(Global transcription machinery engineering，gTME)技术是通过基因工程方法改造全局转录调控因子使整个转录调控过程发生变化从而改变或提高目标基因的转录及表达。此项技术近年来在细胞代谢工程方面已得到成功应用。其中，Hal Alper等在2006年就采用突变TATA结合蛋白的方法在真核生物中筛选到耐受高乙醇和葡萄糖浓度的菌株。随后的2007年Hal Alper又采用gTME技术突变编码σ⁷⁰的rpoD基因，转化大肠杆菌后筛选得到耐受高乙醇、高代谢通量、多样化细胞表型的菌株。另外，刘红梅等利用全局转录工程(gTME)方法将全局转录因子sptl5随机突变并克隆表达，构建突变库。最终筛选得到能够很好的利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖的菌株。因此，gTME技术可以在微生物代谢途径的基因组层面上定向进化或同时改变多个相关基因群，使细胞在整体水平上适应某些物质的代谢或利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵生产L-乳酸的方法，使其具有高产L-乳酸的特点。

本发明还提供一种L-乳酸发酵生产菌，使其具有耐高温高糖和高产的特点。

本发明还提供这种耐高温高糖的高产L-乳酸生产菌的构建方法。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的这种发酵生产L-乳酸的方法，是在培养基中通过微生物发酵来生产L-乳酸，所述的微生物是鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NO：M2010094，所述的培养基为含高糖的培养基，该含高糖的培养基的成分为：葡萄糖100-150g/L、酵母粉5-20g/L。本发明发酵生产L-乳酸方法的发酵过程是在50℃-55℃之间进行。

本发明提供的通过鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03 CCTCCNO：M2010094发酵来生产L-乳酸的具体方法包括以下步骤：

a.活化菌株：配制MRS培养基，调节MRS培养基pH值为6.0-7.0，于121℃灭菌30min；将保存的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NO：M2010094菌株接种至100mL的MRS培养基，于42℃、150rpm摇床中培养过夜，得到活化菌株；

b.种子制备：将活化菌株按5-10％(v/v)接种量接种于MRS培养基中，将其置于42℃、150rpm摇床中培养16h，完成种子制备；

c.发酵：配制高糖发酵培养基，将配制好的高糖发酵培养基于121℃灭菌30min后冷却到50-55℃；再将制备好的种子按5-10％(v/v)接种量接种于高糖发酵培养基，于50℃-55℃搅拌转速100rpm下发酵，发酵过程中以6mol/L的NaOH作为中和剂将发酵液中pH控制在5.5-6.5之间；

d.补料：在发酵24h后，不断补充葡萄糖使发酵体系中的糖含量维持在100-150g/L，持续补糖24h，然后停止补糖，继续发酵24至30h至残糖降低到1g/L以下后停止发酵，得L-乳酸。

在本发明一个实施例中，MRS培养基的组织成分是：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，吐温801mL，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4.4H2O 0.25g/L；调节MRS培养基pH值的具体方法是：以6mol/L的NaOH调MRS培养基pH值至pH6.8。

本发明提供的发酵生产L-乳酸的方法，乳酸终产量达到220g/L，转化率达到90％。

本发明提供的L-乳酸发酵生产菌，是通过利用全局转录工程(gTME)方法将细菌RNA聚合酶的σ因子随机突变，构建突变库，将突变基因连接到表达载体pBBR1MCS-5上，转化鼠李糖乳杆菌中表达，经培养基初筛获得的耐高温、高糖和高乳酸浓度的高产L-乳酸重组菌株。该菌株已经于2010年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉)，保藏号为CCTCC NO：M2010094，名称为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03。

本发明所提供的L-乳酸发酵生产菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)σ因子的编码序列的扩增：

根据genbank公布的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus HN001contig00032基因组序列，设计一对引物，以Lactobacillus rhamnosus总DNA为模板，PCR扩增得到σ因子的编码序列。

(2)σ因子上游控制序列的扩增：

根据genbank公布的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus HN001contig00032基因组序列，设计一对引物，以Lactobacillus rhamnosus总DNA为模板，PCR扩增得到σ因子上游控制序列。

(3)σ因子完整的表达序列的构建：

根据σ因子编码序列和其上游控制序列，设计一对融合引物，以上述步骤(1)和(2)获得的片段为模板，进行融合PCR，得到σ因子和其上游控制序列的融合基因片段，然后将此融合基因连接到pGEM-T载体上进行保存和测序。

(4)σ因子表达序列中随机突变的引入：

根据σ因子编码序列和其上游控制序列，设计一对带酶切位点的引物，以融合基因为模板，进行易错PCR扩增。

(5)σ因子表达载体的构建：

将易错PCR产物回收后和载体pBBR1MCS-5同时进行双酶切，然后用T4连接酶将双酶切后的融合基因和pBBR1MCS-5载体连接。将随机突变的σ因子表达序列插入pBBR1MCS-5载体的多克隆位点，构成σ因子表达载体。

(6)σ因子表达载体导入鼠李糖乳杆菌：

将正常的乳酸杆菌接种至MRS液体培养基中静置培养12小时后，向其中加入氨苄青霉素，静置培养3小时后。将上述培养液离心后弃上清。将上述乳酸杆菌细胞沉淀用PEB溶液清洗，重复两次。最后用预冷的PEB溶液和50％的甘油混匀后分装，即得到乳酸杆菌的感受态细胞液。将连接产物加入乳酸杆菌的感受态细胞溶液中，转移到电极杯中冰浴后进行电转化。然后用高渗MRS培养基恒温培养5个小时。然后吸取培养液涂布到含庆大霉素的固体培养基上培养，筛选转化子。

(7)耐高温、高糖的高产乳酸菌的筛选：

将转化子分别划线至葡萄糖浓度为150～200g/L、乳酸浓度为50～100g/L的培养基上，培养基中均加入65ug/ml的庆大霉素。放置42℃进行筛选转化阳性菌株。再划线至高糖平板上50℃-55℃，进行再筛选。将筛选得到的转化子提取质粒。用限制性内切酶进行双酶切验证，再以经过酶切验证后的质粒为模板，以F-BamHI、R-HindIII为引物进行PCR验证。

附图说明：

图1为σ因子的编码序列的PCR电泳图。

图2为σ因子上游控制序列的PCR电泳图。

图3为σ因子的编码序列和σ因子上游控制序列的融合PCR电泳图。

图4为融合PCR产物连接PGEM-T载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后PCR验证。

图5为σ因子表达序列易错PCR电泳图

图6为σ因子表达序列易错PCR产物BamHI、HindIII双酶切电泳图。

图7为载体PBBR1MCS-5经BamHI、HindIII双酶切后电泳图。

图8为在高糖、高乳酸、含庆大霉素的MRS固体平板上，55℃高温筛选得到的转化子图。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施方式

实施例1

(1)σ因子的编码序列的扩增；

根据genbank公布的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus HN001contig00032基因组序列，利用OLIGO 6.0引物设计软件设计如下一对引物：

LRsigma-up：5’-ATGGCTGATAAAAAAACAGCAAC-3’

LRsigma-down：5’-TTATTCAAGAAAATCCTTAAGCTGC-3’

在50μL的反应体系中，上述两条引物的浓度均为1pmol/μL；dNTP各20pmol/μL；Mg²⁺15pmol/μL；Lactobacillus rhamnosus基因组DNA模板10pmol；Pfu DNA聚合酶2.5U。PCR扩增条件为：95℃5min；94℃1min，57℃1min，72℃2min，进行30个循环；72℃10min。

将PCR产物用0.9％的琼脂糖凝胶电泳(J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南第三版，2002年版)，结果显示得到一条约1251bp的特异片段，与预期扩增的目的片段大小吻合。PCR产物的回收采用3s柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒(购自上海申能博彩生物技术科技有限公司)。回收后的片段-20℃保存备用。

(2)σ因子上游控制序列的扩增；

根据genbank公布的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus HN001contig00032基因组序列，设计如下一对引物：

Psigma-up：5’-ACTTGCTTTTCTTGATTCATCAGGCT-3’

Psigma-down：5’-TCCGGCGATATCAGCTCACT-3’

在50μL的反应体系中，上述两条引物的浓度均为1pmol/μL；dNTP各20pmol/μL；Mg²⁺15pmol/μL；Lactobacillus rhamnosus基因组DNA模板10pmol；Pfu DNA聚合酶2.5U。PCR扩增条件为：95℃5min；94℃1min，52℃1min，72℃1min，进行30个循环；72℃10min。

将PCR产物用0.9％的琼脂糖凝胶电泳(J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南第三版，2002年版)，结果显示得到一条约185bp的特异片段，与预期扩增的目的片段大小吻合。PCR产物的回收采用3s柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒(购自上海申能博彩生物技术科技有限公司)。回收后的片段-20℃保存备用。

(3)σ因子完整的表达序列的构建；

根据σ因子编码序列和其上游控制序列，设计一对融合引物如下：Psigma-RH：

5’-GTTGCTGTTTTTTTATCAGCCATTCCGGCGATATCAGCTCACT-3’LRsigma-RH：

5’-AGTGAGCTGATATCGCCGGAATGGCTGATAAAAAAACAGC AAC-3’

以上述步骤(1)获得的片段为模板，以LRsigma-RH和LRsigma-down为引物进行PCR得到sigma factor的中间融合基因片段，记为LRsigma-RH-M。在50μL反应体系中：上述两条引物的浓度均为1pmol/μL；dNTP 20pmol/μL；Mg²⁺15pmol/μL；步骤(1)获得的片段为模板10pmol；Pfu DNA聚合酶2.5U。PCR扩增条件为：95℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃2min，进行30个循环；72℃10min。

以上述步骤(2)获得的片段为模板，以Psigma-up和Psigma-RH为引物进行PCR得到sigma factor promoter的中间融合基因片段，记为Psigma-RH-M。在50μL反应体系中：上述两条引物的浓度均为1pmol/μL；dNTP各20pmol/μL；Mg²⁺15pmol/μL；步骤(2)获得的片段为模板10pmol；Pfu DNA聚合酶2.5U。PCR扩增条件为：95℃5min；94℃1min，53℃1min，72℃1min，进行30个循环；72℃10min。

在不添加引物的情况下先以Psigma-RH、LRsigma-RH互为引物进行预PCR得到中间产物。在50μL反应体系中：LRsigma-RH-M和Psigma-RH-M的浓度均为10pmol；dNTP 20pmol/μL；Mg²⁺15pmol/μL；Pfu DNA聚合酶2.5U。PCR扩增条件为：94℃1min，58℃1min，72℃5min.共15个循环。

以此中间产物为模板，采用如下程序PCR程序进行进一步的融合PCR得到融合基因。在50μL反应体系中：引物Psig-up和LRsigma-down的浓度均为1pmol/μL；dNTP 20pmol/μL；Mg²⁺15pmol/μL；中间产物的片段为模板10μL；Taq DNA聚合酶5U。PCR扩增条件为：95℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃2min，进行30个循环；72℃10min。

然后将此融合基因连接到pGEM-T载体上进行保存和测序。连接体系如下：

PCR产物     10μL

pGEM-T      0.5μL

T4Buffer    7μL

T4Ligase    0.5μL

4℃过夜连接反应，反应结束后65℃保温10分钟，以灭活T4连接酶。

将连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃，150转摇床上温育培养1小时，然后取100μL温育液涂布含20ug/ml氨苄青霉素的LB平板上，14小时候可得到阳性克隆。挑取阳性克隆到含有100ug/ml氨苄青霉素的1.5ml离心管中37℃，150转培养约7小时，管中可见菌体，取菌液进行菌液PCR程序鉴定阳性克隆。在50μL反应体系中：引物Psig-up和LRsigma-down浓度均为1pmol/μL；dNTP 20pmol/μL；Mg²⁺15pmol/μL；1μL菌液为模板；Pfu DNA聚合酶2.5U。PCR扩增条件为：95℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃2min，进行30个循环；72℃10min。结果显示阳性转化子为100％。

将菌液PCR验证的阳性转化子继续培养至OD值约为1.2，将该菌液送到上海桑尼生物科技有限公司进行测序。该编码序列具有如序列表SEQ ID No.1所示的序列，与报道的σ因子的编码序列的一致性大于99％。

(4)σ因子表达序列中随机突变的引入；

根据σ因子编码序列和其上游控制序列，设计一对带酶切位点的引物如下：

F-BamHI：5’GGCGGATCCACTTGCTTTTCTTGATTCAT 3’

R-HindIII：5’CAGAAGCTTTTATTCAAGAAAATCCTT3’

采用易错PCR试剂盒(购自吉林蓝罡生物科技有限公司)引入突变。在50μL的反应体系中，上述两条引物的浓度均为1pmol/μL；ER dNTP 20pmol/μL；10×ERBuffer1 10μL；10×ER Buffer2 10μL；融合基因为模板10pmol/μL；Taq DNA聚合酶5U。PCR扩增条件为：95℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃1min，进行35个循环；72℃10min。

将PCR产物用0.9％的琼脂糖凝胶电泳(J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南第三版，2002年版)，结果显示得到一条约1454bp的特异片段，与预期扩增的目的片段大小吻合。PCR产物的回收采用3s柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒(购自上海申能博彩生物技术科技有限公司)。

(5)σ因子表达载体的构建；

将易错PCR产物回收后和载体pBBR1MCS-5同时进行双酶切，根据易错PCR扩增基因所用的引物两端的酶切位点为BamHI、HindIII，该PCR用限制性内切酶BamHI、HindIII进行酶切，产生粘性末端的DNA片段，为下一步的互补粘性末端连接做准备，具体步骤：

PCR产物酶切反应体系(50μL)：

PCR回收产物   25μL

BamHI         0.6μL

HindIII         1.2μL

Buffer BamHI    5μL

H₂O             18.2μL

载体pBBR1MCS-5酶切反应体系(50μL)：

pBBR1MCS-5      25μL

BamHI           0.6μL

HindIII         1.2μL

Buffer BamHI    5μL

H₂O             18.2μL

37℃反应过夜。酶切后的DNA溶液于65℃保温20分钟，使内切酶BamHI、HindIII失活。酶切产物的回收采用3s柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒(购自上海申能博彩生物技术科技有限公司)。

然后用T4连接酶将双酶切后的融合基因和pBBR1MCS-5载体连接，将随机突变的σ因子表达序列插入pBBR1MCS-5载体的多克隆位点，构成σ因子表达载体。具体步骤：经过相同双酶切并且纯化的PCR产物和载体pBBR1MCS-5的酶连接体系为(12μL)：

PCR产物             5.5μL

pBBR1MCS-5载体      2μL，

PEG4000             0.8μL

T4Ligase Buffer     1.2μL，

T4Ligase            0.5μL。

16℃过夜连接反应，反应结束后65℃保温10分钟，以灭活T4DNA连接酶。

(6)σ因子表达载体导入鼠李糖乳杆菌；

将正常的乳酸杆菌稀释后涂布MRS固体培养基，24小时后挑取单菌落到20mlMRS液体培养基中培养20小时。按照2％的比例取菌液接种到100mlMRS液体培养基中静置培养12小时，向其中加入终浓度为25ug/ml的氨苄青霉素，继续静置培养3小时至OD值＝0.5-0.8。将上述培养液分装至50ml离心管中，4℃，7000转/分钟离心10分钟，弃上清。将上述乳酸杆菌细胞沉淀每管用0.5ml的4℃预冷的PEB溶液(蔗糖272mmol/L、MgCl₂0.5mmol/L、KH₂PO₄0.5mmol/L)清洗，在4℃，6500转/分钟离心5分钟，重复两次。最后每管用1ml预冷的PEB溶液，2ml 50％的甘油混匀后60μL/管进行分装，即得到乳酸杆菌的感受态细胞液，-80℃保存备用。

将连接产物加入乳酸杆菌的感受态细胞溶液中，冰浴10分钟。再转移到预冷的电极杯中，冰浴2分钟。将电极杯置于电转化仪(Eppendorf AG22331NO.430830095)中，采用2000V电压电击乳酸杆菌细胞溶液，时间为4ms。然后向上述电极杯中加入1ml 4℃预冷的高渗MRS培养基。混匀后转移到离心管中37℃的恒温培养箱中培养5小时。然后，4℃、1000转离心30秒，去除部分上清，后吸取100μL的培养液到含65ug/ml的庆大霉素固体培养基上涂布均匀后，42℃培养24小时筛选转化子。

(7)耐高温、高糖的高产乳酸菌的筛选

用牙签挑取筛选得到的转化子分别划线至葡萄糖浓度为180g/L、乳酸浓度为90g/L的培养基上，培养基中均加入65ug/ml的庆大霉素。放置42℃进行筛选。将筛选到的菌株再划线至高糖平板上50℃-55℃，进行再筛选。将筛选得到的转化子采用AxyPrep质粒小量试剂盒(购自爱思进生物技术有限公司)小量提取质粒。用限制性内切酶BamHI、HindIII进行双酶切验证，再以经过酶切验证后的质粒为模板，以F-BamHI、R-HindIII为引物进行PCR验证，在50μL反应体系中：引物F-BamHI、R-HindIII浓度均为1pmol/μL；dNTP各20pmol/μL；Mg²⁺15pmol/μL；质粒DNA为模板；Pfu DNA聚合酶2.5U。PCR扩增条件为：95℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃2min，进行30个循环；72℃10min。将PCR产物用0.9％的琼脂糖凝胶电泳(J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南第三版，2002年版)，结果显示得到一条约1454bp的特异片段，与预期扩增的目的片段大小吻合。说明已经成功获得含有重组表达质粒的工程菌。

实施例2本发明耐高温、高糖的高产乳酸菌株的乳酸发酵

a.活化菌株：配制MRS培养基，MRS培养基的组织成分是：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，K2HPO42g/L，柠檬酸铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，吐温801mL，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4.4H2O 0.25g/L；以6mol/L的NaOH调MRS培养基pH值至pH6.8，于121℃灭菌30min；将保存的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HRO3 CCTCC NO：M2010094菌株接种至100mL的MRS培养基，于42℃、150rpm摇床中培养过夜，得到活化菌株；

b.种子制备：将活化菌株按5-10％(v/v)接种量接种于MRS培养基中，将其置于42℃、150rpm摇床中培养16h，完成种子制备；

c.发酵：配制发酵培养基，将配制好的发酵培养基于121℃灭菌30min后冷却到50-55℃；再将制备好的种子按5-10％(v/v)接种量接种于发酵培养基，于50℃-55℃搅拌转速100rpm下发酵，发酵过程中以6mol/L的NaOH作为中和剂将发酵液中pH控制在5.5-6.5之间；

d.补料：在发酵24h后，不断补充葡萄糖使发酵体系中的糖含量维持在100-150g/L，持续补糖24h，然后停止补糖，继续发酵24至30h至残糖降低到1g/L以下后停止发酵，得L-乳酸。测定L-乳酸产量。乳酸终产量达到220g/L，转化率达到90％。

序列表

<110>华中科技大学

<120>一种耐高温高糖的高产L-乳酸生产菌及其构建方法

<130>/

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1436

<212>DNA

<213>人工

<400>1

acttgctttt cttgattcat caggctatac tatatcttgt attattatgc cgatagacta    60

tataaaagtc gcatttcacg tcagaagtgc gactttttac cgctatttca atcggttcaa    120

gtcgtggtgg cgcaatgctt gcaatgctat tcgccatggg aagggagtga gctgatatcg    180

ccggaatggc tgataaaaaa acagcaactg aagtaagcaa gaccacaaag aagacaacgg    240

ctgcagcttc aaccaaagca gcaaccgaat caaaggctgc gaccaagaag accgcaacca    300

agaaaacaac ggccaagaag actaccgcta gcaagagtca cacaacgact aaggcttatg    360

atgatgccgt caaagctgtc atcatagatt ataagaagaa aaagcagatc accgaagacg    420

atttaacctc taaactgatc aagccatttg agctaaagag taccgccatc gatgatttaa    480

tgcagaaaat cgaagacaac gggatcgcga ttgttgacga aaacggcgaa ccggccacga    540

tcagcctcaa gaagcaaaaa aaggtttcca agaaggaaat gagcgatatg tccgcgccat    600

ccggggttaa gattaacgac ccagtgcgga tgtatcttaa ggaaatcggc cgggtttcat    660

tgctgaccgc tgatgaagaa gttgcccttg ctttgaagat cgaacaaggt gatcaagaag    720

ccaagcaacg actggccgaa gctaacttac gactggtggt ttctattgct aagcgctacg    780

ttggtcgtgg catgcagttt ctggatttga ttcaggaagg taacatgggc ttgatgaagg    840

cggtcgagaa gtttgattac cgcaaaggct tcaagttctc cacctacgcc acctggtgga    900

ttcggcaggc gatcacccgc gcgattgctg accaagcccg gacgattcga attcctgttc    960

atatggttga aaccattaat aaactgattc ggattcagcg tcaactgctt caggatcttg    1020

gccgcgaacc aactcctgaa gaaatcggtg ccgagatgga tatgccaacc gaaaaagtcc    1080

gcgaaatttt gaagatcgcc caagagccag tgtccttgga aacgccaatc ggtgaagagg    1140

acgattcaca cctcggcgac ttcattgaag accaagacgc taccagacca gaagatcacg    1200

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tgcggaaact ccgccacccg agccgttcca agcagcttaa ggattttctt gaataa        1436

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<400>2

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<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<400>3

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<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工

<400>4

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<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<400>5

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<210>6

<211>43

<212>DNA

<213>人工

<400>6

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<211>43

<212>DNA

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<400>7

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<210>8

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<212>DNA

<213>人工

<400>8

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<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cagaagcttt tattcaagaa aatcctt                 27

Claims (8)

1.一种发酵生产L-乳酸的方法，该方法是在培养基中通过微生物发酵来生产L-乳酸，其特征在于，所述的微生物是鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）HR03，其保藏号为CCTCC NO：M2010094。

2.根据权利要求1所述的发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于，所述的培养基为含高糖的培养基，所述的含高糖的培养基的成分为：葡萄糖100-150g/L、酵母粉5-20g/L。

3.根据权利要求1所述的发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于，所述的发酵过程在50℃-55℃之间进行。

4.根据权利要求1所述的发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于，通过鼠李糖乳杆菌HR03发酵来生产L-乳酸具体方法包括以下步骤：

a.活化菌株：配制MRS培养基，调节MRS培养基pH值为6.0-7.0，于121℃灭菌30min；将保存的鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）HR03 CCTCC NO:M2010094菌株接种至100mL的MRS培养基，于42℃、150rpm摇床中培养过夜，得到活化菌株；

b.种子制备：将活化菌株按5-10%（v/v）接种量接种于MRS培养基中，将其置于42℃、150rpm摇床中培养16h，完成种子制备；

c.发酵：配制发酵培养基，将配制好的发酵培养基于121℃灭菌30min后冷却到50-55℃；再将制备好的种子按5-10%（v/v）接种量接种于发酵培养基，于50℃-55℃搅拌转速100rpm下发酵，发酵过程中以6mol/L的NaOH作为中和剂将发酵液中pH控制在5.5-6.5之间；

d.补料：在发酵24h后，不断补充葡萄糖使发酵体系中的糖含量维持在100-150g/L，持续补糖24h，然后停止补糖，继续发酵24至30h至残糖降低到1g/L以下后停止发酵，得L-乳酸。

5.根据权利要求4所述的发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于，所述的MRS培养基的组成成分是：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，K₂HPO₄ 2g/L,柠檬酸铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，吐温80 1mL，MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，MnSO₄.4H₂O 0.25g/L。

6.根据权利要求4所述的发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于，步骤a中调节MRS培养基pH值的具体方法是：以6mol/L的NaOH调MRS培养基pH值至pH6.8。

7.根据权利要求4所述的发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的成分为：葡萄糖100-150g/L、酵母粉5-20g/L。

8.一种L-乳酸发酵生产菌，其特征在于，该菌是鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）HR03，其保藏号为CCTCC NO：M2010094。 

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