CN110184291A

CN110184291A - 一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其应用

Info

Publication number: CN110184291A
Application number: CN201910476834.2A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 胡梦凯; 夏伟; 吴丹
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-06-03
Filing date: 2019-06-03
Publication date: 2019-08-30

Abstract

本发明涉及一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其在酶重组表达中的应用，属于基因工程技术领域。本发明所述非甲醇诱导毕赤酵母表达载体是将乳酸克鲁维酵母自主复制序列PARS2和毕赤酵母启动子P_GCW14序列插入载体骨架，属于带自我复制序列的游离型载体构建得到的。利用该载体构建的游离型重组毕赤酵母工程菌相对通用的整合型重组毕赤酵母工程菌，分泌生产重组酶的能力显著提升。此外，其发酵原料来源广泛，生产成本较低。

Description

一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其应用

技术领域

本发明涉及一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

毕赤酵母表达系统主要包括诱导型表达系统和组成型表达系统。诱导型表达系统中常使用启动子为甲醇代谢启动子P_AOX1，通过甲醇诱导的表达系统相对于组成型表达系统也有自身的一些劣势。第一，生产时间长，毕赤酵母系统所使用的诱导剂为甲醇，而毕赤酵母对甲醇的利用率和同化效率都较低，其菌体生物量在诱导阶段增长十分缓慢，过量的甲醇积累甚至会对菌体产生一定毒性，与此相应，目标蛋白在诱导阶段的积累速度也较慢，导致生产时间较长。第二，毕赤酵母为好氧微生物，甲醇的代谢也需要大量的氧气，这直接导致溶氧成为生产过程中的限制因素。第三，毕赤酵母在表达外源蛋白时需要大量甲醇作为碳源和诱导剂，大量甲醇的长时间储存带来了安全隐患，另外，甲醇还属于剧毒物质，不适用于食品方面的应用，因而制约了P_AOX1表达载体在食品领域的大规模应用。组成型表达系统是最近几年广泛使用的毕赤酵母表达系统，其中三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(P_GAP)是较为常用的同生长相偶联的组成型表达系统启动子，可以利用甘油或者葡萄糖等碳源生长并高效表达外源基因，具有不需要更换碳源、操作便捷、发酵周期短、耗氧低的优点。组成型表达系统对于表达食品行业用酶制剂具有重要的意义。

外源基因可以整合进宿主基因组进行表达，也能以游离质粒的形式进行表达。整合型表达具有遗传稳定的优点，而游离型表达具有拷贝数高的优点，所以通过构建游离型载体表达异源蛋白的潜力巨大。

广义的木聚糖酶是指能将半纤维素木聚糖彻底降解的一组酶的总称，包括内切β-1,4-木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanohydrolase EC 3.2.1.8.)、β-1,4,-木糖苷酶(β-1,4,-D-xylanxlylohydrolase EC 3.2.1.37)、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase EC 3.2.1.55)、乙醛木聚糖苷酶和α-葡萄糖醛酸等，其中内切β-1,4-木聚糖酶是降解木聚糖主要的酶。能够生产木聚糖酶的微生物已经达到几十个属、一百多个种，包括细菌、真菌、放线菌等，本发明采用Streptomyces sp.FA1来源的木聚糖酶(XynA,GenBank accession no.JX560161)作为重组表达基因材料。

从上世纪70年代开始，木聚糖酶的应用领域从工业饲料生产发展到食品、造纸、能源等多个行业领域。在造纸方面，木聚糖酶可以通过使纸浆中的纤维降解，增大纤维细胞壁的通透性，使木素更容易提取出来，同时，破坏木素碳水化合物的连接，加大漂白液与木素的接触程度，从而使漂白效果显著增强且降低漂白废液对环境的污染。在饲料方面，添加木聚糖酶可以降低木聚糖表现出抗营养现象，减少食糜黏度，使消化酶与食物相接触，增加动物养分吸收利用率。在食品方面，可以用于面制品烘焙，能够改善面制品的品质。在保健食品中，木聚糖酶水解木聚糖β-1,4-糖苷键使其形成可溶性戊糖混合物，改善人们对非消化性碳水化合物的吸收，帮助人体控制体重和血糖、吸收营养物质和预防疾病等功能。迄今为止，国内外已报道了400多种木聚糖酶基因，大多数木聚糖酶在野生菌中表达量仅在10-20IU/mL。而通过非甲醇诱导表达载体在毕赤酵母中表达相同来源的木聚糖酶基因，经高密度发酵后，其发酵上清重组木聚糖酶的表达量也不高于343U/mL。

与木聚糖酶类似，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)也是一种在食品、饲料和医药行业应用广泛的重要酶制剂品种,能够随机水解甘露聚糖主链上的屮β-1,4-糖苷键，生成具有多种功能活性的甘露寡糖。目前应用较好的主要为黑曲霉来源的β-甘露聚糖酶，主要通过甲醇诱导型毕赤酵母进行重组表达生产，而利用组成型表达载体进行非甲醇诱导的重组表达水平普遍低于1000U/mL。

因此，提供一种能够稳定提高酶重组表达水平的游离表达型毕氏酵母重组菌及其构建方法，对于生产毕赤酵母外源蛋白具有很高的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种游离型非甲醇诱导的毕赤酵母表达载体，所述游离型非甲醇诱导的毕赤酵母表达载体是将乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)自主复制序列PARS2和毕赤酵母启动子P_GCW14序列插入载体骨架，构建获得的游离型非甲醇诱导表达载体，所述自主复制序列PARS2含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述启动子P_GCW14含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pGCW14ZαA-PARS2，所述pGCW14ZαA-PARS2是将质粒pGAPZαA中的P_GAP启动子替换成启动子P_GCW14，再将核苷酸序列如SEQ ID NO:1的PARS2复制子连接到pGCW14ZαA质粒上得到游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体pGCW14ZαA-PARS。

本发明的第二个目的是提供含有上述毕赤酵母表达载体的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的木聚糖酶。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的β-甘露聚糖酶。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母KM71、GS115或SMD168。

本发明的第三个目的是提供一种上述细胞的构建方法，包括如下步骤：

(1)合成自主复制序列PARS2和启动子P_GCW14序列；将质粒pGAPZαA中的启动子P_GAP用启动子P_GCW14替换，获得pGCW14ZαA质粒；

(2)将所得PARS2基因与质粒pGCW14ZαA相连，得到表达载体pGCW14ZαA-PARS2；

(3)将目的基因与步骤(2)中的表达载体pGCW14ZαA-PARS2相连，得到重组载体；

(4)将重组载体转化到毕赤酵母中，得到所述毕赤酵母重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述转化使用电击转化法。

本发明的第四个目的是提供上述细胞在生产木聚糖酶或β-甘露聚糖酶中的应用，所述应用包括以下步骤：

(1)以权利要求1所述毕赤酵母重组菌为生产菌株，活化后，28-32℃、200-220rpm条件下培养20-30h，得一级种子发酵液；

(2)以2.5％接种量接种一级种子发酵液至种子培养基中，28-32℃、200-220rpm条件下培养20-30h，得二级种子发酵液；

(3)以10％的接种量将二级种子发酵液接种至发酵培养基中28-32℃、200-220rpm进行发酵70-120h。

在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基为YPD培养基；所述发酵培养基为BSM培养基；其中BSM培养基包括如下成分：85％磷酸26.7mL/L，CaSO₄ 0.93g/L，K₂SO₄18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM1 4.35mL/L，上述成分均溶于水中形成所述BSM培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述方法中补料配方为80％甘油、1.25％PTM1；甘油和PTM1溶于水中形成所述补料。

本发明的第五个目的是提供所述游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体及其构建的毕赤酵母重组菌在饲料、食品、纺织或化工领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明所述非甲醇诱导毕赤酵母表达载体是将乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)自主复制序列PARS2和毕赤酵母启动子P_GCW14序列插入载体骨架，属于带自我复制序列的游离型载体构建得到的。利用该载体构建的游离型重组毕赤酵母工程菌相对通用的整合型重组毕赤酵母工程菌，分泌生产重组酶的能力显著提升。此外，其发酵原料来源广泛，生产成本较低。

以木聚糖酶为例，将Streptomyces sp.FA1来源的木聚糖酶(XynA)基因整合到含自主复制序列PARS2和P_GCW14启动子的游离型质粒中再转入毕赤酵母，使其分泌木聚糖酶。同整合型表达菌株相比，采用游离型表达载体表达木聚糖酶产量相比提高了969％，同时表达的酶的比活力提高了343％，从而显著降低了工业化生产木聚糖酶的生产成本。

以β-甘露聚糖酶为例，将黑曲霉来源的β-甘露聚糖酶基因整合到含自主复制序列PARS2和P_GCW14启动子的游离型质粒中再转入毕赤酵母，成功表达β-甘露聚糖酶。经3.6L发酵罐高密度发酵后，发酵上清的酶活为1545.2U/mL，蛋白含量为4.79g/L，比活为322.6U/g，其在食品行业具有巨大的应用潜力。

附图说明

图1：重组质粒pGCW14ZαA-PARS2-XynA的构建过程图。

图2：pGCW14ZαA-PARS2-XynA重组质粒的双酶切验证图。

图3：pGCW14ZαA-PARS2-XynA重组菌3.6L发酵罐发酵上清实时SDS-PAGE电泳图。

图4：pGCW14ZαA-PARS2-XynA重组菌3.6L发酵罐发酵上清实时酶活图。

图5：pGCW14ZαA-PARS2-甘露聚糖酶重组菌3.6L发酵罐发酵上清实时酶活图。

图6：pGCW14ZαA-PARS2-甘露聚糖酶重组菌3.6L发酵罐发酵上清实时SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

(一)酶活的定义及测定方法：

木聚糖酶：

将0.5g的木聚糖溶于100mL，50mmol/L，pH 5.5的磷酸缓冲液充分混匀，取1mL底物，在55℃预热10min，加入1mL的酶液，反应10min后加入3mL DNS，煮沸10min迅速冷却，加蒸馏水定容至20mL，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂同样操作作为空白对照)。

在上述条件下，将每分钟水解木聚糖糖生成1μmol的木糖所需酶量定义为木聚糖酶的一个单位的酶活力(U)。

甘露聚糖酶：

将0.5g的角豆胶溶于100mL，50mmol/L，pH 5的柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液充分混匀，取2.4mL底物，在50℃预热10min，加入0.1mL的酶液，反应10min后加入2.5mL DNS，煮沸10min迅速冷却，加蒸馏水定容至15mL，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂同样操作作为空白对照)。

在上述条件下，一个酶活力单位(单位U/mL):在最适反应条件下，1min水解底物得到1μmol的甘露糖所需要酶的量。

实施例1游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体pGCW14ZαA-PARS2的构建

通过菌落PCR，以野生毕赤酵母KM71单菌落为模板，设计序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物：GTCATGCATGAGATCCAGGTGAACCCACCTAACT，序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物：TCTCATCGTTTCGAATTTGTTGTTTGAGTGAAGCG。通过聚合酶链式反应获得启动子P_GCW14序列片段。将回收得到启动子P_GCW14序列片段，通过infusion酶将pGAPZαA载体中的P_GAP启动子替换成启动子P_GCW14，构建得到表达载体pGCW14ZαA。

利用全基因合成技术合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的自主复制序列PARS2；将回收得到的PARS2序列片段，用infusion酶与质粒pGCW14ZαA相连，构建得到表达载体pGCW14ZαA-PARS2。

实施例2 pGCW14ZαA-PARS2在生产木聚糖酶中的应用

一、游离型pGCW14ZαA-PARS2-XynA重组菌的构建

以质粒pMD18-T-XynA(构建方法见文献：A xylanase from Streptomycessp.FA1:heterologous expression,characterization,and its application inChinese steamed bread，Yang Xu，Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology，May 2016，Volume43，Issue5，pp 663–670)为模板，设计序列如SEQ IDNO.5所示的正向引物：CCGGAATTCATGGCCGAGAACACCCTT，序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物：ATTTGCGGCCGCTCAGGTGCGGGTCCAGCGTT。通过聚合酶链式反应获得具有Not I和EcoR I酶切位点的XynA片段。

PCR反应体系(50μL)：

PCR程序：94℃，4min(预变性)；98℃，10s(变性)；60℃，5s(退火)；72℃，90s(延伸)；设置30个循环；72℃，10min(保温)后设置保藏温度为4℃。将PCR产物进行胶回收、酶切回收目的基因将其与表达载体pGCW14ZαA-PARS2进行双酶切，并于16℃连接过夜，转化E.coli JM109，涂布含zecoin抗性的LB平板，37℃培养8-10h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，阳性克隆子即pGCW14ZαA-PARS2-XynA。见图1和图2。

重组质粒pGCW14ZαA-PARS2-XynA的转化：

(1)从乙醇中取出电转杯，置于超净台中吹干，并置于冰中预冷备用；

(2)在冰上进行以下操作：将重组游离质粒pGCW14ZαA-PARS2-XynA预冷，吸取5μL快速与80μL酵母感受态中混匀，转移到0.2cm经过紫外照射的的电转杯，冰浴5min，电击条件为：电压1500V，时间控制4-10ms；

(3)迅速向电击杯中加入1mL 1mol/L预冷的山梨醇，轻轻吹打均匀，然后将其转移至冰冷的1.5mL无菌EP管中，30℃、50rpm培养1-2h；

(4)离心菌体，重新悬浮均匀后吸取200μL-300μL涂布上还有zecoin抗性的YPD平板上，于30℃恒温条件下培养，至长出单菌落，即为含有游离质粒的重组单菌落。

(5)使用无菌牙签挑取YPD平板上的菌落，接种到YPD培养基中。

(6)从平板上挑取阳性转化子单酵母菌落转接于装有10mL YPD培养基的50mL三角瓶中培养24h后转入装有50mL YPD培养基的500mL三角瓶培养表达3-4天，培养物经离心后得到含重木聚糖酶的上清，利用DNS法对其进行酶活检测。

二、整合型pGAPZαA-XynA重组菌的构建

1.重组质粒pGAPZαA-XynA构建

以质粒pMD18-T-XynA为模板，设计序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物：CCGGAATTCATGGCCGAGAACACCCTT，序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物：ATTTGCGGCCGCTCAGGTGCGGGTCCAGCGTT。通过聚合酶链式反应获得具有Not I和EcoR I酶切位点的XynA基因片段。

PCR反应体系(50μL)：

PCR程序：94℃，4min(预变性)；98℃，10s(变性)；60℃，5s(退火)；72℃，90s(延伸)；设置30个循环；72℃，10min(保温)后设置保藏温度为4℃。将PCR产物进行胶回收、酶切回收目的基因将其与表达载体pGAPZαA进行双酶切，并于16℃连接过夜，转化E.coliJM109，涂布含zecoin抗性的LB平板，37℃培养8-10h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，阳性克隆子即pGAPZαA-XynA。

2.重组质粒pGAPZαA-XynA的转化

重组质粒经AvrII内切酶线性化，酶切体系如下：

混匀上述溶液，37℃酶切2h，采用琼脂糖凝胶电泳验证酶切得到产物。

(1)从乙醇中取出电转杯，置于超净台中吹干，并置于冰中预冷备用

(2)在冰上进行以下操作：将线性化后回收的pGAPZαA-XynA预冷，吸取5μL快速与80μL酵母感受态中混匀，转移到0.2cm经过紫外照射的的电转杯，冰浴5min，电击条件为：电压1500V，时间控制4-10ms；

(4)离心菌体，重新悬浮均匀后吸取200μL-300μL涂布上还有zecoin抗性的YPD平板上，于30℃恒温条件下培养，至长出单菌落，即为整合到基因组的重组单菌落。

(5)使用无菌牙签挑取YPD平板上的菌落，接种到YPD培养基中。

(6)从平板上挑取阳性转化子单酵母菌落转接于装有10mL YPD培养基的50mL三角瓶中培养24h后转入装有50mL YPD培养基的500mL三角瓶培养表达3～4天，培养物经离心后得到含重木聚糖酶的上清，利用DNS法对其进行酶活检测。

三、pGCW14ZαA-PARS2-XynA重组菌与pGAPZαA-XynA重组菌3.6L发酵罐发酵

重组毕氏酵母工程菌在3.6L发酵罐(New Brunswick Scientific,Edison,NJ,USA)生产木聚糖酶的方法，过程分为三阶段进行：

第一阶段：接种实施例3或实施例5中的阳性转化子单菌落至装有10mL YPD培养基的50mL三角瓶中，200rpm，30℃振荡培养24h，作为一级种子发酵液；

第二阶段：取所述一级种子发酵液2.5mL接种于装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，200rpm，30℃振荡培养24h，作为二级种子发酵液；

第三阶段：将100mL的种子发酵液接种到装有900mL BSM培养基中的3.6L发酵罐中，200rpm，30℃的条件下培养，全程用100％氨水进行pH值的调节，保持在5.0；所述发酵培养基为BSM培养基；其中BSM培养基包括如下成分：85％磷酸26.7mL/L，CaSO₄ 0.93g/L，K₂SO₄18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM1 4.35mL/L，上述成分均溶于水中形成所述BSM培养基。

待碳源耗尽，即DO值迅速上升时，进行补料。补料配方为80％甘油；1.25％PTM1；甘油和PTM1溶于水中形成所述补料。不同时间段取样。

四、重组菌发酵表达水平测定

分别取实施例1和2中pGCW14ZαA-PARS2-XynA重组菌与pGAPZαA-XynA重组菌产的酶进行酶活测定，实验结果见图4。结果表明，发酵96h后，整合型pGAPZαA-XynA重组菌获得的木聚糖酶的酶活力235U/mL，蛋白含量2.7g/L。游离型pGCW14ZαA-PARS2-XynA重组菌获得的木聚糖酶的最大酶活力为2512U/mL，蛋白含量8.7g/L，同整合型pGAPZαA-XynA重组菌相比，采用游离载体表达木聚糖酶产量提高了969％，同时表达的酶的比活力提高了343％，从而显著降低了工业化生产木聚糖酶的生产成本。此外，pGCW14ZαA-PARS2-XynA重组菌所产酶的蛋白电泳结果显示在43kDa处有一条与理论分子量一致的条带(结果如图3所示)。

实施例3：pGCW14ZαA-PARS2在生产黑曲霉β-甘露聚糖酶AnMan5中的应用

合成SEQ ID NO.8所示的β-甘露聚糖酶基因，将其与pGCW14ZαA-PARS2进行酶切，酶切后于16℃连接过夜，转化E.coli JM109，涂布含zecoin抗性的LB平板，37℃培养8-10h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，阳性克隆子即pGCW14ZαA-PARS2-AnMan5。

重组质粒pGCW14ZαA-PARS2-AnMan5的转化：

(2)在冰上进行以下操作：将重组游离型质粒pGCW14ZαA-PARS2-甘预冷，吸取5μL快速与80μL酵母感受态中混匀，转移到0.2cm经过紫外照射的的电转杯，冰浴5min，电击条件为：电压1500V，时间控制4-10ms；

(5)使用无菌牙签挑取YPD平板上的菌落，接种到YPD培养基中。

实施例4：pGCW14ZαA-PARS2-甘重组菌3.6L发酵罐发酵

重组毕赤酵母工程菌在3.6L发酵罐(New Brunswick Scientific,Edison,NJ,USA)生产β-甘露聚糖酶的方法，过程分为三阶段进行：

第三阶段：将100mL的种子发酵液接种到装有900mL BSM培养基中的3.6L发酵罐中，200rpm，30℃的条件下培养，全程用100％氨水进行pH值的调节，保持在5.0；所述发酵培养基为BSM培养基；其中BSM培养基包括如下成分：85％磷酸26.7mL/L，CaSO4 0.93g/L，K2SO4 18.2g/L，MgSO4·7H2O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTM1 4.35mL/L，上述成分均溶于水中形成所述BSM培养基。

取实施例3中的pGCW14ZαA-PARS2-甘重组菌产酶进行酶活测定，实验结果见图6.结果表明，经高密度发酵77h，发酵上清酶活达到最高，最高为1545.2U/mL，此时的蛋白含量为4.79g/L，OD600为516，比活为322.6U/g。此外，pGCW14ZαA-PARS2-甘重组菌产酶的蛋白电泳结果显示在45kDa处有一条与理论分子量一致的条带(结果如图5所示)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其应用

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<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 492

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<213> 人工序列

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ttggtctcca gcttgcaaat tagtgctgat tatgatcata ttaacataac atgtatataa 60

acgtcaagta aattttagtt caaggaccga cactcctacc aaatatatat atgtaatata 120

cccattatac caccaatata gttaaatcaa tctttcctat tagcagatat ctaatttgtt 180

tttttgttct taacctctgg tgagttatta aaagataaaa tataaaaaca tcatttaatt 240

aaatgtcatt aattagttta atatttgttt ctatatatta aagtgtatta gtattcttaa 300

tgaacgtcgg gaagaacaaa agtttaaaga tatctaatat tgatgtttaa cttcatcata 360

agtgcattct ttccatcaat atcagttgct tactaaagaa gtgcaaagag ctcaccaaaa 420

aacgtacgag aaagaacaga tacgcaattc tgatattatc caaagatgtt gcgctggcct 480

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<210> 2

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caggtgaacc cacctaacta tttttaactg ggatccagtg agctcgctgg gtgaaagcca 60

accatctttt ggaaaaaaaa attaacttta cggggcgagc acggttcccc gaaaccgcgc 120

agctttaatc tttcggcaga gaaggcgttt tcatcgtagc gtgggaacag aataatcagt 180

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gttttaagtt gtgggaacag taacaccgcc tagagcttca ggaaaaacca gtacctgtga 480

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aacctttttc gcggtatatt tgtttatatt tcctatttta aactcaaaat ctgccctaat 600

ctggactttt catgcaaagt tatgcacctg aggcaggaat gaagcaggct cgacgacgaa 660

aaggctggaa tgggtaacta tggatcgatt gatttgtctg ttgaaatctt gatttggcac 720

tcgtttaagt ataaatacat actctcctcc cccccctggt tctctttttc ttttgttact 780

tacattttac cgttccgtca ctcgcttcac tcaaacaaca aa 822

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<212> DNA

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gtcatgcatg agatccaggt gaacccacct aact 34

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<212> DNA

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<212> DNA

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ccggaattca tggccgagaa caccctt 27

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<212> DNA

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atttgcggcc gctcaggtgc gggtccagcg tt 32

<210> 7

<211> 436

<212> PRT

<213> Streptomyces sp.

<400> 7

Met Ala Glu Asn Thr Leu Gly Ala Ala Ala Ala Gln Ser Gly Arg Tyr

1 5 10 15

Phe Gly Val Ala Ile Ala Ser Gly Lys Leu Gly Asp Ser Thr Tyr Thr

20 25 30

Ser Ile Ala Asn Arg Glu Phe Asn Ser Val Thr Ala Glu Asn Glu Met

35 40 45

Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Asn Arg Gly Gln Phe Asn Phe Ser Ser

50 55 60

Ala Asp Arg Val Tyr Asn Trp Ala Val Gln Asn Gly Lys Gln Val Arg

65 70 75 80

Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser Gln Gln Pro Gly Trp Met Gln Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Ser Ser Leu Arg Gln Ala Met Ile Asp His Ile Asn Gly

100 105 110

Val Met Ala His Tyr Lys Gly Lys Ile Ala Gln Trp Asp Val Val Asn

115 120 125

Glu Ala Phe Ala Glu Gly Ser Ser Gly Ala Arg Arg Asp Ser Asn Leu

130 135 140

Gln Arg Thr Gly Asn Asp Trp Ile Glu Val Ala Phe Arg Thr Ala Arg

145 150 155 160

Ala Ala Asp Pro Ser Ala Lys Leu Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Val Glu

165 170 175

Asn Trp Thr Trp Ala Lys Thr Gln Ala Met Tyr Asn Met Val Lys Asp

180 185 190

Phe Lys Ser Arg Gly Val Pro Ile Asp Cys Val Gly Phe Gln Ser His

195 200 205

Phe Asn Ser Gly Ser Pro Tyr Asn Ser Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gln

210 215 220

Asn Phe Ala Ala Leu Gly Val Asp Val Ala Val Thr Glu Leu Asp Ile

225 230 235 240

Gln Gly Ala Ser Ser Ser Thr Tyr Ala Ala Val Val Asn Asp Cys Leu

245 250 255

Ala Val Ser Arg Cys Leu Gly Val Thr Val Trp Gly Val Arg Asp Ser

260 265 270

Asp Ser Trp Arg Ala Ser Asp Thr Pro Leu Leu Phe Asn Asn Asp Gly

275 280 285

Ser Lys Lys Ala Ala Tyr Ser Ala Val Leu Asn Ala Leu Asn Gly Gly

290 295 300

Thr Thr Thr Pro Pro Pro Thr Gly Asp Gly Gly Gln Ile Lys Gly Val

305 310 315 320

Ala Ser Gly Arg Cys Leu Asp Val Pro Asn Ala Ser Thr Thr Asp Gly

325 330 335

Thr Gln Ile Gln Leu Tyr Asp Cys His Ser Asn Ser Asn Gln Gln Trp

340 345 350

Ala Val Thr Asp Ser Gly Glu Ile Arg Val Tyr Gly Asp Lys Cys Leu

355 360 365

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385 390 395 400

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405 410 415

Gly Ala Arg Ile Gln Leu Tyr Ser Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gln Arg

420 425 430

Trp Thr Arg Thr

435

<210> 8

<211> 362

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 8

Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ala Ala Ser

1 5 10 15

Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu

20 25 30

Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr

35 40 45

Asp Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Leu Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro

65 70 75 80

Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Leu Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr

245 250 255

Leu His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn

260 265 270

Gly Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro

275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp

325 330 335

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340 345 350

Thr Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala

355 360

Claims

1.一种游离型非甲醇诱导的毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述游离型非甲醇诱导的毕赤酵母表达载体是将自主复制序列PARS2和毕赤酵母启动子P_GCW14序列插入载体骨架，构建获得的游离型非甲醇诱导表达载体，所述自主复制序列PARS2含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述启动子P_GCW14含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述毕赤酵母表达载体为pGCW14ZαA-PARS2，所述pGCW14ZαA-PARS2是将质粒pGAPZαA中的P_GAP启动子替换成启动子P_GCW14，再将核苷酸序列如SEQ ID NO:1的PARS2复制子连接到pGCW14ZαA质粒上得到游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体pGCW14ZαA-PARS。

3.含有权利要求1或2所述毕赤酵母表达载体的细胞。

4.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的木聚糖酶。

5.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的β-甘露聚糖酶。

6.如权利要求3-5任一所述的细胞，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母KM71、GS115或SMD168。

7.一种权利要求3-6任一所述细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述转化使用电击转化法。

9.权利要求3-7任一所述的细胞在生产木聚糖酶或β-甘露聚糖酶中的应用。

10.权利要求1或2所述的毕赤酵母表达载体在饲料、食品、纺织或化工领域的应用。