CN110903992A - 双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株及其构建方法和发酵工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种将含有乳糖酶基因的整合性质粒与游离型质粒相结合，构建一种组成及诱导双重增强型酸性乳糖酶的重组毕赤酵母表达菌株，并利用此重组毕赤酵母高密度表达乳糖酶。本发明将含有乳糖酶基因的整合性质粒与游离型质粒相结合构建表达菌株，可使得表达菌株的乳糖酶表达量大大提高，该表达菌株通过高密度发酵，其分泌表达量可以达到8000ALU/mL以上，因此本发明的表达菌株能够在工业上应用，提高乳糖酶的工业生产量。

Description

双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株及其构建方法和发 酵工艺

技术领域

本发明涉及乳糖酶生物发酵技术，具体是涉及乳糖酶毕赤酵母表达菌株的构建，同时涉及该毕赤酵母表达菌株的发酵工艺。

背景技术

乳糖酶，学名β-半乳糖苷半乳糖水解酶，又名β-半乳糖苷酶，是一种白色粉末，无味道，无嗅。乳糖酶通过特定条件水解半乳糖苷键，将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，易被肠道吸收。大量研究表明哺乳动物的乳糖酶活性随年龄的增长，具有典型的生理性降低，成人乳糖酶下降的不可逆受基因控制。全世界乳糖酶缺乏的发生率在50％以上，而我国有90％左右成人缺乏乳糖酶。若乳糖酶缺乏者一次摄入较多乳糖，乳糖未能及时被消化吸收，进入结肠后被肠道细菌分解，产生大量乳酸、甲酸等短链脂肪酸和氢气，造成渗透压升高，使肠腔中的水分增多，引起腹涨、肠鸣、肠绞痛直至发生水泻等症状，总称为乳糖不耐受症。1889年荷兰生物学家，Beijerincek首次报道了乳糖酶可水解乳糖。乳糖酶不仅能有效的改善乳糖吸收不良，还能大大减轻症状。

乳糖酶存在于杏、桃等植物以及幼小哺乳动物的小肠中，有很多微生物经发酵可以产生乳糖酶。其中细菌中的乳酸菌、环状芽孢杆菌、大肠杆菌、嗜热链球菌、产气肠细菌等；霉菌中的米曲霉、黑曲霉、硫球曲霉、黄青霉、炭色曲霉等；酵母中的脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母和热带假丝酵母等；放线菌中的天蓝色链菌霉都能产出β-半乳糖苷酶。酵母菌是目前工业化生产乳糖酶的一个主要来源。1994年叶祝嵩等人筛选到一株经乳糖诱导能产生高活性乳糖酶的K.fagilig菌株，该菌株还可产生蔗糖酶、麦芽糖酶等双糖酶类，适应于乳糖酶缺乏者使用。商品乳糖酶的另一来源是霉菌。

有关乳糖酶在食品工业中的应用研究引起了人们的极大关注，已经成为食品生物技术领域的新热点之一。目前国内和国外还存在着很大的差距，乳糖酶并未在中国食品和乳品工业中得到广泛应用，主要原因是乳糖酶的单位产量较低，生产工艺复杂，成本高。因此寻找一种提取工艺简单、高产且具有食品安全性的生产方式仍然是目前乳糖酶研究的重要方向。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种将整合型的乳糖酶基因和游离型的乳糖酶基因相结合，构建一种组成及诱导双重增强型酸性乳糖酶的重组毕赤酵母表达菌株，并利用此重组毕赤酵母高密度表达乳糖酶。

本发明的目的之一是提供组成及诱导双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株。

本发明的目的之二是提供组成及诱导双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株的构建方法，并通过高通量筛选的方法，筛出高表达的重组毕赤酵母菌株。

本发明的目的之三是为了提高乳糖酶的工业生产量，提供了一种用于制备乳糖酶的重组酵母高密度发酵方法。

提取pPIC9K-Lac的质粒，用Bgl II、Sac I、Sal I单酶切线性化，用酚抽提，乙醇沉淀，溶于15ul无菌水，通过电转的方法将线性化的质粒导入毕赤酵母中，然后先用MD,MM平板筛选(MM平板中加入X-Gal溶液)，进行初筛，再用高通量筛选的方法进行复筛，将复筛出的高酶活菌株，用摇瓶进行验证，筛出酶活最高的菌株。

将上述筛出的酶活最高的菌株制备成酵母感受态，通过电转将游离型质粒pasegagce-Lacn导入进去，然后先用MD，MM平板筛选(MD，MM平板中都加入X-Gal溶液)，进行初筛，再用高通量筛选的方法进行复筛，将复筛出的高酶活菌株，用摇瓶进行验证，筛出酶活最高的菌株。

利用上述重组酵母进行酸性乳糖酶的高密度发酵。将重组酵母接种培养，然后接入发酵罐中，通气搅拌培养，接种后在培养基中碳源耗尽后补加碳源50％(v/v)甘油，当OD达到170-250时停止补加甘油，开始进行诱导。整个发酵过程中溶氧需要保持在0％-40％，持续培养96h以上。

本发明的优点和有益效果：本发明将整合型的乳糖酶基因和游离型的乳糖酶基因相结合构建表达菌株，可使得乳糖酶的表达量大大提高，该表达菌株通过高密度发酵，其分泌表达量可以达到8000ALU/mL以上，因此本发明的表达菌株能够在工业上应用，提高乳糖酶的工业生产量。

附图说明

图1a、图1b为实施例1整合型酸性乳糖酶进行平板筛选的MM平板显色图，图中未打钩处都已显蓝色。

图2a、图2b为实施例2整合和游离型酸性乳糖酶进行平板筛选的MD、MM平板显色图，图中打钩和画圈处都已显蓝色，打钩的比画圈的早一天显蓝色。

图3a、图3b为实施例2整合和游离型酸性乳糖酶进行平板筛选的MD、MM平板显色图，图中未打钩处都已显蓝色。

图4a和图4b为重组整合与游离型酵母菌株在发酵罐中乳糖酶的溶氧、OD、酶活结果。

图5重组整合与游离型酵母菌株在发酵罐中发酵不同时间的乳糖酶蛋白量的SDS-PAGE，其中

M：蛋白分子量Marker；lane1-7：12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h。

图6a和图6b为整合型酵母在发酵罐中乳糖酶的溶氧、OD、酶活结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

以下实施例中涉及的试剂如下：

酶和试剂盒：限制性内切酶(Bgl II、Sac I、Sal I)、质粒提取试剂盒。

培养基：LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

LLB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。

YPD培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含1.5％琼脂)

10×YNB(13.4％的无氨基酸酵母氮源)：134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存。

500×生物素：生物素20mg/100mL水，过滤灭菌，4℃保存。

10×葡萄糖：200gD-葡萄糖溶于1L水，过滤灭菌，4℃保存。

10×甘油：100mL甘油溶于900mL水，过滤灭菌，4℃保存。

MD培养基：琼脂糖10-30g/L、10×YNB 5-20g/L、10×葡萄糖10-30g/L、500×生物素0.1-3g/L。

MM培养基：琼脂糖10-30g/L、10×YNB5-20g/L、500×生物素0.1-3g/L、甲醇0.5-3％。

BMGY培养基：酵母提取物5-20g/L，蛋白胨10-30g/L，K₂HPO₄ 0-10g/L，KH₂PO₄ 5-20g/L，10×YNB5-20g/L，500×生物素0.1-3g/L，甘油0.5-5％。

BMMY培养基：酵母提取物5-20g/L，蛋白胨10-30g/L，K₂HPO₄ 0-10g/L，KH₂PO₄5-20g/L，10×YNB5-20g/L，500×生物素0.1-3g/L，甲醇0.5-3％。

重组酵母发酵培养基：磷酸(85％)10-30ml/L，甘油2-10g/L，硫酸钾10-30g/L，氢氧化钾1-10g/L，二水硫酸钙1-5g/L，酵母粉1-5g/L，七水硫酸镁3-10g/L，消泡剂1-5ml/L。

补料培养基：甘油500g/L。

微量元素：五水硫酸铜1-10g/L，一水硫酸锰1-10g/L，七水硫酸锌30-60g/L，七水硫酸亚铁50-100g/L，硫酸1-10g/L，碘化钾0.5-5g/L，二水钼酸钠0.5-5g/L，硼酸0.5-3g/L，氯化钴0.5-3g/L，生物素0.1-3g/L。

实施例1诱导型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株的构建和筛选

合成酸性乳糖酶整合型基因(即Lac基因，参考NCBI的genebank中序列号为XM_025613095的基因)，克隆到PMD-18T载体上。接种PMD-18T-Lac单菌落到50mlLB培养基中培养，提取质粒。接种pPIC9K-DH5α单菌落到LB培养基中培养，提取质粒。按照质粒提取试剂盒的方法步骤，提取质粒PMD-18T-Lac和pPIC9K。用限制性内切酶切质粒PMD-18T-Lac和pPIC9K。割胶回收Lac片段和pPIC9K载体。用T4 DNA连接酶连接Lac和pPIC9K。连接产物转化top10化转感受态，涂布在LB Amp抗生素筛选平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证。阳性克隆接种LB，提取质粒送测序公司测序验证。验证正确后，保存甘油菌pPIC9K-Lac置于-70℃保存。

用质粒提取试剂盒提取质粒pPIC9K-Lac，然后用Bgl II、Sac I、Sal I三种酶分别酶切质粒pPIC9K-Lac，电泳检测酶切是否完全，使质粒线性化，用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗，溶于15ul无菌水，-20℃保存备用。毕赤酵母菌株接种于100mlYPD培养基中28℃摇床过夜，使OD至1.0-1.5。参考invitrogen毕赤酵母质粒说明书中所述制备电转感受态及导入基因。在MD固体平板上涂布，将培养皿倒置28℃培养2-3天至转化子出现，即平板上长出单菌落。

用平板筛选的方式进行初筛，用无菌牙签将MD平板上长出来的转化子挑取到MD，MM(加了100ul/ml X-Gal溶液)平板上，将MD，MM平板倒置于28℃培养箱培养。阳性菌株可在MM平板上显蓝色，观察MM平板显色情况如图1a和图1b所示，大部分菌种都显蓝色(即未打钩处均呈现蓝色)。随后对初筛的转化子进行复筛。采用高通量筛选的方法，用无菌牙签将初筛的转化子挑入深孔板中培养，期间每隔24h补加甲醇。在加甲醇后的48h与96h取样离心收集上清液测定酶活。

表1部分重组酵母的高通量筛选酶活测定的结果

注：表1中96h酶活测定结果的2-3(酶活174.2)、7-1(酶活192.5)、11-8(酶活169.9)菌种的酶活较高。

实施例2组成及诱导双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株的构建和筛选

合成ARS_OPT_BglII基因(该基因序列参考Liachko I,Dunham M J.Anautonomously replicating sequence for use in a wide range of budding yeasts[J].FEMS Yeast Research,2014,14(2),364-367，第365页第2段)，克隆到puc57载体上。接种puc57-ARS-top10单菌落到50mL LB培养基中扩大培养，质粒提取。采用实例1中类似方案连接ARS和pGAPZαA，转化得到克隆子。37℃培养过夜，挑取单菌落，进行菌落pcr验证。阳性克隆接种LLB(含ZEOCIN)，提取质粒送测序公司测序验证。验证正确后，保存甘油菌parsGAPzαA置于-70℃保存。

然后再提取质粒parsGAPzαA和pPIC9K-lac，采用实例1中类似方案连接ARS和pGAPZαA，转化得到克隆子。37℃培养过夜，挑取单菌落，进行菌落pcr验证。阳性克隆接种LLB(含ZEOCIN)，提取质粒送测序公司测序验证。验证正确后，命名为pasegagce-Lacn，保存甘油菌置于-70℃保存。

将游离型质粒的pasegagce-Lacn，参考invitrogen毕赤酵母质粒说明书中所述制备电转感受态，电转入毕赤酵母中。在YPD固体平板28℃培养2-3天至转化子出现。

用平板筛选的方式进行初筛，用无菌牙签将YPD平板上长出来的转化子挑取到MD,MM平板(MD,MM都加100ul/ml X-Gal溶液)上，将MD，MM平板倒置于28℃培养箱培养。阳性菌株可在MD、MM平板上都显蓝色，观察MD、MM平板显色情况如图2a、图2b、图3a、图3b所示(MD平板和MM平板上的菌落大部分都显蓝色，图2a和图b中打钩和画圈处都已显蓝色，打钩的比画圈的早一天显蓝色；图3a和图3b中未打钩处都已显蓝色)。随后对初筛的转化子进行复筛。采用高通量筛选的方法，用无菌牙签将初筛的转化子挑入深孔板中(每孔加500ulBMGY培养基)，摇床培养24h(28℃，800rpm)，然后离心，吸净培养基上清，留样测酶活。并加入500ulBMMY培养基，摇床培养96h(28℃，800rpm)，期间每隔24h补加甲醇。在加甲醇后的48h与96h取样离心收集上清液测定酶活。

表2部分重组酵母的高通量筛选酶活测定的结果

注：表2中96h酶活的1-3(酶活230.5)、11-7(酶活203.5)、11-8(酶活215.8)菌种的酶活

较高

实施例3酸性乳糖酶重组毕赤酵母的表达菌株的发酵罐的发酵过程

取实施例1和实施例2中筛选出的最高表达酶活的重组酵母菌株的甘油菌，在YPD上活化培养2-3天，直至长出单菌落。用接种环挑单菌落到50ml的YPD液体培养基中摇床过夜培养(28℃，245rpm)，OD至0.5-1；作为发酵种子液，采用火焰接种法接种。发酵罐的发酵参数设置为PH4.0-6.5，温度25-32℃，不断调节转速、通风量以及补料速度，使溶氧维持在0％-40％。在接种后每隔12h取样测定乳糖酶活性。持续培养至OD到170-250。此时停止补加50％甘油，并开始补加甲醇，进入诱导表达阶段，并控制溶氧保持在0％-40％左右。每12h取样测定乳糖酶活性，直至乳糖酶活性不再升高或开始下降时，停止发酵，下罐。发酵液离心(4000rpm，15min)收集上清液。

通过此发酵工艺，结合图5来看，双重增强型酸性乳糖酶表达菌株在发酵罐中的不同发酵时间越长，酸性乳糖酶表达量越高，组成及诱导双重增强型酸性乳糖酶的表达菌株表达含量可以达到8000ALU/ml以上，如图4a所示，图4b中溶氧值用于说明在发酵过程中溶氧的变化，并用补料将溶氧控制在一定范围内，OD值说明在发酵过程中菌株在不断地生长；同时将上述筛出的诱导型表达菌株通过此发酵工艺进行发酵，获得结果：实施例1得到的诱导型表达菌株表达含量为4700ALU/ml以上，如图6a所示；图6b中溶氧值用于说明在发酵过程中溶氧的变化，并用补料将溶氧控制在一定范围内，OD值是说明在发酵过程中菌株在不断地生长。由此可见，本发明将游离型的酸性乳糖酶基因与整合型的酸性乳糖酶基因结合在一起的乳糖酶菌株显著提高了乳糖酶蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量，且在本发明持续的240h发酵时间内，其表达量随发酵时间越长，表达量越高；同时大幅提高了所获得的乳糖酶的酶活；另外考虑到生产成本和生产效率的综合协调，优选发酵时间为96～156h。与国内外的部分研究比较，本发明的重组毕赤酵母乳糖酶的表达了达到了较高的水平，完全可以满足大规模工业生产的要求。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物工程领域的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (8)

1.双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株，其特征在于，所述表达菌株同时含有整合型质粒和游离型质粒，且所述整合型质粒和游离型质粒均含有乳糖酶基因Lac。

2.根据权利要求1所述的双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株，其特征在于，所述毕赤酵母为GS115、SMD1168、KM71、X33酵母细胞中的一种。

3.含有Lac基因的表达载体，用于向毕赤酵母导入Lac基因。

4.权利要求1所述的双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株的构建方法，其特征在于，步骤包括：

(1)分别构建包含Lac基因的整合型质粒和包含Lac基因的游离型质粒；

(2)提取包含Lac基因的整合型质粒，将其线性化后导入毕赤酵母中，然后先用MD、MM平板筛选，其中MM平板中加入X-Gal溶液，进行初筛，再用高通量筛选的方法进行复筛，将复筛出的高酶活菌株，用摇瓶进行验证，筛出酶活最高的菌株；

(3)将筛出的酶活最高的菌株制备成酵母感受态，将包含Lac基因的游离型质粒导入进去；然后先用MD、MM平板筛选，其中MD、MM平板中都加入X-Gal溶液，进行初筛，再用高通量筛选的方法进行复筛，将复筛出的高酶活菌株，用摇瓶进行验证，筛出酶活最高的菌株。

5.根据权利要求4所述的双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中整合型质粒为pPIC9K质粒，包含Lac基因的质粒导入毕赤酵母通过电转的方法将线性化的质粒导入毕赤酵母中。

6.根据权利要求4所述的双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中包含Lac基因的游离型质粒为pasegagce-Lacn质粒。

7.双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株的发酵方法，其特征在于，步骤包括：

将重组酵母接种培养，然后接入发酵罐中，通气搅拌培养，接种后5h-15h以1-12ml/h加入微量元素；在培养基中碳源耗尽后，补加甘油，当OD达到170-250时停止补加甘油，开始进行表达；整个发酵过程中溶氧需要保持在0％-40％，持续发酵培养0～240h。

8.根据权利要求7所述的双重增强型酸性乳糖酶毕赤酵母表达菌株的发酵方法，其特征在于，发酵时间为96～156h。

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