CN104673769A - 一种新型乳糖酶的制备方法及其应用 - Google Patents

一种新型乳糖酶的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种新型乳糖酶的制备方法及其应用，属于基因工程领域。主要技术特征是构建米曲霉乳糖酶成熟肽编码序列随机突变体库，筛选得到比活高、热稳定性好的突变体。并将突变序列依据毕赤酵母的密码子偏爱性进行优化，连入组成型表达载体进而转入毕赤酵母基因组中，高密度发酵制备得到新型乳糖酶。其发酵产量达7mg/mL发酵液，酶活达4000U/ml；比活由480U/mg提高至700U/mg；pH作用范围由4～7增宽至3～7；最适作用温度由55℃提高至60℃；60℃保温30min由完全失活提高至残余酶活75%，能在60℃高温至25℃常温条件下完成对牛奶中乳糖的降解，可用于低乳糖牛奶及相关产品的制备。

Description

一种新型乳糖酶的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种新型乳糖酶的制备方法及其应用，属于基因工程领域。具体的说涉及比活高、稳定性好的新型乳糖酶的获得，此新型乳糖酶核苷酸序列依据毕赤酵母密码子偏爱性的优化，包含乳糖酶核苷酸序列的组成型表达载体及重组毕赤酵母菌株的构建，利用此重组酵母高密度发酵制备乳糖酶的方法，还涉及此新型乳糖酶在低乳糖牛奶制备中的应用。
背景技术
乳糖是由半乳糖和葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的二糖。世界上约70%的人种，尤其是亚洲人，患有“乳糖不耐受症”，主要表现为肠鸣、腹泻及肠梗塞和胀气等。这是由于体内缺乏能降解乳糖的酶类，进入肠道的乳糖就成为微生物菌群的能源，从而导致形成乳酸和二氧化碳。通过口服乳糖酶或将乳糖酶添加至乳制品中可以解决以上问题。乳糖酶即β-半乳糖苷酶（β-D-galactosedase,EC3.2.1.23.），是一种β-D半乳糖苷半乳糖水解酶，能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，此外亦具有半乳糖苷转移作用。商品化的乳糖酶主要用于治疗乳糖不耐受症、处理牛乳和乳清、生产低乳糖牛奶和低乳糖乳制品及制备低聚半乳糖等领域。自然界中的乳糖酶广泛存在于幼小哺乳动物小肠，植物如扁桃、杏等，微生物如细菌、酵母和霉菌等。食品工业中应用的乳糖酶主要源于克鲁维氏酵母（Kliyveromyces sp.）和曲霉属（Aspergillussp.）。克鲁维氏酵母乳糖酶多为胞内酶，最适pH接近中性（pH6.2～7.0），最适温度35～40℃，但热稳定性比较差。曲霉属乳糖酶多为胞外酶，最适作用温度为50℃或更高，最适pH3.5～4.0，热稳定性好及作用pH低等优点，使曲霉乳糖酶在食品工业上具有更高的应用价值。
目前乳糖酶工业化生产中存在的难题主要表现在胞内酶提取困难和产量低这两方面。在克鲁维氏酵母发酵产酶过程中，通过优化发酵条件能提高产酶量，但是其发酵通常以乳糖作为主要碳源和诱导剂，而乳糖相对其他碳源价格偏高，另外胞内酶的存在形式也不利于产品的获取。因此，国内外的研究均倾向于构建基因工程菌株的方式来生产和制备乳糖酶产品。Berka等人将来自A.oryzae CCC28的乳糖酶基因导入其来源菌株构建得到的米曲霉基因工程菌株，乳糖酶基因受GalA启动子控制，发酵液中酶活提高至500U/ml，蛋白表达量为1g/L。张伟等（亮白曲霉乳糖酶基因在毕赤酵母中的高效分泌表达及酶学性质研究，微生物学报，2005）将来自于A.candidus CGMCC3.2919的乳糖酶基因导入毕赤酵母GS115基因组中，利用醇氧化酶启动子Paox1启动该基因的表达，发酵液中乳糖酶产量约为6g/L，酶活力达3600U/ml，是目前国内外获得的乳糖酶的最高产量。但是该酶表达使用的Paox1启动子属于甲醇诱导型启动子，需要在发酵过程中加入大量的甲醇，其毒性不利于食品安全，从而限制了重组蛋白在食品工业中的应用。
在不同的原核、真核异源表达系统中，毕赤酵母表达系统具有其它表达系统所不可比拟的优点，除了具有甲醇诱导型启动子-醇氧化酶AOX1基因启动子用于严格调控外源蛋白的表达外，还具有另一个组成型的强启动子-甘油醛三磷酸脱氢酶启动子GAP，可在菌体生长过程中组成型表达外源蛋白。另外，外源基因随染色体复制进行整合型表达，稳定性高；菌体生长速度快，培养基成本低廉，易于进行高密度发酵；易于进行遗传操作和培养，具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、折叠、二硫键的形成和糖基化，可获得高产量的蛋白质。
综上所述，寻求一种提取工艺简单、高产且具有食品安全性的生产方式仍然是目前乳糖酶研究的重要方向。本发明将高效组成型启动子GAP与乳糖酶基因连接，构建包含乳糖酶的重组毕赤酵母菌株，并利用该重组酵母高密度发酵制备乳糖酶，既能解决传统的胞内乳糖酶提取困难和产量低的问题，又可避免利用甲醇诱导毕赤酵母大规模发酵而造成的甲醇污染和毒性隐患，有利于食品、医药及工业化乳糖酶的大规模生产与制备。
发明内容
本发明的目的之一在于为了改善米曲霉乳糖酶比活低、稳定性差等缺点，提供一种高活性、高热稳定性的新型乳糖酶，其氨基酸序列为含有序列号1的氨基酸序列。
本发明的目的之二在于为了利于新型乳糖酶在毕赤酵母中的表达，提供一段依据毕赤酵母密码子偏爱性优化得到的乳糖酶核苷酸序列，此核苷酸序列为含有序列号2的核苷酸序列。
本发明的目的之三在于为了解决乳糖酶生产中的胞内酶提取困难的问题，提供一种用于分泌制备新型乳糖酶的重组毕赤酵母菌株。
本发明的目的之四在于为了提高乳糖酶的工业化产量，提供一种用于制备乳糖酶的重组酵母高密度发酵方法。
本发明的目的之五在于为了满足乳糖酶在食品中的应用，而提供一种低乳糖牛奶的制备工艺。
本发明的上述目的通过以下技术方案达到：首先构建米曲霉乳糖酶成熟肽编码序列随机突变体库，并筛选比活高、稳定性好的酶蛋白突变体，测序确定突变位点，然后将突变序列按照毕赤酵母密码子偏爱性进行优化，构建用于表达乳糖酶的组成型表达载体，及用于制备乳糖酶的重组毕赤酵母菌株，利用该重组酵母的高密度发酵制备此新型乳糖酶。最后利用此新型乳糖酶水解牛奶中的乳糖，确定制备低乳糖牛奶的方法。
本发明采用易错PCR方法构建序列号3所示米曲霉乳糖酶成熟肽编码序列随机突变体库，利用毕赤酵母表达系统表达突变体蛋白，从中筛选比活高、稳定性好的突变株，测序确定突变位点，对应的氨基酸突变为：231位丝氨酸突变为甘氨酸，401位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，970位天冬酰胺突变为天冬氨酸。
本发明将序列号3所示的核苷酸序列进行相应突变后按照毕赤酵母密码子偏爱性优化得到含有序列号2的核苷酸序列。
将含有序列号2的核苷酸序列与组成型质粒pGAPZaA进行可操作性连接，将该序列连入组成型启动子GAP下游，构建得到包含乳糖酶基因序列的重组表达载体，命名为pGAPZaA-lac。
本发明采用电穿孔的方法将包含乳糖酶核苷酸序列的组成型表达载体pGAPZaA-lac整合入毕赤酵母SMD1168H菌株的基因组上，利用抗生素筛选得到包含乳糖酶基因的重组毕赤酵母菌株。所得重组毕赤酵母菌株命名为毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168H-pGAPZaA-lac，已于2013年10月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为毕赤酵母（Pichia pastoris），保藏号CGMCC No.8349。
本发明利用上述重组酵母制备乳糖酶的高密度发酵工艺包括：将重组酵母接种培养，然后按5%～10%的接种量接入含3%～6%葡萄糖的发酵基础盐培养基中；通气搅拌培养，并在整个发酵过程中氧饱和度不低于20%；培养15～18h至葡萄糖完全耗尽后，按照12～18ml/(h·L)的流量流加40%～80%葡萄糖:10%～50%甘油:0.05%～0.3%磷酸氢二铵=1～4:1～4:0.005～0.05的混合溶液，继续培养30h以上。
本发明采用新型乳糖酶制备低乳糖牛奶的方法包括：按10U/ml牛奶的添加量60℃水解24h，或37℃水解48h；按30U/ml牛奶的添加量，25℃水解48h，或10℃水解108h。
本发明由米曲霉乳糖酶改造得到的新型乳糖酶具有如下优点：
（1）新型乳糖酶比活由480U/mg提高至700U/mg，pH作用范围由4～7增宽至3～7；最适作用温度由55℃提高至60℃；60℃保温30min由完全失活提高到残余酶活75%，更适于乳品行业的应用；
（2）新型乳糖酶核苷酸编码序列经过毕赤酵母密码子偏爱性优化，在毕赤酵母中的表达，胞外蛋白的表达量由4g/L提高至7.27g/L，表达效率提高了约80%。
（3）本发明构建的包含新型乳糖酶基因的重组毕赤酵母，利用该重组酵母的高密度发酵制备乳糖酶，与传统的克鲁维氏酵母破壁提取乳糖酶的方法相比，乳糖酶可直接分泌至胞外，且杂蛋白种类和含量很少，大大简化了目的蛋白的提取及后期纯化工艺；本发明采用的组成型表达方式，与目前最常用的毕赤酵母体系中利用甲醇诱导外源蛋白表达的方式相比，可避免甲醇添加带来的毒性隐患。
（4）目前帝斯曼中性乳糖酶Maxilact需低温（10℃）水解，能耗高，而新型乳糖酶热稳定性好，水解温度范围宽，因此既可在常温下水解，又可在牛奶高温杀菌过程后的降温过程中添加并完成水解过程，大大降低了能耗，节约了时间。
附图说明
图1：实施例1包含乳糖酶优化核苷酸序列的组成型表达载体pGAPZaA重组质粒构建图
图2：实施例1米曲霉乳糖酶突变前后的酶学性质比较
A：37℃条件下测定的作用pH曲线；B：最适pH条件下测定的作用温度曲线；C：60℃保温不同时间的热稳定性曲线
图3：实施例3重组酵母发酵不同时间的乳糖酶蛋白含量
M：protein marker；lane1-7：发酵24、36、48、60、72、84、96h乳糖酶积累
具体实施方式
实施例1米曲霉乳糖酶成熟肽编码序列随机突变体库的构建及筛选
菌株与载体大肠杆菌Escherichia.coli Top10购自北京博尚展新生物技术公司，毕赤酵母SMD1168H（pepA）、质粒pGAPZaA均购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒限制性内切酶、连接酶购自Takara公司，Taq酶Mix、PFU酶Mix购自百泰克公司，质粒提取试剂盒购自TIANGEN公司，凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司。
生化试剂DNA全序列合成、引物合成及DNA序列测序在北京博尚展新公司完成，各化学试剂除特别说明外均为国产分析纯。
培养基大肠杆菌培养基为LB（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0）和低盐LB（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl，pH7.5）。酵母培养基为YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）和YPDS（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1%山梨醇）。重组酵母发酵培养基为基础盐培养基（0.4%KH2PO4、0.4%(NH4)2SO4、0.038%CaCl2、1.82%K2SO4、0.94%MgSO4·7H2O、4%葡萄糖）和微量盐溶液PTM1（0.6%CuSO4、0.008%NaI、0.3%MnSO4·H2O、0.02%Na2MoO4·2H2O、0.002%硼酸、0.05%CoCl2、2%ZnCl2、6.5%Fe2SO4·7H2O、0.02%Biotin和0.5%硫酸(V/V)）。固体培养基为液体培养基中加入1.6%琼脂粉。
1.1本发明米曲霉乳糖酶成熟肽编码序列的随机突变体库的构建
以包含米曲霉乳糖酶成熟肽编码序列的载体pMD18-T-lac为模板，以基因两端序列为引物lac-up（5’-CCGCTCGAGTCTATTAAGCACAGATTGAAC-3’）和lac-do（5'-GCTCTAGATTAGTAAGCACCCTTTCTTTG-3'），分别加入XhoI和XbaI酶切位点，进行易错PCR。第一轮加样如下：PCR buffer5μl，MgCl24μl，dNTP4μl，lac-up1μl，lac-do1μl，MnCl23μl，Taq Pol1μl，template1μl，H2O up to50μl。反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸3min30sec，共20个循环；72℃再延伸10min。以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR，加样体系将MnCl2换为dITP，其余同上。PCR反应程序同上。产物采用琼脂糖凝胶电泳检测并采用试剂盒回收，进行XhoI和XbaI双酶切消化后连入同样酶切消化的载体pGAPZaA。采用CaCl2法转化大肠杆菌Top10菌株，涂布含有25μg/ml zeocin的低盐LB筛选平板上，挑取平板上的单菌落转接至5ml加入抗生素的低盐LB中，37℃，200r/min震荡培养过夜，试剂盒提取质粒，以通用引物pGAP FP（5'-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3'）和3'AOXI（5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'）进行PCR扩增。PCR程序如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸3min30sec，共30个循环；72℃再延伸10min。琼脂糖电泳检测目的条带大小约为3000bp。测序结果表明，乳糖酶核苷酸序列正确插入表达载体中。未经突变的米曲霉乳糖酶成熟肽编码序列同样进行酶切、连接并转入大肠杆菌Top10菌株，验证正确的转化子作为对照用于下一步实验。
1.2本发明米曲霉乳糖酶成熟肽编码序列的随机突变体库的筛选
5～10μg包含乳糖酶核苷酸序列的pGAPZaA采用限制性内切酶AvrII进行线性化，乙醇沉淀后溶于10ul TE buffer中，采用电穿孔方法转化毕赤酵母SMD1168H，涂布含有100～1000μg/ml zeocin及40μg/ml X-gal的YPD筛选平板，30℃倒置培养2～3d后挑取平板上的蓝色单菌落，接至1.5～5ml YPD液体培养基中，30℃，300r/min震荡培养过夜，取1ml菌液加入200～300μl80%甘油保存菌种，剩余菌液中加入2～5ml新鲜YPD培养基继续培养48h，取菌液4℃离心8000r/min，5min，上清即为粗酶液。通过粗酶液乳糖酶活性测定分析，以未经突变的重组米曲霉乳糖酶活性为参照，筛选活性高于突变前10%的菌株进一步测定60℃时的热稳定性，将稳定性最好的一株重组酵母提取基因组，并采用lac-up和lac-do引物进行常规PCR，加样体系如下：PCR buffer5μl；MgCl24μl；dNTP4μl；lac-up1μl；lac-do1μl；PFU Pol1μl；template1μl；H2O up to50μl。反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸3min30sec，共30个循环；72℃再延伸10min，连入T载体测序确定出突变氨基酸位点。
本发明筛选出的突变株有3个氨基酸位点发生突变：231位丝氨酸突变为甘氨酸，401位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，970位天冬酰胺突变为天冬氨酸。得到的新型乳糖酶蛋白与突变之前相比，比活由480U/mg提高至700U/mg；pH作用范围由4～7增宽至3～7；最适作用温度由55℃提高至60℃；60℃保温30min由完全失活提高至残余酶活75%。
实施例2包含乳糖酶核苷酸序列的重组毕赤酵母的构建
2.1本发明包含乳糖酶优化核苷酸序列的表达载体构建
米曲霉乳糖酶成熟肽编码核苷酸序列（序列号3）突变后在不改变其氨基酸序列的基础上根据毕赤酵母的密码子偏爱进行优化并全基因合成，核苷酸序列为含有序列2的核苷酸序列。
在合成的序列两端分别加入限制性内切酶XhoI和XbaI位点。将乳糖酶核苷酸序列（序列号2）与载体pGAPZaA分别进行XhoI和XbaI双酶切消化，连接并转化大肠杆菌Top10，涂布含有25μg/ml zeocin的低盐LB筛选平板上，挑取平板上的单菌落转接至5ml加入抗生素的低盐LB中，37℃，200r/min震荡培养过夜，试剂盒提取质粒，以通用引物pGAP FP（5'-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3'）和3'AOXI（5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'）进行PCR扩增。PCR程序如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸3min30sec，共30个循环；72℃再延伸10min。琼脂糖电泳检测目的条带大小约为3000bp。测序结果表明，乳糖酶核苷酸序列正确插入表达载体中。
2.2本发明包含乳糖酶核苷酸序列的重组毕赤酵母的构建
5～10μg包含乳糖酶核苷酸序列（序列号2）的pGAPZaA采用限制性内切酶AvrII进行线性化，乙醇沉淀后溶于10μl TE buffer中，采用电穿孔方法转化毕赤酵母SMD1168H，涂布含有100～1000μg/ml zeocin及40μg/ml X-gal的YPD筛选平板，30℃倒置培养2～3d后挑取平板上的蓝色单菌落，试剂盒提取酵母基因组，采用通用引物pGAP FP和3'AOXI及基因两端引物分别进行PCR，前者扩增片段比后者大约400bp，表明外源基因成功整合入酵母基因组中。
2.3高活性重组酵母转化子的筛选
挑取YPD筛选平板上的蓝色酵母转化子接至1.5～5ml YPD液体培养基中，30℃，300r/min震荡培养过夜，取1ml菌液加入200～300μl80%甘油保存菌种，剩余菌液中加入2～5ml新鲜YPD培养基继续培养48h，取菌液4℃离心8000r/min，5min，上清即为粗酶液。通过粗酶液乳糖酶活性测定分析，筛选出活性最高的一株作为制备乳糖酶的重组毕赤酵母菌株，命名为SMD1168H-pGAPZaA-lac。
实施例3用于制备乳糖酶的重组毕赤酵母菌株在50L罐的高密度发酵过程
重组酵母单菌落在5～15mlYPD液体培养基中30℃震荡培养24h，按5%～10%接种量接入2L YPD液体培养基中继续培养16～24h，按照5%～10%接种量接入基础盐培养基中进行发酵。发酵罐接种前先加入30%氨水调节培养基pH至5.0（氨水在发酵过程中也作为菌体生长的氮源），再加入微量盐PTM14.37ml/L，按5%～10%接入种子。通气搅拌14～24h，随着菌体的生长，培养基中的溶氧量会逐渐降低，当碳源消耗完后溶氧量会突然迅速上升，此时菌体湿重将达90g/L。碳源耗尽后，开始按照12～18ml/(h·L)的流量流加40%～80%葡萄糖:10%～50%甘油:0.05～0.3%磷酸氢二铵=1～4:1～4:0.005～0.05的混合溶液，继续培养30h以上，在这个过程中保持罐中氧饱和度不低于20%，每隔12h取样1次测定乳糖酶蛋白含量及活性。
通过此发酵工艺，乳糖酶的表达量可达7mg/ml发酵液，高于Berka等人构建的米曲霉基因工程菌株（US patent,5736374,1998）的产量约7倍，高于张伟等人构建的毕赤酵母基因工程菌株（CN1446909A,2003）的乳糖酶产量的1.2倍。发酵约96h活性可达4000U/ml，完全满足大规模生产的要求。
实施例4采用新型乳糖酶制备低乳糖牛奶的工艺
将实施例3制备的乳糖酶按添加量10U/ml，20U/ml，30U/ml加入纯牛奶中，并采用60℃、37℃、25℃、10℃水解，在水解过程中每隔12h取样1次，样品采用HPLC分析残余乳糖的含量，并以未水解的牛奶作为100%参照，计算乳糖水解率。
经水解实验测定，本新型乳糖酶可在如下条件下将牛奶中90%以上的乳糖水解：按10U/ml牛奶的添加量60℃水解24h，或37℃水解48h；按30U/ml牛奶的添加量，25℃水解48h，或者10℃水解108h。

Claims (11)

1.一种新型乳糖酶氨基酸序列，其特征是将米曲霉乳糖酶的成熟肽做如下位点的突变：231位丝氨酸突变为甘氨酸，401位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，970位天冬酰胺突变为天冬氨酸。
2.权利要求1所述的新型乳糖酶序列，其特征是氨基酸序列为含有序列号1的氨基酸序列。
3.一种新型乳糖酶的核苷酸序列，其特征是用于编码权利要求1所述新型乳糖酶的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的编码乳糖酶的核苷酸序列，其特征是将新型乳糖酶的编码序列（序列号1），在不改变其氨基酸序列的基础上，依据毕赤酵母密码子偏爱性进行优化得到。
5.权利要求3所述的编码乳糖酶的核苷酸序列，其特征是核苷酸序列为含有序列号2的核苷酸序列。
6.一种用于表达新型乳糖酶的组成型表达载体，其特征是包含一段编码新型乳糖酶氨基酸序列（序列号1）或含有序列号2的核苷酸序列。
7.权利要求6所述的用于表达乳糖酶的组成型表达载体，其特征是属于pGAPZaA重组表达载体。
8.一种用于制备乳糖酶的重组毕赤酵母菌株，其特征是包含编码新型乳糖酶的核苷酸序列（序列号2），或包含用于表达新型乳糖酶的组成型表达载体。
9.权利要求8所述的重组毕赤酵母菌株，其特征是属于SMD1168H重组菌株，命名为毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168H-pGAPZaA-lac，其保藏编号为CGMCC No.8349。
10.一种利用重组毕赤酵母发酵制备新型乳糖酶的方法，其特征是：将重组毕赤酵母接种培养，然后按5%～10%的接种量接入含3%～6%葡萄糖的酵母发酵基础盐培养基中；通气搅拌培养，使发酵过程中氧饱和度不低于20%；15～18h，待培养基中的碳源完全耗尽后，按12～18ml/(h·L)的流量补加40%～80%葡萄糖:10%～50%甘油:0.05%～0.3%磷酸氢二铵=1～4:1～4:0.005～0.05的混合物，继续培养30h以上。
11.一种利用新型乳糖酶制备低乳糖牛奶的方法，其特征是：按10U/ml牛奶的添加量60℃水解24h，或37℃水解48h；按30U/ml牛奶的添加量，25℃水解48h，或10℃水解108h。
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