CN105002147A - 表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用 - Google Patents

表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明采用定点突变技术将黑曲霉Aspergillus？niger？GIM？3.452(CICC？2377)的葡萄糖氧化酶(GOD)基因(Genebank:FJ979866.1)进行定点突变，使其氨基酸序列突变位点为Y76C和Q279K；将突变基因克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA，转化Pichia？pastoris？X33，筛选得到表达量提高的葡萄糖氧化酶毕赤酵母菌株P.pastoris？X33-pPICZαA-GODmut；酶学性质测定表明，突变的葡萄糖氧化酶基因能在毕赤酵母中稳定、高效的表达及遗传，突变菌株所表达的葡萄糖氧化酶的酶活性以及稳定性显著高于出发菌株。这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

Description

表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用。
背景技术
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。GOD是同型二聚体分子，含有2个黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合位点。每个单体含有2个完全不同的区域：一个与部分FAD非共价但紧密结合，主要为声折叠；另一个与底物β-D-葡萄糖结合，由4个α-螺旋支撑1个反平行的β-折叠。GOD广泛分布于动植物和微生物体内。由于微生物生长繁殖快、来源广，是生产GOD的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。
GOD已被广泛应用于食品、饲料、医药等领域，目前国外生产的GOD厂家主要是德国的Boehringer和日本的TOYOBO。产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制。
本发明采用定点突变技术将黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶(GOD)基因(Genebank:FJ979866.1)进行定点突变，使其氨基酸序列突变位点为Y76C和Q279K；将突变基因克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA，转化Pichia pastoris X33，筛选得到表达量提高的葡萄糖氧化酶毕赤酵母菌株。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种表达量提高的突变葡萄糖氧化酶GOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MQTLLVSSLVVSLAAALPHYIRSNGIEASLLTDPKEVAGRTVDYIIAGGGLTGLTTAARLTENPDITVLVIESGSCESDRGPIIEDLNAYGDIFGSSVDHAYETVELATNNQTALIRSGNGLGGSTLVNGGTWTRPHKAQVDSWETVFGNEGWNWDSVAAYSLQAERARAPNAKQIAAGHYFNASCHGINGTVHAGPRDTGDDYSPIVKALMSAVEDRGVPTKKDLGCGDPHGVSMFPNTLHEDQVRSDA AREWLLPNYQRPNLQVLTGQYVGKVLLSKNATTPRAVGVEFGTHKGNTHNVYAKHEVLLAAGSAVSPTILEYSGIGMKSILEPLGIDTVVDLPVGLNLQDQTTSTVRSRITSAGAGQGQAAWFATFNETFGDYAEKAHELLNTKLEQWAEEAVARGGFHNTTALLIQYENYRDWIVKDNVAYSELFLDTAGVASFDVWDLLPFTRGYVHILDKDPYLRHFAYDPQYFLNELDLLGQAAATQLARNISNSGAMQTYFAGETIPGDNLAYDADLSAWVEYIPYNFRPNYHGVGTCSMMPKEMGGVVDNAARVYGVQGLRVIDGSIPPTQMSSHVMTVFYAMALKIADAILADYASMQ. 
本发明的再一目的是提供编码上述突变葡萄糖氧化酶GOD的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2:
ATGCAGACTCTCCTTGTGAGCTCGCTTGTGGTCTCCCTCGCTGCGGCCCTCCCACACTACATCAGGAGCAATGGCATCGAAGCCAGCCTCCTGACTGACCCCAAGGAGGTTGCCGGCCGCACTGTCGACTACATCATCGCTGGTGGAGGTCTGACTGGACTCACCACTGCTGCCCGTCTGACGGAGAACCCCGATATCACTGTGCTTGTCATCGAAAGTGGCTCCTGCGAGTCTGACAGAGGTCCTATCATTGAGGACCTGAACGCTTACGGTGACATTTTTGGCAGCAGTGTGGACCACGCCTACGAGACTGTCGAGCTCGCCACCAACAATCAGACTGCGCTGATCCGCTCCGGAAATGGTCTCGGTGGCTCTACCCTCGTCAACGGTGGCACCTGGACTCGCCCCCACAAGGCACAAGTTGACTCATGGGAGACCGTCTTCGGAAATGAGGGCTGGAACTGGGACAGCGTGGCCGCCTACTCCCTCCAGGCTGAGCGTGCTCGCGCACCAAATGCCAAACAGATTGCTGCTGGCCACTACTTTAATGCATCCTGCCATGGTATCAATGGTACTGTCCACGCCGGACCCCGCGATACCGGTGATGACTACTCCCCCATCGTCAAGGCTCTCATGAGCGCTGTCGAAGACAGGGGCGTTCCCACCAAGAAGGACTTGGGATGCGGTGACCCCCATGGTGTGTCCATGTTCCCCAACACCTTGCACGAAGACCAAGTGCGCTCTGATGCCGCTCGCGAATGGCTCCTCCCCAACTACCAGCGTCCCAACCTGCAAGTCCTCACTGGACAGTATGTTGGAAAGGTCCTGCTCAGCAAGAACGCTACCACACCTCGTGCCGTTGGCGTGGAGTTCGGCACCCACAAGGGCAACACCCACAACGTCTACGCTAAGCACGAGGTCCTCCTGGCCGCTGGATCCGCTGTCTCTCCCACCATCCTCGAATATTCCGGTATCGGAATGAAGTCCATTCTAGAGCCTCTTGGAATTGACACCGTCGTTGACCTGCCCGTTGGTCTCAACCTTCAGGACCAGACCACCTCTACCGTCCGCTCACGCATTACCTCCGCCGGTGCCGGACAGGGACAGGCCGCTTGGTTCGCTACCTTCAACGAGACCTTTGGCGACTACGCCGAAAAGGCTCACGAGCTGCTCAACACCAAGCTGGAGCAGTGGGCCGAAGAGGCCGTCGCCCGTGGCGGATTCCACAACACCACCGCTTTGCTCATCCAGTACGAGAACTACCGCGACTGGATCGTCAAGGACAATGTCGCATACTCGGAACTCTTCCTCGACACGGCCGGAGTGGCCAGTTTCGATGTGTGGGATCTTCTGCCCTTCACTAGAGGATACGTACACATCCTCGACAAGGACCCCTACCTCCGCCATTTCGCATACGACCCTCAGTACTTTCTCAACGAGCTTGACCTGCTCGGCCAGGCTGCCGCCACTCAGCTGGCCCGCAACATCTCCAACTCCGGTGCCATGCAAACTTATTTCGCTGGAGAGACTATTCCCGGTGACAACCTCGCGTATGATGCCGACTTGAGCGCCTGGGTTGAGTATATCCCGTACAACTTCCGCCCTAACTACCATGGTGTGGGTACTTGCTCCATGATGCCGAAGGAGATGGGCGGTGTTGTCGACAATGCTGCCCGTGTGTATGGTGTGCAGGGACTGCGAGTCATCGATGGTTCTATTCCCCCTACGCAAATGTCGTCCCATGTTATGACGGTCTTTTATGCCATGGCCTTGAAGATTGCGGATGCCATCTTGGCGGATTATGCTTCCATGCAGTGA 
所述突变基因是以Genebank:FJ979866.1所示的序列为出发基因序列，通过定点突变，获得葡萄糖氧化酶氨基酸序列在第76位发生酪氨酸突变为半胱氨酸、第279 位发生谷氨酰胺突变为赖氨酸的突变序列。
本发明的再一目的是提供一种构建产所述突变葡萄糖氧化酶的基因工程菌的方法：用Stratagene的方法做定点突变技术，即用一对带有突变位点的引物扩增整个质粒，具体包括如下步骤：
(1)采用融合PCR方法将GOD基因序列中的EcoRI酶切位点突变，使其不能被EcoRI酶消化。
(2)将上述本发明的编码上述突变葡萄糖氧化酶GOD的基因连接到pPICZαA质粒，构建重组质粒GOD-pPICZαA。
(3)用Stratagene的方法做定点突变技术，扩增含突变Y76C的GOD重组质粒。
(4)在(3)的基础上，用Stratagene的方法做定点突变技术，扩增含突变Q279K的GOD重组质粒。
(5)将获得的重组表达载体转化Pichia pastoris X33得到基因工程菌；
(6)将获得的重组基因工程菌进行发酵，诱导葡萄糖氧化酶的表达；
(7)发酵结束后，回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶。
本发明的另一目的是提供一种应用上述基因工程菌株发酵生产葡萄糖氧化酶的方法，是以构建得到的产葡萄糖氧化酶基因工程菌株为生产菌株，基因工程菌经种子培养活化后接种到基本发酵培养集中，于30℃、200rpm条件下培养；当OD600值为1.2-1.5时，将菌株转入诱导培养基中诱导蛋白的产生。
本发明采用定点突变技术将黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶(GOD)基因(Genebank:FJ979866.1)进行定点突变，使其氨基酸序列突变位点为Y76C和Q279K；将突变基因克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA，转化Pichia pastoris X33，筛选得到表达量提高的葡萄糖氧化酶毕赤酵母菌株P.pastoris X33-pPICZαA-GODmut；酶学性质测定表明，突变的葡萄糖氧化酶基因能在毕赤酵母中稳定、高效的表达及遗传，突变菌株所表达的葡萄糖氧化酶的酶活性以及稳定性显著高于出发菌株。这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。
附图说明
图1重叠PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，M：DNA ladder 10,000；1：GOD2的PCR产物；2：GOD1的PCR产物；
图2重组质粒pPIC ZαA—GODTB的菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，1：重组表达质粒pPICZαA-GODTB转化子菌落PCR产物；空白：阴性对照；M：DNA ladder  10,000；
图3重组质粒pPIC-GODTB用EcoRI和NotI酶切后的产物琼脂糖凝胶电泳图，M:DNA ladder 10,000；1‐4：NotI/EcoRI双酶切重组质粒pPIC ZαA—GODTB，5：重组质粒pPIC ZαA—GODT
图4.1重组质粒pPICZαA‐GODmut琼脂糖凝胶电泳图，M：DNA ladder 10,000；1:重组质粒pPICZαA‐GODmut；
图4.2重组质粒pPICZαA‐GODmut用EcoRI和NotI酶切后的产物琼脂糖凝胶电泳图M：DNA ladder 10,000；1:重组质粒pPICZαA‐GODmut的双酶切产物；
图4.3 pPICZαA-GODmut-TOP10菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，1:阴性对照；2‐4：pPICZαA‐GODmut‐TOP10菌液PCR；M：DNA ladder 10,000；
图5突变型重组菌P.pastoris X33-pPICZαA-GODmut产GOD生长曲线；
图6出发菌株P.pastoris X33-pPICZαA-GOD产GOD生长曲线；
图7葡萄糖氧化酶蛋白电泳SDS-PAGE，1：发酵上清液；2：经过纯化的葡萄糖氧化酶溶液；M：protein ladder。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验材料和试剂
1、菌株与载体 
大肠杆菌菌株Top10、毕赤酵母X33、载体pPICZαA、Zeocin购自Invitrogen公司。
2、酶与试剂盒 
PCR酶、质粒提取试剂盒、胶纯化试剂盒购于上海生工公司，限制性内切酶购于NEB公司。
3、培养基
大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCL，pH7.0)。LB-Amp为LB培养基加100μg/ml氨苄青霉素。LB-Zeocin为LB培养基加25μg/ml Zeocin。 酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+100μg/ml Zeocin)。
酵母诱导培养基BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(v/v))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成分与BMGY相同)。
重组酵母发酵基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35mlPTM1。
PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％。一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、流水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％
4、化学试剂：葡萄糖氧化酶标准品、邻联茴香胺盐酸盐及辣根过氧化物购于Sigma公司，葡萄糖购于OXIOD公司，其他试剂购于广州化学试剂厂。
实施例1表达量提高的葡萄糖氧化酶基因
在Genebank:FJ979866.1的基因序列基础上；使其两个氨基酸位点发生突变，具体是Y76C和Q279K，可通过化学合成或定点突变的方式将两个位点进行氨基酸突变，突变后所得的GOD突变型氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2产葡萄糖氧化酶基因工程菌的构建及鉴定
采用PCR方法或化学全合成法获得序列如Genebank:FJ979866.1所示的GOD基因。PCR方法引物序列如下：
GODF:5'-CGGAATTCAGCAATGGCATCGAAGCCAGCCTC-3'
GODR:5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACTGCATGGAAGCATAATC-3'
PCR反应体系：0.2mL PCR管中按序列加入黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)DNA 1μl作为模板；上下游引物各1μl；2x pfu酶25μl；加双蒸水至终体积为50μl；PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸4min(30个循环)；72延伸10min；保留胶回收纯化后的PCR产物(GOD)。
采用融合PCR方法将GOD基因序列中的EcoRI酶切位点突变，使其不能被EcoRI酶消化。融合PCR方法引物序列如下：
GODF:5'-CGGAATTCAGCAATGGCATCGAAGCCAGCCTC-3'
GODR:5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACTGCATGGAAGCATAATC-3'
GODFmut:TGGCGTGGAGTTCGGCACCCACAAGGGCAA
GODRmut:GGGTGCCGAACTCCACGCCAACGGCACGAG
PCR片段1反应体系：0.2mL PCR管中按序列加入1)中的胶回收纯化后的PCR 产物(GOD)1μl作为模板；上下游引物(GODF/GODRmut)各1μl；2x pfu酶25μl；加双蒸水至终体积为50μl；PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸2min(30个循环)；72延伸10min；保留胶回收纯化后的PCR产物(GOD1)。
PCR片段2反应体系：0.2mL PCR管中按序列加入1)中的胶回收纯化后的PCR产物(GOD)1μl作为模板；上下游引物(GODR/GODFmut)各1μl；2x pfu酶25μl；加双蒸水至终体积为50μl；PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸2min(30个循环)；72延伸10min；保留胶回收纯化后的PCR产物(GOD2)。以1％琼脂糖凝胶电泳验证(图1)。
融合PCR反应体系：0.2mL PCR管中按序列加入GOD1 5μl；GOD2 5μl；2x pfu酶10μl；PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸2min(18个循环)；72延伸10min；
基因序列中EcoRI酶切位点突变的融合PCR反应体系：0.2mL PCR管中按序列加入融合PCR反应产物1μl；上下游引物(GODR/GODF)各1μl；2x pfu酶25μl；加双蒸水至终体积为50μl；PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸4min(30个循环)；72延伸10min；保留胶回收纯化后的PCR产物(GODTB)。
用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切消化纯化后的GODTB基因和载体pPICZαA，用T4连接酶置于16℃过夜连接，连接产物用化学转化法转化宿主菌TOP10，转化液涂布在含有Zeocin(25μg/ml)的LB平板上，于37℃、200rpm恒温培养箱中过夜培养，以通用引物5’AOX/3’AOX为引物进行菌落PCR，鉴定阳性克隆子(图2)，获得含有GODTB基因的重组表达质粒pPICZαA-GODTB，用EcoRI和NotI酶切后的产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行验证。(图3)
大肠杆菌化学转化法：取连接产物10μl加入到含有100μl TOP10感受态细胞中，将装有混合物的Eppendorf管置于冰上40min；置于42℃水浴90s，然后将其立即转移到冰上冷却3min；向管中加入500μl LB培养液，置于37℃、200rpm恒温培养箱中培养1h，然后涂布于含有zeocin的平板上，倒置培养12-16h后观察菌落生长状况。
Y76C定点突变重组质粒构建
采用PCR方法扩增含突变Y76C的GOD基因引物序列如下：
Y76C上游引物：5'-catcgaaagtggctcctgcgagtctgacagagg-3'
Y76C下游引物：5'-cctctgtcagactcgcaggagccactttcgatg-3'
PCR反应体系：0.2mL PCR管中按序列加入重组表达质粒pPICZαA-GODTB 1μl；Y76C上下游引物各1μl；2x primer star max酶25μl；加双蒸水至终体积为50μl；PCR扩增条件：98℃10s；55℃15s，72℃3min(30个循环)；保留胶回收纯化后的PCR产物(pPICZαA-GODTB-Y76C)。
K279Q定点突变重组质粒构建
采用PCR方法扩增含突变Q279K的GOD基因引物序列如下：
Q279K上游引物：5'-aaggtcctgctcagcaagaacgctaccacac-3'
Q279K下游引物：5'-gtgtggtagcgttcttgctgagcaggacctt-3'
PCR反应体系：0.2mL PCR管中按序列加入pPICZαA-GODTB-Y76C 1μl；K279Q上下游引物各1μl；2x primer star max酶25μl；加双蒸水至终体积为50μl；PCR扩增条件：98℃10s；55℃15s，72℃3min(30个循环)；保留胶回收纯化后的PCR产物(pPICZαA-GODTB-Y76C-K279Q)，命名为pPICZαA-GODmut，该质粒大小以及用EcoRI和NotI酶切后的产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行验证(图4.1与图4.2)。
大肠杆菌化学转化法：取已定点突变的重组质粒pPICZαA-GODmut 10μl加入到含有100μl TOP10感受态细胞中，将装有混合物的Eppendorf管置于冰上40min；置于42℃水浴90s，然后将其立即转移到冰上冷却3min；向管中加入500μl LB培养液，置于37℃、200rpm恒温培养箱中培养1h，然后涂布于含有zeocin的平板上，倒置培养12-16h后观察菌落生长状况。菌液PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定(图4.3)。
将含突变的重组质粒pPICZαA-GODmut以及未突变的重组质粒pPICZαA-GOD分别用限制性内切酶PmeI线性化后转化P.pastoris X33感受态细胞，得到能在YPDZ(含有100μg/ml Zeocin)的固体培养基上生长的基因工程菌，分别命名为P.pastoris X33-pPICZαA-GODmut和P.pastoris X33-pPICZαA-GOD。
实施例3葡萄糖氧化酶重组菌株的高效表达
将上述出发菌P.pastoris X33-pPICZαA-GOD和突变型重组菌P.pastoris X33-pPICZαA-GODmut单菌落进行高密度发酵培养。配置20L基本盐培养基，在50L自动控制发酵罐中灭菌后，冷却至常温备用。用氨水和磷酸调节发酵液的pH值至5.0，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于30％，发酵温度为30℃。整个发酵过程分3个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，将重组菌按照10％的接种量接种至发酵罐中，流加已灭菌的4L 50％的葡萄糖，培养24-30h，以补充完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖不完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上即 表明该阶段结束，约需30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，在此阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在180-200h之间。发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得酶液。在发酵过程中的不同时间点取样测定酶活，发酵过程中突变型重组菌P.pastoris X33-pPICZαA-GODmut表达GOD的情况如图5所示，诱导培养185h的发酵液的酶活性为1936U/ml。同样发酵条件下，将本发明人实验室保藏的出发菌株P.pastoris X33-pPICZαA-GOD进行高密度发酵培养，发酵过程中GOD的表达情况如图6所示，诱导培养185h后其发酵液的酶活性为460.3U/ml。说明突变型重组菌株能明显地提高GOD的表达水平。
酶学性质分析结果表明突变型重组菌株产的GOD，其最适作用温度和最适作用pH分别为40℃和5.5；耐温性实验结果表明60℃处理10min后剩余相对酶活力达到60％。耐酸碱性实验结果表明在pH4.0-7.0的缓冲液中处理7h，剩余相对酶活力达到85％以上。
GOD酶活性测定方法：取适当稀释的发酵上清液，加入2.5mL邻联茴香胺甲醇溶液，0.3mL 18％的葡萄糖溶液，0.1mL辣根过氧化物酶(90U/ml)，37℃保温5min后，向试管中加入稀释后的酶液0.1mL，反应3min后，加入2mol/L硫酸溶液终止反应，取出试管，测定OD540的吸光度值，以热失活的酶液做空白对照，根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶的活力单位。
发酵上清液经DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析法纯化，获得葡萄糖氧化酶纯品溶液。发酵上清液以及经过纯化后的葡萄糖氧化酶经SDS-PAGE蛋白电泳显示结果如图7所示。

Claims (7)

1.一种表达量提高的突变葡萄糖氧化酶GOD，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种突变的葡萄糖氧化酶基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述表达量提高的突变葡萄糖氧化酶GOD。
3.根据权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.包含权利要求2所述的突变的葡萄糖氧化酶基因的重组表达载体。
5.一种构建高表达葡萄糖氧化酶的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因连接到毕赤酵母表达载体，得到重组表达载体；
(2)将获得的重组表达载体转化Pichia pastoris X33得到基因工程菌。
6.一种高表达葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括发酵权利要求2所述葡萄糖氧化酶基因的基因工程菌
(3)将获得的重组进行发酵，诱导葡萄糖氧化酶的表达；
(4)发酵结束后，回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶。
7.权利要求1所述的表达量提高的突变葡萄糖氧化酶GOD的应用。
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