CN106754979A

CN106754979A - 一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用

Info

Publication number: CN106754979A
Application number: CN201611218540.2A
Authority: CN
Inventors: 王瑞明; 石莹; 汪俊卿; 杨晓慧; 程成; 彭健; 修翔
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-12-26
Also published as: CN106754979B

Abstract

本发明涉及一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用。所述调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因fat1p，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述长链脂肪酸转运蛋白Fat1p，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次发现热带假丝酵母中的长链脂肪酸转运蛋白基因fat1p为长链脂肪酸的跨膜转运过程中的关键基因，其表达可以促进长链脂肪酸由胞外到胞内的跨膜转运，为以油脂为原料实现新途径合成长链二元酸打下基础。

Description

一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

长链二元酸一般是指碳链中含有10个以上碳原子的直链脂肪族二元羧酸。该产品具有较高的工业应用价值，可以用于合成特种尼龙、高级麝香、粘合剂、热熔胶、医药、农药等重要的化工中间体。目前国内外生产长链二元酸主要有2种方法：化学法和发酵法。与微生物发酵法相比，化学法生产长链二元酸条件苛刻、工艺复杂、不够环保，且产品质量差，因此众多研究者将目标转向有广阔发展前景、工业价值大的微生物发酵上来。微生物发酵法是以正构烷烃为原料，利用热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)的氧化性能，在常温常压下氧化正构烷烃两端的甲基，生成基质烷烃相应链长的二元酸。国内已经实现了以烷烃为底物发酵生产长碳链二元酸的产业化，生物法制备得到十一至十四碳二元酸已投放市场。如中国专利文献CN1570124A(申请号2004100182557)、中国专利文献CN1844404A(申请号CN200610038331X)、中国专利文献CN101225411A(申请号2007101958427)、中国专利文献CN102115769A(申请号2009102565907)、中国专利文献CN102115768A(申请号2009102565890)、中国专利文献CN102115766A(申请号2009102565871)、中国专利文献CN102115765A(申请号2009102565867)、中国专利文献CN102061316A(申请号2010101603101)和中国专利文献CN103805642A(申请号2012104397995)等。

目前微生物发酵法生产长链二元酸的技术特别是微生物育种方面日趋成熟，如中国专利文献CN105400796A(申请号201511003830)则公开了一种热带假丝酵母定位于过氧化物酶体膜上的长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p，并通过基因工程阻断该基因的合成实现长链二元酸产量的提升。中国专利文献CN103992959A(申请号2014101755564)通过增加一个拷贝的CYP单加氧酶基因提高热带假丝酵母长链二元酸的产率，中国专利文献CN102839133A(申请号CN201110168672X)则菌种诱变育种筛选到一株pox4基因、fao基因和CYP52A18基因的突变株，突变株对不同碳链长度的烷烃、脂肪酸等物质具有很高的转化性能。但随着石油资源的枯竭，以烷烃为原料生产长链二元酸面临日益严重的成本压力和原料压力。因此，寻找可再生的、廉价的烷烃替代品作为原料，成为长碳链二元酸产业所面临的重大挑战。采用油脂为原料生产长链二元酸，可以大大降低原料成本，与国外化学合成法、国内利用石油生物发酵生产二元酸相比，节省了能源类原料，预计生产成本下降20％以上。虽然以油脂为原料生产长链二元酸能够有效节约成本，并且为油脂特别是回收油脂的资源化利用开辟了一条新途径，但由于目前长链二元酸生产菌株均利用烷烃为底物进行发酵，而对油脂的吸收和利用效率较低，因而寻找新的途径提高热带假丝酵母吸收油脂的效率势在必行。

在酵母的生活周期中，油脂需要在胞外环境中被脂肪酶分解为甘油和脂肪酸后才能被细胞吸收利用，而目前对酵母吸收转运脂肪酸的详尽机制还不十分明确。Stahl(2004)提出，在酿酒酵母中FAT/CD36可能把长链脂肪酸(long chain fatty acids,LCFAs)传递给FATP转运进入细胞。进入细胞的LCFAs被FATP激活形成乙酰CoA，然后与细胞质结合蛋白(acyl-coenzyme A-binding protein,ACBP)结合，参与甘油三酯的合成。其它LCFAs和细胞质结合蛋白或FABP结合，转运至细胞内代谢需要的位点(Pohl等，2004)，而在热带假丝酵母中尚未有相关转运蛋白被报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用。

本发明技术方案如下：

一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因fat1p，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因fat1p来源于热带假丝酵母，定位于热带假丝酵母细胞膜上，其表达可以促进长链脂肪酸由胞外到胞内的跨膜转运。

一种长链脂肪酸转运蛋白Fat1p，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因fat1p在改造热带假丝酵母制备长链二元酸中的应用。

根据本发明优选的，所述应用，通过构建长链脂肪酸转运的基因fat1p的多拷贝重组假丝酵母或更换启动子实现长链脂肪酸转运的基因fat1p的过量表达。

通过构建长链脂肪酸转运的基因fat1p的多拷贝重组假丝酵母或更换启动子实现长链脂肪酸转运的基因fat1p的过量表达，从而可以提高热带假丝酵母胞外长链脂肪酸向胞内转运速率，增加长链二元酸合成原料长链脂肪酸的供给，进而提高热带假丝酵母长链二元酸的产量。

有益效果

本发明首次发现热带假丝酵母中的长链脂肪酸转运蛋白基因fat1p为长链脂肪酸的跨膜转运过程中的关键基因，其表达可以促进长链脂肪酸由胞外到胞内的跨膜转运，为以油脂为原料实现新途径合成长链二元酸打下基础。

附图说明

图1、同源臂Fat1p1电泳结果照片；

图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为同源臂Fat1p1；

图2、G418抗性基因片段Kan电泳结果照片；

图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为G418抗性基因片段Kan；

图3、重叠片段Fat1p1-kan电泳结果照片；

图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为重叠片段Fat1p1-kan；

图4、酵母基因组PCR验证电泳结果照片；

图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为重叠片段Fat1p1-kan；

图5、热带假丝酵母原始菌和热带假丝酵母重组菌生长曲线图；

图6、实施例3通过PCR扩增获得Fat1p基因的电泳照片；

图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为Fat1p基因；

图7、实施例3采用菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子的结果照片；

图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为Fat1p基因；

图8、实施例3电转入热带假丝酵母感受态后的鉴定结果照片；

图9、热带假丝酵母重组菌油脂利用能力曲线图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

质粒pPIC9K购自宝生物有限公司；

热带假丝酵母(Candida tropicalis)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC1798；

实施例1热带假丝酵母长链脂肪酸基因的查找及分析

目前关于长链脂肪酸转运蛋白的研究非常少，已知仅酿酒酵母中存在特殊的长链脂肪酸转运蛋白负责长链脂肪酸的跨膜转运，而热带假丝酵母中类似基因尚未被报道。以酿酒酵母fat1p基因为模板在NCBI数据库查询可知，热带假丝酵母基因组中存在相似基因序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的蛋白质与酿酒酵母中的fat1p序列一致性为59.7％，推测其与长链脂肪酸转运有关。

实施例2热带假丝酵母fat1p基因功能的验证

1、热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法，步骤如下：

(1)提取热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌体的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到同源臂Fat1p1，长度551bp，如图1所示，所述的PCR引物序列如下：

Fat1p F₁:GGAATTCAGACCAAGAAAGAATGCACCA；

Fat1p R₁:CAACGGCCTCAACCCCAAGACATGATACCTGCT；

其中，下划线标识为EcoR I酶切位点；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物Fat1p F₁ 2.5μl，浓度10μmol/L的引物Fat1p R₁ 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(2)提取pPIC9K质粒，并以此为模板，进行PCR扩增，得到Kan片段，长度1523bp，如图2所示，所述的PCR引物序列如下：

Kan F₂:TCTTGGGGTTGAGGCCGTTGAGCA；

Kan R₂:ATTGTGTGAATTCAGTGAGTCAGTCATCAGG；

其中，下划线标识为EcoR I酶切位点；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物Kan-F₂ 2.5μl，浓度10μmol/L的引物Kan-R₂ 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(3)将步骤(1)制得的Fat1p1片段与步骤(2)制得的kan片段进行重叠PCR，制得Fat1p1-kan片段，长度2074bp，如图3所示；所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：

Fat1p1片段4μl；kan片段4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；

所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：

上游引物Fat1p F₁2μl；下游引物Kan R₂ 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O8.5μl；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

2、制备热带假丝酵母感受态

(i)将热带假丝酵母(Candida tropicalis)接种到含50ml菌体增殖培养基的250ml三角瓶中，30℃，200rpm/min，摇床过夜培养；

所述菌体增殖培养基，每升组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L。

(ii)将过夜培养的菌液涂布至固体YPD培养基，30℃培养1～2d，得到热带假丝酵母(Candida tropicalis)单菌落；用接种环挑取单菌落到50ml菌体增殖培养基中，30℃、200rpm/min培养12h，转接，培养10h；

所述YPD固体培养基，每升组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L、琼脂2g/L。

(iii)取1.5ml菌液到Ep管中，3000rpm/min，离心1min，收集菌体，用1.5ml预冷的无菌水吹打悬浮细胞；

(iv)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用1ml预冷的无菌水悬浮细胞；

(v)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用1ml 1mol/L预冷的山梨醇悬浮细胞；

(vi)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用80μL预冷的山梨醇悬浮细胞，即制成热带假丝酵母电转化感受态；将制备好的感受态细胞置于-80℃保存备用。

3、将Fat1p1-kan片段转化热带假丝酵母细胞

(i)将制得的Fat1p1-kan片段用限制性内切酶EcoR I酶切，酶切体系如下，总体系40μL：

(ii)浓缩纯化酶切产物

(1)加入1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃冰箱20min；

(2)12000r/min，离心5min得沉淀；

(3)300μL体积百分比为70％的乙醇重悬沉淀；

(4)12000r/min，离心5min，除去乙醇，37℃风干30min；

(5)加入15～18μL ddH₂O重悬DNA，并置于-20℃保存。

(iii)电转化

利用核酸超微量分光光度计(BioFuture MD2000)测定Fat1p1-kan片段浓度，达到浓度2000μg/ml后进行电转化，电转化条件为1500V、5ms，然后在含1mol/L山梨醇的复苏培养基中培养，得到的细胞复苏后取100μL涂布在含1mg/mLG418(遗传霉素)的YPD固体培养基上，在30℃培养3天，筛选具有G418抗性的转化子；

所述复苏培养基，每升组分如下：山梨醇1mol/L

4、阳性重组菌的培养及鉴定

将上述筛选获得的转化子接种到含G418抗性的YPD液体培养基中培养过夜，吸取1mL菌液，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，Fat1p F₁和Kan R₂为引物进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳证明外源片段Fat1p1-kan转化到基因组上，结果如图4所示。

所述YPD液体培养基，每升组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L。

利用上述热带假丝酵母基因工程重组菌发酵验证敲除Fat1p基因对细胞吸收油脂速率的影响的方法，步骤如下：

将热带假丝酵母原始菌和上述重组菌种子液分别接种于YPD液体培养基中，30℃条件下培养14小时；取1ml原始菌菌液和1ml油脂接种到50ml发酵培养基中；每两小时测一次OD₆₀₀，即得热带假丝酵母原始菌的生长曲线；取1ml重组菌菌液和1ml油脂接种到50ml发酵培养基中；每两小时测一次OD₆₀₀，即得热带假丝酵母重组菌的生长曲线。

所述发酵培养基组分如下：

(NH₄)₂SO₄ 1g/L、酵母膏2g/L、VB₁ 0.1g/L、NaCl 2g/L、KH₂PO₄ 4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O10.08g/L、尿素2g/L、Mg₂SO₄·7H₂O 6.15g/L，水配制，pH 7.0；油脂；

所述热带假丝酵母基因工程重组菌种子液采用如下方法制备：

将热带假丝酵母基因工程重组菌接种于种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养14小时，制得热带假丝酵母基因工程重组菌种子液；

所述种子培养基组分如下：

酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖30g/L，水配制，pH自然。

使用含油脂质量浓度为2％的发酵培养基培养12h，并对热带假丝酵母重组菌和热带假丝酵母原始菌分别进行油脂利用能力分析，结果如图5所示。

据图5 OD₆₀₀值可知重组后的热带假丝酵母的生长速率较热带假丝酵母原始菌相比受到影响，热带假丝酵母重组菌的生长滞后，没有出现正常状态下的S形生长曲线，菌体生长速率变慢，菌体量降低至原始菌的50％以下。由此可知，fat1p基因的单敲除后酵母吸收利用油脂的能力显著下降，表明fat1p基因为热带假丝酵母油脂吸收的关键基因。

实施例3

在获得Fat1p全长基因的基础上，设计特异性引物克隆目的基因，通过无缝克隆技术将载体和目的基因配置重组反应体系，进行重组反应。转化入DH5α感受态中，筛选阳性克隆子。测序正确后提取质粒电转入热带假丝酵母感受态中。发酵验证增加Fat1p基因拷贝数对细胞吸收油脂速率的影响的。其技术核心是利用同源重组原理，将载体进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化载体的末端序列，使得PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(15bp～20bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在无缝交换酶的催化下，仅需反应30min即可进行转化，完成定向克隆，阳性率可达95％以上。

(i)提取热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌体的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到Fat1p基因，长度3049bp，如图6所示，所述的PCR引物序列如下：

Fat1p F₂:ctcactatagggagagcggccgcTAGTTCTATCTAAGTAGATGATCTTAAATCGAT；

Fat1p R₂:catccggaagatctggcggccgcTTTGATTTAAGAAGTCACAAAACAATACTT；

其中，下划线标识为Not I酶切位点；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Phanta Master Mix25μl，浓度10μmol/L的引物Fat1p F₂ 2.5μl，浓度10μmol/L的引物Fat1p R₂ 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性15sec，51℃退火15sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；

(ii)将质粒载体用限制性内切酶Not I酶切，酶切体系如下，总体系50μL：

所述的载体为带有G418抗性标签的pZERO-Blunt(购自Aidlab公司)克隆载体；

(iii)酶切产物使用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒柱纯化，柱纯化产物去磷酸化后配置重组体系进行重组反应，反应产物转化、涂板，挑取单菌落采用菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子；送至上海博尚测序。

所述的PCR引物序列如下：

Fat1p F₂:ctcactatagggagagcggccgcTAGTTCTATCTAAGTAGATGATCTTAAATCGAT；

Fat1p R₂:catccggaagatctggcggccgcTTTGATTTAAGAAGTCACAAAACAATACTT；

结果如图7所示。

(iv)确认序列的信息正确后，抽提相应的质粒，电转入热带假丝酵母感受态中，步骤如实施例2步骤3第(iii)中所述，阳性重组菌的培养及鉴定如实施例2步骤4所述，结果如图8所示。

利用上述热带假丝酵母基因工程重组菌发酵验证增加Fat1p基因拷贝数对细胞吸收油脂速率的影响的方法，步骤如下：

将热带假丝酵母原始菌接种于YPD液体培养基中，30℃条件下培养14小时；取1ml取1ml重组菌菌液和1ml油脂接种到50ml发酵培养基中；每12小时测一次OD₆₀₀即得热带假丝酵母重组菌的生长曲线。

所述发酵培养基组分如下：

所述种子培养基组分如下：

酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖30g/L，水配制，pH自然。

使用含油脂质量浓度为2％的发酵培养基培养84h，并对热带假丝酵母重组菌和热带假丝酵母原始菌分别进行油脂利用能力分析，结果如图9所示。该图结果表明，增加Fat1p基因拷贝数后的热带假丝酵母前期发酵过程的与原始菌株接近，但在对数中后期，增加Fat1p基因拷贝数后的热带假丝酵母热带假丝酵母对油脂的吸收速度明显加快，较原始菌更快的到达稳定期(提前约14h)，进而明显加快以油脂为底物的发酵进程。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3049

<212> DNA

<213> Candida tropicalis

<400> 1

tagttctatc taagtagatg atcttaaatc gataaatctc gttttgtatt ttcccacacc 60

gttagttgca aaaaaaaaaa aatagcactg ttaattccga attatgcata tattcttcta 120

tgttttgtga tctcatccgc actaaggcaa acattataaa ataggagggg aatctcatgt 180

gaaaaataaa aaatcaggtg caatatgtca aaaccattca gagaaaaaac atgctcggtt 240

aattggaaga aggcaagaaa tgttgggcag ttgatccgaa gaagttcatc gagggttgaa 300

gatgaacttt tgccattaat ccattctact atagaaagct aaacacatat ccaaacaaga 360

cccaattaaa tcgtgaaata gcaatctata agtaattctc aacaactggt tctgttagtg 420

acgtctcgtg gtgaagcaaa acgaacgagc gtaccgagta ataactttga ttgctcacaa 480

ggtaattatt tttttctcct gtattttgtg gagaaacatg ttcgattcct taatgattcc 540

tgtgaaaaga gaaacatggt agtaactttc tgggaaattt tcacattacg tatattgtgt 600

tgaatttctt ttttatattg ttttaagttt gttccctatc agggaaattc tggatacttt 660

tcaatagttt gtataaatac ataatgaata tcccactgat aactgttttt ctctcatcct 720

ctcactttct ttctttcata atactatatt cttttttaat cgaaattttt tttttggttc 780

tcgctaatat ttctatcaga taaatattat tcacatcatt aaatctacta aatcaaaata 840

attgcaaatg tcaggattag aaattgctgc agctgccgtt cttggtagtc agttattaga 900

agccaaatat ttaatttccg atgatgtact gttggccaaa acagttgctc ttaatgcact 960

tccatattta tggaaagcct ccaggggtaa agcttcatat tggtatttct ttgaaaaatc 1020

agtatttaaa aatccaaata ataaagcatt ggcatttcca agaccaagaa agaatgcacc 1080

accaccaaag gttgatgatg aaggatttca aatttatgac gatcaatttg acctagaaga 1140

atatacctat aaggaattgt atgacatggt tttgaaatac tcttacattt tgaaacatga 1200

atatggtgtt actgcaaatg atactattgg tgtttcttgt atgaataaac cacttttcat 1260

tgttttatgg ttggccttat ggaatattgg tgccttgcca gcatttttga atttcaacac 1320

caaagataaa ccattgattc actgtcttaa aattgtcaat gctagtcaag ttttcgttga 1380

tcctgattgt gatgctccaa tcaaagatac tgaatctcaa attaaagagg aattaccaca 1440

tgttagaata aattacattg atgaatttgc tttgtttgat agattaagac tcaagtctac 1500

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tgcgttgatc tatacatcag gtaccactgg tttaccaaaa gcaggtatca tgtcttggag 1620

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tcaagctaga ttatgtggtg ccacacatat tcaatatgtt ggtgaagttt gtcgttattt 1860

gttaaactca aaacatcacc cagatcaaga tagacacaat gttaaaattg cctatggtaa 1920

tggattacgt ccagatatat ggtctgaatt caagagaaga ttccacattg aaggtattgg 1980

ggaattttat gcagctactg aatctccaat tgccactaca aacttacaat acggtgaata 2040

tggtgtaggt gcctgtcgta aatatggttc acttattagt ttattgttat ctacccaaca 2100

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acttaattca tgaaaacaca agtattgttt tgtgacttct taaatcaaa 3049

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<211> 650

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 2

Met Ser Gly Leu Glu Ile Ala Ala Ala Ala Val Leu Gly Ser Gln Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Lys Tyr Leu Ile Ser Asp Asp Val Leu Leu Ala Lys Thr

20 25 30

Val Ala Leu Asn Ala Leu Pro Tyr Leu Trp Lys Ala Ser Arg Gly Lys

35 40 45

Ala Ser Tyr Trp Tyr Phe Phe Glu Lys Ser Val Phe Lys Asn Pro Asn

50 55 60

Asn Lys Ala Leu Ala Phe Pro Arg Pro Arg Lys Asn Ala Pro Pro Pro

65 70 75 80

Lys Val Asp Asp Glu Gly Phe Gln Ile Tyr Asp Asp Gln Phe Asp Leu

85 90 95

Glu Glu Tyr Thr Tyr Lys Glu Leu Tyr Asp Met Val Leu Lys Tyr Ser

100 105 110

Tyr Ile Leu Lys His Glu Tyr Gly Val Thr Ala Asn Asp Thr Ile Gly

115 120 125

Val Ser Cys Met Asn Lys Pro Leu Phe Ile Val Leu Trp Leu Ala Leu

130 135 140

Trp Asn Ile Gly Ala Leu Pro Ala Phe Leu Asn Phe Asn Thr Lys Asp

145 150 155 160

Lys Pro Leu Ile His Cys Leu Lys Ile Val Asn Ala Ser Gln Val Phe

165 170 175

Val Asp Pro Asp Cys Asp Ala Pro Ile Lys Asp Thr Glu Ser Gln Ile

180 185 190

Lys Glu Glu Leu Pro His Val Arg Ile Asn Tyr Ile Asp Glu Phe Ala

195 200 205

Leu Phe Asp Arg Leu Arg Leu Lys Ser Thr Pro Lys Tyr Arg Ala Glu

210 215 220

Asp Ser Thr Arg Arg Pro Thr Asp Thr Asp Ser Ser Ala Cys Ala Leu

225 230 235 240

Ile Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Ala Gly Ile Met Ser

245 250 255

Trp Arg Lys Ala Phe Met Ala Ser Val Phe Phe Gly His Ile Met Lys

260 265 270

Ile Lys Asn Asp Ser Asn Val Leu Thr Ala Met Pro Leu Tyr His Ser

275 280 285

Thr Ala Ala Met Leu Gly Leu Cys Pro Thr Leu Ile Val Gly Gly Cys

290 295 300

Val Ser Val Ser Gln Lys Phe Ser Ala Thr Ser Phe Trp Thr Gln Ala

305 310 315 320

Arg Leu Cys Gly Ala Thr His Ile Gln Tyr Val Gly Glu Val Cys Arg

325 330 335

Tyr Leu Leu Asn Ser Lys His His Pro Asp Gln Asp Arg His Asn Val

340 345 350

Lys Ile Ala Tyr Gly Asn Gly Leu Arg Pro Asp Ile Trp Ser Glu Phe

355 360 365

Lys Arg Arg Phe His Ile Glu Gly Ile Gly Glu Phe Tyr Ala Ala Thr

370 375 380

Glu Ser Pro Ile Ala Thr Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Glu Tyr Gly Val

385 390 395 400

Gly Ala Cys Arg Lys Tyr Gly Ser Leu Ile Ser Leu Leu Leu Ser Thr

405 410 415

Gln Gln Lys Leu Ala Lys Met Asp Pro Glu Asp Glu Ser Glu Ile Tyr

420 425 430

Lys Asp Pro Lys Thr Gly Phe Cys Val Glu Ala Ala Tyr Asn Glu Pro

435 440 445

Gly Glu Leu Leu Met Arg Ile Leu Asn Pro Asn Asp Ile Gln Lys Ser

450 455 460

Phe Gln Gly Tyr Tyr Gly Asn Lys Ser Ala Thr Asn Ser Lys Ile Leu

465 470 475 480

Thr Asn Val Phe Lys Lys Gly Asp Ala Trp Tyr Arg Ser Gly Asp Leu

485 490 495

Leu Lys Met Asp Glu His Gln Leu Leu Tyr Phe Val Asp Arg Leu Gly

500 505 510

Asp Thr Phe Arg Trp Lys Ser Glu Asn Val Ser Ala Thr Glu Val Glu

515 520 525

Asn Glu Leu Met Gly Ser Lys Ala Leu Lys Gln Ser Val Val Val Gly

530 535 540

Val Lys Val Pro Asn His Glu Gly Arg Ala Cys Phe Ala Val Cys Glu

545 550 555 560

Ala Lys Asp Asp Leu Thr His Glu Asp Ile Leu Lys Leu Ile His Gly

565 570 575

His Val Thr Lys Ser Leu Pro Val Tyr Ala Gln Pro Ala Phe Ile Lys

580 585 590

Ile Gly Ser Ile Glu Ala Ser His Asn His Lys Val Pro Lys Asn Gln

595 600 605

Phe Lys Asn Gln Lys Leu Pro Lys Gly Glu Asp Gly Lys Asp Leu Ile

610 615 620

Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Lys Tyr Gln Glu Leu Thr Glu Glu Asp Trp

625 630 635 640

Ser Leu Ile Cys Thr Gly Lys Ala Lys Leu

645 650

Claims

1.一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因fat1p，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种长链脂肪酸转运蛋白Fat1p，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因fat1p在改造热带假丝酵母制备长链二元酸中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，通过构建长链脂肪酸转运的基因fat1p的多拷贝重组假丝酵母或更换启动子实现长链脂肪酸转运的基因fat1p的过量表达。