CN107384923A - 启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用 - Google Patents

启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107384923A
CN107384923A CN201710645497.6A CN201710645497A CN107384923A CN 107384923 A CN107384923 A CN 107384923A CN 201710645497 A CN201710645497 A CN 201710645497A CN 107384923 A CN107384923 A CN 107384923A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pylg
pcr
follows
kanr
candida tropicalis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710645497.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107384923B (zh
Inventor
汪俊卿
彭健
王瑞明
修翔
薛乐
王腾飞
苏静
杨晓慧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qilu University of Technology
Original Assignee
Qilu University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qilu University of Technology filed Critical Qilu University of Technology
Priority to CN201710645497.6A priority Critical patent/CN107384923B/zh
Publication of CN107384923A publication Critical patent/CN107384923A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107384923B publication Critical patent/CN107384923B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/0103—Glycerol kinase (2.7.1.30)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用。启动子pYLG，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还涉及启动子pYLG在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用。本发明首次公开了一种可以在热带假丝酵母中实现控制热带假丝酵母甘油激酶基因GK表达的启动子pYLG，为构建可调控甘油激酶基因GK的热带假丝酵母工程菌奠定了基础。

Description

启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的 应用
技术领域
本发明涉及一种启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
长链二元酸(Long chain dicarboxylic acid)是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸，其通式为HOOC-(CH2)n-COOH(n＝9～16)，是一类用途极其广泛的重要精细化工产品。长链二元酸是重要的精细化工中间体，可以合成人造麝香、共聚酰胺塑料热熔胶、尼龙工程塑料、高级尼龙喷麽、高温电解质、高档服装热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级汽车油漆、防紫外线涂料、合成光缆导体等众多精细化工产品。二元酸被广泛应用于化工，轻工，国防、汽车工业、农药，医药，工程材料，晶体材料等领域。长链二元酸在自然界不存在，目前国内外生产长链二元酸主要有2种方法：化学法和发酵法。与微生物发酵法相比，化学法生产长链二元酸条件苛刻、工艺复杂、污染严重，且产品质量差，因此众多研究者将目标转向有广阔发展前景、工业价值大的微生物发酵上来。
微生物发酵法是以正构烷烃为原料，利用热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)的氧化性能，在常温常压下氧化正构烷烃两端的甲基，生成基质烷烃相应链长的二元酸。由于长链二元酸的下游产品的开发潜力广阔，国内长链二元酸的需求量将不断增加，其市场潜力极大。
目前，国内已经实现了热带假丝酵母以烷烃为底物生成长链二元酸的发酵手段，如中国专利文献CN103074325A(申请号201310045582.0)、中国专利文献CN102839133A(申请号201110168672X)、中国专利文献CN102115766A(申请号2009102565871)、中国专利文献CN102115766B(申请号2009102565871)、中国专利文献CN1614004A(申请号200410096698.8)、中国专利文献CN103805642A(申请号2012104397995)、中国专利文献CN102115769A(申请号2009102565907)、中国专利文献CN102115765A(申请号2009102565867)、中国专利文献CN1844404A(申请号200610038331X)。
但以油脂为底物进行发酵产长链二元酸的研究则较少，如中国专利文献CN106754979A(申请号CN201611218540.2)、中国专利文献CN105154483A(申请号CN201510659020.4)和CN105400796A(申请号CN201511003830.0)阐述了利用热带假丝酵母发酵油脂产长链二元酸的可行性。而与烷烃发酵不同的是，以油脂为底物进行发酵产长链二元酸发酵时，除会产生长链二元酸之外，油脂被水解后还有一定量的甘油作为副产物产生，中国专利文献CN106636156A(CN201611219248.2)描述了利用改造后的工程菌在产长链二元酸的同时，将副产物甘油转化为1,3-丙二醇的技术路线。但上述副产物的生成不仅不利于后续长链二元酸的分离，而且由于副产物的合成消耗了大量的能量，极大的增加了长链二元酸生产成本。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用。
本发明技术方案如下：
一种启动子pYLG，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述启动子pYLG在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：
(1)PCR扩增制备核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子pYLG片段；
(2)制备核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的甘油激酶GK片段；
(3)将步骤(1)制得的启动子pYLG片段与步骤(2)制得的甘油激酶GK片段进行PCR重叠连接，制得pYLG-GK片段；
(4)以含有Kanr9k质粒的大肠杆菌为模板，进行PCR扩增，得到抗性基因Kanr片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：
Kanr-up:5’-GACCTTCGTTTGTGCGGATCCTGAGGGAGCCACGGTTGAT-3’，
Kanr-down:5’-GAAAAGGGGGACGAGGATCGGTTGAGGCCGTTGAGCAC-3’
(5)将步骤(4)得到的抗性基因Kanr片段通过一步法定向克隆无缝克隆连接至pPICzαA载体，制得重组载体pPICzαA-Kanr；
(6)将步骤(3)制得的pYLG-GK片段通过一步法定向克隆无缝克隆连接至步骤(5)制得的的重组载体pPICzαA-Kanr，制得重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK；
(7)将步骤(6)制得的重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK经电击转化至热带假丝酵母，筛选阳性菌株，制得高产长链二元酸的热带假丝酵母。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增引物序列如下：
pYLG-up:5’-TTAGACCACTCTTTTGAGCTCGGTTGAAATGAATCGGCCG-3’，
pYLG-down:5’-ACTACGACGTGGCATTGTTGATGTGTGTTTAATTCAAGAATG-3’，
PCR扩增反应体系如下，总体系为50μl：
2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L浓度的上游引物(pYLG-up)2μl，10μmol/L浓度的下游引物(pYLG-down)2μl，解脂耶氏酵母基因组DNA2μl，ddH2O补足50μl；
PCR反应程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增引物序列如下：
GK-up:5’-AATTAAATTTTAACAATGCCACGTCGTAGTAGTAA-3’，
GK-down:5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAGCTTTATTTTTTTTTGTTCATTAGTTCTAC-3’；
PCR扩增反应体系如下，总体系为50μl：
2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L浓度的上游引物(GK-up)2μl，10μmol/L浓度的下游引物(GK-down)2μl，热带假丝酵母基因组DNA2μl，ddH2O补足50μl；
PCR反应程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(3)中，所述的重叠PCR的第一步扩增体系如下，总体系为25μl：
2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，浓度10μmol/L的pYLG片段2μl，浓度10μmol/L的GK片段回收产物2μl，ddH2O补足25μl；
重叠PCR的第一步扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存；
所述的重叠PCR的第二步扩增体系如下，总体系为25μl：
2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，浓度10μmol/L的上游引物(pYLGg-up)2μl，浓度10μmol/L的下游引物(GD-down)2μl，ddH2O补足25μl；
重叠PCR的第二步扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(4)中，PCR扩增反应体系如下，总体系为50μl：
2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L浓度的上游引物(Kanr-up)2μl，10μmol/L浓度的下游引物(Kanr-down)2μl，模板2μl，ddH2O补足50μl；
PCR反应程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。
步骤(5)和(6)中的一步法定向克隆无缝克隆连接可参见pPICzαA载体的使用说明书，步骤(7)中的电击转化、筛选阳性菌株均采用本领域的常规技术即可。
原理说明
发明人通过研究发现，热带假丝酵母具备正常的甘油吸收能力，但对甘油的代谢利用效果不佳，推测胞内的甘油激酶的含量是热带假丝酵母利用甘油的关键限制点，并基于该推测将包括解脂耶氏酵母的pYLG启动子、热带假丝酵母中的甘油激酶基因GK及对应终止子和G418抗性基因Kanr通过一步法定向克隆无缝克隆连接至pPICzαA表达载体，然后将重组载体转化到热带假丝酵母基因组中，构建了高产长链二元酸的热带假丝酵母工程菌，实现了GK在pYLG强启动子控制下的表达，使热带假丝酵母能高效利用在以油脂为底物生产长链二元酸的同时，将产生的副产物甘油转化为ATP为热带假丝酵母发酵提供能量，提高工程菌的发酵效率，减少葡萄糖供给量，节约发酵成本的目的；该技术方案的主要技术难点在于：
1、启动子的选取，目前常规的酵母启动子均无法实现甘油激酶基因GK的控制表达，而发明人通过偶然机会发现解脂耶氏酵母中的pYLG启动子对甘油激酶基因GK具有很好的控制表达效果；
2、甘油激的含量是热带假丝酵母利用甘油的关键限制点结论的得出，由于甘油的利用收多种基因调控，发明人通过多次假设性试验才获得甘油激的含量是热带假丝酵母利用甘油的关键限制点的结论。
有益效果
1、本发明首次公开了一种可以在热带假丝酵母中实现控制热带假丝酵母甘油激酶基因GK表达的启动子pYLG，为构建可调控甘油激酶基因GK的热带假丝酵母工程菌奠定了基础；
2、本发明所提供的一种重组载体及应用方法；
3、本发明所构建的热带假丝酵母工程菌，能够实现热带假丝酵母甘油激酶基因GK在pYLG强启动子控制下的表达，使热带假丝酵母具备高效的甘油利用能力，使热带假丝酵母工程菌在高效利用以油脂为底物生产长链二元酸的同时，将产生的副产物甘油转化为ATP，为热带假丝酵母发酵提供能量，提高工程菌的发酵效率，同时减少产物长链二元酸的消耗，提高长链二元酸产量，节约发酵成本。
附图说明
图1、实施例制备的启动子pYLG的过程图；
图2、甘油脱水酶GK电泳图；
图3、重叠片段pYLG-GK电泳图；
图4、抗性标记Kanr电泳图；
图5、重组载体pPICzαA-Kanr菌落PCR电泳图；
图6、重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK菌落PCR电泳图；
图7、重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK电转化至热带假丝酵母验证电泳图；
图8、原始菌、pYLG启动子替换工程菌和pGAP启动子替换工程菌对2％甘油效果效果曲线图；
图9、原始菌、pYLG启动子替换工程菌和pGAP启动子替换工程菌以甘油为唯一碳源的菌体增长情况曲线图；
具体实施方式:
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：
热带假丝酵母原始菌(Candida tropicalis)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC1798；
解脂耶氏酵母原始菌(Yarrowia lipolytica)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC1457；
质粒pPICzαA购自北京艾德莱生物科技有限公司。
实施例1抗性标记基因Kanr和表达载体pPICzαA的连接。
将来源于Kanr9k的抗性标记Kanr基因片段通过一步法定向克隆无缝克隆连接至pPICzαA表达载体，组成重组质粒pPICzαA-Kanr。
(i)根据Genbank中注释的Kanr9k质粒中Kanr的序列，对Kanr设计两对引物为：(其中单下划线为酶切位点BamH I)。
所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：
Kanr-up:5’-GACCTTCGTTTGTGCGGATCCTGAGGGAGCCACGGTTGAT-3’，
Kanr-down:5’-GAAAAGGGGGACGAGGATCGGTTGAGGCCGTTGAGCAC-3’
Kanr-PCR反应体系50μl：
2×HiFi-PCR Master 25μl，上游引物(10μmol/L)2μl，下游引物(10μmol/L)2μl，模板2μl，用ddH2O补足50μl。
PCR反应程序：
(1)95℃5min；(2)95℃30sec；(3)56℃30sec；(4)72℃3min；(5)72℃10min；其中(2)、(3)、(4)共30个循环，-20℃保存。
(ii)构建重组质粒pPICzαA-Kanr。
将pPICzαA载体用限制性内切酶BamH I进行单酶切，并将酶切产物去磷酸化处理，将抗性标记基因Kanr与处理后的载体进行一步法定向克隆无缝克隆连接，得到重组载体pPICzαA-Kanr。
所述的去磷酸化的体系如下，总体系为50ul：
胶回收产物25μl，10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μl，CIAP 2μl，用ddH2O补足至50μl；
所述的去磷酸化的条件为：将加好的体系37℃反应30分钟；添加5μl，3mol/L的醋酸钠，并加入125μl的冰乙醇在-20℃下保存30-60min；4℃12000rpm离心15min回收沉淀，用200μl70％冰乙醇洗净后4℃12000rpm离心15min，用20μl以下的H2O溶解沉淀。
所述的一步法定向克隆无缝克隆连接的反应体系如下，体系总体积20μl：
5×CE II Buffer 4μl；线性化克隆载体pPICzαA50～200ng；插入片段扩增产物Kanr 20～200ng；Exnase II 2μl；ddH2O Up to 20μl；
最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)
最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)
体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡(勿剧烈震荡或者涡旋混匀)，置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min,之后，反应产物直接进行转化，或储存于-20℃待需要时解冻转化。
(iii)将获得的重组载体pPICzαA-Kanr转化到大肠杆菌DH5α中进行菌落PCR验证并进行基因序列测定。
所述的转化步骤如下：
将大肠杆菌DH5α感受态冰浴融化，加入10μl连接产物pPICzαA-Kanr，置于冰浴中30min，42℃水浴90sec，然后继续冰浴3min；加入500μl无抗生素LB培养基于37℃200rpm摇床培养45-60min；取200μl的转化产物涂到加有Kan抗生素的LB固体培养基平板中，并作对照组，于37℃恒温箱培养12h。
挑取实验组平板长出的单菌落于加有Kan抗生素LB培养基中培养12h(为排除片段未转化进大肠杆菌而吸附在菌体表面影响验证结果，需将菌体进行洗脱)。分别取部分菌液于离心管中12000rpm，5min获取菌体，弃掉上清液后加入适量无菌水反复吹打至菌体悬浮，再次同样条件离心，弃掉上清液，加入适量无菌水至菌体悬浮，将此悬浮液作为菌落PCR验证的模板。
所述菌落PCR验证体系如下，体系总体积为20μl：
2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，模板菌体悬浮液2μl，上游引物Kanr-up(10μmol/L)2μl，下游引物Kanr-down(10μmol/L)2ul，用ddH2O补足20μl；如上所述菌落PCR验证程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
将经菌落PCR验证后的各菌体挑选部分进行基因序列测定，分析反馈的测序结果，挑取测定结果良好的菌株培养，然后从各菌液中提取基因质粒pPICzαA-Kanr于-20℃保存备用。
实施例2重叠片段pYLG-GK与重组载体pPICzαA-Kanr的连接
(i)启动子基因pYLG和甘油激酶基因GK的重叠连接
将来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的启动子基因pYLG和来源于热带假丝酵母中的甘油激酶基因GK进行重叠连接，组成重叠基因片段pYLG-GK。
分别针对pYLG和GK设计两对引物为：(其中单下划线为酶切位点)
pYLG-up:5’-TTAGACCACTCTTTTGAGCTCGGTTGAAATGAATCGGCCG-3’，
pYLG-down:5’-ACTACGACGTGGCATTGTTGATGTGTGTTTAATTCAAGAATG-3’，
GK-up:5’-AATTAAATTTTAACAATGCCACGTCGTAGTAGTAA-3’，
GK-down:5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAGCTTTATTTTTTTTTGTTCATTAGTTCTAC-3
pYLG-PCR反应体系50μl：
2×HiFi-PCR Master 25μl，上游引物(10μmol/L)2μl，下游引物(10μmol/L)2μl，模板2μl，用ddH2O补足50μl；
PCR反应程序：
(1)95℃5min；(2)95℃30sec；(3)50℃30sec；(4)72℃2min；(5)72℃10min；其中(2)、(3)、(4)共30个循环，-20℃保存。
GK-PCR反应体系50μl：
2×HiFi-PCR Master 25μl，上游引物(10μmol/L)2μl，下游引物(10μmol/L)2μl，模板2μl，用ddH2O补足50μl；
PCR反应程序：(1)95℃5min；(2)95℃30sec；(3)53℃30sec；(4)72℃4min；(5)72℃10min；其中(2)、(3)、(4)共30个循环，-20℃保存。
将启动子pYLG片段与甘油激酶片段GK进行PCR重叠连接得到pYLG-GK片段；所述的重叠PCR第一步扩增体系为25μl：
2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，pYLG片段回收产物(10μmol/L)2μl，GK片段回收产物(10μmol/L)2μl，用ddH2O补足25μl；
重叠PCR扩增程序：
(1)95℃5min；(2)95℃30sec；(3)52℃30sec；(4)72℃30sec；(5)72℃10min；其中(2)、(3)、(4)共30个循环，-20℃保存；
所述第二步PCR扩增体系为25μl：
2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，上游引物pYLGg-up(10μmol/L)2μl，下游引物GD-down(10μmol/L)2μl，用ddH2O补足25μl；
第二步PCR扩增程序：
(1)95℃5min；(2)95℃30sec；(3)55℃30sec；(4)72℃3min；(5)72℃10min；其中(2)、(3)、(4)共30个循环，-20℃保存。
(ii)构建重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK
将实施例1中获得的重组载体pPICzαA-Kanr用限制性内切酶Sac I和Xba I进行双酶切，将获得的重叠片段pYLG-GK通过一步法定向克隆无缝克隆连接至双酶切处理后的载体，得到重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK。
所述的一步法定向克隆无缝克隆连接的反应体系如下，体系总体积20μl：
5×CE II Buffer 4μl，线性化克隆载体pPICzαA-Kanr 50～200ng，插入片段扩增产物pYLG-GK20～200ng，Exnase II 2μl，ddH2O加至20μl；
最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)
最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)
体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡(勿剧烈震荡或者涡旋混匀)，置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min,之后，反应产物直接进行转化，或储存于-20℃待需要时解冻转化。
(iii)将获得的重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK转化到大肠杆菌DH5α中进行菌落PCR验证并进行基因序列测定
所述的转化步骤如下：
将大肠杆菌DH5α感受态冰浴融化，加入10μl连接产物pPICzαA-Kanr-pYLG-GK，置于冰浴中30min，42℃水浴90sec，然后继续冰浴3min；加入500μl无抗生素LB培养基于37℃200rpm摇床培养60min；取200μl转化产物涂到加有抗生素Kan的LB固体培养基平板中，并作对照组，于37℃恒温箱培养12h。
挑取实验组平板长出的单菌落于加有抗生素Kan的LB液体培养基中培养12h(为排除片段未转化进大肠杆菌而吸附在菌体表面影响验证结果，需将菌体进行洗脱)。取部分菌液于离心管中12000rpm 5min获取菌体，弃掉上清液后加入适量无菌水反复吹打至菌体悬浮，再次同样条件离心，弃掉上清液，加入适量无菌水至菌体悬浮，将此悬浮液作为菌落PCR验证的模板；
所述菌落PCR验证体系如下，体系总体积为20μl：
2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，模板菌体悬浮液2μl，上游引物pYLG-up(10μmol/L)2μl，下游引物GK-down(10μmol/L)2ul，用ddH2O补足20μl；
所述菌落PCR验证程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
将经菌落PCR验证后的各菌体挑选部分进行基因序列测定，分析反馈的测序结果，挑取测定结果良好的菌株培养，然后从各菌液中提取基因质粒pPICzαA-Kanr-pYLG-GK于-20℃保存备用。
实施例3将构建好的重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK转化到热带假丝酵母原始菌中
将实施例2中获得的重组质粒pPICzαA-Kanr-pYLG-GK电转化到热带假丝酵母；转化热带假丝酵母的步骤为：
将80μl热带假丝酵母感受态细胞与10μl线性化后的质粒pPICzαA-Kanr-pYLG-GK混合，并将其转化至0.2cm点转杯，将装有混合液的转化杯冰浴5min，调整好基因导入仪的参数，1500v电压点击一次，时间为5ms；立即往转化杯中加入1ml预冷的1mol/L山梨酸溶液混匀，并将其转化至灭菌的离心管中，于30℃摇床1h，将混合液涂于加有抗生素G418的YPD固体培养基平板上，每个平板涂200μl混合液，将平板置于30℃培养箱中过夜培养，挑取平板上的单菌落于10ml YPD液体培养基，于30℃摇床培养8h,取2ul培养液为模板作菌落PCR，筛选G418克隆，保存转化子。
将构建完毕的热带假丝酵母工程菌接种于加有抗生素G418的YPD培养基，培养条件为30℃摇床12h，取适量培养液转接于热带假丝酵母发酵培养基中进行发酵验证。
实施例4以甘油为唯一碳源的发酵验证
取500μL甘油管保藏的实施例3构建的pYLG启动子替换工程菌(解脂耶氏酵母中的pYLG启动子替换pGAP启动子)、热带假丝酵母原始菌和pGAP启动子替换工程菌，分别接种于50mL含2％甘油的液体无糖YPD培养基，30℃、200r/min振荡培养，每2h取样检测其OD600nm值。
甘油测定方法：准确吸取一定量的上清液，放入50ml三角瓶中，加入水10ml，2-3滴酚酞指示剂；用0.1mol/L标准NaOH溶液滴定至中性(微红)，加入10ml 0.1mol/L的高碘酸钠溶液，闭光反应5min；再加入25％乙二醇溶液5ml，闭光5min；最后用0.1mol/L标准NaOH溶液滴定至中性，记录消耗NaOH溶液体积V(mL)。
经测定发现，所述pYLG启动子的启动转率效果要强于现有酵母商用常规组成型启动子pGAP(pGAPzα)，同时与pGAL(pYES2，需半乳糖诱导)和pAOX(pPIC9K，需甲醇诱导)相比无需诱导剂即可实现高效表达，pYLG启动子替换工程菌对甘油的消耗效率(如图8所示)和以甘油为唯一碳源时的菌体增长量(如图9所示)明显高于其他菌株，表明解脂耶氏酵母的pYLG启动子在热带假丝酵母中能够发挥较好的作用，同时启动子替换后，甘油的消耗速率及利用效率明显提高。
实施例5以油脂为底物的发酵生产长链二元酸
发酵培养基组成成分为：
葡萄糖62g，硫酸铵1g，酵母粉2g，微生物B1 0.2g，氯化钠2g，磷酸二氢钾8g，磷酸氢二钠10g，硫酸镁6g，尿素3g，水定容至1L。
发酵条件为30℃摇床培养，发酵时间为144h，其中添加花生油为底物，添加量为5wt％。
长链二元酸测定方法：取20mL发酵液，加入2mL 4mol/L的NaOH溶液，沸水浴5min，混匀，冷却后置于50mL离心管中，10 000r/min离心10min。吸取中间的水相于50mL锥形瓶中，滴加3mol/L的硫酸溶液至pH为2～3之间，使二元酸完全结晶析出。抽滤，并用去离子水洗涤锥形瓶和滤饼，至滤液和滤纸呈中性为止。将滤饼及滤纸移入150mL锥形瓶，加入30mL体积分数为95％乙醇作溶剂，加热使二元酸完全溶解，加入2～3滴溴百里香酚蓝作指示剂，用NaOH标准液滴定至终点。
经测定发现，发酵144小时后pYLG启动子替换工程菌长链二元酸的产量达到5.48g/L，较原始菌4.13g/L相比提高了32.7％，表明启动子替换后，由于菌体对甘油利用效果被提高，导致长链二元酸被用做能源的部分减少，进而产量增加。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213> Yarrowia lipolytica
<400> 1
ggttgaaatg aatcggccga cgctcggtag tcggaaagag ccgggaccgg ccggcgagca 60
taaaccggac gcagtaggat gtcctgcacg ggtctttttg tggggtgtgg agaaaggggt 120
gcttggagat ggaagccggt agaaccgggc tgcttggggg gatttggggc cgctgggctc 180
caaagagggg taggcatttc gttggggtta cgtaattgcg gcatttgggt cctgcgcgca 240
tgtcccattg gtcagaatta gtccggatag gagacttatc agccaatcac agcgccggat 300
ccacctgtag gttgggttgg gtgggagcac ccctccacag agtagagtca aacagcagca 360
gcaacatgat agttgggggt gtgcgtgtta aaggaaaaaa aaagaagctt gggttatatt 420
cccgctctat ttagaggttg cgggatagac gccgacggag ggcaatggcg ccatggaacc 480
ttgcggatat cgatacgccg cggcggactg cgtccgaacc agctccagca gcgttttttc 540
cgggccattg agccgactgc gaccccgcca acgtgtcttg gcccacgcac tcatgtcatg 600
ttggtgttgg gaggccactt tttaagtagc acaaggcacc tagctcgcag caaggtgtcc 660
gaaccaaaga agcggctgca gtggtgcaaa cggggcggaa acggcgggaa aaagccacgg 720
gggcacgaat tgaggcacgc cctcgaattt gagacgagtc acggccccat tcgcccgcgc 780
aatggctcgc caacgcccgg tcttttgcac cacatcaggt taccccaagc caaacctttg 840
tgttaaaaag cttaacatat tataccgaac gtaggtttgg gcgggcttgc tccgtctgtc 900
caaggcaaca tttatataag ggtctgcatc gccggctcaa ttgaatcttt tttcttcttc 960
tcttctctat attcattctt gaattaaaca cacatcaaca 1000
<210> 2
<211> 1896
<212> DNA
<213> Candida tropicalis
<400> 2
atgccacgtc gtagtagtaa tgctccttct ataccagtgg tcgcaaccat cgatattggt 60
accacttcag caagagcaat cattttctca agagaaggtg aagaattagc taagcatcaa 120
attgaatact ccactactgc ttcagaagca cctgattcct cgtcaaacac tgaccaattc 180
agaagaagat cgtctttaat gagacaaaat gaacctattt tctcggctga aggtattgct 240
atctccatca atgataacgt tatgatcgaa aacaaccatt cctcggttgg tccgacttta 300
agattccctc aacctggttg ggttgaatgt atgcctgttc atatcttggc caatgctgtt 360
caatgtttgg ttgcttgttt gatcacattg agaaaaatta accaaaatcc taatttgaag 420
cttaaatata gagttaaagc tattgggatt gccaatatga gagaaaccac tattgtttgg 480
tccagaaaaa ctggtaagcc attaagtggt ggtatcactt ggactgatac tagaactgcc 540
gaaattgttc aacatttaga aaaaatgatt gatgaagata gaaaagctga attgaaagaa 600
aaaacaggtt tgccattgtc aacttatttc tcagctgcta aattgagatg gttattggat 660
aatgatgatg tcatcagaga agaatatgaa aagggtgacg gtaatttaat gtttggtact 720
gttgatacct ggttgattta ccatttaact aaagaaaaaa cctacgtttc tgatatcact 780
aatgcatcaa gaacttattt tatggatttg gaaactttag attgggatga tgaattatta 840
gatttctggg gtattgatcc aactagaatc agattcccaa aaatcgtctc atcttctgaa 900
ttctatggtg aatttgctgc cccaaatttg tccaacttgg gattccataa taaaatcacc 960
caagaagcat atgatatttt gaaaaccata actggtgttc caatttgtgg ttgtcttggt 1020
gatcaatcag cctccttggt aggtcaattg gccttcactt ctggttctgc taaatgtact 1080
tatggtactg gtgctttcct tttgtacaac actggtccac gtaagttgat tagtaaacaa 1140
ggggcattga ctacttttgg ttattggttc ccaacattag aaggaaatga aggtaaacct 1200
cattatgctt tggaaggttc tattgctgtt gctgggtcca ttattcaatg gttgagagat 1260
aacttgaaaa tgattgataa tgccaaggac attggtccat tggcttctca agttgaaaat 1320
tctggtggag ttgtgtttat tccagcattc tcggggttgt atgctccata ttgggatagt 1380
ggttctcgag gtactatatt tggtatgact caatacactt cagcctctca tattgctcgt 1440
gctgcattgg aaggggtttg tttccaagta cgtgccattt taaaagctat ggctagtgat 1500
gctggtgcgt ctgaagattt cttggaagaa tcattatgtt gtcaaggtag tagcagacct 1560
ttatcttcat tggccactga tggtggtatg tccaaagcag acgaagtctt acaaattcaa 1620
gcagatattt tagggccttg tgttacagtt actcgtgcat taactcctga atgtactgct 1680
ttaggtgctg ctattgctgc tggtttatca tttgaaaatg aagaagatcg tatatggaag 1740
gatcttgacg atgtggttga aaaaatcact ggtggagcca gtggtaaaac tggcaacaag 1800
tttgttgctg aattacctga tgatacgaga agaaagaatt ggaaacgttg ggaaaaggca 1860
atcgaaagag ccaagagctg gttagatgat gagtaa 1896

Claims (7)

1.一种启动子pYLG，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述启动子pYLG在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)PCR扩增制备核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子pYLG片段；
(2)制备核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的甘油激酶GK片段；
(3)将步骤(1)制得的启动子pYLG片段与步骤(2)制得的甘油激酶GK片段进行PCR重叠连接，制得pYLG-GK片段；
(4)以含有Kanr9k质粒的大肠杆菌为模板，进行PCR扩增，得到抗性基因Kanr片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：
Kanr-up:5’-GACCTTCGTTTGTGCGGATCCTGAGGGAGCCACGGTTGAT-3’，
Kanr-down:5’-GAAAAGGGGGACGAGGATCGGTTGAGGCCGTTGAGCAC-3’
(5)将步骤(4)得到的抗性基因Kanr片段通过一步法定向克隆无缝克隆连接至pPICzαA载体，制得重组载体pPICzαA-Kanr；
(6)将步骤(3)制得的pYLG-GK片段通过一步法定向克隆无缝克隆连接至步骤(5)制得的的重组载体pPICzαA-Kanr，制得重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK；
(7)将步骤(6)制得的重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK经电击转化至热带假丝酵母，筛选阳性菌株，制得高产长链二元酸的热带假丝酵母。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增引物序列如下：
pYLG-up:5’-TTAGACCACTCTTTTGAGCTCGGTTGAAATGAATCGGCCG-3’，
pYLG-down:5’-ACTACGACGTGGCATTGTTGATGTGTGTTTAATTCAAGAATG-3’，
PCR扩增反应体系如下，总体系为50μl：
2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L浓度的上游引物(pYLG-up)2μl，10μmol/L浓度的下游引物(pYLG-down)2μl，解脂耶氏酵母基因组DNA 2μl，ddH2O补足50μl；
PCR反应程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增引物序列如下：
GK-up:5’-AATTAAATTTTAACAATGCCACGTCGTAGTAGTAA-3’，
GK-down:5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAGCTTTATTTTTTTTTGTTCATTAGTTCTAC-3’；
PCR扩增反应体系如下，总体系为50μl：
2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L浓度的上游引物(GK-up)2μl，10μmol/L浓度的下游引物(GK-down)2μl，热带假丝酵母基因组DNA 2μl，ddH2O补足50μl；
PCR反应程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，所述的重叠PCR的第一步扩增体系如下，总体系为25μl：
2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，浓度10μmol/L的pYLG片段2μl，浓度10μmol/L的GK片段回收产物2μl，ddH2O补足25μl；
重叠PCR的第一步扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存；
所述的重叠PCR的第二步扩增体系如下，总体系为25μl：
2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，浓度10μmol/L的上游引物(pYLGg-up)2μl，浓度10μmol/L的下游引物(GD-down)2μl，ddH2O补足25μl；
重叠PCR的第二步扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，PCR扩增反应体系如下，总体系为50μl：
2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L浓度的上游引物(Kanr-up)2μl，10μmol/L浓度的下游引物(Kanr-down)2μl，模板2μl，ddH2O补足50μl；
PCR反应程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。
CN201710645497.6A 2017-08-01 2017-08-01 启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用 Active CN107384923B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710645497.6A CN107384923B (zh) 2017-08-01 2017-08-01 启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710645497.6A CN107384923B (zh) 2017-08-01 2017-08-01 启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107384923A true CN107384923A (zh) 2017-11-24
CN107384923B CN107384923B (zh) 2020-12-01

Family

ID=60344511

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710645497.6A Active CN107384923B (zh) 2017-08-01 2017-08-01 启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107384923B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109797165A (zh) * 2018-07-21 2019-05-24 齐鲁工业大学 一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102839133A (zh) * 2011-06-21 2012-12-26 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种长链二元酸生产菌株及其应用
CN103080305A (zh) * 2010-06-18 2013-05-01 丹麦科技大学 酵母由木质纤维素和甘油生产生物柴油
JP2014070030A (ja) * 2012-09-28 2014-04-21 Nippon Shokubai Co Ltd 長鎖ジカルボン酸の製造方法
CN103805642A (zh) * 2012-11-07 2014-05-21 中国石油化工股份有限公司 一种生产长链二元酸的发酵方法
CN105400796A (zh) * 2015-12-28 2016-03-16 齐鲁工业大学 一种调控产长链二元酸的基因及其应用
CN106636156A (zh) * 2016-12-26 2017-05-10 齐鲁工业大学 一种联产长链二元酸和1,3‑丙二醇的工程菌及其构建方法
CN106754979A (zh) * 2016-12-26 2017-05-31 齐鲁工业大学 一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103080305A (zh) * 2010-06-18 2013-05-01 丹麦科技大学 酵母由木质纤维素和甘油生产生物柴油
CN102839133A (zh) * 2011-06-21 2012-12-26 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种长链二元酸生产菌株及其应用
JP2014070030A (ja) * 2012-09-28 2014-04-21 Nippon Shokubai Co Ltd 長鎖ジカルボン酸の製造方法
CN103805642A (zh) * 2012-11-07 2014-05-21 中国石油化工股份有限公司 一种生产长链二元酸的发酵方法
CN105400796A (zh) * 2015-12-28 2016-03-16 齐鲁工业大学 一种调控产长链二元酸的基因及其应用
CN106636156A (zh) * 2016-12-26 2017-05-10 齐鲁工业大学 一种联产长链二元酸和1,3‑丙二醇的工程菌及其构建方法
CN106754979A (zh) * 2016-12-26 2017-05-31 齐鲁工业大学 一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "Accession no. CP017555.1", 《GENBANK》 *
WANG J.ET AL.: "Development of mazF-based markerless genome editing system and metabolic pathway engineering in Candida tropicalis for producing long-chain dicarboxylic acids", 《J.IND.MICROBIOL.BIOTECHNOL.》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109797165A (zh) * 2018-07-21 2019-05-24 齐鲁工业大学 一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法
CN109797165B (zh) * 2018-07-21 2020-07-28 齐鲁工业大学 一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107384923B (zh) 2020-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105734002B (zh) 一种重组谷氨酸生产菌株及其制备方法与应用
CN103881954B (zh) 一株产γ-聚谷氨酸基因工程菌及其高产γ-聚谷氨酸方法
CN107142225B (zh) 一种强化表达Streptomyces sp.FA1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌
CN108102995A (zh) 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶生产菌株及其固定化方法
CN105143447B (zh) 具有木糖异构酶活性的蛋白质及其用途
CN101531988B (zh) 碱性果胶酶基因工程菌及其构建方法
CN105368838B (zh) 一株高效积累多聚磷酸盐的积磷小月菌工程菌及其应用
CN105899664A (zh) 用于精细化学品的改进生产的重组微生物
CN103249832B (zh) 同时利用蔗糖和甘油的新的产琥珀酸突变微生物和利用其生产琥珀酸的方法
CN107022515A (zh) 一株利用木质纤维素水解液厌氧发酵产l‑天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN109370971A (zh) 一株发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN107384923A (zh) 启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用
CN106574236A (zh) 遗传修饰的产生(r)‑乳酸的嗜热细菌
CN107858364A (zh) 一种适于甲醇酵母表达的耐高温高比活细菌植酸酶基因
CN105062981B (zh) 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体n315f及其应用
CN103820367A (zh) 一种高产丁醇的基因工程菌株及其应用
CN112779197A (zh) 利用大肠杆菌及基因工程菌生产乙二醇和乙醇酸的方法
KR20130098603A (ko) Ｄ―형 젖산 생성 변이균주 및 이를 이용한 광학 순도가 높은 ｄ―형 젖산 생산 방법
CN111500479B (zh) 一种非甲醇诱导双启动子毕赤酵母工程菌的构建及其应用
CN106636156A (zh) 一种联产长链二元酸和1,3‑丙二醇的工程菌及其构建方法
CN105132388B (zh) 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体r485p及其应用
KR20050102827A (ko) 신규 루멘 박테리아 변이균주 및 이를 이용한 숙신산의제조방법
CN101892228B (zh) 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用
CN104845948B (zh) 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体p474n及其应用
CN103937733B (zh) 一株利用蔗糖产丁二酸基因工程菌株及其发酵生产丁二酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Wang Junqing

Inventor after: Xiu Xiang

Inventor after: Peng Jian

Inventor after: Wang Ruiming

Inventor after: Xue Le

Inventor after: Wang Tengfei

Inventor after: Su Jing

Inventor after: Yang Xiaohui

Inventor before: Wang Junqing

Inventor before: Peng Jian

Inventor before: Wang Ruiming

Inventor before: Xiu Xiang

Inventor before: Xue Le

Inventor before: Wang Tengfei

Inventor before: Su Jing

Inventor before: Yang Xiaohui

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant