CN109797165B - 一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法。基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在提高二元酸产量中的应用，所述基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建的载体包含Cas9、sgRNA、同源臂、正向筛选标记、原核生物的复制起始位点。经检测，使用本发明制得的重组菌株可大幅提高二元酸的产量，为工业化生产二元酸奠定了基础，同时也为其他酵母、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌等微生物基因的无痕编辑提供了应用借鉴。

Description

一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法

技术领域

本发明涉及一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

长链二元酸(Long-chain dicarboxylic acid，DCA)是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸，包括不饱和二元酸。它们是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品，是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等的重要原料，同时也可作为生产不10-HDA、羟基脂肪酸、不饱和二元酸等脂肪酸衍生物的原料。

目前长链二元酸的生产主要依赖微生物发酵法获取。微生物发酵法主要依赖于微生物特有的氧化能力及其胞内酶的作用，通过增强α及ω氧化的方法，阻断二元酸分解途径，在常温常压下将油脂或者烷烃或者一元羧酸等为生产原料转化为二元羧酸的技术。最初长链二元酸生产技术自20世纪60年代兴起，随后日本、美国和德国等国家开始由相关技术的基础理论研究转入应用开发研究，主要涉及十二碳二元酸(DC12)、十三碳二元酸(DC13)、十四碳二元酸(DC14)和十六碳二元酸(DC16)的生产。目前国内已经实现了以烷烃为底物发酵生产长碳链二元酸的产业化，生物法制备得到十一至十四碳二元酸已投放市场。如中国专利文献CN1570124A(申请号2004100182557)、中国专利文献CN1844404A(申请号CN200610038331X)、中国专利文献CN101225411A(申请号2007101958427)、中国专利文献CN102115769A(申请号2009102565907)、中国专利文献CN102115768A(申请号2009102565890)、中国专利文献CN102115766A(申请号2009102565871)、中国专利文献CN102115765A(申请号2009102565867)、中国专利文献CN102061316A(申请号2010101603101)和中国专利文献CN103805642A(申请号2012104397995)等。

现阶段增加长链二元酸产量的方法是利用同源重组的原理进行减少或增加目的基因的拷贝数，从而增加二元酸的产量，如中国专利文献CN103992959A(申请号2014101755564)通过增加一个拷贝的CYP单加氧酶基因提高热带假丝酵母长链二元酸的产率，中国专利文献CN106754979A(申请号201611218540.2)通过增加长链二元酸转运基因fatlp的拷贝数或者更换启动子增加fatlp基因的过表达。但由于微生物发酵法生产长链二元酸的主要菌种热带假丝酵母为二倍体，利用这种传统基因编辑的方法，不但效率不高，并且转化率与理论转化率相比依然还有较大的提升空间。

酵母作为一种微生物工程菌，在生产脂肪酸等方面一直以来受到很大关注，相比较大肠杆菌，酵母中有蛋白质加工等相关系统，表达的蛋白等产物往往接近天然产物，生物活性好。热带假丝酵母作为一种非常规酵母，具有很高的合成、修饰和储存细胞内脂质的能力，具备较高的脂肪酸衍生物，如：二元酸、ω-羟基脂肪酸、10-羟基-2-癸烯酸、氨基脂肪酸等生产能力或生产潜力，但一直缺乏一种高效无痕的编辑系统对其进行基因编辑，本发明提供一种适用于热带假丝酵母的高效无痕的基因组编辑系统，这无疑具有巨大的应用前景。

在近几年分子生物学中CRISPR-Cas9开始作为一种新的、高效率的基因编辑技术被广泛使用，仅在短短几年时间里已经在人体细胞、老鼠、斑马鱼、植物、细菌、真菌等多种生物中成功实现了对靶基因的定向编辑，目前该技术已成为基因编辑的首选技术。如中国专利文献CN105593367A(申请号CN201580000476.8)、中国专利文献CN105695485A(申请号CN201410606474.0)、中国专利文献CN105886498A(申请号CN201510240981.1)、中国专利文献CN105647962A(申请号CN201610085619.6)、中国专利文献CN105331607A(申请号CN201510688330.9)、中国专利文献CN105567738A(申请号CN201610028603.1)、中国专利文献CN105907758A(申请号CN201610330754.2)和国外专利文献WO2017092201(申请号WO2016CN77337)等。

CRISPR-Cas9技术是在一个长约20bp左右的sgRNA引导下、利用特异的核酸酶实现对基因组进行编辑的新技术。CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术已经成为现代分子生物学和生物信息学的重要组成部分，为后期的进一步方法优化和改造提供了基础，如中国专利文献CN105907758A(申请号CN201610330754.2)则公开了一种CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法。但CRISPR-Cas9技术尚无在热带假丝酵母中进行基因编辑的报道。

目前尚有的微生物基因的无痕编辑主要通过正向筛选标记(一般为抗性基因或遗传缺陷型基因)以及反向筛选标记(果聚糖蔗糖酶编码基因sacB、毒素蛋白基因mazF)实现，这其中反向筛选标记的选择及使用极大的影响了微生物基因的无痕编辑的筛选效率，即便如此，利用现有反向筛选标记实现二次筛选仍然存在许多弊端，如需额外添加诱导物、诱导物添加的量难以控制、微生物对反向筛选标记的抗性容易积累等，往往会造成假阳性率高等问题，增加了后期筛选的难度。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法。本发明的特点在于所提供的基因编辑系统是基于Cas9编辑系统，所采用的反向筛选标记为Cas9基因，即，Cas9基因具备基因编辑和反向筛选标记的双重功能。

本发明技术方案如下：

基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在提高二元酸产量中的应用，所述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：

(1)制备热带假丝酵母的感受态细胞；

(2)将上述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与步骤(1)制得的感受态细胞混合均匀后，进行电转化，制得转化细胞；

(3)将转化细胞复苏培养后，在含G418浓度800～1000μg/mL的固体YPD培养基上进行筛选培养，筛选抗G418的菌株；

(4)将步骤(3)制得的抗G418的菌株在含有5～15g/L半乳糖的筛选培养基筛选培养，制得编辑后的细胞；

(5)将步骤(4)制得的编辑后的细胞在发酵培养基中进行发酵培养6～8d，经分离、纯化，制得二元酸。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的热带假丝酵母为热带假丝酵母(Candidatropicalis)CICC1798。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，制备热带假丝酵母的感受态细胞的具体步骤如下：

取热带假丝酵母单菌落，培养至菌体浓度OD₆₀₀为1.0～1.8，置于冰上冷却，离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得热带假丝酵母感受态细胞。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，电转化条件为：1300～1800V、5～10ms连续点击2～3次；

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，复苏培养条件为：28～32℃、150～200r/min摇床复苏培养40～80min；进一步优选的，所述复苏培养基组份为浓度1mol/L的山梨醇溶液；

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，筛选培养条件为：28～32℃培养1～2天；

固体YPD培养基组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L，琼脂2g/L；

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，筛选培养条件为：28～32℃、培养24～72h；

筛选培养基组分如下：半乳糖100g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L。

根据本发明优选的，所述步骤(5)中，发酵培养基组份如下：

葡萄糖40g/L、(NH₄)₂SO₄ 1g/L、酵母膏2g/L、VB1 0.1g/L、NaCl 2g/L、KH₂PO₄ 4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 10.08g/L、尿素2g/L、Mg₂SO₄·7H₂O 6.15g/L、癸烷10％(体积百分比)，水配制，pH 7.0。

有益效果

本发明成功构建了基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体，并成功用于热带假丝酵母菌CAT基因的敲除。本发明所构建质粒中的Cas9基因具有作为基因编辑和反向筛选标记的双重功能，因而Cas9经诱导发挥作用时，Cas9蛋白即会识别基因组上的靶向基因，也会识别载体中的同源臂基因，进而在实现靶向基因编辑的同时，亦可以将整个载体从目标菌株中进行切除，达到无痕敲除的目的。经检测，制得的重组菌株可大幅提高二元酸的产量，为工业化生产二元酸奠定了基础。本发明的实施也为其他酵母、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌等微生物基因的无痕编辑提供了应用借鉴。

附图说明

图1、基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的结构示意图；

图2、本发明所述无痕敲除过程示意图；

图3、CAT基因敲除验证电泳结果照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

含有Cas9基因的质粒pCRISPRyl购自淼灵生物科技有限公司；

热带假丝酵母(Candida tropicalis)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC1798；

质粒pPICzαA、pPIC9K购自山东省微生物酶技术重点实验室，普通市售产品；

实施例1热带假丝酵母基因编辑系统中自杀质粒构建

(1)提取热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌体的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到同源臂片段，长度549bp，所述的PCR引物序列如下：

pCATF:CTTTTTGCCATCCGGAGCTCACTAAATCTGTAATTATGCCAG；

pCATR:TAACCCTGATAAATGCTCCTAGGGATATCAGAACCTTCAGCTG；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物pPGATF 2.5μl，浓度10μmol/L的引物pPGATR 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(2)提取质粒pCRISPRyl，并以质粒基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到sgRNA基因段，长度792bp，所述的PCR引物序列如下：

pSgRNAF:TCCAGCTGAAGGTTCTGATATCCCTAGGAGCATTTATCAGGGT；

pSgRNAR:CACGAGCAGCTTGCCTATGTTACATC；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物pSgRNAF 2.5μl，浓度10μmol/L的引物pSgRNAR 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(3)提取热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌体的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到pGAL片段，长度1061bp，所述的PCR引物序列如下：：

pPGALF:AACATAGGCAAGCTGCTCGTGGTCGACGTGAACAGAGAGGTGT；

pPGALR:CAATGGAGTATTTCTTATCCATTGAGAGGAGTATATGTATGTA；所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物pPGALF₁ 2.5μl，浓度10μmol/L的引物pPGALR₁ 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(4)提取质粒pCRISPRyl，并以质粒基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到Cas9基因段，长度4425bp，所述的PCR引物序列如下：

pCas9F:TACATATACTCCTCTCAATGGATAAGAAATACTCCATTGGCC；

pCas9R:GGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAA；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物pCas9F 2.5μl，浓度10μmol/L的引物pCas9R 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

将(3)获得的pGAL片段与获得的Cas9片段进行重叠PCR拼接，所述的PCR引物序列如下：

pPGALF:AACATAGGCAAGCTGCTCGTGGTCGACGTGAACAGAGAGGTGT；

pCas9R:GGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAA；

第一轮PCR：

所述的PCR扩增体系为25μl：

2×HiFi-PCR master 12.5μl，pGAL片段4μl，Cas9片段4μl，用ddH₂O补足25μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，5个循环；72℃延伸10min，72℃保存；

第二轮PCR：

2×HiFi-PCR master 12.5μl，浓度10μmol/L的引物pPGALF 4μl，浓度10μmol/L的引物pCas9R 4μl，用ddH₂O补足25μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，-4℃保存；

(5)以质粒pPIC9K基因组为模板，使用引物Kanr-F和Kanr-R进行PCR扩增，得G418基因片段，长度1200bp，所述的PCR引物序列如下：

Kanr-F：GACCTTCGTTTGTGCGGATCCTGAGGGAGCCACGGTTGAT

Kanr-R：GACCTTCGTTTGTGCGGATCCTGAGGGAGCCACGGTTGAT

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物Kanr-F 2.5μl，浓度10μmol/L的引物Kanr-R 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；

(6)提取质粒pPICzαA，并以质粒基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到原核生物复制起始位点基因段，长度1804bp，所述的PCR引物序列如下：

pOriF:GCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCGGATCCTCCGTCCCCCTTTT

pOriR:TGGCATAATTACAGATTTAGTGAGCTCCGGATGGCAAAAAGG；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物pOriF 2.5μl，浓度10μmol/L的引物pOriR 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(7)将获得的同源臂片段、sgRNA片段、pGAL片段、Cas9片段、G418筛选标记、原核生物复制起始位点，长度bp左右；使用Gibson Cloning试剂盒进行连接，反应体系为20μl：

置于50℃反应60min。反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

(8)筛选正确的载体pCTCas9，将(8)中反应完成后的质粒转化入DH5α感受态中，在含有卡那霉素的LB平板中筛选阳性克隆子。然后挑取单菌落于液体LB培养基中，进行菌落PCR验证，获得含有重组质粒的大肠杆菌，将其送往上海博尚测序，正确后提取质粒-20℃保存。

实施例2用质粒敲除热带假丝酵母菌基因组中的CAT基因

1、制备热带假丝酵母感受态

(1)将热带假丝酵母(Candida tropicalis)接种到含50ml菌体增殖培养基的250ml三角瓶中，30℃，200rpm/min，摇床过夜培养；

所述菌体增殖培养基，每升组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L

(2)将过夜培养的菌液涂布至固体YPD培养基，30℃培养1～2d，得到热带假丝酵母(Candida tropicalis)单菌落；用接种环挑取单菌落到50ml菌体增殖培养基中，30℃、200rpm/min培养12h，转接，培养10h；

所述YPD固体培养基，每升组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L、琼脂2g/L

(3)取1.5ml菌液到Ep管中，3000rpm/min，离心1min，收集菌体，用1.5ml预冷的无菌水吹打悬浮细胞；

(4)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用1ml预冷的无菌水悬浮细胞；

(5)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用1ml 1mol/L预冷的山梨醇悬浮细胞；

(6)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用80μL预冷的山梨醇悬浮细胞，即制成热带假丝酵母电转化感受态；将制备好的感受态细胞置于-80℃保存备用。

2、以质粒pCTCas9基因组为模板，使用引物qCATF和qCATR进行PCR扩增，更改sgRNA中20bp靶序列序列，所述的PCR引物序列如下：

qCATF:CGTTTTGTTAAAGCCGGTGGTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT；

qCATR:GCACCACCGGCTTTAACAAAACGTCAACCTGCGCCGACCCGGAA；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物qCATF 2.5μl，浓度10μmol/L的引物qCATR2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸7min，30个循环；72℃延伸5min。

将PCR得到产物通过进行1％的琼脂糖凝胶电泳并在透射紫外波长为302nm条件下观察大小，用已洗净并用火焰烤干的刀片将含有目的条带的胶块切下来，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)胶回收制得的Kanr片段，保存于-20℃保存。

2、将构件质粒pCTCas9转化热带假丝酵母细胞

(1)从实施例1得到的正确的重组大肠杆菌中提取基因编辑质粒pCTCas9。

(2)电转化

利用核酸超微量分光光度计(BioFuture MD2000)测定重组质粒浓度，达到浓度300μg/ml后进行电转化，电转化条件为1500V、5ms，然后在含1mol/L山梨醇的复苏培养基中培养所述复苏培养基。

所述复苏培养基每升组分如下：山梨醇1mol/L；

所述YPD固体培养基，每升组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L、琼脂2g/L。

3、CAT基因缺失菌株的获得

将上述得到的细胞复苏液取100μL涂布在含1mg/mL G418(遗传霉素)的YPD固体培养基上，在30℃培养2天，筛选具有G418抗性的转化子。挑取在G418抗性平板上长出的单菌落。

将初筛得到的单菌落，分别接种到含有100g/L的半乳糖固体培养基中进行筛选，培养3d，挑去单菌落于100g/L的半乳糖液体培养基中进行培养，并进行编号和验证。

所述YPD液体培养基，每升组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L；

所述筛选液体培养基，每升组分如下：半乳糖100g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L；

所述筛选固体培养基，每升组分如下：半乳糖100g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L、琼脂2g/L。

4、CAT基因缺失验证

(1)提取筛选得到的重组菌体的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到CAT片段，长度1074bp，所述的PCR引物序列如下：

pCATF:CTTTTTGCCATCCGGAGCTCACTAAATCTGTAATTATGCCAG；

pCATR:TAACCCTGATAAATGCTCCTAGGGATATCAGAACCTTCAGCTG；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物CAT-F 2.5μl，浓度10μmol/L的引物CAT-R 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；

将所得产物作凝胶电泳验证，并回收进行测序。

实施例3CAT基因缺失菌株发酵验证

将验证正确的CAT基因缺失热带假丝酵母菌和热带假丝酵母原始菌分别接种于YPD液体培养基中，30℃条件下培养14小时；取10ml缺失菌菌液和10ml原始菌菌液分别接种到100ml发酵培养基中，培养12h后分别加入10ml癸烷，进入产酸期；在产酸期，每12h或24h调节pH到7.5～8.0，并测其OD₆₀₀，产酸期5天。

所述发酵培养基组分如下：

葡萄糖40g/L、(NH₄)₂SO₄ 1g/L、酵母膏2g/L、VB1 0.1g/L、NaCl 2g/L、KH₂PO₄ 4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 10.08g/L、尿素2g/L、Mg₂SO₄·7H₂O 6.15g/L、癸烷10％(体积百分比)，水配制，pH 7.0；

发酵结束后采用酸碱滴定法对二元酸的产量进行测定，测定结果显示热带假丝酵母敲除CAT基因重组菌的二元酸转化率由原始菌种的4.8％提高到了14.9％，产量由原始菌种的3.9g/L提高到了20g/L，二元酸的产率和产量都有了较大幅度的提升。

对比例：传统Mazf反向筛选敲除CAT基因缺失菌株及发酵验证

1.CAT同源臂的获得

以热带假丝酵母基因组为模板，使用引物CAT-R₁和CAT-F₁进行PCR扩增，得到上有同源臂，使用引物CAT-F₂和CAT-R₂进行PCR扩增，得到下游同源臂，所述的PCR引物序列如下：

CAT-F₁：CCTTTTTGCCRATCCGGAGCTCACTAAATCTGTAATTATGCCAGTTTTGA；

CAT-R₁:：AATGACAAAACTAGAACCTAGGTGATATCAGAACCTTCAGCTGG；

CAT-F₂：AGGTTCTGATATCACCTAGGTTCTAGTTTTGTCRATTGCCTTG；

CAT-R₂：GGTACCGATCCGAGAAGAATTTTCTAGTAGCAGCAGATTCRATAA；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物CAT-F₁ 2.5μl，浓度10μmol/L的引物CAT-R₁ 2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；

2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物CAT-F₂ 2.5μl，浓度10μmol/L的引物CAT-R₂ 2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

同源臂构建：

第一轮PCR：

所述的PCR扩增体系为25μl：

2×HiFi-PCR master 12.5μl，片段一4μl，片段二4μl，用ddH2O补足25μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸10min，72℃保存；

第二轮PCR：

2×HiFi-PCR master 12.5μl，浓度10μmol/L的引物CAT-F1 4μl，浓度10μmol/L的引物CAT-R2 4μl，用ddH2O补足25μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-4℃保存；

2.同源臂连接到含有Mazf反向筛选标记的质粒

提取含有Mazf反向筛选标记质粒pPICPJm，将重组质粒载体用限制性内切酶Sac I酶切，酶切体系如下：

将酶切产物柱纯化后去磷酸化。将回收后的酶切产物和基因片段分别进行浓缩，使用核酸超微量分光光度计分别测定浓缩回收得到的DNA溶液，其浓度为500～1000ng/μL的溶液。

将同源臂重叠片段连接至线性化后的载体pPICPJm，连接方法为一步法定向克隆法，所示反应体系：

将体系按说明配制完成后，用移液枪轻轻吹打，混合均匀，避免产生气泡。置于37℃金属浴中反应30min。反应完成后，立即于冰水浴中冷却5min。反应产物直接进行转化，

3.阳性重组菌株的筛选

将转化后的大肠杆菌于37℃恒温箱培养12～14h，使用移液枪挑取单菌落并转移至LB培养基(50μL/mL Kanr)中，于37℃、220r/min摇床中培养12h至培养基出现混浊。以培养后的浑浊菌液为模板，以CAT-F₁和CAT-R₂为引物PCR，凝胶电泳验证特异性条带的大小。扩增培养获得的阳性菌，保藏于甘油管中并放置于-80℃超低温冰箱，从扩培后的菌体提取获得阳性基因敲除载体pPICPJm-CRAT，送至铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序。

4.电转酵母并发酵验证

提取pPICPJm-CAT质粒，测定质粒的质量浓度为840.63ng/μL。将80μLC.tropicalis1798感受态细胞与20μL重组质粒混合均匀并电转化，经G418筛选后，获得发生第一次单交换的重组子经100mL YPD液体培养基培养后，按照1.0％接种量依此转接至含有10％半乳糖的筛选培养基中，培养24h后划线分离半乳糖抗性菌株，挑取单菌落培养并提取其基因组，以CAT-F₁和CAT-R₂为引物进行PCR验证。最终获得发生第二次单交换的重组子C.tropicalis CAT。

将用该方法敲除的CAT基因缺失热带假丝酵母菌和热带假丝酵母原始菌分别接种于YPD液体培养基中，30℃条件下培养14小时；取10ml缺失菌菌液和10ml原始菌菌液分别接种到100ml发酵培养基中，培养12h后分别加入10ml癸烷，进入产酸期；在产酸期，每12h或24h调节pH到7.5～8.0，并测其OD600，产酸期5天。

所述发酵培养基组分如下：

葡萄糖40g/L、(NH₄)₂SO₄ 1g/L、酵母膏2g/L、VB1 0.1g/L、NaCl 2g/L、KH₂PO₄ 4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 10.08g/L、尿素2g/L、Mg₂SO₄·7H₂O 6.15g/L、癸烷10％(体积百分比)，水配制，pH 7.0；

发酵结束后采用酸碱滴定法对二元酸的产量进行测定，测定结果显示该方法敲除的热带假丝酵母敲除CAT基因重组菌的二元酸转化率由原始菌种的5.1％提高到了9.6％，产量由原始菌种的3.2g/L提高到了8.9g/L，二元酸的产率和产量都有提升，但低于使用本发明方法获得菌株的二元酸产量。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9268

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

actaaatctg taattatgcc agttttgaaa aaaccatttt ccactagttc tccaaaaggt 60

gatttgttca aatttcaatc acaattacca aaattacctg ttccttcatt agaagaaaca 120

agtgcaaaat atcttaaaac tgtcgaacca tttttaaatc aggaacaatt agaatcaact 180

aaagaaaaag ttgcagaatt tgttaaagcc ggtggtgcag gtgaaatttt acaagctaga 240

ttgaatcaat ttgccactga taaagataat tggttagctg aattctggga tgattatgct 300

tatatgtctt atagagatcc tgttgttcca tatgtttcct atttctttag tcacaaggat 360

gtcaacaata ttattggtca agatcaattg ttaaaagcta ctttgattgc ttattatact 420

actgaatttc aagaaaaagt cttggatgaa tccttggcac cagaagtcat caaaggtaat 480

ccattctgta tgaatgcttt caagtatatg tttaacaatt ctagagttcc agctgaaggt 540

tctgatatcc ctaggagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 600

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcacacat ttccccgaaa agtgccacct 660

gacgtcccca gttgcaaaag ttgacacaac tctagatctg cttccaaata tagaatcata 720

acaagggtta gggtgtgatt atataatatt ggtcttaatt gatgtgctag ggctttaaaa 780

gttggttaaa ataacgctct aatgcctttt taatatattg tctttttcaa aatctcaaat 840

cggacacttc ttcgtgtatg agactccatt ttttggctcc gtcacgtgat atgtattatc 900

agctatagtg gtgtaaacaa agttttttac tagctgtaat ggcattttgt cggagtggta 960

aatcgccttc ttgttgtgcg ttcgagttct ggactctgca ctgggctact ttgaaaaata 1020

cctctaatgc gccgatggtt tagtggtaaa atccatcgtt gccatcgatg ggcccccggt 1080

tcgattccgg gtcggcgcag gttgacgtca tagttccagt gtttcgaagt tttagagcta 1140

gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 1200

gtgctttttt ttacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 1260

gtatcacgag gcccagatcc tctagagtcg aagcggccgc tatgtctgat aaaaggatgt 1320

aacataggca agctgctcgt ggtcgacgtg aacagagagg tgtgcaagtg gacttgtgtt 1380

ggtgacgtgt attgatgact agtgcatgca cgtgcaactt aattttctgt tcgaatcagg 1440

gaccaatgcc agaaccagac tattgacgag ttttccgcgc tgttattctg ctgattgcga 1500

atctcaacga gctgacaaat ggtctgtcaa tgtcccccta ccctcttgtc gaccattgct 1560

gccaaattcc cacattgcca gaagatgata ctcatgccaa atttactgta cgaggatttt 1620

tagagttcca tacgatgaaa cattcaaacg gccccagaag acacaatttg accggtggat 1680

cttggatatt tcgtgtggac cgtctacatg gcacgtacat gcgtctgtcc agattttgtc 1740

cgaatctgac cttccaaaag tgcagcagat ggaccctcga agccgtgtga aatgttggaa 1800

ccttgactgc tataaagtgc agacccccac catggtgccc aatgtagacc ccccgccatg 1860

gttcccactg tggattctag acacggctat gttggtatat aaggcgcaat ttcgagtttc 1920

tggacgtgtc gtgaaccggg gaacaatatc tattacacca cgggttcatg aagatgtgtt 1980

ttagggtcga ttagtggagt tgagaggtac cccataggag aagcatgcga gaacagtggt 2040

agcagagtca gacacttgta gatgtggaca tgtggtacaa gtactgtatg tacagaactg 2100

tacctgtaga tattacagtt gtctagcgtc catattacgt ctctattgct cttttcgggt 2160

ctagttgtgt cttttccgtg cagatgagta acgagatcag aacgagacaa tcagacaatc 2220

agaacgttga gtcagtcgaa catacttgga ccccatgaca gataatgatc acctctgaca 2280

ataaaacccc tcctacacct ttctgactgc agaattcagc tccaccgcca tcaatgtgtt 2340

ttcatctcca cctaaacatg gcaaaacatc tgatactgta gtacatacat atactcctct 2400

caatggataa gaaatactcc attggcctgg acatcggaac caactccgtg ggttgggccg 2460

tgatcaccga tgagtacaag gtgccctcta agaaattcaa ggtcctgggc aacaccgacc 2520

gacactccat caagaagaac ctgatcggcg ctctgctctt cgactctggc gagaccgctg 2580

aggccacccg actgaagcga accgctcgaa gacgatacac ccgaagaaag aaccgaatct 2640

gttacctgca ggagatcttc tctaacgaga tggccaaggt ggacgactct ttcttccacc 2700

gactggagga gtctttcctg gtggaggagg acaagaagca cgagcgacac cccatcttcg 2760

gcaacatcgt ggacgaggtg gcctaccacg agaagtaccc caccatctac cacctgcgaa 2820

agaagctggt ggactctacc gacaaggccg acctgcgact gatctacctg gccctggccc 2880

acatgatcaa gttccgaggc cacttcctga tcgagggcga cctgaacccc gacaactctg 2940

acgtggacaa gctgttcatc cagctggtgc agacctacaa ccagctcttc gaagagaacc 3000

ccattaacgc ttctggcgtg gatgctaagg ccatcctgtc tgcccgactg tctaagtctc 3060

gacgactcga gaacctgatt gctcagctcc ccggagagaa gaagaacggt ctgttcggaa 3120

acctgattgc tctgtccctg ggtctcaccc ctaacttcaa gtccaacttc gatctggctg 3180

aggacgctaa gctgcagctg tctaaggaca cctacgacga tgacctggat aacctgctcg 3240

cccagattgg cgaccagtac gccgacctgt tcctggccgc caagaacctg tctgacgcca 3300

tcctgctgtc tgacatcctg cgagtgaaca ccgagatcac caaggccccc ctgtctgcct 3360

ccatgattaa gcgatacgat gagcaccacc aggatctgac cctcctcaag gctctggtcc 3420

gacagcagct gcccgagaag tacaaggaga ttttcttcga ccagtctaag aacggctacg 3480

ccggctacat cgacggcggc gcctctcagg aggagttcta caagttcatt aagcccatcc 3540

tggagaagat ggacggaacc gaggaactgc tcgtgaagct gaaccgagag gacctcctgc 3600

gaaagcagcg aaccttcgac aacggctcta tcccccacca gatccacctg ggcgagctgc 3660

acgccatcct gcgacgacag gaggacttct accccttcct gaaggacaac cgagagaaga 3720

tcgagaagat cctgaccttc cgaatcccct actacgtggg acccctggcc cgaggaaact 3780

ctcgattcgc ttggatgacc cgaaagtctg aggagaccat taccccctgg aacttcgagg 3840

aggtggtgga taagggcgcc tctgctcagt ctttcatcga gcgaatgacc aacttcgaca 3900

agaacctccc caacgagaag gtcctgccca agcactctct gctctacgag tacttcaccg 3960

tctacaacga gctcaccaag gtcaagtacg tgaccgaggg aatgcgaaag cccgctttcc 4020

tgtctggaga gcagaagaag gctattgtgg atctgctctt caagactaac cgaaaggtca 4080

ccgtcaagca gctgaaggag gattacttca agaagattga gtgtttcgat tctgtcgaga 4140

tctccggcgt cgaggaccga ttcaacgcct ctctgggtac ctaccacgac ctgctgaaga 4200

ttatcaagga caaggatttc ctggataacg aggagaacga ggatattctc gaggacattg 4260

tcctgaccct caccctgttc gaggatcgag agatgattga ggagcgactc aagacctacg 4320

ctcacctgtt cgacgacaag gtgatgaagc agctgaagcg acgacgatac accggctggg 4380

gccgactgtc tcgaaagctg atcaacggca tccgagacaa gcagtctggc aagaccatcc 4440

tggacttcct gaagtctgac ggcttcgcca accgaaactt catgcagctg atccacgacg 4500

actctctgac cttcaaggag gacatccaga aggcccaggt gtctggccag ggcgactctc 4560

tgcacgagca catcgccaac ctggccggct ctcccgccat taagaaaggt atcctgcaga 4620

ccgtcaaggt ggtcgatgag ctcgtcaagg tgatgggccg acacaagccc gagaacattg 4680

tcattgagat ggctcgagag aaccagacta ctcagaaggg tcagaaaaac tcccgagagc 4740

gaatgaagcg aattgaggaa ggtattaagg agctgggatc ccagattctc aaggagcatc 4800

ccgtggagaa cactcagctc cagaacgaga agctgtacct gtactatctg cagaacggtc 4860

gagacatgta cgtcgaccag gagctggata tcaaccgact ctccgactac gatgtggacc 4920

acattgtgcc ccagtccttc ctgaaggacg attctatcga taacaaggtg ctgacccgat 4980

ccgacaagaa ccgaggcaag tctgacaacg tgccctccga ggaggtggtc aagaagatga 5040

agaactactg gcgacagctg ctgaacgcca agctgattac ccagcgaaag ttcgacaacc 5100

tgaccaaggc cgagcgaggc ggcctgtctg agctggacaa ggccggcttc atcaagcgac 5160

agctggtgga gacccgacag atcaccaagc acgtggccca gatcctggac tctcgaatga 5220

acaccaagta cgacgagaac gacaagctga tccgagaggt gaaggtgatc accctgaagt 5280

ctaagctggt gtctgacttc cgaaaggact tccagttcta caaggtgcga gagattaaca 5340

actaccacca cgcccacgat gcctacctga acgctgtcgt gggcaccgcc ctcatcaaga 5400

agtatcccaa gctggagtcc gagttcgtct acggcgacta caaggtctac gatgtgcgaa 5460

aaatgattgc caagtccgag caggagattg gcaaggctac cgccaagtac ttcttctact 5520

ccaacattat gaacttcttc aagaccgaga ttaccctggc taacggcgag attcgaaagc 5580

gacccctcat tgagaccaac ggagagaccg gtgagatcgt gtgggacaag ggacgagact 5640

tcgccaccgt gcgaaaggtg ctgtctatgc cccaggtgaa catcgtgaag aagaccgagg 5700

tgcagaccgg aggtttctct aaggagtcca tcctgcccaa gcgaaactct gacaagctga 5760

tcgcccgaaa gaaggactgg gaccccaaga agtacggagg tttcgactct cccaccgtgg 5820

cttactctgt gctggtggtg gccaaggtgg agaagggcaa gtctaagaag ctgaagtctg 5880

tgaaggagct gctgggcatt accatcatgg agcgatcttc tttcgagaag aaccccattg 5940

acttcctgga ggccaaggga tacaaggagg tgaagaaaga tctgattatc aagctcccca 6000

agtactctct gttcgagctg gagaacggac gaaagcgaat gctggcctct gccggcgagc 6060

tgcagaaggg aaacgagctg gccctgccct ccaagtacgt caacttcctg tacctcgcct 6120

cccattacga gaagctgaag ggctctcccg aggataacga gcagaagcag ctcttcgtgg 6180

agcagcataa gcactacctg gacgagatca tcgagcagat ctctgagttc tctaagcgag 6240

tgatcctggc tgacgccaac ctggataagg tgctgtctgc ttacaacaag caccgagaca 6300

agcccattcg agagcaggct gagaacatca ttcacctgtt caccctgacc aacctgggag 6360

cccccgctgc cttcaagtac ttcgacacca ccatcgaccg aaagcgatac acctctacca 6420

aggaggtgct ggacgccacc ctgatccacc agtctatcac cggcctgtac gagacccgaa 6480

tcgacctgtc tcagctgggc ggcgactctc gagccgaccc caagaagaag cgaaaggtgt 6540

aagctagcct catgtaatta gttatgtcac gcttacattc acgccctccc tccacatccg 6600

ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta 6660

tagttatgtt agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca 6720

gacgcgtgta cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct 6780

cgaaggcttt aatttgcaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc ttgagggagc 6840

cacggttgat gagagctttg ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac ttttgctttg 6900

ccacggaacg gtctgcgttg tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag 6960

ttcgatttat tcaacaaagc cgccgtcccg tcaagtcagc gtaatgctct gccagtgtta 7020

caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt 7080

attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga 7140

aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac 7200

tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga 7260

gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt 7320

ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa 7380

accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg 7440

acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat 7500

attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc 7560

agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg 7620

cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct 7680

acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat 7740

tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc 7800

catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac 7860

accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg atatattttt 7920

atcttgtgca atgtaacatc agagattttg agacacaacg tggctttccc ccccccccct 7980

gcaggtcggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac 8040

cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat 8100

ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg caccattcct 8160

tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaaccg gatcctccgt cccccttttc ctttgtcgat 8220

atcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc cccccacatc cgctctaacc 8280

gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt tatagttatg 8340

ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt tttttctgta cagacgcgtg 8400

tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg ctcgaaggct 8460

ttaatttgca agctggagac caacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 8520

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 8580

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 8640

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 8700

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc 8760

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 8820

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 8880

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 8940

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 9000

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 9060

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 9120

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 9180

aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga tcagatctaa catccaaaga cgaaaggttg 9240

aatgaaacct ttttgccatc cggagctc 9268

Claims (10)

1.基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在提高二元酸产量中的应用，所述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)制备热带假丝酵母的感受态细胞；

(2)将上述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与步骤(1)制得的感受态细胞混合均匀后，进行电转化，制得转化细胞；

(3)将转化细胞复苏培养后，在含G418浓度800～1000μg/mL的固体YPD培养基上进行筛选培养，筛选抗G418的菌株；

(4)将步骤(3)制得的抗G418的菌株在含有5～15g/L半乳糖的筛选培养基筛选培养，制得编辑后的细胞；

(5)将步骤(4)制得的编辑后的细胞在发酵培养基中进行发酵培养6～8d，经分离、纯化，制得二元酸。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的热带假丝酵母为热带假丝酵母(Candida tropicalis)CICC1798。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，制备热带假丝酵母的感受态细胞的具体步骤如下：

取热带假丝酵母单菌落，培养至菌体浓度OD₆₀₀为1.0～1.8，置于冰上冷却，离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得热带假丝酵母感受态细胞。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，电转化条件为：1300～1800V、5～10ms连续点击2～3次。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，复苏培养条件为：28～32℃、150～200r/min摇床复苏培养40～80min。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，复苏培养的复苏培养基组份为浓度1mol/L的山梨醇溶液。

8.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，筛选培养条件为：28～32℃培养1～2天；

固体YPD培养基组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L，琼脂2g/L。

9.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，筛选培养条件为：28～32℃、培养24～72h；

筛选培养基组分如下：半乳糖100g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L。

10.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(5)中，发酵培养基组份如下：

葡萄糖40g/L、(NH₄)₂SO₄ 1g/L、酵母膏2g/L、VB1 0.1g/L、NaCl 2g/L、KH₂PO₄ 4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 10.08g/L、尿素2g/L、Mg₂SO₄·7H₂O 6.15g/L、癸烷10％按体积百分比计，水配制，pH 7.0。

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