CN113122556B - 振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的应用 - Google Patents

振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的应用。所述的振荡型基因表达系统含有启动子PluxI，阻遏基因tetR，启动子Ptet，应答调节因子基因LuxI和LuxR，蛋白降解标签基因ssrA。通过调控基因表达的周期性开关过程，振荡型基因表达系统可以缓解稳定生长期大肠杆菌代谢中间产物及能量的供给压力，使基因表达与底物供给达到平衡，进而提高次级代谢产物的产量。本发明通过在振荡型基因表达调控质粒中导入鼠李糖脂生物合成途径相关基因，实现鼠李糖脂在大肠杆菌中的异源合成，构建得到的高产鼠李糖脂的振荡型基因表达系统的工程菌，发酵产量达838mg/L。

Description

振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的 应用
技术领域
本发明涉及一种振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
大肠杆菌作为一种重要的革兰氏阴性模式菌株，具有非致病性、构造相对简单、遗传背景清晰、容易分离培养等特性，常作为模式生物参与生物实验或作为基因工程的对象加以利用，是异源表达和分泌次级代谢产物的理想宿主。
鼠李糖脂(Rhamnolipid)是一种结晶酸，属于阴离子表面活性剂，是由一个或两个鼠李糖与3-羟基脂肪酸以糖苷键相连而构成的两亲性分子。鼠李糖脂的种类繁多，化学结构多种多样，目前已发现多达60种鼠李糖脂的同系物，这些同系物的主要区别在于饱和(C-C)和不饱和(C＝C)脂肪酸链的长度的差异，由C8到C14不等。根据鼠李糖分子数目的不同，可以将其分为单鼠李糖脂Rha-C10、Rha-C10-C10和双鼠李糖脂Rha-Rha-C10、Rha-Rha-C10-C10。鼠李糖脂具有优越的表/界面活性，可大大降低两相间的表面张力，具有乳化、发泡、洗涤等功效，在农业、环境保护、医药化妆品、食品、精细化工等领域有非常广泛的应用前景。
鼠李糖脂广泛存在于假单胞菌属细菌中，常以铜绿假单胞菌为主要菌种进行发酵得来。铜绿假单胞菌可在不同的碳底物上生长，有着非常优良的生产鼠李糖脂的能力，然而铜绿假单胞菌是一种无处不在的环境细菌，同时也是一种机会性致病菌，其工业应用有限，很难大规模的生产。并且由于涉及到鼠李糖脂生产转录调控网络的QS系统的复杂性，使得筛选铜绿假单胞菌高产菌株成为了一个很难完成的任务。有研究表明，鼠李糖基转移酶基因可以在大肠杆菌中有效表达。文献1(Wang QH,Fang XD,Bai BJ,et al.Engineeringbacteria for production of rhamnolipid as an agent for enhanced oil recovery[J].Biotechnology&Bioengineering,2007,98(4):842-53)通过转座子介导的方法将rh1AB操纵子整合到大肠杆菌BL21(DE3)的基因组中，经IPTG成功诱导表达出鼠李糖脂，产量约为0.080g/L。文献2(Cabrera-Valladares N,Richardson AP,Olvera C,etal.Monorhamnolipids and 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids(HAAs)production using Escherichia coli as a heterologous host.Appl Microbiol Biot[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2006,73(1):187-94)利用rh1AB操纵子和rmlBDAC操纵子(铜绿假单胞菌鼠李糖合成基因簇)成功表达鼠李糖脂，产量约为0.121g/L。文献3(HanL,Liu P,Peng Y,et al.Engineering the biosynthesis of novelrhamnolipids in Escherichia coli for enhanced oil recovery[J].Journal ofApplied Microbiology,2014,117(1):139-50)通过整合不同的鼠李糖脂合成相关基因，构建不同的产鼠李糖脂的质粒载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)发酵得到最高产量为0.120g/L。文献4(Du J,Zhang A,Hao J A,et al.Biosynthesis of di-rhamnolipids andvariations of congeners composition in genetically-engineered Escherichiacoli[J].Biotechnology letters,2017,39(7):1041-8)在大肠杆菌中将rfbD和rhlAB-rhlC共过量表达鼠李糖脂，将产量由0.446g/L提高至0.64g/L。上述方法虽然将产鼠李糖脂的相关基因导入大肠杆菌，并验证了异源合成鼠李糖脂的可行性，但是鼠李糖脂在大肠杆菌中的产量较低，并且由于合成鼠李糖脂的前体物质大多来自于大肠杆菌的中心代谢途径，细菌过量表达鼠李糖脂会影响细菌本身的生长代谢。
综上所述，鼠李糖脂发酵对安全性的需求限制了铜绿假单胞菌的发酵应用，异源微生物表达鼠李糖脂产量低也限制了鼠李糖脂的工业化发展。
发明内容
本发明提供一种安全经济、鼠李糖脂产量高的振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的应用。本发明通过在振荡型基因表达调控质粒中导入鼠李糖脂生物合成途径相关基因，实现鼠李糖脂在大肠杆菌中的异源合成。
本发明的技术方案如下：
本发明提供振荡型基因表达调控质粒pOSC，通过在载体pTD103基础上删除多余的启动子PluxR和基因LuxR，并且在启动子PluxI(SEQ ID：NO.1)上游反向插入启动子Ptet(SEQ ID：NO.2)得到，由此形成启动子Ptet及启动子PluxI启动的两条代谢调控通路。
本发明所述的质粒pOSC中，启动子Ptet启动的代谢调控通路包含启动子Ptet、应答调节因子基因LuxR(SEQ ID：NO.3)；所述的启动子PluxI启动的代谢调控通路包含启动子PluxI、靶基因sfGFP(SEQ ID：NO.4)、阻遏基因tetR(SEQ ID：NO.5)、蛋白降解标签基因ssrA(SEQ ID：NO.6)和调节基因LuxI(SEQ ID：NO.7)。
本发明还提供基于上述质粒pOSC形成的合成鼠李糖脂的振荡型基因表达调控质粒pOSC-rh1AB，通过将振荡型基因表达调控质粒pOSC的靶位点上的标记基因sfGFP替换为表达鼠李糖脂的鼠李糖基转移酶基因rh1A(SEQ ID：NO.8)和rh1B(SEQ ID：NO.9)得到。
进一步地，本发明提供上述振荡基因表达调控质粒pOSC的构建方法，具体步骤如下：
(1)以质粒pTD103为DNA模板，利用引物sfGFPFor、PtetRev扩增1Kb的T1-sfGFP-PluxI-Ptet序列；
(2)用限制性内切酶EcoRI对质粒pTD103进行酶切，回收纯化酶切后的3.6Kb载体片段luxR-kan-ColE1-luxI；
(3)通过Gibson assembly将步骤(1)与步骤(2)中纯化回收的片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pTD-Ptet；
(4)以质粒pTD-Ptet为DNA模板，利用引物LuxRfor、gfpRev扩增片段，删除PluxR，利用Nhel对PCR扩增片段进行酶切，利用T4连接酶进行连接，获得质粒pTD-ptet2；
(5)用HindIII和KpnI对pTD-Ptet2进行双酶切，回收纯化3.4Kb载体片段luxI-colE1-kan-LuxR；
(6)以大肠杆菌XL1-Blue基因组DNA为模板，利用引物tetRFor、tetRRev扩增tetR基因片段，对tetR的PCR扩增产物用HindIII和KpnI双酶切；
(7)通过T4连接酶将步骤(5)与步骤(6)中的酶切片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pTD-tetR；
(8)以质粒pTD-ptet2为DNA模板，利用引物gfpFor、gfpRev扩增sfGFP标记基因，用HindIII对sfGFP的PCR片段和pTD-tetR进行酶切；
(9)通过T4连接酶将步骤(8)酶切片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pOSC。
进一步地，本发明所述的合成鼠李糖脂的振荡型基因表达调控质粒pOSC-rh1AB的构建方法，包括以下步骤：
(1)以铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA为模板，利用引物rhalABFor，rhalABRev扩增2.2Kb的鼠李糖基转移酶基因rh1AB；
(2)以振荡型基因表达质粒pOSC为模板，以pTD-tetFor1、pTD-tetRev1为引物扩增2.3Kb的tetR-LuxI-ColE1片段，以pTD-tetFor2、pTD-tetRev2为引物扩增2.0Kb的kanR-luxR-Ptet片段；
(3)通过Gibson assembly将步骤(1)和步骤(2)中纯化回收的三个片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pOSC-rh1AB。
更进一步地，本发明提供鼠李糖脂的大肠杆菌振荡型基因表达系统，通过将合成鼠李糖脂的振荡型基因表达调控质粒pOSC-rh1AB转入大肠杆菌中得到。
本发明还提供上述鼠李糖脂的大肠杆菌振荡型基因表达系统在生产鼠李糖脂中的应用。
具体地，上述鼠李糖脂的大肠杆菌振荡型基因表达系统在生产鼠李糖脂中的应用，具体方法包括以下步骤：
(1)将振荡型基因表达调控质粒pOSC-rh1AB转入大肠杆菌DH10B感受态细胞，筛选阳性克隆，得到由振荡型基因表达调控的高产鼠李糖脂大肠杆菌DH10B/pOSC-rh1AB；
(2)将步骤(1)得到的大肠杆菌接入LB液体培养基中培养，得到预培养的工程菌菌液；
(3)按1％-10％的体积比将预培养的工程菌菌液接入发酵培养基进行培养，得到含有鼠李糖脂的发酵液。
优选地，步骤(3)中，培养条件为：37℃，220rpm，12～36h。发酵培养基组成为：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，NaCl 10g/L，甘油3％，葡萄糖20～30g/L。
本发明利用PluxI/tetR-LuxI及Ptet/LuxR元件，PluxI作为外源基因的启动子，实现外源基因表达的周期性开关过程。其基本原理如下：由Ptet启动子控制的pluxR以及由PluxI启动子控制的luxI，靶基因组成了振荡的基因表达回路。大肠杆菌基因组luxI表达产生的信息素AHL，作为细胞密度的信号分子，AHL随着细胞的生长逐渐表达并积累。当细胞生长到稳定生长期，AHL达到阈值浓度后，结合并LuxR蛋白，接着LuxR蛋白与AHL形成的复合体蛋白，与启动子PluxI结合，激活LuxI的转录，进一步生成AHL，信号分子AHL的累计能够激活tetR与靶基因转录。当TetR表达增加，tetR抑制子将抑制由Ptet启动的LuxR的表达，从而使LuxI表达量减少，无法再激活tetR与靶基因表达，tetR的表达受到抑制则又使振荡型表达系统中的Ptet启动子解除抑制，激活表达LuxR蛋白，与信号分子AHL结合激活由PluxI启动的tetR和靶基因，形成振荡型的基因表达回路。通过此系统可以缓解稳定生长期大肠杆菌代谢中间产物及能量的供给压力，使目的基因的表达与底物供给达到平衡，进而提高所表达次级代谢产物的产量。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明构建的振荡型基因表达系统通过周期性开关靶基因的表达，缓解稳定生长期大肠杆菌代谢中间产物及能量的供给压力，使目的基因的表达与底物供给达到平衡，进而提高所表达次级代谢产物鼠李糖脂的产量。本发明通过转入鼠李糖脂合成途径，构建得到的高产鼠李糖脂的振荡型基因表达系统的工程菌，发酵产量达838mg/L。
附图说明
图1为重组质粒pOSC图谱。
图2为重组质粒pOSC-rh1AB图谱。
图3为重组质粒pOSC-rh1AB酶切验证电泳图，Marker为10kb DNA分子量标准，编号1泳道为PvuII限制酶酶切，编号2泳道为BamHI限制酶酶切，编号3泳道为KpnI限制酶酶切。
图4为振荡型与组成型基因表达鼠李糖脂产量的对比图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。下述实施例中，如无特殊说明，采用的试剂为本领域常规使用试剂，采用的方法为本领域常规使用的方法。
pTD103的构建参考【Danino T,Mondragón-Palomino O,Tsimring L,et al.Asynchronized quorum of genetic clocks[J].Nature,2010,463(7279):326-30】。
实施例1：构建振荡型基因表达质粒pOSC和pOSC-rh1AB。
1.重组质粒pOSC的构建，包括以下步骤：
(1)以质粒pTD103为DNA模板，利用引物sfGFPFor、PtetRev扩增1Kb的T1-sfGFP-PluxI-Ptet序列，
sfGFPFor(SEQ ID：NO.10)：5’-gtacctttctcctctttaatgcggcggatttgtcctactca-3’，
PtetRev(SEQ ID：NO.11)：
5’-tggtttgttatagtcgaaTgcaagcagcagtatctctatcactgatagggatgtcaagcacctgtaggatcgtac-3’。
(2)用限制性内切酶EcoRI对质粒pTD103进行酶切，回收纯化酶切后的3.6Kb载体片段luxR-kan-ColE1-luxI。
(3)通过Gibson assembly将步骤(1)与步骤(2)中纯化回收的片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pTD-Ptet。Gibson assembly体系为T1-sfGFP-PluxI-Ptet片段，luxR-kan-ColE1-luxI片段各1.5μl，2×Gibson assembly Mix 3μl，反应条件为50℃1h，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，卡那霉素100μg/ml筛选，挑取单菌落接种，提取质粒进行酶切验证，阳性重组子进行测序。
(4)以质粒pTD-Ptet为DNA模板，利用引物LuxRfor、gfpRev扩增片段，删除PluxR，利用Nhel对PCR扩增片段进行酶切，利用T4连接酶进行连接，获得质粒pTD-ptet2，
LuxRfor(SEQ ID：NO.12)：5’-ctagctagcgacaaacaataggtaagg-3’，
gfpRev(SEQ ID：NO.13)：5’-ctagctagcgtcgaatgcaagcagcagtatc-3’。
(5)用HindIII和KpnI对pTD-Ptet2进行双酶切，回收纯化3.4Kb载体片段luxI-colE1-kan-LuxR。
(6)以大肠杆菌XL1-Blue(市售常规菌株)基因组DNA为模板，利用引物tetRFor、tetRRev扩增tetR基因片段，对tetR的PCR扩增产物用HindIII和KpnI双酶切，
tetRFor(SEQ ID：NO.14)：5’-ctagctagcgtcgaatgcaagcagcagtatc-3’，
tetRRev(SEQ ID：NO.15)：5’-cagcgtaaaagcttaattaggaattaatgatgtc-3’。
(7)通过T4连接酶将步骤(5)与步骤(6)中的酶切片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pTD-tetR。T4连接体系为luxI-colE1-kan-LuxR片段5.5μl，tetR片段3μl，T4ligase 0.5μl，T4 ligase buffer 1μl，反应条件为16℃14h，转化至大肠杆菌DH10B感受态细胞，卡那霉素50μg/ml筛选，挑取单菌落接种，提取质粒进行酶切验证，阳性重组子进行测序。
(8)以质粒pTD-ptet2为DNA模板，利用引物gfpFor、gfpRev扩增sfGFP标记基因，用HindIII对sfGFP的PCR片段和pTD-tetR进行酶切，
gfpfor(SEQ ID：NO.16)：5’-gtcatatcagataagcattg-3’，
gfprev(SEQ ID：NO.17)：5’-gggaagcttttacgctgcaagggcg-3’。
(9)通过T4连接酶将步骤(8)酶切片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pOSC，质粒图谱见图1。
上述步骤中，采用的PCR反应体系(50μl)为：
上述步骤中，采用的PCR反应条件为：
上述步骤中，采用的单酶切体系(30μl)为：
质粒 10μl
EcoRI 1μl
Cutsmart buffer 3μl
ddH2O 16μl
上述步骤中，采用的双酶切体系(30μl)为：
质粒 10μl
限制酶 1+1μl
Cutsmart buffer 3μl
ddH2O 15μl
酶切条件一般为37℃，酶切3h。
2.将重组质粒pOSC的sfGFP替换为rh1AB基因，利用PCR手段扩增pOSC的主要元件，从铜绿假单胞菌PAO1中扩增基因rh1AB，随后将两片段进行连接，转化至大肠杆菌DH10B中，利用含卡那霉素50μg/ml的LB平板进行筛选，挑取单菌落接种于LB液体培养基培养12h，提取质粒进行酶切验证，阳性重组子进行测序并进行测序。
产鼠李糖脂振荡基因表达调控质粒pOSC-rh1AB的构建，包括以下步骤：
(1)以铜绿假单胞菌PAO1基因组为DNA模板，利用引物rhalABFor、rhalABRev扩增2.2Kb的鼠李糖基转移酶基因rh1AB，
rhalABFor(SEQ ID：NO.18)：5’-gaggagaaaggtaccatgcggcgcgaaagtctgttg-3’，
rhalABRev(SEQ ID：NO.19)：5’-cctaattaagcttttatcaggacgcagccttcag-3’。
(2)以振荡型基因表达质粒pOSC为模板，以pTD-tetFor1、pTD-tetRev1为引物扩增2.3Kb的tetR-LuxI-ColE1片段，以pTD-tetFor2、pTD-tetRev2为引物扩增2.0Kb的kanR-luxR-Ptet片段，
pTD-tetFor1(SEQ ID：NO.20)：5’-ctgaaggctgcgtcctgataaaagcttaattagg-3’，
pTD-tetRev1(SEQ ID：NO.21)：5’-gatccagtaatgacctcag-3’，
pTD-tetFor2(SEQ ID：NO.22)：5’-ctgaggtcattactggatc-3’，
pTD-tetRev2(SEQ ID：NO.23)：5’-caacagactttcgcgccgcatggtacctttctcctc-3’。(3)通过Gibson assembly将步骤(1)和步骤(2)中纯化回收的三个片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pOSC-rh1AB，质粒图谱见图2。Gibson assembly体系为rh1AB片段1μl，tetR-LuxI-ColE1片段和kanR-luxR-Ptet片段各2ul，2×Gibson assembly Mix 5μl，反应条件为50℃1h，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，卡那霉素50μg/ml筛选，挑取单菌落接种，提取质粒进行酶切验证，选取限制性内切酶PvuII、BamHI、KpnI进行酶切，得到DNA片段大小分别为360bp/1671bp/4479bp、60bp/5950bp、2897bp/3613bp，酶切图谱如图3。
(4)以振荡型基因表达质粒pOSC为模板，以pTD-tetFor2、pTD-Rev1为引物扩增ColE-LuxI片段，以铜绿假单胞菌PAO1基因组为DNA模板，利用引物rhalABFor、pTD-Rev2为引物扩增鼠李糖基转移酶基因rh1AB，
pTD-tetFor2(SEQ ID：NO.22)：5’-ctgaggtcattactggatc-3’，
pTD-Rev1(SEQ ID：NO.24)：5’-ggtcttaaaaggagaaaggtacc-3’，
rhalABFor(SEQ ID：NO.18)：5’-gaggagaaaggtaccatgcggcgcgaaagtctgttg-3’，
pTD-Rev2(SEQ ID：NO.25)：5’-ggtacctttctccttttaagacctcaggacgcagccttcag-3’。
通过Gibson assembly将纯化回收的ColE-LuxI、rh1AB片段与步骤(2)中的kanR-luxR-Ptet片段进行连接形成新的质粒载体，即获得对照组质粒pTD-rh1AB。Gibsonassembly体系为rh1AB片段1μl，ColE-LuxI片段和kanR-luxR-Ptet片段各2ul，2×Gibsonassembly Mix 5μl，反应条件为50℃1h，转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，卡那霉素50μg/ml筛选。对照组质粒pTD-rh1AB不含基因tetR，为组成型基因表达质粒，不引起基因振荡。
PCR反应步骤，酶切反应步骤与1中相同。
实施例2：应用大肠杆菌振荡型基因表达系统表达鼠李糖脂
将构建好的重组质粒pOSC-rh1AB和pTD-rh1AB转化至DH10B中，获得工程菌DH10B/pOSC-rh1AB、DH10B/pTD-rh1AB。将工程菌DH10B/pOSC-rh1AB与对照组DH10B/pTD-rh1AB接种于LB液体培养基(含卡那霉素50μg/ml)，37℃，220rpm/min培养16h做种子液。按1％体积比接种于发酵培养基(LB培养基配方+3％甘油+3％葡萄糖)，30℃，220rpm振荡培养24～48h，得到含有鼠李糖脂的发酵液。
发酵液中鼠李糖脂含量的检测方法：
(1)鼠李糖标准曲线的绘制
取1g/L的鼠李糖母液稀释为浓度分别为0g/L，0.02g/L，0.04g/L，0.06g/L，0.08g/L和1g/L的10mL标准样品。然后取各标准样300μL于1.5mL离心管中，置于冰浴上，各加入600μL硫酸-蒽酮溶液，摇匀后冰浴10min。再于100℃金属浴反应15min后冷却至室温，以0g/L鼠李糖溶液和硫酸蒽酮溶液反应的样品作为空白对照，测定所有反应后的标准样品在625nm下的吸光度，得到一系列不同鼠李糖浓度与硫酸蒽酮溶液反应后的吸光度值，由此绘制标准曲线。
(2)发酵液中鼠李糖脂浓度的测定
将含有鼠李糖脂的发酵液高速离心(14000rpm)5min，取上清液稀释(稀释倍数视鼠李糖脂浓度而定)待测，然后取稀释后的各样品300μL加入到1.5mL离心管中，置于冰浴上，再各加入600μL硫酸-蒽酮溶液；以0g/L鼠李糖溶液和硫酸蒽酮溶液反应的样品作为空白对照，测定所有反应后的标准样品在625nm下的吸光度。鼠李糖的浓度可由标准曲线计算得出。
(3)鼠李糖脂浓度的计算
发酵液中的鼠李糖脂浓度可根据鼠李糖浓度计算得到，如上式所示计算：
其中X表示发酵液中鼠李糖脂浓度(g/L)，V0表示样品稀释后的总体积(mL)，V表示测定用的样品总体积(mL)，C为从吸光度-鼠李糖浓度标准曲线上所得的鼠李糖浓度(g/L)。
检测结果显示，本发明的高产鼠李糖脂的大肠杆菌DH10B/pOSC-rh1AB发酵生产鼠李糖脂发酵产量达838mg/L，而对照组大肠杆菌DH10B/pTD-rh1AB发酵产量为0.262mg/L，振荡型基因表达是组成型基因表达的3.2倍，二者产量对比如图4。现有的大肠杆菌生产鼠李糖脂的方法多是通过组成型基因表达或外部诱导物诱导表达，前者基因持续表达容易造成稳定生长期代谢底物及能量的供给压力，后者添加的外部诱导物容易对细菌有毒性危害，影响工程菌的持续性表达。本发明合理利用基因编辑技术，利用基因间相互作用构建了振荡型基因表达系统，并将其与鼠李糖脂转移酶基因rh1AB相结合，在大肠杆菌中生产鼠李糖脂，优化了大肠杆菌的代谢途径，缓解稳定生长期大肠杆菌代谢中间产物及能量的供给压力，使目的基因的表达与底物供给达到平衡，进而提高次级代谢产物鼠李糖脂的产量。
序列表
<110> 南京理工大学
<120> 振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的应用
<141> 2019-12-30
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 82
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
agcacctgta ggatcgtaca ggtttacgca agaaaatggt ttgttatagt cgaatgaatt 60
cattaaagag gagaaaggta cc 82
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
tgcaagcagc agtatctcta tcactgatag ggatgtcaa 39
<210> 3
<211> 704
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
ttaattttta aagtatgggc aatcaattgc tcctgttaaa attgctttag aaatactttg 60
gcagcggttt gttgtattga gtttcatttg cgcattggtt aaatggaaag tgacagtacg 120
ctcactgcag cctaatattt ttgaaatatc ccaagagctt tttccttcgc atgcccacgc 180
taaacattct ttttctcttt tggttaaatc gttgtttgat ttattatttg ctatatttat 240
ttttcgataa ttatcaacta gagaaggaac aattaatggt atgttcatac acgcatgtaa 300
aaataaacta tctatatagt tgtctttttc tgaatgtgca aaactaagca ttccgaagcc 360
attgttagcc gtatgaatag ggaaactaaa cccagtgata agacctgatg ttttcgcttc 420
tttaattaca tttggagatt ttttatttac agcattgttt tcaaatatat tccaattaat 480
tggtgaatga ttggagttag aataatctac tataggatca tattttatta aattagcgtc 540
atcataatat tgcctccatt ttttagggta attatctaga attgaaatat cagatttaac 600
catagaatga ggataaatga tcgcgagtaa ataatattca caatgtacca ttttagtcat 660
atcagataag cattgattaa tatcattatt gcttctacaa gctt 704
<210> 4
<211> 750
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
atgagcaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60
gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtccgt ggagagggtg aaggtgatgc tacaaacgga 120
aaactcaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccgtg gccaacactt 180
gtcactactc tgacctatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca catgaaacgg 240
catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300
aaagatgacg ggacctacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360
aatcgtatcg agttaaaggg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420
ctcgagtaca actttaactc acacaatgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480
atcaaagcta acttcaaaat tcgccacaac gttgaagatg gttccgttca actagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
ctgtcgacac aatctgtcct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt 660
cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaagcagcg 720
aacgacgaaa attacgccct tgcagcgtaa 750
<210> 5
<211> 624
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
atgtctagat tagataaaag taaagtgatt aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc 60
ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca 120
ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta 180
gataggcacc atactcactt ttgcccttta gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt 240
aataacgcta aaagttttag atgtgcttta ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat 300
ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta 360
tgccaacaag gtttttcact agagaatgca ttatatgcac tcagcgctgt ggggcatttt 420
actttaggtt gcgtattgga agatcaagag catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca 480
cctactactg atagtatgcc gccattatta cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa 540
ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa 600
cttaaatgtg aaagtgggtc ttaa 624
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
gcagcgaacg acgaaaatta cgcccttgca gcg 33
<210> 7
<211> 615
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
atgactataa tgataaaaaa atcggatttt ttggcaattc catcggagga gtataaaggt 60
attctaagtc ttcgttatca agtgtttaag caaagacttg agtgggactt agttgtagaa 120
aataaccttg aatcagatga gtatgataac tcaaatgcag aatatattta tgcttgtgat 180
gatactgaaa atgtaagtgg atgctggcgt ttattaccta caacaggtga ttatatgctg 240
aaaagtgttt ttcctgaatt gcttggtcaa cagagtgctc ccaaagatcc taatatagtc 300
gaattaagtc gttttgctgt aggtaaaaat agctcaaaga taaataactc tgctagtgaa 360
attacaatga aactatttga agctatatat aaacacgctg ttagtcaagg tattacagaa 420
tatgtaacag taacatcaac agcaatagag cgatttttaa agcgtattaa agttccttgt 480
catcgtattg gagacaaaga aattcatgta ttaggtgata ctaaatcggt tgtattgtct 540
atgcctatta atgaacagtt taaaaaagca gtcttaaatg cagcgaacga cgaaaattac 600
gcccttgcag cgtaa 615
<210> 8
<211> 888
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 8
atgcggcgcg aaagtctgtt ggtatcggtt tgcaagggcc tgcgggtaca tgtcgagcgc 60
gttgggcagg atcccgggcg cagcacggtg atgctggtca acggcgcgat ggcgaccacc 120
gcctcgttcg cccggacctg caagtgcctg gccgaacatt tcaacgtggt gctgttcgac 180
ctgcccttcg ccgggcagtc gcgtcagcac aacccgcagc gcgggttgat caccaaggac 240
gacgaggtgg aaatcctcct ggcgctgatc gagcgcttcg aggtcaatca cctggtctcc 300
gcgtcctggg gcggtatctc cacgctgctg gcgctgtcgc gcaatccgcg cggcatccgc 360
agctcggtgg tgatggcatt cgcccctgga ctgaaccagg cgatgctcga ctacgtcggg 420
cgggcgcagg cgctgatcga gctggacgac aagtcggcga tcggccatct gctcaacgag 480
accgtcggca aatacctgcc gcagcgcctg aaagccagca accatcagca catggcttcg 540
ctggccaccg gcgaatacga gcaggcgcgc tttcacatcg accaggtgct ggcgctcaac 600
gatcggggct acttggcttg cctggagcgg atccagagcc acgtgcattt catcaacggc 660
agctgggacg aatacaccac cgccgaggac gcccgccagt tccgcgacta cctgccgcac 720
tgcagtttct cgcgggtgga gggcaccggg catttcctcg acctggagtc caagctggca 780
gcggtacgcg tgcaccgcgc cctgctcgag cacctgctga agcaaccgga gccgcagcgg 840
gcggaacgcg cggcgggatt ccacgagatg gccatcggct acgcctga 888
<210> 9
<211> 1281
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 9
atgcacgcca tcctcatcgc catcggctcg gccggcgacg tatttccctt catcggcctg 60
gcccggaccc tgaaactgcg cgggcaccgc gtgagcctct gcaccatccc ggtgtttcgc 120
gacgcggtgg agcagcacgg catcgcgttc gtcccgctga gcgacgaact gacctaccgc 180
cggaccatgg gcgatccgcg cctgtgggac cccaagacgt ccttcggcgt gctctggcaa 240
gccatcgccg ggatgatcga gccggtctac gagtacgtct cggcgcagcg ccatgacgac 300
atcgtggtgg tcggctcgct atgggcgctg ggcgcacgca tcgctcacga gaagtacggg 360
attccctacc tgtccgcgca ggtctcgcca tcgaccctgt tgtcggcgca cctgccgccg 420
gtacacccca agttcaacgt gcccgagcag atgccgctgg cgatgcgcaa gctgctctgg 480
cgctgcatcg agcgcttcaa gctggatcgc acctgcgcgc cggagatcaa cgcggtgcgc 540
cgcaaggtcg gcctggaaac gccggtgaag cgcatcttca cccaatggat gcattcgccg 600
cagggcgtgg tctgcctgtt cccggcctgg ttcgcgccgc cccagcagga ttggccgcaa 660
cccctgcaca tgaccggctt cccgctgttc gacggcagta tcccggggac cccgctcgac 720
gacgaactgc aacgctttct cgatcagggc agccggccgc tggtgttcac ccagggctcg 780
accgaacacc tgcagggcga cttctacgcc atggccctgc gcgcgctgga acgcctcggc 840
gcgcgtggga tcttcctcac cggcgccggc caggaaccgc tgcgcggctt gccgaaccac 900
gtgctgcagc gcgcctacgc gccactggga gccttgctgc catcgtgcgc cgggctggtc 960
catccgggcg gtatcggcgc catgagccta gccttggcgg cgggggtgcc gcaggtgctg 1020
ctgccctgtg cccacgacca gttcgacaat gccgaacggc tggtccggct cggctgcggg 1080
atgcgcctgg gcgtgccgtt gcgcgagcag gagttgcgcg gggcgctgtg gcgcttgctc 1140
gaggacccgg ccatggcggc ggcctgtcgg cgtttcatgg aattgtcaca accgcacagt 1200
atcgcttgcg gtaaagcggc ccaggtggtc gaacgttgtc atagggaggg ggatgctcga 1260
tggctgaagg ctgcgtcctg a 1281
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gtacctttct cctctttaat gcggcggatt tgtcctactc a 41
<210> 11
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tggtttgtta tagtcgaatg caagcagcag tatctctatc actgataggg atgtcaagca 60
cctgtaggat cgtac 75
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ctagctagcg acaaacaata ggtaagg 27
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ctagctagcg tcgaatgcaa gcagcagtat c 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ctagctagcg tcgaatgcaa gcagcagtat c 31
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
cagcgtaaaa gcttaattag gaattaatga tgtc 34
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gtcatatcag ataagcattg 20
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gggaagcttt tacgctgcaa gggcg 25
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gaggagaaag gtaccatgcg gcgcgaaagt ctgttg 36
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
cctaattaag cttttatcag gacgcagcct tcag 34
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
ctgaaggctg cgtcctgata aaagcttaat tagg 34
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gatccagtaa tgacctcag 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
ctgaggtcat tactggatc 19
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
caacagactt tcgcgccgca tggtaccttt ctcctc 36
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
ggtcttaaaa ggagaaaggt acc 23
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
ggtacctttc tccttttaag acctcaggac gcagccttca g 41
<210> 26
<211> 5023
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 26
atgactataa tgataaaaaa atcggatttt ttggcaattc catcggagga gtataaaggt 60
attctaagtc ttcgttatca agtgtttaag caaagacttg agtgggactt agttgtagaa 120
aataaccttg aatcagatga gtatgataac tcaaatgcag aatatattta tgcttgtgat 180
gatactgaaa atgtaagtgg atgctggcgt ttattaccta caacaggtga ttatatgctg 240
aaaagtgttt ttcctgaatt gcttggtcaa cagagtgctc ccaaagatcc taatatagtc 300
gaattaagtc gttttgctgt aggtaaaaat agctcaaaga taaataactc tgctagtgaa 360
attacaatga aactatttga agctatatat aaacacgctg ttagtcaagg tattacagaa 420
tatgtaacag taacatcaac agcaatagag cgatttttaa agcgtattaa agttccttgt 480
catcgtattg gagacaaaga aattcatgta ttaggtgata ctaaatcggt tgtattgtct 540
atgcctatta atgaacagtt taaaaaagca gtcttaaatg cagcgaacga cgaaaattac 600
gcccttgcag cgtaaacgcg tgctagaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag 660
actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc 720
cgccgcccta gacctagggc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 780
taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 840
agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 900
cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 960
tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 1020
tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 1080
gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 1140
acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 1200
acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 1260
cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 1320
gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 1380
gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 1440
agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 1500
ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgact agtgcttgga 1560
ttctcaccaa taaaaaacgc ccggcggcaa ccgagcgttc tgaacaaatc cagatggagt 1620
tctgaggtca ttactggatc tatcaacagg agtccaagcg agctctcgaa ccccagagtc 1680
ccgctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg 1740
cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat 1800
cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga 1860
tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg 1920
tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg 1980
gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc 2040
gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat 2100
caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa 2160
ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg 2220
cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata 2280
gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa 2340
gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc atcagagcag ccgattgtct 2400
gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca 2460
atccatcttg ttcaatcatg cgaaacgatc ctcatcctgt ctcttgatca gatcttgatc 2520
ccctgcgcca tcagatcctt ggcggcaaga aagccatcca gtttactttg cagggcttcc 2580
caaccttacc agagggcgcc ccagctggca attccgacgt ctaagaaacc attattatca 2640
tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcac ctcgagttaa 2700
tttttaaagt atgggcaatc aattgctcct gttaaaattg ctttagaaat actttggcag 2760
cggtttgttg tattgagttt catttgcgca ttggttaaat ggaaagtgac agtacgctca 2820
ctgcagccta atatttttga aatatcccaa gagctttttc cttcgcatgc ccacgctaaa 2880
cattcttttt ctcttttggt taaatcgttg tttgatttat tatttgctat atttattttt 2940
cgataattat caactagaga aggaacaatt aatggtatgt tcatacacgc atgtaaaaat 3000
aaactatcta tatagttgtc tttttctgaa tgtgcaaaac taagcattcc gaagccattg 3060
ttagccgtat gaatagggaa actaaaccca gtgataagac ctgatgtttt cgcttcttta 3120
attacatttg gagatttttt atttacagca ttgttttcaa atatattcca attaattggt 3180
gaatgattgg agttagaata atctactata ggatcatatt ttattaaatt agcgtcatca 3240
taatattgcc tccatttttt agggtaatta tctagaattg aaatatcaga tttaaccata 3300
gaatgaggat aaatgatcgc gagtaaataa tattcacaat gtaccatttt agtcatatca 3360
gataagcatt gattaatatc attattgctt ctacaagctt taattttatt aattattctg 3420
tatgtgtcgt cggcatttat gtttttcata cccatctctt tatccttacc tattgtttgt 3480
cgctagcgtc gaatgcaagc agcagtatct ctatcactga tagggatgtc aagcacctgt 3540
aggatcgtac aggtttacgc aagaaaatgg tttgttatag tcgaatgaat tcattaaaga 3600
ggagaaaggt accatgagca aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc caattcttgt 3660
tgaattagat ggtgatgtta atgggcacaa attttctgtc cgtggagagg gtgaaggtga 3720
tgctacaaac ggaaaactca cccttaaatt tatttgcact actggaaaac tacctgttcc 3780
gtggccaaca cttgtcacta ctctgaccta tggtgttcaa tgcttttccc gttatccgga 3840
tcacatgaaa cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaacg 3900
cactatatct ttcaaagatg acgggaccta caagacgcgt gctgaagtca agtttgaagg 3960
tgataccctt gttaatcgta tcgagttaaa gggtattgat tttaaagaag atggaaacat 4020
tcttggacac aaactcgagt acaactttaa ctcacacaat gtatacatca cggcagacaa 4080
acaaaagaat ggaatcaaag ctaacttcaa aattcgccac aacgttgaag atggttccgt 4140
tcaactagca gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc 4200
agacaaccat tacctgtcga cacaatctgt cctttcgaaa gatcccaacg aaaagcgtga 4260
ccacatggtc cttcttgagt ttgtaactgc tgctgggatt acacatggca tggatgagct 4320
ctacaaagca gcgaacgacg aaaattacgc ccttgcagcg taaaagctta attaggaatt 4380
aatgatgtct agattagata aaagtaaagt gattaacagc gcattagagc tgcttaatga 4440
ggtcggaatc gaaggtttaa caacccgtaa actcgcccag aagctaggtg tagagcagcc 4500
tacattgtat tggcatgtaa aaaataagcg ggctttgctc gacgccttag ccattgagat 4560
gttagatagg caccatactc acttttgccc tttagaaggg gaaagctggc aagatttttt 4620
acgtaataac gctaaaagtt ttagatgtgc tttactaagt catcgcgatg gagcaaaagt 4680
acatttaggt acacggccta cagaaaaaca gtatgaaact ctcgaaaatc aattagcctt 4740
tttatgccaa caaggttttt cactagagaa tgcattatat gcactcagcg ctgtggggca 4800
ttttacttta ggttgcgtat tggaagatca agagcatcaa gtcgctaaag aagaaaggga 4860
aacacctact actgatagta tgccgccatt attacgacaa gctatcgaat tatttgatca 4920
ccaaggtgca gagccagcct tcttattcgg ccttgaattg atcatatgcg gattagaaaa 4980
acaacttaaa tgtgaaagtg ggtcttaaaa ggagaaaggt acc 5023
<210> 27
<211> 6510
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 27
ctcgagttaa tttttaaagt atgggcaatc aattgctcct gttaaaattg ctttagaaat 60
actttggcag cggtttgttg tattgagttt catttgcgca ttggttaaat ggaaagtgac 120
agtacgctca ctgcagccta atatttttga aatatcccaa gagctttttc cttcgcatgc 180
ccacgctaaa cattcttttt ctcttttggt taaatcgttg tttgatttat tatttgctat 240
atttattttt cgataattat caactagaga aggaacaatt aatggtatgt tcatacacgc 300
atgtaaaaat aaactatcta tatagttgtc tttttctgaa tgtgcaaaac taagcattcc 360
gaagccattg ttagccgtat gaatagggaa actaaaccca gtgataagac ctgatgtttt 420
cgcttcttta attacatttg gagatttttt atttacagca ttgttttcaa atatattcca 480
attaattggt gaatgattgg agttagaata atctactata ggatcatatt ttattaaatt 540
agcgtcatca taatattgcc tccatttttt agggtaatta tctagaattg aaatatcaga 600
tttaaccata gaatgaggat aaatgatcgc gagtaaataa tattcacaat gtaccatttt 660
agtcatatca gataagcatt gattaatatc attattgctt ctacaagctt taattttatt 720
aattattctg tatgtgtcgt cggcatttat gtttttcata cccatctctt tatccttacc 780
tattgtttgt cgctagcgtc gaatgcaagc agcagtatct ctatcactga tagggatgtc 840
aagcacctgt aggatcgtac aggtttacgc aagaaaatgg tttgttatag tcgaatgaat 900
tcattaaaga ggagaaaggt accatgcggc gcgaaagtct gttggtatcg gtttgcaagg 960
gcctgcgggt acatgtcgag cgcgttgggc aggatcccgg gcgcagcacg gtgatgctgg 1020
tcaacggcgc gatggcgacc accgcctcgt tcgcccggac ctgcaagtgc ctggccgaac 1080
atttcaacgt ggtgctgttc gacctgccct tcgccgggca gtcgcgtcag cacaacccgc 1140
agcgcgggtt gatcaccaag gacgacgagg tggaaatcct cctggcgctg atcgagcgct 1200
tcgaggtcaa tcacctggtc tccgcgtcct ggggcggtat ctccacgctg ctggcgctgt 1260
cgcgcaatcc gcgcggcatc cgcagctcgg tggtgatggc attcgcccct ggactgaacc 1320
aggcgatgct cgactacgtc gggcgggcgc aggcgctgat cgagctggac gacaagtcgg 1380
cgatcggcca tctgctcaac gagaccgtcg gcaaatacct gccgcagcgc ctgaaagcca 1440
gcaaccatca gcacatggct tcgctggcca ccggcgaata cgagcaggcg cgctttcaca 1500
tcgaccaggt gctggcgctc aacgatcggg gctacttggc ttgcctggag cggatccaga 1560
gccacgtgca tttcatcaac ggcagctggg acgaatacac caccgccgag gacgcccgcc 1620
agttccgcga ctacctgccg cactgcagtt tctcgcgggt ggagggcacc gggcatttcc 1680
tcgacctgga gtccaagctg gcagcggtac gcgtgcaccg cgccctgctc gagcacctgc 1740
tgaagcaacc ggagccgcag cgggcggaac gcgcggcggg attccacgag atggccatcg 1800
gctacgcctg aacccttgac ctgcgaagac ccggcctggc cgggctttgc ggttgcataa 1860
cgcacggagt agccccatgc acgccatcct catcgccatc ggctcggccg gcgacgtatt 1920
tcccttcatc ggcctggccc ggaccctgaa actgcgcggg caccgcgtga gcctctgcac 1980
catcccggtg tttcgcgacg cggtggagca gcacggcatc gcgttcgtcc cgctgagcga 2040
cgaactgacc taccgccgga ccatgggcga tccgcgcctg tgggacccca agacgtcctt 2100
cggcgtgctc tggcaagcca tcgccgggat gatcgagccg gtctacgagt acgtctcggc 2160
gcagcgccat gacgacatcg tggtggtcgg ctcgctatgg gcgctgggcg cacgcatcgc 2220
tcacgagaag tacgggattc cctacctgtc cgcgcaggtc tcgccatcga ccctgttgtc 2280
ggcgcacctg ccgccggtac accccaagtt caacgtgccc gagcagatgc cgctggcgat 2340
gcgcaagctg ctctggcgct gcatcgagcg cttcaagctg gatcgcacct gcgcgccgga 2400
gatcaacgcg gtgcgccgca aggtcggcct ggaaacgccg gtgaagcgca tcttcaccca 2460
atggatgcat tcgccgcagg gcgtggtctg cctgttcccg gcctggttcg cgccgcccca 2520
gcaggattgg ccgcaacccc tgcacatgac cggcttcccg ctgttcgacg gcagtatccc 2580
ggggaccccg ctcgacgacg aactgcaacg ctttctcgat cagggcagcc ggccgctggt 2640
gttcacccag ggctcgaccg aacacctgca gggcgacttc tacgccatgg ccctgcgcgc 2700
gctggaacgc ctcggcgcgc gtgggatctt cctcaccggc gccggccagg aaccgctgcg 2760
cggcttgccg aaccacgtgc tgcagcgcgc ctacgcgcca ctgggagcct tgctgccatc 2820
gtgcgccggg ctggtccatc cgggcggtat cggcgccatg agcctagcct tggcggcggg 2880
ggtgccgcag gtgctgctgc cctgtgccca cgaccagttc gacaatgccg aacggctggt 2940
ccggctcggc tgcgggatgc gcctgggcgt gccgttgcgc gagcaggagt tgcgcggggc 3000
gctgtggcgc ttgctcgagg acccggccat ggcggcggcc tgtcggcgtt tcatggaatt 3060
gtcacaaccg cacagtatcg cttgcggtaa agcggcccag gtggtcgaac gttgtcatag 3120
ggagggggat gctcgatggc tgaaggctgc gtcctgataa aagcttaatt aggaattaat 3180
gatgtctaga ttagataaaa gtaaagtgat taacagcgca ttagagctgc ttaatgaggt 3240
cggaatcgaa ggtttaacaa cccgtaaact cgcccagaag ctaggtgtag agcagcctac 3300
attgtattgg catgtaaaaa ataagcgggc tttgctcgac gccttagcca ttgagatgtt 3360
agataggcac catactcact tttgcccttt agaaggggaa agctggcaag attttttacg 3420
taataacgct aaaagtttta gatgtgcttt actaagtcat cgcgatggag caaaagtaca 3480
tttaggtaca cggcctacag aaaaacagta tgaaactctc gaaaatcaat tagccttttt 3540
atgccaacaa ggtttttcac tagagaatgc attatatgca ctcagcgctg tggggcattt 3600
tactttaggt tgcgtattgg aagatcaaga gcatcaagtc gctaaagaag aaagggaaac 3660
acctactact gatagtatgc cgccattatt acgacaagct atcgaattat ttgatcacca 3720
aggtgcagag ccagccttct tattcggcct tgaattgatc atatgcggat tagaaaaaca 3780
acttaaatgt gaaagtgggt cttaaaagga gaaaggtacc atgactataa tgataaaaaa 3840
atcggatttt ttggcaattc catcggagga gtataaaggt attctaagtc ttcgttatca 3900
agtgtttaag caaagacttg agtgggactt agttgtagaa aataaccttg aatcagatga 3960
gtatgataac tcaaatgcag aatatattta tgcttgtgat gatactgaaa atgtaagtgg 4020
atgctggcgt ttattaccta caacaggtga ttatatgctg aaaagtgttt ttcctgaatt 4080
gcttggtcaa cagagtgctc ccaaagatcc taatatagtc gaattaagtc gttttgctgt 4140
aggtaaaaat agctcaaaga taaataactc tgctagtgaa attacaatga aactatttga 4200
agctatatat aaacacgctg ttagtcaagg tattacagaa tatgtaacag taacatcaac 4260
agcaatagag cgatttttaa agcgtattaa agttccttgt catcgtattg gagacaaaga 4320
aattcatgta ttaggtgata ctaaatcggt tgtattgtct atgcctatta atgaacagtt 4380
taaaaaagca gtcttaaatg cagcgaacga cgaaaattac gcccttgcag cgtaaacgcg 4440
tgctagaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc 4500
tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgcccta gacctagggc 4560
gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 4620
tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 4680
aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 4740
aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 4800
ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 4860
tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 4920
agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 4980
gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 5040
tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 5100
acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 5160
tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 5220
caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 5280
aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 5340
aactcacgtt aagggatttt ggtcatgact agtgcttgga ttctcaccaa taaaaaacgc 5400
ccggcggcaa ccgagcgttc tgaacaaatc cagatggagt tctgaggtca ttactggatc 5460
tatcaacagg agtccaagcg agctctcgaa ccccagagtc ccgctcagaa gaactcgtca 5520
agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg 5580
aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg 5640
tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca 5700
ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg 5760
tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct 5820
tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg 5880
cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc 5940
attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc 6000
tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc 6060
acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc 6120
agttcattca gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct 6180
gacagccgga acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg 6240
aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg 6300
cgaaacgatc ctcatcctgt ctcttgatca gatcttgatc ccctgcgcca tcagatcctt 6360
ggcggcaaga aagccatcca gtttactttg cagggcttcc caaccttacc agagggcgcc 6420
ccagctggca attccgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 6480
aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcac 6510

Claims (9)

1. 振荡型基因表达调控质粒pOSC，其特征在于，通过在载体pTD103基础上删除多余的启动子PluxR和基因LuxR，并且在启动子PluxI上游反向插入启动子Ptet得到，由此形成启动子Ptet及启动子PluxI启动的两条代谢调控通路；所述的启动子Ptet启动的代谢调控通路包含启动子Ptet、应答调节因子基因LuxR；所述的启动子PluxI启动的代谢调控通路包含启动子PluxI、靶基因sfGFP、阻遏基因tetR、蛋白降解标签基因ssrA和调节基因LuxI；所述的应答调节因子基因LuxR、靶基因sfGFP、阻遏基因tetR、蛋白降解标签基因ssrA和调节基因LuxI的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3~7所示，所述的质粒pOSC的核苷酸序列如SEQ IDNO：26所示。
2. 合成鼠李糖脂的振荡型基因表达调控质粒pOSC-rh1AB，其特征在于，通过将权利要求1所述的振荡型基因表达调控质粒pOSC的靶位点上的标记基因sfGFP替换为表达鼠李糖脂的鼠李糖基转移酶基因rh1A和rh1B得到，所述的鼠李糖基转移酶基因rh1A和rh1B的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8~9所示，所述的质粒pOSC-rh1AB的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示。
3.根据权利要求1所述的振荡型基因表达调控质粒pOSC的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）以质粒pTD103为DNA模板，利用引物sfGFPFor、PtetRev扩增1Kb 的T1-sfGFP-PluxI-Ptet序列；
（2）用限制性内切酶EcoRI对质粒pTD103进行酶切，回收纯化酶切后的3.6Kb载体片段luxR-kan-ColE1-luxI；
（3）通过Gibson assembly将步骤(1)与步骤(2)中纯化回收的片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pTD-Ptet；
（4）以质粒pTD-Ptet为DNA模板，利用引物LuxRfor、gfpRev扩增片段，删除PluxR，利用Nhel对PCR扩增片段进行酶切，利用T4 连接酶进行连接，获得质粒pTD-ptet2；
（5）用HindIII和 KpnI对 pTD-Ptet2 进行双酶切，回收纯化3.4Kb载体片段luxI-colE1-kan-LuxR；
（6）以大肠杆菌XL1-Blue基因组DNA为模板，利用引物tetRFor、tetRRev扩增tetR基因片段，对tetR的PCR扩增产物用HindIII和KpnI双酶切；
（7）通过T4 连接酶将步骤(5)与步骤(6)中的酶切片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pTD-tetR；
（8）以质粒pTD-ptet2为DNA模板，利用引物gfpFor、gfpRev扩增sfGFP标记基因，用HindIII对sfGFP的PCR片段和pTD-tetR进行酶切；
（9）通过T4 连接酶将步骤(8)酶切片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pOSC；
所述的引物sfGFPFor、PtetRev、LuxRfor、gfpRev、tetRFor、tetRRev、gfpFor、gfpRev的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10~17所示。
4.根据权利要求2所述的合成鼠李糖脂的振荡型基因表达调控质粒pOSC-rh1AB的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA为模板，利用引物rhalABFor，rhalABRev扩增2.2Kb的鼠李糖基转移酶基因rh1AB；
（2）以振荡型基因表达质粒pOSC为模板，以pTD-tetFor1、pTD-tetRev1为引物扩增2.3Kb的tetR-LuxI-ColE1片段，以pTD-tetFor2、pTD-tetRev2为引物扩增2.0Kb的kanR-luxR-Ptet片段；
（3）通过Gibson assembly将步骤（1）和步骤（2）中纯化回收的三个片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pOSC-rh1AB；
所述的引物rhalABFor、rhalABRev、pTD-tetFor1、pTD-tetRev1、pTD-tetFor2、pTD-tetRev2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：18~23所示。
5.鼠李糖脂的大肠杆菌振荡型基因表达系统，其特征在于，通过将权利要求2所述的合成鼠李糖脂的振荡型基因表达调控质粒pOSC-rh1AB转入大肠杆菌中得到。
6.根据权利要求5所述的鼠李糖脂的大肠杆菌振荡型基因表达系统在生产鼠李糖脂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，具体方法包括以下步骤：
（1）将振荡型基因表达调控质粒pOSC-rh1AB转入大肠杆菌DH10B感受态细胞，筛选阳性克隆，得到由振荡型基因表达调控的高产鼠李糖脂大肠杆菌DH10B/pOSC-rh1AB；
（2）将步骤(1)得到的大肠杆菌接入LB液体培养基中培养，得到预培养的工程菌菌液；
（3）按1%-10%的体积比将预培养的工程菌菌液接入发酵培养基进行培养，得到含有鼠李糖脂的发酵液。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，培养条件为：37℃，220rpm，12~36h。
9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，发酵培养基组成为：酵母提取物10g/L ，胰蛋白胨20 g/L，NaCl 10 g/L，甘油3%，葡萄糖20~30 g/L。
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