CN106222165A - 一种长片段和复杂片段dna的高效体外合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法，通过先用引物合成一级片段，再进行二级片段组装，最后组装成最终的DNA序列。本方法合成的DNA片段具有合成质量稳定，不受DNA复杂性和GC含量干扰，能够合成超长的DNA片段，稳定合成30kb以内的DNA片段，满足了现代分子实验的需求。

Description

一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法

技术领域

本发明涉及一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法。

背景技术

DNA体外人工合成是目前生物科研和应用经常遇到的实验，一般委托专门的生物公司进行合成，目前应用最广的合成方法是通过设计多条overlap的引物通过退火扩增的方式，然后进行pcr扩增，获得全长的DNA。另外一中方案通过芯片的技术进行高通量DNA合成，虽然可以大规模低成本的合成DNA，但是合成长度较短。对于长链复杂DNA的合成，以及长链DNA合成目前仍然是此领域的难题，需要耗费大量的精力和时间，合成周期没有保障，甚至合成失败。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在提出了一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法，该方法先用引物合成一级片段，再合成二级片段，最终组装成全长片段。

一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法，通过先用引物合成一级片段，再进行二级片段组装，最后组装成最终的DNA序列。

具体步骤为：

1)DNA片段拆分；

a、二级片段拆分：二级片段长度限定小于等于<1200bp；对于大于1200bp的片段遵循计算公式：如果L/1200为整数则N2＝INT(L/1200)，否则N2＝INT(L/1200)+1；二级片段长度L2＝INT(L/N2)，第1到N2-1个二级片段长度为L2,第N2个二级片段长度为L-L2*(N2-1)；

b、一级片段拆分：将二级片段进一步平均拆分成长度为100-200bp的一级片段；如果L2/200为整数则N1＝INT(L2/200)，否则N1＝INT(L2/200)+1；一级片段长度L1＝INT(L2/N1)，第1到N1-1个一级片段长度为L1，第N1个一级片段长度为L2-L1*(N1-1)；

其中L为待合成DNA片段长度；L1为一级片段长度；L2为二级片段长度；N1为每个二级片段拆分成一级片段数量；N2为合成片段拆分成二级片段的数量，函数INT()取一个数的整数部位值。

2)一级片段合成：

一级片段合成是通过相互over lap的引物退火合成的，每条引物长度不超过59bp，根据每个一级片段的长度拆分成3-5条引物进行合成，因为一级片段比较短小，一般不超过200bp所以能够耐受高GC含量，并且有效拆分DNA复杂性，化繁为简；

3)一级片段组装：

一级片段末端设有TypeIIS酶切位点，酶切后产生的粘性末端与相邻的一级片段粘性末端互补，最两端的一级片段黏末端与BIOWALK载体系统供给载体产生的粘末端互补以便克隆到BIOWALK载体系统，进行二级片段的组装；一级片段组装通过typeIIS限制性内切酶，酶切连接技术将5-6个一级片段无缝的装载到BIOWALK供给载体；

4)二级片段组装：

二级片段组装采用BIOWALK技术的原理，采用逐个添加的方式，稳定的将二级片段一个个的克隆到接受载体完成最终片段的拼装。

优选地，二级片段组装采用先将二级片段交替装载到A类供给载体和B类供给载体上，然后轮流组装到接受载体上实现大片段的合成。

本发明产生的有益效果为：本发明一级片段组装式以无缝的形式进行酶切连接组装，所以完全不受DNA的复杂性和GC含量的影响，合成质量稳定；一级片段长度控制在100-200bp范围，因为一级片段较为短小所以最大程度的克服复杂片段DNA合成和高GC含量的DNA合成的困难，能够合成超长的DNA片 段，稳定合成30kb以内的DNA片段，满足了现代分子实验的需求。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：一个10221bp的DNA合成

第一步，将整个片段拆分成二级片段

根据总序列的长度DNA片段将被拆分成9段，每段约1136bp。

SegB1：

1-tagaatagca tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg-60

61-ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg-120

121-gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaattgacgcttaga-180

181-caacttaata acacattgcg gacgttttta atgttagact gaattaacgccgaattaatt-240

241-cgggggatct ggattttagt actggatttt ggttttagga attagaaattttattgatag-300

301-aagtatttta caaatacaaa tacatactaa gggtttctta tatgctcaacacatgagcga-360

361-aaccctatag gaaccctaat tcccttatct gggaactact cacacattattatggagaaa-420

421-ctcgagcttg tcgatcgaca gatccggtcg gcatctactc tatttctttgccctcggacg-480

481-agtgctgggg cgtcggtttc cactatcggc gagtacttct acacagccatcggtccagac-540

541-ggccgcgctt ctgcgggcga tttgtgtacg cccgacagtc ccggctccggatcggacgat-600

601-tgcgtcgcat cgaccctgcg cccaagctgc atcatcgaaa ttgccgtcaaccaagctctg-660

661-atagagttgg tcaagaccaa tgcggagcat atacgcccgg agtcgtggcgatcctgcaag-720

721-ctccggatgc ctccgctcga agtagcgcgt ctgctgctcc atacaagccaaccacggcct-780

781-ccagaagaag atgttggcga cctcgtattg ggaatccccg aacatcgcctcgctccagtc-840

841-aatgaccgct gttatgcggc cattgtccgt caggacattg ttggagccgaaatccgcgtg-900

901-cacgaggtgc cggacttcgg ggcagtcctc ggcccaaagc atcagctcatcgagagcctg-960

961-cgcgacggac gcactgacgg tgtcgtccat cacagtttgc cagtgatacacatggggatc-1020

1021-agcaatcgcg catatgaaat cacgccatgt agtgtattga ccgattccttgcggtccgaa-1080

1081-tgggccgaac ccgctcgtct ggctaagatc ggccgcagcg atcgcatcca tagcct

SegB2：

ccgc-1140

1141-gaccggttgt agaacagcgg gcagttcggt ttcaggcagg tcttgcaacgtgacaccctg-1200

1201-tgcacggcgg gagatgcaat aggtcaggct ctcgctaaac tccccaatgtcaagcacttc-1260

1261-cggaatcggg agcgcggccg atgcaaagtg ccgataaaca taacgatctttgtagaaacc-1320

1321-atcggcgcag ctatttaccc gcaggacata tccacgccct cctacatcgaagctgaaagc-1380

1381-acgagattct tcgccctccg agagctgcat caggtcggag acactgtcgaacttttcgat-1440

1441-cagaaacttc tcgacagacg tcgcggtgag ttcaggcttt ttcatatctcattgcccccc-1500

1501-cggatctgcg aaagctcgag agagatagat ttgtagagag agactggtgatttcagcgtg-1560

1561-tcctctccaa atgaaatgaa cttccttata tagaggaagg tcttgcgaaggatagtggga-1620

1621-ttgtgcgtca tcccttacgt cagtggagat atcacatcaa tccacttgctttgaagacgt-1680

1681-ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccatctttgggacc-1740

1741-actgtcggca gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgatggcatttgta-1800

1801-ggtgccacct tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctgggcaatggaa-1860

1861-tccgaggagg tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccctttggtcttc-1920

1921-tgagactgta tctttgatat tcttggagta gacgagagtg tcgtgctccaccatgttatc-1980

1981-acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttccacgatgctcct-2040

2041-cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaacgatagcctt-2100

2101-tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc ttttctactgtccttttgat-2160

2161-gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatattaccctttgttg-2220

2221-aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga gactgtatct ttgatattct tg

SegB3：

gagtagac-2280

2281-gagagtgtcg tgctccacca tgttggcaag ctgctctagc caatacgcaaaccgcctgca-2340

2341-ggtctagaca tggagtcaaa gattcaaata gaggacctaa cagaactcgccgtaaagact-2400

2401-ggcgaacagt tcatacagag tctcttacga ctcaatgaca agaagaaaatcttcgtcaac-2460

2461-atggtggagc acgacacact tgtctactcc aaaaatatca aagatacagtctcagaagac-2520

2521-caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcctcggattccat-2580

2581-tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtggctcctacaaa-2640

2641-tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg cctctgccgacagtggtccc-2700

2701-aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttccaaccacgtct-2760

2761-tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgcacaatcccac-2820

2821-tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttggagagaacacgg-2880

2881-gggactttgc aacatgagca tgctgttcta cactttgatt actgcttttcttattgggat-2940

2941-ccaggccgag cctcactctg aatccaacgt tcctgctggc catacaatcccacaagttca-3000

3001-ttggactaaa cttcagcatt ctctcgacac cgccttgcgc cgcgccagatctgctcctgc-3060

3061-tgctgctatt gctgctagag tagcaggaca aacaaggaac ataaccgtcgacccgcggct-3120

3121-ttttaagaag aggaggctga gatctcccag ggttcttttc tcaacacagccgccgcggga-3180

3181-ggcggcggat actcaagatc ttgatttcga ggtggggggt gctgctccttttaaccgcac-3240

3241-acaccgctcc aagaggtcat ccagccatcc aattttccac cgcggcgagttctcagtttg-3300

3301-tgattcagtt tctgtttggg ttggagataa aacaactgct actgatatcaaagggaagga-3360

3361-ggtcatggtt cttggcgagg tgaacattaa taactctgtt tttaaaca

SegB4：

at atttcttcga-3420

3421-gactaagtgc cgcgacccaa atccagtgga ttcaggctgc cgcgggatcgacagcaagca-3480

3481-ttggaacagc tactgcacca ccacacatac atttgttaaa gctcttactatggatggtaa-3540

3541-gcaggctgct tggaggttca tcaggatcga caccgcctgc gtgtgcgtcctttccaggaa-3600

3601-ggctgttcgt cgtgcttgta tcgtgaaggg cgaggaactc ttcaccggcgtggtgccgat-3660

3661-cctcgtggag ctcgacggcg acgtgaacgg ccacaagttc tccgtgtccggcgagggcga-3720

3721-gggcgacgcc acctacggca agctcaccct caagttcatc tgcaccaccggcaagctccc-3780

3781-ggtgccgtgg ccgaccctcg tgaccacctt ctcctacggc gtgcagtgcttctcccgcta-3840

3841-cccggaccac atgaagcgcc acgacttctt caagtccgcc atgccggagggctacgtgca-3900

3901-ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccgaggtgaagtt-3960

3961-cgagggcgac accctcgtga accgcatcga gctcaagggc atcgacttcaaggaggacgg-4020

4021-caacatcctc ggccacaagc tcgagtacaa ctacaactcc cacaacgtgtacatcatggc-4080

4081-cgacaagcag aagaacggca tcaaggccaa cttcaagacc cgccacaacatcgaggacgg-4140

4141-cggcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccg atcggcgacggcccggtgct-4200

4201-cctcccggac aaccactacc tctccaccca gagcgccctc tccaaggacccgaacgagaa-4260

4261-gcgcgaccac atggtgctcc tcgagttcgt gaccgccgcc ggcatcacccacggcatgga-4320

4321-cgagctctac aactgatgca ggtgagagca cctcacctgc aaaatgtaactagctctgtc-4380

4381-ttcagtactg ggcccgaaga ctgaccagct cgaatttccc cgatcgttcaaacatttggc-4440

4441-aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatcatataatttc-4500

4501-tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catg

SegB5：

acgtta tttatgagat-4560

4561-gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaaaacaaaatat-4620

4621-agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttactagatcgggcca-4680

4681-tccgcactgt agcggatggc ctaaaaaaaa aactagaaga gacgagtctgagactcagcg-4740

4741-tctcggtcgc agtcataact tcgtatagca tacattatac gaagttatgggccgcattac-4800

4801-cctgttatcc ctaggccgca taacttcgta tagcctacat tataggatggagggatatcc-4860

4861-tctcttaagg tagcgagcaa gctctaagag gagtgtcgac aagcttggcactggccgtcg-4920

4921-ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgccttgcagcac-4980

4981-atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgcccttcccaac-5040

5041-agttgcgcag cctgaatggc gaatgctaga gcagcttgag cttggatcagattgtcgttt-5100

5101-cccgccttca gtttaaacta tcagtgtttg acaggatata ttggcgggtaaacctaagag-5160

5161-aaaagagcgt ttattagaat aacggatatt taaaagggcg tgaaaaggtttatccgttcg-5220

5221-tccatttgta tgtgcatgcc aaccacaggg ttcccctcgg gatcaaagtactttgatcca-5280

5281-acccctccgc tgctatagtg cagtcggctt ctgacgttca gtgcaggagatgatcgcggc-5340

5341-cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcatgt ctcaaccgtg cggctgcatgaaatcctggc-5400

5401-cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc ttggccgctgaagaaaccga-5460

5461-gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac agcttgcgtcatgcggtcgc-5520

5521-tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag gggaacgcatgaaggttatc-5580

5581-gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca tcgcaacccatctagcccgc-5640

5641-gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt

SegB6：

ccgatcccca gggcagtgcc-5700

5701-cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg ttgtcggcatcgaccgcccg-5760

5761-acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact tcgtagtgatcgacggagcg-5820

5821-ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag ccgacttcgtgctgattccg-5880

5881-gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc tggtggagctggttaagcag-5940

5941-cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg tcgtgtcgcgggcgatcaaa-6000

6001-ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg ggtacgagctgcccattctt-6060

6061-gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg ccgccgccggcacaaccgtt-6120

6121-cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc cgcgaggtcc aggcgctggccgctgaaatt-6180

6181-aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat gagcaaaagcacaaacacgc-6240

6241-taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca gcaaggctgc aacgttggccagcctggcag-6300

6301-acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc agttgccggc ggaggatcacaccaagctga-6360

6361-agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca ttaccgagct gctatctgaatacatcgcgc-6420

6421-agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa atgagtagat gaattttagcggctaaagga-6480

6481-ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc accgacgccg tggaatgccccatgtgtgga-6540

6541-ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc tgggttgtct gccggccctgcaatggcact-6600

6601-ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga cggtcgcaaa ccatccggcccggtacaaat-6660

6661-cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag gccgcgcaggccgcccagcg-6720

6721-gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg caagcggccgctgatcgaat-6780

6781-ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgc

SegB7：

gccg tcgattagga agccgcccaa-6840

6841-gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat gacgtgggcacccgcgatag-6900

6901-tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag cgtgaccgacgagctggcga-6960

6961-ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt tccgcagggccggccggcat-7020

7021-ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt tcccatctaaccgaatccat-7080

7081-gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc gtgttccgtccacacgttgc-7140

7141-ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag cagaaagacgacctggtaga-7200

7201-aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag cgtacgaagaaggccaagaa-7260

7261-cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt agccgctacaagatcgtaaa-7320

7321-gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta gctgattggatgtaccgcga-7380

7381-gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac cccgattactttttgatcga-7440

7441-tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc gccgcaggcaaggcagaagc-7500

7501-cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc gccggagagttcaagaagtt-7560

7561-ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg ccggagtacgatttgaagga-7620

7621-ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac cgcaacctgatcgagggcga-7680

7681-agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg caaattgccctagcagggga-7740

7741-aaaaggtcga aaagatctct ttcctgtgga tagcacgtac attgggaacccaaagccgta-7800

7801-cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg tacattgggaaccggtcaca-7860

7861-catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt tccgcctaaaactctttaaa-7920

7921-acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ct

SegB8：

gtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc-7980

7981-cgaagctccc ggatacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagcagacaagccc-8040

8041-gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacccagtcacgta-8100

8101-gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattgtactgagagt-8160

8161-gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaataccgcatcaggcg-8220

8221-ttcatccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgcggcgagcggt-8280

8281-atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggataacgcaggaaa-8340

8341-gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccgcgttgctggc-8400

8401-gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgctcaagtcagag-8460

8461-gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaagctccctcgt-8520

8521-gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttctcccttcggg-8580

8581-aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgtaggtcgttcg-8640

8641-ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcgccttatccgg-8700

8701-taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactggcagcagccac-8760

8761-tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttcttgaagtggtg-8820

8821-gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgctgaagccagt-8880

8881-taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccgctggtagcgg-8940

8941-tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctcaagaagatcc-9000

9001-tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgttaagggatttt-9060

9061-ggtcatgcat tctaggtact aaaacaat

SegB9：

tc atccagtaaa atataatatt ttattttctc-9120

9121-ccaatcaggc ttgatcccca gtaagtcaaa aaatagctcg acatactgttcttccccgat-9180

9181-atcctccctg atcgaccgga cgcagaaggc aatgtcatac cacttgtccgccctgccgct-9240

9241-tctcccaaga tcaataaagc cacttacttt gccatctttc acaaagatgttgctgtctcc-9300

9301-caggtcgccg tgggaaaaga caagttcctc ttcgggcttt tccgtctttaaaaaatcata-9360

9361-cagctcgcgc ggatctttaa atggagtgtc ctcttcccag ttttcgcaatccacatcggc-9420

9421-cagatcgtta ttcagtaagt aatccaattc ggctaagcgg ctgtctaagctattcgtata-9480

9481-gggacaatcc gatatgtcga tggagtgaaa gagcctgatg cactccgcatacagctcgat-9540

9541-aatcttttca gggctttgtt catcttcata ctcttccgag caaaggacgccatcggcctc-9600

9601-actcatgagc agattgctcc agccatcatg ccgttcaaag tgcaggacctttggaacagg-9660

9661-cagctttcct tccagccata gcatcatgtc cttttcccgt tccacatcataggtggtccc-9720

9721-tttataccgg ctgtccgtca tttttaaata taggttttca ttttctcccaccagcttata-9780

9781-taccttagca ggagacattc cttccgtatc ttttacgcag cggtatttttcgatcagttt-9840

9841-tttcaattcc ggtgatattc tcattttagc catttattat ttccttcctcttttctacag-9900

9901-tatttaaaga taccccaaga agctaattat aacaagacga actccaattcactgttcctt-9960

9961-gcattctaaa accttaaata ccagaaaaca gctttttcaa agttgttttcaaagttggcg-10020

10021-tataacatag tatcgacgga gccgattttg aaaccgcggt gatcacaggcagcaacgctc-10080

10081-tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttcaaacccggca-10140

10141-gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgccgccttacaa-10200

10201-cggctctccc gctgacgccg t

第二步，对二级片段进行拆分成一级片段：

以segB1为例，其他二级片段类似操作。

SegB1：

1-tagaatagca tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg-60

61-ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg-120

121-gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaattgacgcttaga-180

181-caacttaata acacattgcg gacgttttta atgttagact gaattaacgccgaattaatt-240

241-cgggggatct ggattttagt actggatttt ggttttagga attagaaattttattgatag-300

301-aagtatttta caaatacaaa tacatactaa gggtttctta tatgctcaacacatgagcga-360

361-aaccctatag gaaccctaat tcccttatct gggaactact cacacattattatggagaaa-420

421-ctcgagcttg tcgatcgaca gatccggtcg gcatctactc tatttctttgccctcggacg-480

481-agtgctgggg cgtcggtttc cactatcggc gagtacttct acacagccatcggtccagac-540

541-ggccgcgctt ctgcgggcga tttgtgtacg cccgacagtc ccggctccggatcggacgat-600

601-tgcgtcgcat cgaccctgcg cccaagctgc atcatcgaaa ttgccgtcaaccaagctctg-660

661-atagagttgg tcaagaccaa tgcggagcat atacgcccgg agtcgtggcgatcctgcaag-720

721-ctccggatgc ctccgctcga agtagcgcgt ctgctgctcc atacaagccaaccacggcct-780

781-ccagaagaag atgttggcga cctcgtattg ggaatccccg aacatcgcctcgctccagtc-840

841-aatgaccgct gttatgcggc cattgtccgt caggacattg ttggagccgaaatccgcgtg-900

901-cacgaggtgc cggacttcgg ggcagtcctc ggcccaaagc atcagctcatcgagagcctg-960

961-cgcgacggac gcactgacgg tgtcgtccat cacagtttgc cagtgatacacatggggatc-1020

1021-agcaatcgcg catatgaaat cacgccatgt agtgtattga ccgattccttgcggtccgaa-1080

1081-tgggccgaac ccgctcgtct ggctaagatc ggccgcagcg atcgcatcca tagcct

SegB1拆分成6个一级片段：

SegB11

Tagaatagcatcggtaacatgagcaaagtctgccgccttacaacggctctcccgctgacgccgtcccggactgatgggctgcctgtatcgagtggtgattttgtgccgagctgccggtcggggagctgttggctggctggtggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaata

SegB12

Acacattgcggacgtttttaatgttagactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaat

SegB13

Tcccttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgagcttgtcgatcgacagatccggtcggcatctactctatttctttgccctcggacgagtgctggggcgtcggtttccactatcggcgagtacttctacacagccatcggtccagacggccgcgcttctgcgggcgatttgtgtacg

SegB14

Cccgacagtcccggctccggatcggacgattgcgtcgcatcgaccctgcgcccaagctgcatcatcgaaattgccgtcaaccaagctctgatagagttggtcaagaccaatgcggagcatatacgcccggagtcgtggcgatcctgcaagctccggatgcctccgctcgaagtagcgcgtctgctgctcc

SegB15

Atacaagccaaccacggcctccagaagaagatgttggcgacctcgtattgggaatccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggccattgtccgtcaggacattgttggagccgaaatccgcgtgcacgaggtgccggacttcggggcagtcctcggcccaaagcatcagctcat

SegB16

Cgagagcctgcgcgacggacgcactgacggtgtcgtccatcacagtttgccagtgatacacatggggatcagcaatcgcgcatatgaaatcacgccatgtagtgtattgaccgattccttgcggtccgaatgggccgaacccgctcgtctggctaagatcggccgcagcgatcgcatccatagcct

第三步，对一级片段进行引物设计(以segB1为例，其他片段同样操作)

1:segB11引物＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

segB11(+):cgatGGTCTCaCTCATAGAtagaatagcatcggtaacatgagcaaagtctgccgcctta

segB11(m+):agtctgccgccttacaacggctctcccgctgacgccgtcccggactgatgggctgcctg

segB11(m):ccggactgatgggctgcctgtatcgagtggtgattttgtgccgagctgccggtcgggga

segB11(m-):tacaccacaatatatcctgccaccagccagccaacagctccccgaccggcagctcggca

segB11(-):cgatGGTCTCatattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcct

2:segB12引物＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

segB12(+):cgatGGTCTCaaataacacattgcggacgtttttaatgttagactgaattaacgccgaa

segB12(m+):gactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttt

segB12(m):ttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaa

segB12(m-):gtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatacttctatcaa

segB12(-):cgatGGTCTCaattagggttcctatagggtttcgctcatgtgttgagcatataagaa

3:segB13引物＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

segB13(+):cgatGGTCTCataattcccttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcg

segB13(m+):ttattatggagaaactcgagcttgtcgatcgacagatccggtcggcatctactctattt

segB13(m):ggtcggcatctactctatttctttgccctcggacgagtgctggggcgtcggtttccact

segB13(m-):ccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagc

segB13(-):cgatGGTCTCacgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggct

4:segB14引物＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

segB14(+):cgatGGTCTCatacgcccgacagtcccggctccggatcggacgattgcgtcgcatcgac

segB14(m+):cgattgcgtcgcatcgaccctgcgcccaagctgcatcatcgaaattgccgtcaaccaag

segB14(m):cgaaattgccgtcaaccaagctctgatagagttggtcaagaccaatgcggagcatatac

segB14(m-):aggcatccggagcttgcaggatcgccacgactccgggcgtatatgctccgcattggtct

segB14(-):cgatGGTCTCaggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgca

5:segB15引物＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

segB15(+):cgatGGTCTCactccatacaagccaaccacggcctccagaagaagatgttggcgacctc

segB15(m+):gaagatgttggcgacctcgtattgggaatccccgaacatcgcctcgctccagtcaatga

segB15(m):cgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggccattgtccgtcaggacattgttgg

segB15(m-):ccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggaca

segB15(-):cgatGGTCTCaatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacct

6:segB16引物＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

segB16(+):cgatGGTCTCatcatcgagagcctgcgcgacggacgcactgacggtgtcgtccatcaca

segB16(m+):tgacggtgtcgtccatcacagtttgccagtgatacacatggggatcagcaatcgcgcat

segB16(m):ggggatcagcaatcgcgcatatgaaatcacgccatgtagtgtattgaccgattccttgc

segB16(m-):gatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacac

segB16(-):cagtGGTCTCattccaggctatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagc

第四歩，一级片段合成，以segB11为例：

采用引物退火pcr扩增的方式进行，因为片段均比较短所以可以轻松的合成高GC含量和拆分复杂结构。

|+＝+＝+＝+＝+＝+

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝PCR system＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝[2016/8/2]

做6个50ul体系的PCR反应:

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝The PCR system&cycles＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

Total:50ul

Sum:6

H2O:32 192ul

buffer:5 30ul

Mg2+:4 24ul

dNTP:2 12ul

P+:2 ul

PM+:1ul

PM:1ul

PM-:1ul

P-:2ul

taq:2 12U

-----------pcr cycle-------------

94℃for 5 min

+++++++++++30 cycles

94℃for 30 sec

50℃for 45 sec

72℃for 20 sec

+++++++++++++

72℃for 10min

16℃for 30min

将： 194bp,190bp,190bp,190bp,190bp,186bp,bp的电泳片段切下，溶胶回收,回收程序见具体厂家的试剂盒说明书,用总体积30ul的水溶解回收DNA(回收产物标记为：rDNAssssss6)，检测无误后与载体进行连接。

＝＝＝＝＝＝＝＝酶切连接＝＝＝＝＝＝＝＝＝[2016/8/2]

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝The Digesting-link Protocal＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

total:20ul

Sum:1

H2O:8 8ul

Buffer:2 2ul

BsaI/Eco31I:1 1ul

T4_ligase:1 1ul

pBWD(LA):4 4ul

rDNAssssss6:4 4ul

--------The Digest-Link(DL)procedure--------

37℃for 20 min

++++++++5 cycles

37℃ for 10 min

20℃ for 10min

++++++++

37℃ for 20 min

80℃ for 5 min

Remark field:

将连接产物转化感受态

＝＝＝＝＝＝＝＝＝转化＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝[2016/8/2]

将5-10ul连接产物转化大肠杆菌感受态(见大肠杆菌感受态转化标准方法)

转化涂chlR抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑pcr鉴定。

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝菌斑PCR鉴定＝＝＝＝＝＝＝＝[2016/8/3]

挑取10个菌斑同时进行1.5mlEP管接菌和PCR鉴定,引物：pBWD(LA)鉴定引物BR1-F,BR1-R.

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝PCR system＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝[2016/8/3]

做10个25ul体系的PCR反应:

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝The PCR system&cycles＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

Total:25ul

Sum:10

H2O:16.5 165ul

buffer:2.5 25ul

Mg2+:2 20ul

dNTP:1 10ul

BR1-F:1 10ul

BR1-R:1 10ul

taq:1 10U

Template:1ul

-----------pcr cycle-------------

94℃for 5 min

+++++++++++30 cycles

94℃for 30 sec

50℃for 45 sec

72℃for 11 sec

+++++++++++++

72℃for 10min

16℃for 30min

目标条带为1187bp左右的片段。取1-3个阳性条带对应的菌液，取100ul送 样测序，其余400ul菌液接种到含有5-10mlchlR抗性LB中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒做后续实验，命名为pBWD(LA)-segB1。

用同样的方合成引物并构建pBWD(LA)-segB1,pBWD(LB)-segB2,pBWD(LA)-segB3,pBWD(LB)-segB4,pBWD(LA)-segB5,pBWD(LB)-segB6,pBWD(LA)-segB7,pBWD(LB)-segB8,pBWD(LA)-segB9。

进五步用BIOWALK技术组装二级片段得到最终合成的DNA.

A轮反应：pBWA(I)进行biowalk反应程序如下

###############[pBWA(I)-segB1]载体构建流程如下###############

＝＝＝＝＝＝＝＝酶切连接＝＝＝＝＝＝＝＝＝

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝The Digesting-link Protocal＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

total:20ul

Sum:1

H2O:8 8ul

Buffer:2 2ul

BsmBI/Esp3I:1 1ul

T4_ligase:1 1ul

pBWA(I):4 4ul

pBWD(LA)-segB1:4 4ul

--------The Digest-Link(DL)procedure--------

37℃for 20 min

++++++++5 cycles

37℃for 10 min

20℃for 10min

++++++++

37℃for 20 min

80℃for 5 min

将连接产物转化感受态

＝＝＝＝＝＝＝＝＝转化＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

将5-10ul连接产物转化大肠杆菌感受态(见大肠杆菌感受态转化标准方法)

转化涂(卡纳霉素)抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑pcr或酶切鉴定和测序，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒(质粒命名为：pBWA(I)-segB1)。

B轮反应：

###############[pBWA(I)-segB1-2]载体构建流程如下###############

＝＝＝＝＝＝＝＝酶切连接＝＝＝＝＝＝＝＝＝[2016/8/1]

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝The Digesting-link Protocal＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

total:20ul

Sum:1

H2O:8 8ul

Buffer:2 2ul

SapI/LguI:1 1ul

T4_ligase:1 1ul

pBWA(I)-segB1:4 4ul

pBWD(LB)-segB2:4 4ul

--------The Digest-Link(DL)procedure--------

37℃for 20 min

++++++++5 cycles

37℃for 10 min

20℃for 10min

++++++++

37℃for 20 min

80℃for 5 min

将连接产物转化感受态

＝＝＝＝＝＝＝＝＝转化＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝[2016/8/1]

将5-10ul连接产物转化大肠杆菌感受态(见大肠杆菌感受态转化标准方法)

转化涂(卡纳霉素)抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑pcr或酶切鉴定和测序，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒(质粒命名为：pBWA(I)-segB1-2)。

重复A轮B轮反应最终得到pBWA(I)-segB1-9)。

Claims (3)

1.一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法，其特征在于，通过先用引物合成一级片段，再进行二级片段组装，最后组装成最终的DNA序列。

2.如权利要求1所述的一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法，其特征在于，具体步骤为：

1)DNA片段拆分；

a、二级片段拆分：二级片段长度限定小于等于<1200bp；对于大于1200bp的片段遵循计算公式：如果L/1200为整数则N2＝INT(L/1200)，否则N2＝INT(L/1200)+1；二级片段长度L2＝INT(L/N2)，第1到N2-1个二级片段长度为L2,第N2个二级片段长度为L-L2*(N2-1)；

b、一级片段拆分：将二级片段进一步平均拆分成长度为100-200bp的一级片段；如果L2/200为整数则N1＝INT(L2/200)，否则N1＝INT(L2/200)+1；一级片段长度L1＝INT(L2/N1)，第1到N1-1个一级片段长度为L1，第N1个一级片段长度为L2-L1*(N1-1)；

其中L为待合成DNA片段长度；L1为一级片段长度；L2为二级片段长度；N1为每个二级片段拆分成一级片段数量；N2为合成片段拆分成二级片段的数量，函数INT()取一个数的整数部位值。

2)一级片段合成：

一级片段合成是通过相互over lap的引物退火合成的，每条引物长度不超过59bp，根据每个一级片段的长度拆分成3-5条引物进行合成，因为一级片段比较短小，一般不超过200bp所以能够耐受高GC含量，并且有效拆分DNA复杂性，化繁为简；

3)一级片段组装：

一级片段末端设有TypeIIS酶切位点，酶切后产生的粘性末端与相邻的一级片段粘性末端互补，最两端的一级片段黏末端与BIOWALK载体系统供给载体产生的粘末端互补以便克隆到BIOWALK载体系统，进行二级片段的组装；一级片段组装通过typeIIS限制性内切酶，酶切连接技术将5-6个一级片段无缝的装载到BIOWALK供给载体；

4)二级片段组装：

二级片段组装采用BIOWALK技术的原理，采用逐个添加的方式，稳定的将二级片段一个个的克隆到接受载体完成最终片段的拼装。

3.如权利要求2所述的一种长片段和复杂片段DNA的高效体外合成方法，其特征在于，二级片段组装采用先将二级片段交替装载到A类供给载体和B类供给载体上，然后轮流组装到接受载体上实现大片段的合成。