CN112011563A - 一种基于ai-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于AI‑2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用。所述自诱导表达载体使用的启动子为可受大肠杆菌自身的AI‑2群体感应系统激活的LsrR启动子，在大肠杆菌生长到对数生长期时可被细菌自己产生的AI‑2信号分子激活自动启动目的基因的表达。所述LsrR的启动子序列如SEQIDNO.1所示。本发明提供了所述新型表达载体的构建方法以及其在蛋白表达中的应用。与需IPTG诱导的pET表达载体相比，本发明引入LsrR启动子所构建的自诱导pXWZ‑1表达载体具有无需添加诱导剂、经济安全、蛋白表达量高、形成包涵体少且不需要低温诱导等优点。

Description

一种基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种自诱导启动子的克隆，及依托上述启动子的自诱导蛋白表达载体的构建与及其应用。

背景技术

传统的大肠杆菌蛋白表达系统需要选择合适的表达载体，才能促进蛋白的高效及高质量表达。虽然目前已存在很多蛋白表达载体，但是这些载体或多或少存在如下缺点：1、多拷贝数，强启动子；这就造成外源基因表达量高，胞内形成大量包涵体，从而抑制细胞本身的活力。同时相应关键酶的过量表达使产物的合成代谢通路在关键酶所在位置形成拥堵，影响宿主菌株本身活力。2、需IPTG诱导；一方面,IPTG价格较昂贵，诱导表达成本高，只适用于实验室规模的小量样品制备，应用于大规模发酵生产重组基因工程药物成本较高；另一方面，IPTG在后续的蛋白产品中很难完全去除，限制了其在生产食品医药类产品中的应用。。3、宿主菌的选择范围较窄。

为解决上述存在的实际问题，需要构建一种更加方便有效的蛋白表达载体。本发明构建的自诱导表达载体pXWZ-1，，以BL21(DE3)为宿主菌，通过可受大肠杆菌AI-2群体感应系统自动激活的LsrR启动子作为载体目的蛋白的启动子，应用于多种蛋白的表达。结果表明：与需IPTG诱导的pET系统相比，该自诱导载体pXWZ-1表达系统具有无需添加诱导剂、蛋白表达量高、形成包涵体少且不需要低温诱导等优点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一个高效表达外源基因的自诱导质粒载体pXWZ-1及其应用。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明构建的自诱导表达载体pXWZ-1，是以pET28(a)+质粒为框架改造，通过连接插入AI-2群体感应受体蛋白LsrR启动子，所述启动子序列如：SEQIDNO.1所示。

一种基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)PCR扩增如SEQIDNO.1所示的LsrR启动子核苷酸序列。合成带有酶切位点的引物，并在此引物的引导下，以包含核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的LsrR启动子为模板进行PCR扩增，得到带有酶切位点的核苷酸序列；

(2)将pET28(a)+质粒以及上述PCR扩增得到的产物分别进行酶切并回收酶切后片段，用DNA连接酶连接回收片段，并用于转化大肠杆菌；

(3)将转化后的大肠杆菌平涂于含有50μg/mL卡那霉素LB固体培养基上培养。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，并提取质粒进行双酶切验证，后将PCR检测与酶切验证正确的样品进行测序。将测序结果正确的质粒命名为pXWZ-1。构建方法如附图1，pXWZ-1载体的序列如SEQIDNO.2所示。

本发明所述的基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体pXWZ-1在表达蛋白中的应用。

本发明所述的基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体pXWZ-1在构建表达外源蛋白的大肠杆菌基因工程菌中的应用。

作为本发明的一种优选，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

作为本发明的进一步优选，将需要表达的外源蛋白编码基因插入所述的表达载体pXWZ-1中，构建外源蛋白表达载体；再将构建成功的外源蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达外源蛋白的基因工程菌；培养该基因工程菌，表达外源蛋白，在培养过程中无需加入诱导剂诱导。

为对构建的表达载体进行评价，采用的技术方案为：

使用上述构建表达载体pXWZ-1-GFPuv、pXWZ-1-LacZ，用于表达绿色荧光蛋白及β-半乳糖苷酶等。

评价检测绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶的表达包括如下步骤：将重组质粒pXWZ-1-GFPuv、pXWZ-1-LacZ转化至大肠杆菌BL21(DE3)。利用荧光显微镜及酶标仪实时监测绿色荧光强度，以2-硝基苯基-β-D吡喃半乳糖苷(ONPG)为底物检测β-半乳糖苷酶的酶活。

有益效果：

本发明提供的表达载体具有蛋白表达量高、形成包涵体少且不需要低温诱导等优点，应用该质粒表达绿色荧光蛋白及β-半乳糖苷酶的量优于pET系统。

附图说明

图1载体pXWZ-1的物理图谱

图2表达载体pET28a-GFPuv、pXWZ-1-GFPuv的物理图谱

图3荧光显微镜和紫外观察GFPuv在大肠杆菌中的实时表达

a代表紫外灯照射下的绿色荧光照片。b、c、d分别代表三中菌体在荧光显微镜下的观察图片。图4酶标仪实时检测GFPuv的荧光强度

图5表达载体pET28a-LacZ、pXWZ-1-LacZ的物理图谱

图6β-半乳糖苷酶酶活测定,横坐标表示诱导时间

图7表达载体pET28a-QseB、pXWZ-1-QseB的物理图谱

图8pET与pXWZ-1系统在最佳诱导条件下破碎上清和沉淀对比

a:pXWZ-1-QseB表达破碎上清；b:pXWZ-1-QseB表达破碎沉淀；c:pET-28-QseB表达破碎上清；d:pET-28-QseB表达破碎沉淀.

图9pET与pXWZ-1系统表达的蛋白纯化后的对比结果

图A为pET28a-QseB纯化后的SDS-PAGE图，图B为pXWZ-1-QseB纯化后的SDS-PAGE图泳道1至泳道9中1、2、3泳道是经20mM、50mM、100mM咪唑洗脱后的SDS-PAGE结果；4、5、6泳道是经150mM咪唑洗脱后SDS-PAGE结果；7、8、9泳道是经250mM咪唑洗脱后的SDS-PAGE结果。4、5、6泳道均有一条特异性强且高纯度的蛋白条带，其分子量大小为25kDa，结果与预期一致。对比A、B可知，在37℃条件下，免诱导的pXWZ-1系统的蛋白表达量高于IPTG诱导的pET系统.

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明的技术方案进行详细描述。

实施例1载体pXWZ-1的构建

根据NCBI上报道的大肠杆菌lsrR启动子基因序列设计引物，以具有lsr操纵子的大肠杆菌模式菌MG1655基因组为模板。以plsrR-Xba I-f、plsrR-Xba I-r:为引物扩增lsrR启动子序列。

上游引物：plsrR-Xba I-f:5’-GCTCTAGAAATTCATTCTTCACTTTGAA-3’(下划线为XbaI的酶切位点,SEQIDNO.3)

下游引物：plsrR-Xba I-r:5’-GCTCTAGAATTTCCCCCGTTCAGTTTTG-3’(下划线为XbaI的酶切位点,SEQIDNO.4)

利用限制性内切酶Xba I分别酶切扩增得到的lsrR启动子片段和pET28(a)+质粒，37℃孵育2h进行琼脂糖凝胶电泳并进行凝胶回收，将回收得到DNA片段命名为A1、A2。将A1、A2混合于一定体系中，用DNA连接酶过夜连接，后进行转化。经PCR和酶切验证及测序验证正确载体命名为pXWZ-1。载体的物理图谱如附图1。

实施例2载体pET28a-GFPuv和pXWZ-1-GFPuv的构建

提取pGFPuv质粒，以pGFPuv质粒为模板，gfp-EcoR I-f、gfp-Hind III-r为引物，PCR扩增GFPuv片段，分别连接至载体pET28(a)+及pXWZ-1中，构建表达载体pET28a-GFPuv和pXWZ-1-GFPuv。

上游引物：gfp-EcoR I-f:5’-CCGGAATTCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3’(下划线为EcoR I的酶切位点)

下游引物：gfp-Hind III-r:5’-CCCAAGCTTTTATTTGTATAGTTCATCCA-3’(下划线为Hind III的酶切位点)

利用限制性内切酶EcoR I、Hind III分别酶切扩增得到的GFPuv片段、pET28(a)+质粒和pXWZ-1质粒，37℃孵育2h进行琼脂糖凝胶电泳并进行凝胶回收，将回收得到DNA片段分别命名为B1、B2、B3。分别将B1和B2，B1和B3混合于一定体系中，用连接酶过夜连接，后进行转化。经PCR和酶切验证及测序验证正确载体命名为pET28a-GFPuv和pXWZ-1-GFPuv。载体的物理图谱如附图2。

实施例3表达绿色荧光蛋白

1.工程菌的构建

将表达载体pET28a-GFPuv和pXWZ-1-GFPuv利用化学转化法分别化转至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上。于37℃培养箱内倒置过夜培养。挑选单一克隆菌落，进行PCR鉴定。

2.利用荧光显微镜监测GFPuv的荧光强度

将含有表达载体pET-GFPuv和pXWZ-1-GFPuv的BL21(DE3)菌液按照1:100(v/v)转接于100mL并含有50μg/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中。分别标记为①、②、③。其中①样品为BL21/pET28-GFPuv，②样品为加入终浓度为0.5mM IPTG诱导的BL21/pET28-GFPuv，③样品为BL21/pXWZ-1-GFPuv。于37℃，150rpm震荡培养至OD600＝0.3，在②中加入0.5mM IPTG，放置于37℃摇床继续培养。每隔2h各取1mL上述3组样品菌液离心，并用0.9％NaCl重悬洗涤菌体两次。在紫外凝胶成像仪及荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFPuv的表达情况，并拍照保存。荧光显微镜和紫外观察GFPuv在大肠杆菌中的实时表达结果如附图3。

3.利用多功能酶标仪监测GFPuv的荧光强度

培养步骤同上，每隔2h取1mL菌液，200μL每孔加入96孔酶标板中，设置5个平行。以LB空白培养基作阴性对照。设置激发光波长395nm、发射光波长509nm，利用多功能荧光酶标仪实时监测绿色荧光蛋白的荧光强度。该实验重复三次。酶标仪检测GFPuv的荧光强度结果如附图4。

本研究利用荧光显微镜与多功能酶标仪实时监测pET28(a)+表达载体与构建的自诱导pXWZ-1表达载体，GFPuv的荧光强度。结果显示在培养24h时pXWZ-1表达载体组的荧光强度高达32800，相较于IPTG诱导的pET28载体组提高了18％。无需添加任何诱导剂的pXWZ-1载体在相同条件下自诱导GFPuv的量显著增强。构建的自诱导表达载体与pET表达载体相比，蛋白表达量优于pET系列载体。

实施例4载体pET28a-LacZ和pXWZ-1-LacZ的构建

以大肠杆菌MG1655基因组为模板，lacZ-BamH I-f、lacZ-Hind III-r为引物，PCR扩增lacZ片段，分别连接至质粒载体pET28(a)+及pXWZ-1中，构建表达载体pET28a-LacZ和pXWZ-1-LacZ。

上游引物：lacZ-BamH I-f:5’-CGCGGATCCATGACCATGATTACGGATTC-3’(下划线为BamH I的酶切位点)

下游引物：lacZ-Hind III-r:5’-CCCAAGCTTTTATTTTTGACACCAGACCA-3’(下划线为Hind III的酶切位点)

利用限制性内切酶BamH I、Hind III分别酶切扩增得到的lacZ片段、pET28(a)+质粒及pXWZ-1质粒，37℃孵育2h进行琼脂糖凝胶电泳并进行凝胶回收，将回收得到DNA片段命名为C1、C2、C3。分别将C1和C2，C1和C3混合于一定体系中，用连接酶过夜连接，后进行转化，经PCR和酶切验证及测序验证正确载体命名为pET28a-LacZ和pXWZ-1-LacZ。载体的物理图谱如附图5。

实施例5表达β-半乳糖苷酶

1.工程菌的构建

将表达载体pET28a-LacZ和pXWZ-1-LacZ分别化转至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上。于37℃培养箱内倒置过夜培养,其中,BL21/pET28a-LacZ在OD600为0.5时，加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导,BL21/pXWZ-1-LacZ不加诱导。挑选单一克隆菌落，进行PCR鉴定。

2.β-半乳糖苷酶酶活测定

实验步骤参考《分子克隆实验指南》，测定结果如附图6。由图6可见，pXWZ-1-LacZ表达的β-半乳糖苷酶酶活远高于pET28a-LacZ加IPTG诱导表达的β-半乳糖苷酶酶活。

实施例6载体pET28a-QseB和pXWZ-1-QseB的构建

以大肠杆菌模式菌株MG1655基因组为模板，qseB-BamH I-f、qseB-Hind III-r为引物，PCR扩增qseB片段，分别连接至pET28(a)+及pXWZ-1中，构建表达载体pET28a-QseB和pXWZ-1-QseB。

上游引物：qseB-EcoR I-f:5’-CCGGAATTCATGGGAATTTTACTGATAGA-3’(下划线为EcoR I的酶切位点)

下游引物：qseB-Hind III-r:5’-CCCAAGCTTTCATTTCTCACCTAATG-3’(下划线为Hind III的酶切位点)

用EcoR I、Hind III分别酶切得到的lacZ片段、pET28(a)+质粒及pXWZ-1质粒，37℃孵育2h进行琼脂糖凝胶电泳并进行凝胶回收，将两回收得到DNA片段命名为D1、D2、D3。分别将D1和D2，D1和D3混合于一定体系中，用连接酶过夜连接，经PCR和酶切验证及测序验证正确载体命名为pET28a-QseB和pXWZ-1-QseB。载体的物理图谱如附图7。

实施例7QseB蛋白表达和纯化

1.工程菌的构建

将表达载体pET28a-QseB和pXWZ-1-QseB分别化转至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上。于37℃培养箱内倒置过夜培养。挑选单一克隆菌落，进行PCR鉴定。

2.蛋白纯化

为确定pET28a-QseB和pXWZ-1-QseB表达载体所表达蛋白以包涵体形式存在的比例，pXWZ-1-QseB不需要添加诱导剂，pET28a-QseB是在OD600＝0.5时加诱导剂，破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE，pET28(a)+与pXWZ-1表达载体在最佳诱导条件下破碎上清和沉淀对比如附图8。纯化后的对比结果如附图9。

本研究通过对比BL21/pET28-QseB和BL21/pXWZ-1-QseB的表达的SDS-PAGE结果表明自诱导表达载体上清中的可溶性蛋白含量显著提高，且表达过程中蛋白错误折叠少，降低了形成包涵体的风险。经蛋白质纯化后，蛋白浓度测定结果表明pXWZ-1-QseB表达载体在37℃即可实现目标蛋白的大量表达，经100mM洗脱后蛋白浓度高达0.43mg/mL，而pET28a-QseB载体组仅有0.19mg/mL，前者是后者的2.3倍。

表1 pET28-QseB系统表达QseB在3种咪唑洗脱浓度下的蛋白浓度

表2 pXWZ-1-QseB系统表达QseB在3种咪唑洗脱浓度下的蛋白浓度

本研究成功构建自诱导pXWZ-1蛋白表达载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，成功实现了对多种重组蛋白的表达。研究初步表明，pXWZ-1表达载体具有免IPTG诱导、蛋白表达量高、形成包涵体少、易纯化且不需要低温诱导等优点，为适用于大规模发酵生产重组蛋白的工业化需求提供了一个潜在的思路，具有广阔的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 248

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

atttcccccg ttcagttttg caggtgagtt ttgaacaaat gtatttctgc ttttaatttg 60

ttcataacct taggtggaca ttgcacatat ttccgacgaa tagatcacaa tttatgctat 120

tttgattttc acggttgcgt ttgttcatgc tcgtagagtc aaactgtggt tgccatcaca 180

gatataaatg agcaagaact gaacaattgc attaaagatt taaatatgtt caaagtgaag 240

aatgaatt 248

<210> 2

<211> 5614

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat gctagccata 240

tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct gctgcccatg 300

gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga atttcccccg ttcagttttg 360

caggtgagtt ttgaacaaat gtatttctgc ttttaatttg ttcataacct taggtggaca 420

ttgcacatat ttccgacgaa tagatcacaa tttatgctat tttgattttc acggttgcgt 480

ttgttcatgc tcgtagagtc aaactgtggt tgccatcaca gatataaatg agcaagaact 540

gaacaattgc attaaagatt taaatatgtt caaagtgaag aatgaattgg ggaattgtta 600

tccgctcaca attcccctat agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag atctcgatcc 660

tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac aggtgcggtt gctggcgcct 720

ctatatcgcc gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc 780

ttgtttcggc gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc 840

cttgcatgca ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg 900

cttcctaatg caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc 960

gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga 1020

atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg 1080

tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag 1140

cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac 1200

agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg 1260

tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag 1320

aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca 1380

gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct 1440

gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta 1500

ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc 1560

agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg 1620

gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact 1680

ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca 1740

ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt 1800

ccgggctgcg cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct 1860

catgttatat cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca 1920

gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc 1980

ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 2040

gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc 2100

agtgagcgca acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg 2160

atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc 2220

gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg 2280

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cttgcggtat tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc 2400

aaacgtttcg gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccccacg ggtgcgcatg 2460

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tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag 2640

tcagcgccct gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt 2700

ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg 2760

tcccgccgca tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt 2820

tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc 2880

atgaacagaa atccccctta cacggaggca tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt 2940

aacatggccc gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg 3000

gacgcggatg aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac 3060

cgcagctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 3120

gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 3180

tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga 3240

gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatat 3300

gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct 3360

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 3420

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 3480

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 3540

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 3600

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 3660

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 3720

ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 3780

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 3840

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 3900

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 3960

ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 4020

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 4080

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 4140

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caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg 4980

ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg 5040

ctcgatgagt ttttctaaga attaattcat gagcggatca tatttgaatg tatttagaaa 5100

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga aattgtaaac 5160

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<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctctagaaa ttcattcttc actttgaa 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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Claims (6)

1.一种基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体pXWZ-1，其特征在于：以pET28(a)+质粒为框架改造，通过连接插入AI-2群体感应受体蛋白LsrR启动子，所述启动子序列如：SEQIDNO.1所示。

2.权利要求1所述的自诱导蛋白表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)以含有lsrR启动子核苷酸序列的大肠杆菌基因组为模板，扩增得到带有酶切位点的lsrR启动子序列；

(2)利用限制性内切酶将pET28(a)+质粒和扩增出的lsrR启动子序列酶切回收，经DNA连接酶连接后转化大肠杆菌；

(3)利用pET28(a)+质粒中抗性基因筛选出阳性克隆，并进行菌落PCR验证，测序获得AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体pXWZ-1。

3.权利要求1所述的基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体pXWZ-1在表达蛋白中的应用。

4.权利要求1所述的基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体pXWZ-1在构建表达外源蛋白的大肠杆菌基因工程菌中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于将需要表达的外源蛋白编码基因插入到权利要求1所述的表达载体pXWZ-1中，构建外源蛋白表达载体；再将构建成功的外源蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达外源蛋白的基因工程菌；培养该基因工程菌，表达外源蛋白，在培养过程中无需加入诱导剂诱导。

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