CN112011563A - 一种基于ai-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用 - Google Patents

一种基于ai-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112011563A
CN112011563A CN202010962241.XA CN202010962241A CN112011563A CN 112011563 A CN112011563 A CN 112011563A CN 202010962241 A CN202010962241 A CN 202010962241A CN 112011563 A CN112011563 A CN 112011563A
Authority
CN
China
Prior art keywords
expression vector
pxwz
protein
self
protein expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010962241.XA
Other languages
English (en)
Inventor
薛挺
汪晖
汪瑾
王文辉
张丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Agricultural University AHAU
Original Assignee
Anhui Agricultural University AHAU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Agricultural University AHAU filed Critical Anhui Agricultural University AHAU
Priority to CN202010962241.XA priority Critical patent/CN112011563A/zh
Publication of CN112011563A publication Critical patent/CN112011563A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245Escherichia (G)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00Nucleic acids vectors
    • C12N2800/60Vectors containing traps for, e.g. exons, promoters

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于AI‑2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用。所述自诱导表达载体使用的启动子为可受大肠杆菌自身的AI‑2群体感应系统激活的LsrR启动子,在大肠杆菌生长到对数生长期时可被细菌自己产生的AI‑2信号分子激活自动启动目的基因的表达。所述LsrR的启动子序列如SEQIDNO.1所示。本发明提供了所述新型表达载体的构建方法以及其在蛋白表达中的应用。与需IPTG诱导的pET表达载体相比,本发明引入LsrR启动子所构建的自诱导pXWZ‑1表达载体具有无需添加诱导剂、经济安全、蛋白表达量高、形成包涵体少且不需要低温诱导等优点。

Description

一种基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,具体涉及一种自诱导启动子的克隆,及依托上述启动子的自诱导蛋白表达载体的构建与及其应用。
背景技术
传统的大肠杆菌蛋白表达系统需要选择合适的表达载体,才能促进蛋白的高效及高质量表达。虽然目前已存在很多蛋白表达载体,但是这些载体或多或少存在如下缺点:1、多拷贝数,强启动子;这就造成外源基因表达量高,胞内形成大量包涵体,从而抑制细胞本身的活力。同时相应关键酶的过量表达使产物的合成代谢通路在关键酶所在位置形成拥堵,影响宿主菌株本身活力。2、需IPTG诱导;一方面,IPTG价格较昂贵,诱导表达成本高,只适用于实验室规模的小量样品制备,应用于大规模发酵生产重组基因工程药物成本较高;另一方面,IPTG在后续的蛋白产品中很难完全去除,限制了其在生产食品医药类产品中的应用。。3、宿主菌的选择范围较窄。
为解决上述存在的实际问题,需要构建一种更加方便有效的蛋白表达载体。本发明构建的自诱导表达载体pXWZ-1,,以BL21(DE3)为宿主菌,通过可受大肠杆菌AI-2群体感应系统自动激活的LsrR启动子作为载体目的蛋白的启动子,应用于多种蛋白的表达。结果表明:与需IPTG诱导的pET系统相比,该自诱导载体pXWZ-1表达系统具有无需添加诱导剂、蛋白表达量高、形成包涵体少且不需要低温诱导等优点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一个高效表达外源基因的自诱导质粒载体pXWZ-1及其应用。
本发明通过以下技术方案实现:
本发明构建的自诱导表达载体pXWZ-1,是以pET28(a)+质粒为框架改造,通过连接插入AI-2群体感应受体蛋白LsrR启动子,所述启动子序列如:SEQIDNO.1所示。
一种基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体的构建方法,包括以下步骤:
(1)PCR扩增如SEQIDNO.1所示的LsrR启动子核苷酸序列。合成带有酶切位点的引物,并在此引物的引导下,以包含核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的LsrR启动子为模板进行PCR扩增,得到带有酶切位点的核苷酸序列;
(2)将pET28(a)+质粒以及上述PCR扩增得到的产物分别进行酶切并回收酶切后片段,用DNA连接酶连接回收片段,并用于转化大肠杆菌;
(3)将转化后的大肠杆菌平涂于含有50μg/mL卡那霉素LB固体培养基上培养。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定,并提取质粒进行双酶切验证,后将PCR检测与酶切验证正确的样品进行测序。将测序结果正确的质粒命名为pXWZ-1。构建方法如附图1,pXWZ-1载体的序列如SEQIDNO.2所示。
本发明所述的基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体pXWZ-1在表达蛋白中的应用。
本发明所述的基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体pXWZ-1在构建表达外源蛋白的大肠杆菌基因工程菌中的应用。
作为本发明的一种优选,所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
作为本发明的进一步优选,将需要表达的外源蛋白编码基因插入所述的表达载体pXWZ-1中,构建外源蛋白表达载体;再将构建成功的外源蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达外源蛋白的基因工程菌;培养该基因工程菌,表达外源蛋白,在培养过程中无需加入诱导剂诱导。
为对构建的表达载体进行评价,采用的技术方案为:
使用上述构建表达载体pXWZ-1-GFPuv、pXWZ-1-LacZ,用于表达绿色荧光蛋白及β-半乳糖苷酶等。
评价检测绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶的表达包括如下步骤:将重组质粒pXWZ-1-GFPuv、pXWZ-1-LacZ转化至大肠杆菌BL21(DE3)。利用荧光显微镜及酶标仪实时监测绿色荧光强度,以2-硝基苯基-β-D吡喃半乳糖苷(ONPG)为底物检测β-半乳糖苷酶的酶活。
有益效果:
本发明提供的表达载体具有蛋白表达量高、形成包涵体少且不需要低温诱导等优点,应用该质粒表达绿色荧光蛋白及β-半乳糖苷酶的量优于pET系统。
附图说明
图1载体pXWZ-1的物理图谱
图2表达载体pET28a-GFPuv、pXWZ-1-GFPuv的物理图谱
图3荧光显微镜和紫外观察GFPuv在大肠杆菌中的实时表达
a代表紫外灯照射下的绿色荧光照片。b、c、d分别代表三中菌体在荧光显微镜下的观察图片。图4酶标仪实时检测GFPuv的荧光强度
图5表达载体pET28a-LacZ、pXWZ-1-LacZ的物理图谱
图6β-半乳糖苷酶酶活测定,横坐标表示诱导时间
图7表达载体pET28a-QseB、pXWZ-1-QseB的物理图谱
图8pET与pXWZ-1系统在最佳诱导条件下破碎上清和沉淀对比
a:pXWZ-1-QseB表达破碎上清;b:pXWZ-1-QseB表达破碎沉淀;c:pET-28-QseB表达破碎上清;d:pET-28-QseB表达破碎沉淀.
图9pET与pXWZ-1系统表达的蛋白纯化后的对比结果
图A为pET28a-QseB纯化后的SDS-PAGE图,图B为pXWZ-1-QseB纯化后的SDS-PAGE图泳道1至泳道9中1、2、3泳道是经20mM、50mM、100mM咪唑洗脱后的SDS-PAGE结果;4、5、6泳道是经150mM咪唑洗脱后SDS-PAGE结果;7、8、9泳道是经250mM咪唑洗脱后的SDS-PAGE结果。4、5、6泳道均有一条特异性强且高纯度的蛋白条带,其分子量大小为25kDa,结果与预期一致。对比A、B可知,在37℃条件下,免诱导的pXWZ-1系统的蛋白表达量高于IPTG诱导的pET系统.
具体实施方式
下面结合附图和实例对本发明的技术方案进行详细描述。
实施例1载体pXWZ-1的构建
根据NCBI上报道的大肠杆菌lsrR启动子基因序列设计引物,以具有lsr操纵子的大肠杆菌模式菌MG1655基因组为模板。以plsrR-Xba I-f、plsrR-Xba I-r:为引物扩增lsrR启动子序列。
上游引物:plsrR-Xba I-f:5’-GCTCTAGAAATTCATTCTTCACTTTGAA-3’(下划线为XbaI的酶切位点,SEQIDNO.3)
下游引物:plsrR-Xba I-r:5’-GCTCTAGAATTTCCCCCGTTCAGTTTTG-3’(下划线为XbaI的酶切位点,SEQIDNO.4)
利用限制性内切酶Xba I分别酶切扩增得到的lsrR启动子片段和pET28(a)+质粒,37℃孵育2h进行琼脂糖凝胶电泳并进行凝胶回收,将回收得到DNA片段命名为A1、A2。将A1、A2混合于一定体系中,用DNA连接酶过夜连接,后进行转化。经PCR和酶切验证及测序验证正确载体命名为pXWZ-1。载体的物理图谱如附图1。
实施例2载体pET28a-GFPuv和pXWZ-1-GFPuv的构建
提取pGFPuv质粒,以pGFPuv质粒为模板,gfp-EcoR I-f、gfp-Hind III-r为引物,PCR扩增GFPuv片段,分别连接至载体pET28(a)+及pXWZ-1中,构建表达载体pET28a-GFPuv和pXWZ-1-GFPuv。
上游引物:gfp-EcoR I-f:5’-CCGGAATTCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3’(下划线为EcoR I的酶切位点)
下游引物:gfp-Hind III-r:5’-CCCAAGCTTTTATTTGTATAGTTCATCCA-3’(下划线为Hind III的酶切位点)
利用限制性内切酶EcoR I、Hind III分别酶切扩增得到的GFPuv片段、pET28(a)+质粒和pXWZ-1质粒,37℃孵育2h进行琼脂糖凝胶电泳并进行凝胶回收,将回收得到DNA片段分别命名为B1、B2、B3。分别将B1和B2,B1和B3混合于一定体系中,用连接酶过夜连接,后进行转化。经PCR和酶切验证及测序验证正确载体命名为pET28a-GFPuv和pXWZ-1-GFPuv。载体的物理图谱如附图2。
实施例3表达绿色荧光蛋白
1.工程菌的构建
将表达载体pET28a-GFPuv和pXWZ-1-GFPuv利用化学转化法分别化转至大肠杆菌BL21(DE3)中,涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上。于37℃培养箱内倒置过夜培养。挑选单一克隆菌落,进行PCR鉴定。
2.利用荧光显微镜监测GFPuv的荧光强度
将含有表达载体pET-GFPuv和pXWZ-1-GFPuv的BL21(DE3)菌液按照1:100(v/v)转接于100mL并含有50μg/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中。分别标记为①、②、③。其中①样品为BL21/pET28-GFPuv,②样品为加入终浓度为0.5mM IPTG诱导的BL21/pET28-GFPuv,③样品为BL21/pXWZ-1-GFPuv。于37℃,150rpm震荡培养至OD600=0.3,在②中加入0.5mM IPTG,放置于37℃摇床继续培养。每隔2h各取1mL上述3组样品菌液离心,并用0.9%NaCl重悬洗涤菌体两次。在紫外凝胶成像仪及荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFPuv的表达情况,并拍照保存。荧光显微镜和紫外观察GFPuv在大肠杆菌中的实时表达结果如附图3。
3.利用多功能酶标仪监测GFPuv的荧光强度
培养步骤同上,每隔2h取1mL菌液,200μL每孔加入96孔酶标板中,设置5个平行。以LB空白培养基作阴性对照。设置激发光波长395nm、发射光波长509nm,利用多功能荧光酶标仪实时监测绿色荧光蛋白的荧光强度。该实验重复三次。酶标仪检测GFPuv的荧光强度结果如附图4。
本研究利用荧光显微镜与多功能酶标仪实时监测pET28(a)+表达载体与构建的自诱导pXWZ-1表达载体,GFPuv的荧光强度。结果显示在培养24h时pXWZ-1表达载体组的荧光强度高达32800,相较于IPTG诱导的pET28载体组提高了18%。无需添加任何诱导剂的pXWZ-1载体在相同条件下自诱导GFPuv的量显著增强。构建的自诱导表达载体与pET表达载体相比,蛋白表达量优于pET系列载体。
实施例4载体pET28a-LacZ和pXWZ-1-LacZ的构建
以大肠杆菌MG1655基因组为模板,lacZ-BamH I-f、lacZ-Hind III-r为引物,PCR扩增lacZ片段,分别连接至质粒载体pET28(a)+及pXWZ-1中,构建表达载体pET28a-LacZ和pXWZ-1-LacZ。
上游引物:lacZ-BamH I-f:5’-CGCGGATCCATGACCATGATTACGGATTC-3’(下划线为BamH I的酶切位点)
下游引物:lacZ-Hind III-r:5’-CCCAAGCTTTTATTTTTGACACCAGACCA-3’(下划线为Hind III的酶切位点)
利用限制性内切酶BamH I、Hind III分别酶切扩增得到的lacZ片段、pET28(a)+质粒及pXWZ-1质粒,37℃孵育2h进行琼脂糖凝胶电泳并进行凝胶回收,将回收得到DNA片段命名为C1、C2、C3。分别将C1和C2,C1和C3混合于一定体系中,用连接酶过夜连接,后进行转化,经PCR和酶切验证及测序验证正确载体命名为pET28a-LacZ和pXWZ-1-LacZ。载体的物理图谱如附图5。
实施例5表达β-半乳糖苷酶
1.工程菌的构建
将表达载体pET28a-LacZ和pXWZ-1-LacZ分别化转至大肠杆菌BL21(DE3)中,涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上。于37℃培养箱内倒置过夜培养,其中,BL21/pET28a-LacZ在OD600为0.5时,加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导,BL21/pXWZ-1-LacZ不加诱导。挑选单一克隆菌落,进行PCR鉴定。
2.β-半乳糖苷酶酶活测定
实验步骤参考《分子克隆实验指南》,测定结果如附图6。由图6可见,pXWZ-1-LacZ表达的β-半乳糖苷酶酶活远高于pET28a-LacZ加IPTG诱导表达的β-半乳糖苷酶酶活。
实施例6载体pET28a-QseB和pXWZ-1-QseB的构建
以大肠杆菌模式菌株MG1655基因组为模板,qseB-BamH I-f、qseB-Hind III-r为引物,PCR扩增qseB片段,分别连接至pET28(a)+及pXWZ-1中,构建表达载体pET28a-QseB和pXWZ-1-QseB。
上游引物:qseB-EcoR I-f:5’-CCGGAATTCATGGGAATTTTACTGATAGA-3’(下划线为EcoR I的酶切位点)
下游引物:qseB-Hind III-r:5’-CCCAAGCTTTCATTTCTCACCTAATG-3’(下划线为Hind III的酶切位点)
用EcoR I、Hind III分别酶切得到的lacZ片段、pET28(a)+质粒及pXWZ-1质粒,37℃孵育2h进行琼脂糖凝胶电泳并进行凝胶回收,将两回收得到DNA片段命名为D1、D2、D3。分别将D1和D2,D1和D3混合于一定体系中,用连接酶过夜连接,经PCR和酶切验证及测序验证正确载体命名为pET28a-QseB和pXWZ-1-QseB。载体的物理图谱如附图7。
实施例7QseB蛋白表达和纯化
1.工程菌的构建
将表达载体pET28a-QseB和pXWZ-1-QseB分别化转至大肠杆菌BL21(DE3)中,涂布于含有涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上。于37℃培养箱内倒置过夜培养。挑选单一克隆菌落,进行PCR鉴定。
2.蛋白纯化
为确定pET28a-QseB和pXWZ-1-QseB表达载体所表达蛋白以包涵体形式存在的比例,pXWZ-1-QseB不需要添加诱导剂,pET28a-QseB是在OD600=0.5时加诱导剂,破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀,进行SDS-PAGE,pET28(a)+与pXWZ-1表达载体在最佳诱导条件下破碎上清和沉淀对比如附图8。纯化后的对比结果如附图9。
本研究通过对比BL21/pET28-QseB和BL21/pXWZ-1-QseB的表达的SDS-PAGE结果表明自诱导表达载体上清中的可溶性蛋白含量显著提高,且表达过程中蛋白错误折叠少,降低了形成包涵体的风险。经蛋白质纯化后,蛋白浓度测定结果表明pXWZ-1-QseB表达载体在37℃即可实现目标蛋白的大量表达,经100mM洗脱后蛋白浓度高达0.43mg/mL,而pET28a-QseB载体组仅有0.19mg/mL,前者是后者的2.3倍。
表1 pET28-QseB系统表达QseB在3种咪唑洗脱浓度下的蛋白浓度
Figure BDA0002680993950000071
表2 pXWZ-1-QseB系统表达QseB在3种咪唑洗脱浓度下的蛋白浓度
Figure BDA0002680993950000072
本研究成功构建自诱导pXWZ-1蛋白表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,成功实现了对多种重组蛋白的表达。研究初步表明,pXWZ-1表达载体具有免IPTG诱导、蛋白表达量高、形成包涵体少、易纯化且不需要低温诱导等优点,为适用于大规模发酵生产重组蛋白的工业化需求提供了一个潜在的思路,具有广阔的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 248
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
atttcccccg ttcagttttg caggtgagtt ttgaacaaat gtatttctgc ttttaatttg 60
ttcataacct taggtggaca ttgcacatat ttccgacgaa tagatcacaa tttatgctat 120
tttgattttc acggttgcgt ttgttcatgc tcgtagagtc aaactgtggt tgccatcaca 180
gatataaatg agcaagaact gaacaattgc attaaagatt taaatatgtt caaagtgaag 240
aatgaatt 248
<210> 2
<211> 5614
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180
cgacggagct cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat gctagccata 240
tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct gctgcccatg 300
gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga atttcccccg ttcagttttg 360
caggtgagtt ttgaacaaat gtatttctgc ttttaatttg ttcataacct taggtggaca 420
ttgcacatat ttccgacgaa tagatcacaa tttatgctat tttgattttc acggttgcgt 480
ttgttcatgc tcgtagagtc aaactgtggt tgccatcaca gatataaatg agcaagaact 540
gaacaattgc attaaagatt taaatatgtt caaagtgaag aatgaattgg ggaattgtta 600
tccgctcaca attcccctat agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag atctcgatcc 660
tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac aggtgcggtt gctggcgcct 720
ctatatcgcc gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc 780
ttgtttcggc gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc 840
cttgcatgca ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg 900
cttcctaatg caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc 960
gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga 1020
atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg 1080
tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag 1140
cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac 1200
agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg 1260
tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag 1320
aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca 1380
gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct 1440
gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta 1500
ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc 1560
agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg 1620
gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact 1680
ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca 1740
ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt 1800
ccgggctgcg cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct 1860
catgttatat cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca 1920
gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc 1980
ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 2040
gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc 2100
agtgagcgca acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg 2160
atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc 2220
gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg 2280
ctctgggtca ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg 2340
cttgcggtat tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc 2400
aaacgtttcg gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccccacg ggtgcgcatg 2460
atcgtgctcc tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg gttgccttac tggttagcag 2520
aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc 2580
tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag 2640
tcagcgccct gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt 2700
ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg 2760
tcccgccgca tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt 2820
tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc 2880
atgaacagaa atccccctta cacggaggca tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt 2940
aacatggccc gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg 3000
gacgcggatg aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac 3060
cgcagctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 3120
gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 3180
tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga 3240
gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatat 3300
gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct 3360
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 3420
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 3480
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 3540
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 3600
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 3660
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 3720
ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 3780
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 3840
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 3900
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 3960
ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 4020
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 4080
gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 4140
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa actcacgtta agggattttg gtcatgaaca 4200
ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg 4260
gaaacgtctt gctctaggcc gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt atatgggtat 4320
aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaac 4380
gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttaa 4440
gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat 4500
tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg gaaaacagca 4560
ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg 4620
ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta 4680
tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt 4740
gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taaacttttg 4800
ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt 4860
gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac 4920
caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg 4980
ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg 5040
ctcgatgagt ttttctaaga attaattcat gagcggatca tatttgaatg tatttagaaa 5100
aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga aattgtaaac 5160
gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaacaat 5220
aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg 5280
ttgttccagt ttggaaaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg 5340
aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt 5400
ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc 5460
ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg 5520
cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct 5580
taatgcgccg ctacagggcg cgtcccattc gcca 5614
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctctagaaa ttcattcttc actttgaa 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctctagaat ttcccccgtt cagttttg 28

Claims (6)

1.一种基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体pXWZ-1,其特征在于:以pET28(a)+质粒为框架改造,通过连接插入AI-2群体感应受体蛋白LsrR启动子,所述启动子序列如:SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述的自诱导蛋白表达载体的构建方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)以含有lsrR启动子核苷酸序列的大肠杆菌基因组为模板,扩增得到带有酶切位点的lsrR启动子序列;
(2)利用限制性内切酶将pET28(a)+质粒和扩增出的lsrR启动子序列酶切回收,经DNA连接酶连接后转化大肠杆菌;
(3)利用pET28(a)+质粒中抗性基因筛选出阳性克隆,并进行菌落PCR验证,测序获得AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体pXWZ-1。
3.权利要求1所述的基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体pXWZ-1在表达蛋白中的应用。
4.权利要求1所述的基于AI-2群体感应自诱导蛋白表达载体pXWZ-1在构建表达外源蛋白的大肠杆菌基因工程菌中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于将需要表达的外源蛋白编码基因插入到权利要求1所述的表达载体pXWZ-1中,构建外源蛋白表达载体;再将构建成功的外源蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达外源蛋白的基因工程菌;培养该基因工程菌,表达外源蛋白,在培养过程中无需加入诱导剂诱导。
CN202010962241.XA 2020-09-14 2020-09-14 一种基于ai-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用 Pending CN112011563A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010962241.XA CN112011563A (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种基于ai-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010962241.XA CN112011563A (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种基于ai-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112011563A true CN112011563A (zh) 2020-12-01

Family

ID=73522347

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010962241.XA Pending CN112011563A (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种基于ai-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112011563A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113073108A (zh) * 2021-04-26 2021-07-06 江南大学 一种群体感应型双向调控系统及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1609223A (zh) * 2004-08-09 2005-04-27 南京师范大学 一种大肠杆菌质粒载体及其应用方法
US20100021942A1 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 Paul Freemont Cell-free expression system for the detection of bacterial biofilms
CN104131018A (zh) * 2014-07-31 2014-11-05 厦门大学 一种细胞内蛋白自诱导表达的方法
CN108866057A (zh) * 2018-07-06 2018-11-23 江南大学 一种大肠杆菌压力响应型启动子及其制备方法
CN110268062A (zh) * 2017-02-03 2019-09-20 艾力格生物科技有限公司 用于在微生物群体中递送的优化的载体

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1609223A (zh) * 2004-08-09 2005-04-27 南京师范大学 一种大肠杆菌质粒载体及其应用方法
US20100021942A1 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 Paul Freemont Cell-free expression system for the detection of bacterial biofilms
CN104131018A (zh) * 2014-07-31 2014-11-05 厦门大学 一种细胞内蛋白自诱导表达的方法
CN110268062A (zh) * 2017-02-03 2019-09-20 艾力格生物科技有限公司 用于在微生物群体中递送的优化的载体
CN108866057A (zh) * 2018-07-06 2018-11-23 江南大学 一种大肠杆菌压力响应型启动子及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEAULAURIER,J. ET AL.: ""Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 strain K-12 chromosome,GenBank: CP027060.1"", 《GENBANK》, 1 March 2018 (2018-03-01), pages 1 - 3 *
FEI SHANG ET AL.: ""Construction of an AI-2 quorum sensing induced heterologous protein expression system in Escherichia coli"", 《PEERJ》, vol. 9, 16 November 2021 (2021-11-16), pages 1 - 14 *
NANCY WEILAND-BRÄUER ET AL.: ""Novel Reporter for Identification of Interference with Acyl Homoserine Lactone and Autoinducer-2 Quorum Sensing"", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》, vol. 81, no. 4, 19 December 2014 (2014-12-19), pages 1478 *
TING XUE ET AL.: ""LsrR-binding site recognition and regulatory characteristics in Escherichia coli AI-2 quorum sensing"", 《CELL RESEARCH》, 28 July 2009 (2009-07-28), pages 1260 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113073108A (zh) * 2021-04-26 2021-07-06 江南大学 一种群体感应型双向调控系统及其应用
CN113073108B (zh) * 2021-04-26 2022-10-11 江南大学 一种群体感应型双向调控系统及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105838733A (zh) Cas9 介导的香石竹基因编辑载体和应用
CN111909953B (zh) 用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法
CN109456973A (zh) SpCas9n&amp;PmCDA1&amp;UGI碱基编辑系统在植物基因编辑中的应用
CN107326043B (zh) 一种多功能载体的构建及使用方法
CN112011563A (zh) 一种基于ai-2群体感应自诱导蛋白表达载体及应用
CN113215136B (zh) 一种壳聚糖酶突变体CsnT及其应用
CN109722436B (zh) 基于CRISPR-Cas9的基因组无痕编辑的载体与应用
CN108165579B (zh) 一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法
CN113862235A (zh) 一种嵌合酶及其在体外一步反应合成Cap0 mRNA的用途和方法
CN110184290B (zh) 一种用于生产大分子量透明质酸的遗传重组质粒及工程菌与应用
CN114774427B (zh) 一种提高金银花中木犀草素含量的重组基因及其应用
CN101818151B (zh) 一种大豆种子特异性启动子及其应用
CN113122556B (zh) 振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的应用
CN112538493B (zh) 全基因组沉默子筛选系统及其应用
CN112877358B (zh) 一种基于5型腺病毒序列的重组质粒及应用
CN110923235B (zh) 一种控制玉米籽粒灌浆的非编码基因及其应用
CN108893487A (zh) 一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法
CN110923258A (zh) 一种真姬菇的遗传转化方法
CN110964741B (zh) 一种核定位信号fnb及其在提高碱基编辑效率中的应用
CN106222165A (zh) 一种长片段和复杂片段dna的高效体外合成方法
CN110904137A (zh) Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用
CN114457082B (zh) 一种辣椒NaCl诱导启动子、重组载体及其应用
CN110257444B (zh) 一种在植物细胞中生产中链脂肪酸的方法
CN114561388B (zh) 一种辣椒外源aba诱导型启动子、表达载体及其应用
CN114231555A (zh) 含有弱启动子的用于放线菌基因无痕编辑质粒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination