CN109722436B - 基于CRISPR-Cas9的基因组无痕编辑的载体与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与应用。一种基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体，结构为同源臂、sgRNA基因、启动子pGAL、Cas9、正向筛选标记、原核生物的复制起始位点六个组件顺次连接组成环形载体。本发明所构建质粒中的Cas9基因具有作为基因编辑和反向筛选标记的双重功能，因而Cas9经诱导发挥作用时，Cas9蛋白即会识别基因组上的靶向基因，也会识别载体中的同源臂基因，进而在实现靶向基因编辑的同时，亦可以将整个载体从目标菌株中进行切除，达到无痕敲除的目的。
Description
技术领域
本发明涉及基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
酵母作为一种微生物工程菌，在生产脂肪酸等方面一直以来受到很大关注，相比较大肠杆菌，酵母中有蛋白质加工等相关系统，表达的蛋白等产物往往接近天然产物，生物活性好。热带假丝酵母作为一种非常规酵母，具有很高的合成、修饰和储存细胞内脂质的能力，具备较高的脂肪酸衍生物，如：ω-羟基脂肪酸、10-羟基-2-癸烯酸、氨基脂肪酸等生产能力或生产潜力，但一直缺乏一种高效无痕的编辑系统对其进行基因编辑，本发明提供一种适用于热带假丝酵母的高效无痕的基因组编辑系统，这无疑具有巨大的应用前景。
传统的基因编辑技术是基于人工核酸内切酶的基因编辑技术，分别是：锌指核酸酶 (Zinc-finger nucleases，ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases，TALENs)，但是这两种方法程序较复杂、技术难度较大、组装时间较长、费用较高、效率不高，在很多方面上制约了这两种技术的应用。与传统的基因编辑技术相比，该编辑系统具有良好的靶向性、构建简单、效率高、可同时快速敲出多倍体中相同基因等优点，在近几年分子生物学中CRISPR-Cas9开始作为一种新的、高效率的基因编辑技术被广泛使用，仅在短短几年时间里已经在人体细胞、老鼠、斑马鱼、植物、细菌、真菌等多种生物中成功实现了对靶基因的定向编辑，目前该技术已成为基因编辑的首选技术。如中国专利文献CN105593367A(申请号CN201580000476.8)、中国专利文献CN105695485A(申请号 CN201410606474.0)、中国专利文献CN105886498A(申请号CN201510240981.1)、中国专利文献CN105647962A(申请号CN201610085619.6)、中国专利文献CN105331607A(申请号CN201510688330.9)、中国专利文献CN105567738A(申请号CN201610028603.1)、中国专利文献CN105907758A(申请号CN201610330754.2)和国外专利文献WO2017092201 (申请号WO2016CN77337)等。
CRISPR-Cas9技术是在一个长约20bp左右的sgRNA引导下、利用特异的核酸酶实现对基因组进行编辑的新技术。CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术已经成为现代分子生物学和生物信息学的重要组成部分，为后期的进一步方法优化和改造提供了基础，如中国专利文献 CN105907758A(申请号CN201610330754.2)则公开了一种CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法。但CRISPR-Cas9技术尚无在热带假丝酵母中进行基因编辑的报道。
目前尚有的微生物基因的无痕编辑主要通过正向筛选标记(一般为抗性基因或遗传缺陷型基因)以及反向筛选标记(果聚糖蔗糖酶编码基因sacB、毒素蛋白基因mazF)实现，这其中反向筛选标记的选择及使用极大的影响了微生物基因的无痕编辑的筛选效率，即便如此，利用现有反向筛选标记实现二次筛选仍然存在许多弊端，如需额外添加诱导物、诱导物添加的量难以控制、微生物对反向筛选标记的抗性容易积累等，往往会造成假阳性率高等问题，增加了后期筛选的难度。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与应用。本发明的特点在于所提供的基因编辑系统是基于Cas9编辑系统，所采用的反向筛选标记为Cas9基因，即，Cas9基因具备基因编辑和反向筛选标记的双重功能。
本发明技术方案如下：
Cas9基因作为基因编辑和反向筛选标记双重功能组件，在基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑中的应用。
一种基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体，结构为同源臂、sgRNA 基因、启动子pGAL、Cas9、正向筛选标记、原核生物的复制起始位点六个组件顺次连接组成环形载体。上述载体为自杀载体，即该载体无法在酵母中进行复制及增殖。
根据本发明优选的，所述Cas9基因启动子为受半乳糖诱导的启动子pGAL，启动子pGAL 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述sgRNA中具有18-35bp的靶向基因序列A，该靶向基因序列与目的基因对应的序列相同，并能为Cas9所识别。
所述同源臂中具有一段大于250bp的靶向基因序列B，同时该同源臂中需含有靶向基因序列A。
根据本发明优选的，所述正向筛选标记选自G418基因、Zeocin基因或His基因。
根据本发明优选的，所述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在无痕编辑中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：
(1)制备热带假丝酵母的感受态细胞；
(2)将上述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与步骤(1)制得的感受态细胞混合均匀后，进行电转化，制得转化细胞；
(3)将转化细胞复苏培养后，在含G418浓度800～1000μg/mL的固体YPD培养基上进行筛选培养，筛选抗G418的菌株；
(4)将步骤(3)制得的抗G418的菌株在含有5～15g/L半乳糖的筛选培养基筛选培养，制得编辑后的细胞。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的热带假丝酵母为热带假丝酵母(Candidatropicalis) CICC1798。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，制备热带假丝酵母的感受态细胞的具体步骤如下：
取热带假丝酵母单菌落，培养至菌体浓度OD600为1.0～1.8，置于冰上冷却，离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得热带假丝酵母感受态细胞。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，电转化条件为：1300～1800V、5～10ms连续电击2～3次。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，复苏培养条件为：28～32℃、150～200r/min摇床复苏培养40～80min；进一步优选的，所述复苏培养基组份为浓度1mol/L的山梨醇溶液。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，筛选培养条件为：28～32℃培养1～2天；
固体YPD培养基组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L，琼脂2g/L；
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，筛选培养条件为：28～32℃、培养24～72h；
筛选培养基组分如下：蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L。
有益效果
本发明成功构建了能够用于热带假丝酵母菌中的基因高效无痕编辑的系统，并成功用于热带假丝酵母菌CAT基因的敲除。本发明所构建质粒中的Cas9基因具有作为基因编辑和反向筛选标记的双重功能，因而Cas9经诱导发挥作用时，Cas9蛋白即会识别基因组上的靶向基因，也会识别载体中的同源臂基因，进而在实现靶向基因编辑的同时，亦可以将整个载体从目标菌株中进行切除，达到无痕敲除的目的。本发明的实施也为其他酵母、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌等微生物基因的无痕编辑提供了应用借鉴。
附图说明
图1、基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的结构示意图；
图2、本发明所述无痕敲除过程示意图；
图3、CAT基因敲除验证电泳结果照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：
含有Cas9基因的质粒pCRISPRyl购自淼灵生物科技有限公司；
热带假丝酵母(Candida tropicalis)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC1798；
质粒pPICzαA、pPIC9K购自于山东省微生物酶技术重点实验室，普通市售产品；
实施例1热带假丝酵母基因编辑系统中自杀质粒构建
(1)提取热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌体的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到同源臂片段，长度549bp，所述的PCR引物序列如下：
pCATF:CTTTTTGCCATCCGGAGCTCACTAAATCTGTAATTATGCCAG；
pCATR:TAACCCTGATAAATGCTCCTAGGGATATCAGAACCTTCAGCTG；
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物pPGATF 2.5μl，浓度10μmol/L的引物 pPGATR 2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(2)提取质粒pCRISPRyl，并以质粒基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到sgRNA 基因段，长度792bp，所述的PCR引物序列如下：
pSgRNAF:TCCAGCTGAAGGTTCTGATATCCCTAGGAGCATTTATCAGGGT；
pSgRNAR:CACGAGCAGCTTGCCTATGTTACATC；
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物pSgRNAF 2.5μl，浓度10μmol/L的引物pSgRNAR 2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(3)提取热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌体的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到pGAL片段，长度1061bp，所述的PCR引物序列如下：：
pPGALF:AACATAGGCAAGCTGCTCGTGGTCGACGTGAACAGAGAGGTGT；
pPGALR:CAATGGAGTATTTCTTATCCATTGAGAGGAGTATATGTATGTA；所述的PCR 扩增体系为50μl：
2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物pPGALF1 2.5μl，浓度10μmol/L的引物pPGALR1 2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(4)提取质粒pCRISPRyl，并以质粒基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到Cas9 基因段，长度4425bp，所述的PCR引物序列如下：
pCas9F:TACATATACTCCTCTCAATGGATAAGAAATACTCCATTGGCC；
pCas9R:GGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAA；
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物pCas9F 2.5μl，浓度10μmol/L的引物 pCas9R 2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
将(3)获得的pGAL片段与获得的Cas9片段进行重叠PCR拼接，所述的PCR引物序列如下：
pPGALF:AACATAGGCAAGCTGCTCGTGGTCGACGTGAACAGAGAGGTGT；
pCas9R:GGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAA；
第一轮PCR：
所述的PCR扩增体系为25μl：
2×HiFi-PCR master 12.5μl，pGAL片段4μl，Cas9片段4μl，用ddH2O补足25μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，5个循环；72℃延伸10min，72℃保存；
第二轮PCR：
2×HiFi-PCR master 12.5μl，浓度10μmol/L的引物pPGALF 4μl，浓度10μmol/L的引物 pCas9R 4μl，用ddH2O补足25μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，-4℃保存；
(5)以质粒pPIC9K基因组为模板，使用引物Kanr-F和Kanr-R进行PCR扩增，得G418基因片段，长度1200bp，所述的PCR引物序列如下：
Kanr-F：GACCTTCGTTTGTGCGGATCCTGAGGGAGCCACGGTTGAT
Kanr-R：GACCTTCGTTTGTGCGGATCCTGAGGGAGCCACGGTTGAT
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物Kanr-F 2.5μl，浓度10μmol/L的引物 Kanr-R 2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；
(6)提取质粒pPICzαA，并以质粒基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到原核生物复制起始位点基因段，长度1804bp，所述的PCR引物序列如下：
pOriF:GCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCGGATCCTCCGTCCCCCTTTT
pOriR:TGGCATAATTACAGATTTAGTGAGCTCCGGATGGCAAAAAGG；
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物pOriF 2.5μl，浓度10μmol/L的引物 pOriR 2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(7)将获得的同源臂片段、sgRNA片段、pGAL片段、Cas9片段、G418筛选标记、原核生物复制起始位点，长度bp左右；使用Gibson Cloning试剂盒进行连接，反应体系为 20μl：
置于50℃反应60min。反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。
(8)筛选正确的载体pCTCas9，将(8)中反应完成后的质粒转化入DH5α感受态中，在含有卡那霉素的LB平板中筛选阳性克隆子。然后挑取单菌落于液体LB培养基中，进行菌落PCR验证，获得含有重组质粒的大肠杆菌，将其送往上海博尚测序，正确后提取质粒 -20℃保存。
实施例2用质粒敲除热带假丝酵母菌基因组中的CAT基因
1、制备热带假丝酵母感受态
(1)将热带假丝酵母(Candida tropicalis)接种到含50ml菌体增殖培养基的250ml三角瓶中，30℃，200rpm/min，摇床过夜培养；
所述菌体增殖培养基，每升组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L
(2)将过夜培养的菌液涂布至固体YPD培养基，30℃培养1～2d，得到热带假丝酵母(Candida tropicalis)单菌落；用接种环挑取单菌落到50ml菌体增殖培养基中，30℃、200rpm/min培养12h，转接，培养10h；
所述YPD固体培养基，每升组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L、琼脂2g/L
(3)取1.5ml菌液到Ep管中，3000rpm/min，离心1min，收集菌体，用1.5ml预冷的无菌水吹打悬浮细胞；
(4)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用1ml预冷的无菌水悬浮细胞；
(5)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用1ml 1mol/L预冷的山梨醇悬浮细胞；
(6)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用80μL预冷的山梨醇悬浮细胞，即制成热带假丝酵母电转化感受态；将制备好的感受态细胞置于-80℃保存备用。
2、以质粒pCTCas9基因组为模板，使用引物qCATF和qCATR进行PCR扩增，更改sgRNA中20bp靶序列序列，所述的PCR引物序列如下：
qCATF:CGTTTTGTTAAAGCCGGTGGTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT；
qCATR:GCACCACCGGCTTTAACAAAACGTCAACCTGCGCCGACCCGGAA；
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物qCATF 2.5μl，浓度10μmol/L的引物qCATR2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸7min，30个循环；72℃延伸5min。
将PCR得到产物通过进行1％的琼脂糖凝胶电泳并在透射紫外波长为302nm条件下观察大小，用已洗净并用火焰烤干的刀片将含有目的条带的胶块切下来，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)胶回收制得的Kanr片段，保存于-20℃保存。
2、将构件质粒pCTCas9转化热带假丝酵母细胞
(1)从实施例1得到的正确的重组大肠杆菌中提取基因编辑质粒pCTCas9。
(2)电转化
利用核酸超微量分光光度计(BioFuture MD2000)测定重组质粒浓度，达到浓度300μg/ml 后进行电转化，电转化条件为1500V、5ms，然后在含1mol/L山梨醇的复苏培养基中培养所述复苏培养基。
所述复苏培养基每升组分如下：山梨醇1mol/L；
所述YPD固体培养基，每升组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L、琼脂2g/L。
3、CAT基因缺失菌株的获得
将上述得到的细胞复苏液取100μL涂布在含1mg/mL G418(遗传霉素)的YPD固体培养基上，在30℃培养2天，筛选具有G418抗性的转化子。挑取在G418抗性平板上长出的单菌落。
将初筛得到的单菌落，分别接种到含有10g/L的半乳糖固体培养基中进行筛选，培养3d，挑去单菌落于10g/L的半乳糖液体培养基中进行培养，并进行编号和验证。
所述YPD液体培养基，每升组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L；
所述筛选液体培养基，每升组分如下：半乳糖10g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L；
所述筛选固体培养基，每升组分如下：半乳糖10g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L、琼脂2g/L。
4、CAT基因缺失验证
(1)提取筛选得到的重组菌体的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到CAT片段，长度1074bp，所述的PCR引物序列如下：
pCATF:CTTTTTGCCATCCGGAGCTCACTAAATCTGTAATTATGCCAG；
pCATR:TAACCCTGATAAATGCTCCTAGGGATATCAGAACCTTCAGCTG；
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Phanta-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物CAT-F 2.5μl，浓度10μmol/L的引物CAT-R 2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；
将所得产物作凝胶电泳验证，并回收进行测序。
实施例3 CAT基因缺失菌株发酵验证
将验证正确的CAT基因缺失热带假丝酵母菌和热带假丝酵母原始菌分别接种于YPD液体培养基中，30℃条件下培养14小时；取10ml缺失菌菌液和10ml原始菌菌液分别接种到100ml发酵培养基中，培养12h后分别加入10ml油脂，进入产酸期；在产酸期，每12h或 24h调节pH到7.5～8.0，并测其OD600，产酸期5天。
所述发酵培养基组分如下：
葡萄糖60g/L、(NH4)2SO4 1g/L、酵母膏2g/L、VB1 0.1g/L、NaCl 2g/L、KH2PO4 4g/L、Na2HPO4·12H2O 10.08g/L、尿素2g/L、Mg2SO4·7H2O 6.15g/L、花生油10％，水配制，pH 7.0；
发酵结束后采用酸碱滴定法对二元酸的产量进行测定，测定结果显示热带假丝酵母敲除 CAT基因重组菌的二元酸转化率由原始菌种的5.0％提高到了16.1％，产量由原始菌种的 3.5g/L提高到了20.1g/L，二元酸的产率和产量都有了较大幅度的提升。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
诸城东晓生物科技有限公司
<120> 基于CRISPR-Cas9的基因组无痕编辑的载体及应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1061
<212> DNA
<213> Candida tropicalis
<400> 1
gtcgacgtga acagagaggt gtgcaagtgg acttgtgttg gtgacgtgta ttgatgacta 60
gtgcatgcac gtgcaactta attttctgtt cgaatcaggg accaatgcca gaaccagact 120
attgacgagt tttccgcgct gttattctgc tgattgcgaa tctcaacgag ctgacaaatg 180
gtctgtcaat gtccccctac cctcttgtcg accattgctg ccaaattccc acattgccag 240
aagatgatac tcatgccaaa tttactgtac gaggattttt agagttccat acgatgaaac 300
attcaaacgg ccccagaaga cacaatttga ccggtggatc ttggatattt cgtgtggacc 360
gtctacatgg cacgtacatg cgtctgtcca gattttgtcc gaatctgacc ttccaaaagt 420
gcagcagatg gaccctcgaa gccgtgtgaa atgttggaac cttgactgct ataaagtgca 480
gacccccacc atggtgccca atgtagaccc cccgccatgg ttcccactgt ggattctaga 540
cacggctatg ttggtatata aggcgcaatt tcgagtttct ggacgtgtcg tgaaccgggg 600
aacaatatct attacaccac gggttcatga agatgtgttt tagggtcgat tagtggagtt 660
gagaggtacc ccataggaga agcatgcgag aacagtggta gcagagtcag acacttgtag 720
atgtggacat gtggtacaag tactgtatgt acagaactgt acctgtagat attacagttg 780
tctagcgtcc atattacgtc tctattgctc ttttcgggtc tagttgtgtc ttttccgtgc 840
agatgagtaa cgagatcaga acgagacaat cagacaatca gaacgttgag tcagtcgaac 900
atacttggac cccatgacag ataatgatca cctctgacaa taaaacccct cctacacctt 960
tctgactgca gaattcagct ccaccgccat caatgtgttt tcatctccac ctaaacatgg 1020
caaaacatct gatactgtag tacatacata tactcctctc a 1061
<210> 2
<211> 9268
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
actaaatctg taattatgcc agttttgaaa aaaccatttt ccactagttc tccaaaaggt 60
gatttgttca aatttcaatc acaattacca aaattacctg ttccttcatt agaagaaaca 120
agtgcaaaat atcttaaaac tgtcgaacca tttttaaatc aggaacaatt agaatcaact 180
aaagaaaaag ttgcagaatt tgttaaagcc ggtggtgcag gtgaaatttt acaagctaga 240
ttgaatcaat ttgccactga taaagataat tggttagctg aattctggga tgattatgct 300
tatatgtctt atagagatcc tgttgttcca tatgtttcct atttctttag tcacaaggat 360
gtcaacaata ttattggtca agatcaattg ttaaaagcta ctttgattgc ttattatact 420
actgaatttc aagaaaaagt cttggatgaa tccttggcac cagaagtcat caaaggtaat 480
ccattctgta tgaatgcttt caagtatatg tttaacaatt ctagagttcc agctgaaggt 540
tctgatatcc ctaggagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 600
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcacacat ttccccgaaa agtgccacct 660
gacgtcccca gttgcaaaag ttgacacaac tctagatctg cttccaaata tagaatcata 720
acaagggtta gggtgtgatt atataatatt ggtcttaatt gatgtgctag ggctttaaaa 780
gttggttaaa ataacgctct aatgcctttt taatatattg tctttttcaa aatctcaaat 840
cggacacttc ttcgtgtatg agactccatt ttttggctcc gtcacgtgat atgtattatc 900
agctatagtg gtgtaaacaa agttttttac tagctgtaat ggcattttgt cggagtggta 960
aatcgccttc ttgttgtgcg ttcgagttct ggactctgca ctgggctact ttgaaaaata 1020
cctctaatgc gccgatggtt tagtggtaaa atccatcgtt gccatcgatg ggcccccggt 1080
tcgattccgg gtcggcgcag gttgacgtca tagttccagt gtttcgaagt tttagagcta 1140
gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 1200
gtgctttttt ttacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 1260
gtatcacgag gcccagatcc tctagagtcg aagcggccgc tatgtctgat aaaaggatgt 1320
aacataggca agctgctcgt ggtcgacgtg aacagagagg tgtgcaagtg gacttgtgtt 1380
ggtgacgtgt attgatgact agtgcatgca cgtgcaactt aattttctgt tcgaatcagg 1440
gaccaatgcc agaaccagac tattgacgag ttttccgcgc tgttattctg ctgattgcga 1500
atctcaacga gctgacaaat ggtctgtcaa tgtcccccta ccctcttgtc gaccattgct 1560
gccaaattcc cacattgcca gaagatgata ctcatgccaa atttactgta cgaggatttt 1620
tagagttcca tacgatgaaa cattcaaacg gccccagaag acacaatttg accggtggat 1680
cttggatatt tcgtgtggac cgtctacatg gcacgtacat gcgtctgtcc agattttgtc 1740
cgaatctgac cttccaaaag tgcagcagat ggaccctcga agccgtgtga aatgttggaa 1800
ccttgactgc tataaagtgc agacccccac catggtgccc aatgtagacc ccccgccatg 1860
gttcccactg tggattctag acacggctat gttggtatat aaggcgcaat ttcgagtttc 1920
tggacgtgtc gtgaaccggg gaacaatatc tattacacca cgggttcatg aagatgtgtt 1980
ttagggtcga ttagtggagt tgagaggtac cccataggag aagcatgcga gaacagtggt 2040
agcagagtca gacacttgta gatgtggaca tgtggtacaa gtactgtatg tacagaactg 2100
tacctgtaga tattacagtt gtctagcgtc catattacgt ctctattgct cttttcgggt 2160
ctagttgtgt cttttccgtg cagatgagta acgagatcag aacgagacaa tcagacaatc 2220
agaacgttga gtcagtcgaa catacttgga ccccatgaca gataatgatc acctctgaca 2280
ataaaacccc tcctacacct ttctgactgc agaattcagc tccaccgcca tcaatgtgtt 2340
ttcatctcca cctaaacatg gcaaaacatc tgatactgta gtacatacat atactcctct 2400
caatggataa gaaatactcc attggcctgg acatcggaac caactccgtg ggttgggccg 2460
tgatcaccga tgagtacaag gtgccctcta agaaattcaa ggtcctgggc aacaccgacc 2520
gacactccat caagaagaac ctgatcggcg ctctgctctt cgactctggc gagaccgctg 2580
aggccacccg actgaagcga accgctcgaa gacgatacac ccgaagaaag aaccgaatct 2640
gttacctgca ggagatcttc tctaacgaga tggccaaggt ggacgactct ttcttccacc 2700
gactggagga gtctttcctg gtggaggagg acaagaagca cgagcgacac cccatcttcg 2760
gcaacatcgt ggacgaggtg gcctaccacg agaagtaccc caccatctac cacctgcgaa 2820
agaagctggt ggactctacc gacaaggccg acctgcgact gatctacctg gccctggccc 2880
acatgatcaa gttccgaggc cacttcctga tcgagggcga cctgaacccc gacaactctg 2940
acgtggacaa gctgttcatc cagctggtgc agacctacaa ccagctcttc gaagagaacc 3000
ccattaacgc ttctggcgtg gatgctaagg ccatcctgtc tgcccgactg tctaagtctc 3060
gacgactcga gaacctgatt gctcagctcc ccggagagaa gaagaacggt ctgttcggaa 3120
acctgattgc tctgtccctg ggtctcaccc ctaacttcaa gtccaacttc gatctggctg 3180
aggacgctaa gctgcagctg tctaaggaca cctacgacga tgacctggat aacctgctcg 3240
cccagattgg cgaccagtac gccgacctgt tcctggccgc caagaacctg tctgacgcca 3300
tcctgctgtc tgacatcctg cgagtgaaca ccgagatcac caaggccccc ctgtctgcct 3360
ccatgattaa gcgatacgat gagcaccacc aggatctgac cctcctcaag gctctggtcc 3420
gacagcagct gcccgagaag tacaaggaga ttttcttcga ccagtctaag aacggctacg 3480
ccggctacat cgacggcggc gcctctcagg aggagttcta caagttcatt aagcccatcc 3540
tggagaagat ggacggaacc gaggaactgc tcgtgaagct gaaccgagag gacctcctgc 3600
gaaagcagcg aaccttcgac aacggctcta tcccccacca gatccacctg ggcgagctgc 3660
acgccatcct gcgacgacag gaggacttct accccttcct gaaggacaac cgagagaaga 3720
tcgagaagat cctgaccttc cgaatcccct actacgtggg acccctggcc cgaggaaact 3780
ctcgattcgc ttggatgacc cgaaagtctg aggagaccat taccccctgg aacttcgagg 3840
aggtggtgga taagggcgcc tctgctcagt ctttcatcga gcgaatgacc aacttcgaca 3900
agaacctccc caacgagaag gtcctgccca agcactctct gctctacgag tacttcaccg 3960
tctacaacga gctcaccaag gtcaagtacg tgaccgaggg aatgcgaaag cccgctttcc 4020
tgtctggaga gcagaagaag gctattgtgg atctgctctt caagactaac cgaaaggtca 4080
ccgtcaagca gctgaaggag gattacttca agaagattga gtgtttcgat tctgtcgaga 4140
tctccggcgt cgaggaccga ttcaacgcct ctctgggtac ctaccacgac ctgctgaaga 4200
ttatcaagga caaggatttc ctggataacg aggagaacga ggatattctc gaggacattg 4260
tcctgaccct caccctgttc gaggatcgag agatgattga ggagcgactc aagacctacg 4320
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tgcacgagca catcgccaac ctggccggct ctcccgccat taagaaaggt atcctgcaga 4620
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gagacatgta cgtcgaccag gagctggata tcaaccgact ctccgactac gatgtggacc 4920
acattgtgcc ccagtccttc ctgaaggacg attctatcga taacaaggtg ctgacccgat 4980
ccgacaagaa ccgaggcaag tctgacaacg tgccctccga ggaggtggtc aagaagatga 5040
agaactactg gcgacagctg ctgaacgcca agctgattac ccagcgaaag ttcgacaacc 5100
tgaccaaggc cgagcgaggc ggcctgtctg agctggacaa ggccggcttc atcaagcgac 5160
agctggtgga gacccgacag atcaccaagc acgtggccca gatcctggac tctcgaatga 5220
acaccaagta cgacgagaac gacaagctga tccgagaggt gaaggtgatc accctgaagt 5280
ctaagctggt gtctgacttc cgaaaggact tccagttcta caaggtgcga gagattaaca 5340
actaccacca cgcccacgat gcctacctga acgctgtcgt gggcaccgcc ctcatcaaga 5400
agtatcccaa gctggagtcc gagttcgtct acggcgacta caaggtctac gatgtgcgaa 5460
aaatgattgc caagtccgag caggagattg gcaaggctac cgccaagtac ttcttctact 5520
ccaacattat gaacttcttc aagaccgaga ttaccctggc taacggcgag attcgaaagc 5580
gacccctcat tgagaccaac ggagagaccg gtgagatcgt gtgggacaag ggacgagact 5640
tcgccaccgt gcgaaaggtg ctgtctatgc cccaggtgaa catcgtgaag aagaccgagg 5700
tgcagaccgg aggtttctct aaggagtcca tcctgcccaa gcgaaactct gacaagctga 5760
tcgcccgaaa gaaggactgg gaccccaaga agtacggagg tttcgactct cccaccgtgg 5820
cttactctgt gctggtggtg gccaaggtgg agaagggcaa gtctaagaag ctgaagtctg 5880
tgaaggagct gctgggcatt accatcatgg agcgatcttc tttcgagaag aaccccattg 5940
acttcctgga ggccaaggga tacaaggagg tgaagaaaga tctgattatc aagctcccca 6000
agtactctct gttcgagctg gagaacggac gaaagcgaat gctggcctct gccggcgagc 6060
tgcagaaggg aaacgagctg gccctgccct ccaagtacgt caacttcctg tacctcgcct 6120
cccattacga gaagctgaag ggctctcccg aggataacga gcagaagcag ctcttcgtgg 6180
agcagcataa gcactacctg gacgagatca tcgagcagat ctctgagttc tctaagcgag 6240
tgatcctggc tgacgccaac ctggataagg tgctgtctgc ttacaacaag caccgagaca 6300
agcccattcg agagcaggct gagaacatca ttcacctgtt caccctgacc aacctgggag 6360
cccccgctgc cttcaagtac ttcgacacca ccatcgaccg aaagcgatac acctctacca 6420
aggaggtgct ggacgccacc ctgatccacc agtctatcac cggcctgtac gagacccgaa 6480
tcgacctgtc tcagctgggc ggcgactctc gagccgaccc caagaagaag cgaaaggtgt 6540
aagctagcct catgtaatta gttatgtcac gcttacattc acgccctccc tccacatccg 6600
ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta 6660
tagttatgtt agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca 6720
gacgcgtgta cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct 6780
cgaaggcttt aatttgcaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc ttgagggagc 6840
cacggttgat gagagctttg ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac ttttgctttg 6900
ccacggaacg gtctgcgttg tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag 6960
ttcgatttat tcaacaaagc cgccgtcccg tcaagtcagc gtaatgctct gccagtgtta 7020
caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt 7080
attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga 7140
aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac 7200
tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga 7260
gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt 7320
ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa 7380
accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg 7440
acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat 7500
attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc 7560
agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg 7620
cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct 7680
acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat 7740
tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc 7800
catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac 7860
accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg atatattttt 7920
atcttgtgca atgtaacatc agagattttg agacacaacg tggctttccc ccccccccct 7980
gcaggtcggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac 8040
cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat 8100
ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg caccattcct 8160
tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaaccg gatcctccgt cccccttttc ctttgtcgat 8220
atcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc cccccacatc cgctctaacc 8280
gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt tatagttatg 8340
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tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg ctcgaaggct 8460
ttaatttgca agctggagac caacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 8520
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aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 8640
ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 8700
tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc 8760
agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 8820
gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 8880
tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 8940
acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 9000
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aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga tcagatctaa catccaaaga cgaaaggttg 9240
aatgaaacct ttttgccatc cggagctc 9268
Claims (12)
1.一种基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体，结构为同源臂、sgRNA基因、启动子pGAL、Cas9、正向筛选标记、原核生物的复制起始位点六个组件顺次连接组成环形载体；
所述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述Cas9基因启动子为受半乳糖诱导的启动子pGAL，启动子pGAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述正向筛选标记选自G418基因。
4.权利要求1所述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在无痕编辑中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)制备热带假丝酵母的感受态细胞；
(2)将上述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与步骤(1)制得的感受态细胞混合均匀后，进行电转化，制得转化细胞；
(3)将转化细胞复苏培养后，在含G418浓度800～1000μg/mL的固体YPD培养基上进行筛选培养，筛选抗G418的菌株；
(4)将步骤(3)制得的抗G418的菌株在含有5～15g/L半乳糖的筛选培养基筛选培养，制得编辑后的细胞。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的热带假丝酵母为热带假丝酵母(Candida tropicalis)CICC1798。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，制备热带假丝酵母的感受态细胞的具体步骤如下：
取热带假丝酵母单菌落，培养至菌体浓度OD600为1.0～1.8，置于冰上冷却，离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得热带假丝酵母感受态细胞。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，电转化条件为：1300～1800V、5～10ms连续电击2～3次。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，复苏培养条件为：28～32℃、150～200r/min摇床复苏培养40～80min。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述复苏培养的复苏培养基组份为浓度1mol/L的山梨醇溶液。
11.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，筛选培养条件为：28～32℃培养1～2天；
固体YPD培养基组分如下：葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L，琼脂2g/L。
12.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，筛选培养条件为：28～32℃、培养24～72h；
筛选培养基组分如下：蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L。
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