CN108165579B - 一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，包括如下步骤：1)构建重组病毒质粒pTRV2‑RhPDS；2)制备侵染液；3)使用高压喷枪法和真空渗透法分别侵染月季植株、月季扦插苗和已经生根月季组培苗，后续并检测基因沉默效率；4)从沉默植株的数量效率、植株出现白化时间、RhPDS基因的相对表达量三个方面进行分析比较，从而得到VIGS沉默体系的优化方案。本发明的有益效果是：提高了VIGS技术体系在月季中的应用效率，为之后VIGS技术体系在月季上的大规模应用奠定了基础。

Description

一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说涉及一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法。
背景技术
病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)，是指携带植物目的基因cDNA的病毒，在侵染植物体后可诱导内源基因的mRNA发生特异性降解，使该基因发生转录水平后的基因沉默，相应表型发生变异，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化反映该基因的功能。与传统遗传转化的方法相比，VIGS技术是一种免去大规模筛选突变体，能够在当代完成目的基因验证，操作简单、适用于植物基因功能分析，成为了功能基因组学研究领域很有吸引力的技术手段之一。
VIGS技术被广泛用于植物的生长发育、抗病虫、代谢调控等相关基因的功能研究中。VIGS技术也被应用于不同类型的植物，如烟草、拟南芥、矮牵牛、番茄、大豆、小麦、草莓等，但多局限在一、二年生的草本植物上，在木本植物方面有较少的应用。由于木本植物本身生理结构特点，植物生长周期较长，造成VIGS技术难以在木本植物中应用。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，本发明提供了一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，实现简单、快速、鉴定月季RhPDS基因。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，包括如下步骤：
1)构建重组病毒质粒pTRV2-RhPDS；
2)利用所述重组质粒pTRV2-RhPDS通过电击转化法转化农杆菌GV3101，含有pTRV1和pTRV2-RhPDS的农杆菌GV3101菌液，按照1:1混合，制备侵染液；
3)将所述侵染液避光室温静置活化4小时后分别使用高压喷枪法侵染4片复叶的月季植株、使用真空渗透法侵染2片复叶的扦插苗和生根组培苗；
4)将所述步骤3)中侵染后的月季植株和扦插苗经暗处理24小时之后置于常规栽培基质，在植物培养室分别培养60天和30天，将所述步骤3)中侵染后的生根组培苗栽种到生根培养基中进行无菌培养30天；
5)从沉默植株的数量效率、植株出现白化时间、RhPDS基因的相对表达量三个方面对所述步骤4)中培养后的月季植株、扦插苗和组培苗进行分析比较，从而得到VIGS沉默体系的优化方案。
进一步，步骤1)中构建重组质粒pTRV2-RhPDS的方法为：
步骤一，提取月季的总RNA并进行反转录,得到cDNA；
步骤二，用酶切引物对所述cDNA进行PCR扩增,得到RhPDS基因386bp片段；
步骤三，对所述PCR扩增产物和pTRV2质粒进行双酶切，采用连接酶进行过夜连接，重组质粒转化入大肠杆菌中扩繁，然后提取重组质粒，进行双酶切验证。
进一步，所述步骤二中所述PCR扩增时的引物1的核苷酸序列为序列表中序列2，所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列3。
进一步，所述步骤2)中制备侵染液的过程为：将分别含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-RhPDS的农杆菌GV3101菌液在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基上培养36-48小时，挑取各自单菌落，于5ml含有相同种类和浓度的LB液体培养基培养24小时，转入含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、200μM AS、10mM MES的200mlLB培养基中培养过夜；当菌液的OD600约为0.8时，4000rpm离心10分钟，用含有200μM AS、10mM MES、10mM MgCl2的悬菌液分别收集菌液,调节各个菌液OD600均为1.0，将含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2的农杆菌GV3101菌液、含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2-RhPDS的农杆菌GV3101菌液按照1:1混合，避光室温静置活化4小时后，侵染液制备完成。
进一步，所述步骤3)中所述高压喷枪法的方法为：对4片复叶时期的月季植株叶片的正面和背面喷射，直到有菌液渗透为止，随后用灭菌去离子水冲洗2次，侵染完成；所述高压喷枪法侵染的压力为75psi。
进一步，所述步骤3)中的真空渗透法的方法为：在真空泵中，将2片复叶时期的月季扦插苗和已经生根月季组培苗浸没在侵染液中，真空状态下反复抽吸两次，每次一分钟，最后用灭菌去离子水冲洗2次，侵染完成。
进一步，所述步骤5)中RhPDS基因的相对表达量采用qRT-PCR方法进行分析，步骤如下：选取pTRV2-RhPDS侵染过的植株提取总RNA，并反转录为cDNA，在RhPDS基因沉默片段以外设计得到引物3、引物4，以18S为内参基因扩增内参基因引物为引物5、引物6，采用qRT-PCR分析检测，得到RhPDS基因的相对表达量。
进一步，所述步骤4)中的生根培养基包括50mg/L卡那霉素、300mg/L头孢霉素、1/2MS、0.05mg/LNAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂。
一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法得出的优化方案，采用月季组培苗通过真空渗透法侵染。
本发明的有益效果为：
本实验成功构建pTRV2-RhPDS重组载体，并分别采用高压喷枪法对月季植株进行侵染、采用真空渗透法对扦插苗以及组培苗进行侵染，通过统计表型数据、RhPDS基因qRT-PCR表达分析，从而比较得出针对于月季的VIGS技术体系的更优方法。结果显示，采用真空渗透法侵染组培苗是最为快速、高效的实验方法。为之后VIGS技术体系在月季上的大规模应用奠定了基础。
附图说明
图1是RhPDS基因片段的PCR扩增结果电泳图；
图2是pTRV2-RhPDS重组载体双酶切检测电泳图；
图3是喷枪法侵染月季植株表型图；
图4是真空渗透法侵染月季扦插苗表型图；
图5月季扦插苗不同处理下RhPDS基因的相对表达量；
图6是真空渗透法侵染月季组培苗表型图；
图7月季组培苗不同处理下RhPDS基因的相对表达量。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
1、材料与方法
1.1、材料
选用的月季品种为‘karina’；盆栽植株在温室中常规养护直至4片复叶；扦插条在培养基质中生根，在温室中常规养护直至长出两片复叶；组培苗选自北京农学院组培试验中心正常生长的生根组培苗。购置商品化的pTRV1和pTRV2载体。
1.2载体构建
1.2.1带有酶切位点的RhPDS基因片的扩增
采用多糖多酚RNA快速提取试剂盒提取月季叶片中的总RNA，再采用cDNA反转试剂盒反转录为cDNA。以RhPDS基因为模板设计引物，设计引物时引入EcoR I、BamH I酶切位点序列，
引物1：PDS-F1：CGCGGATCCCTCCCACAGGCTTAGTGAAAA；(序列表2)
引物2：PDS-R1：CCGGAATTCGGACTGAACTCCGTCGTTCT。(序列表3)
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶检测并回收目的条带，经测序验证后，得到386bp的片段，用于下一步实验。
1.2.2pTRV2-RhPDS重组载体的构建及验证
采用内切酶BamH I和EcoR I对带有酶切位点的386bp的RhPDS基因片段(完整基因序列见序列表6)扩增产物和pTRV2质粒进行双酶切，将双酶切产物分别经琼脂糖凝胶检测并回收目的条带后，采用T4DNA连接酶进行过夜连接，将连接产物转化到E.coli DH5α中，选取阳性克隆菌液进行测序验证，并提取重组质粒pTRV2-RhPDS(完整基因序列见序列表1)，进行双酶切验证。
1.3侵染方法
将质粒pTRV1、pTRV2、重组质粒pTRV2-RhPDS通过电击转化法转化农杆菌GV3101；将分别含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-RhPDS的农杆菌GV3101菌液在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基上培养36-48小时，挑取各自单菌落，于5ml含有相同种类和浓度的LB液体培养基培养24小时，转入含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、200μM AS、10mM MES的200mlLB培养基中培养过夜。当菌液的OD600约为0.8时，4000rpm离心10分钟，用含有200μM AS、10mM MES、10mM MgCl2的悬菌液分别收集菌液。调节各个菌液OD600均为1.0，将pTRV1菌液与pTRV2菌液、pTRV1菌液与pTRV2-RhPDS菌液按照1:1混合，避光室温静置活化4小时后侵染；
采用高压喷枪法侵染4片复叶的月季植株，压力保持在75psi；采用真空渗透法侵染2片复叶的扦插苗和生根组培苗，真空状态下反复抽吸两次，每次一分钟。；经过以上侵染后用灭菌去离子水冲洗2次；
扦插苗栽种到新的常规培养基质中，组培苗接种到新的含有50mg/L卡那霉素、300mg/L头孢霉素的生根培养基(1/2MS，0.05mg/LNAA，30g/L蔗糖，6g/L琼脂)中，其中，组培苗要注意在操作过程中严格保持无菌环境；经暗处理24h后，月季植株、扦插苗于植物培养室中培养，组培苗于组培试验中心培养。
1.4RhPDS基因的沉默分析
对月季植株、扦插苗、组培苗分别进行表型性状观测统计，采用qRT-PCR分析方法检测RhPDS基因的转录表达水平，在RhPDS基因沉默片段以外设计得到RhPDS基因扩增引物3和引物4；以18S为内参基因，扩增引物引物5和引物6；得到RhPDS基因的相对表达量。
引物3：PDS-F2：CGGGACGAGCGAGAGCGG；(序列9)
引物4：PDS-R2：TGAAGCATGCACCCAACTCT；(序列10)
引物5：18S rRNA F：CCTGAGAAACGGCTACCACAT；(序列7)
引物6：18S rRNA R：CACCAGACTTGCCCTCCA。(序列8)
2、结果
2.1RhPDS基因片段的克隆结果
经琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图1)，图1表明RhPDS基因片段的PCR扩增产物约在400bp处有清晰条带，回收后经测序验证，使用DNAMAN软件进行比对，与预期结果RhPDS基因386bp片段序列一致，表明RhPDS基因片段的克隆成功。
2.2pTRV2-RhPDS重组载体的验证结果
将pTRV2-RhPDS重组载体转化E.coli DH5α后，提取阳性克隆的菌液质粒，采用内切酶BamH I、EcoR I对pTRV2-RhPDS重组质粒进行双酶切验证。经琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图2)，图2表明目的条带约为386bp，符合预期目标，证明pTRV2-RhPDS重组载体构建成功。
2.3RhPDS基因沉默结果
2.3.1月季植株的沉默结果
采用喷枪法对月季植株进行侵染，侵染60天后，侵染植株一直未有白化表型出现(结果见图3)。
2.3.2月季扦插苗的沉默结果
采用真空渗透法对月季扦插苗进行侵染。侵染30天后(结果见图4)，TRV空载体植株未有白化表型，而TRV-RhPDS植株出现明显白化表型，并且新生嫩叶也出现明显白化表型，结果表明RhPDS基因沉默成功。对接种的植株以及空白对照植株进行qRT-PCR分析(结果见图5)，结果显示TRV-RhPDS植株的RhPDS基因的表达量明显降低，进一步证明了TRV-RhPDS植株的白化表型是由RhPDS基因沉默引起。而TRV空载体植株RhPDS基因的表达量与空白对照相比并未出现明显变化。
2.3.3月季组培苗的沉默结果
采用真空渗透法对月季组培苗进行侵染。侵染30天后(结果见图6)，TRV空载体组培苗未有白化表型，仅在部分老叶中出现边缘轻微黄化。而TRV-RhPDS组培苗的新生叶片出现明显白化表型。结果表明RhPDS基因沉默成功。对接种的组培苗以及空白对照组培苗进行qRT-PCR分析(结果见图7)，结果显示TRV-RhPDS组培苗的RhPDS基因的表达量明显的降低，进一步证明了TRV-RhPDS组培苗的白化表型是由RhPDS基因沉默引起。而TRV空载体组培苗RhPDS基因的表达量与空白对照组培苗相比并未出现较明显变化。
2.4VIGS构建体系的比较
从上述结果来看，喷枪法并不适于月季的革质叶片，未成功引起RhPDS基因沉默出现白化表型。而真空渗透法能够成功的引起RhPDS基因沉默从而出现白化表型。因此，对月季扦插苗与组培苗这两种不同的侵染材料的TRV-RhPDS植株，从沉默植株的数量效率、植株出现白化时间、RhPDS基因的相对表达量三个方面进行比较，从而得到VIGS技术体系的更优方法(结果见表1)。
表1月季扦插苗与组培苗TRV-RhPDS植株的比较
Figure BDA0001525032930000061
结果显示月季组培苗无论是沉默植株的数量上，还是RhPDS基因的沉默效果都比扦插苗更为高效；从出现白化表型的时间上来看侵染月季组培苗比侵染扦插苗更为快速。
PDS基因是在光合作用过程中类胡萝卜素合成的关键酶，其基因的沉默能够引起白化现象，因此常作为VIGS实验中的指示基因。本研究以RhPDS基因作为研究对象，成功构建pTRV2-RhPDS重组载体，并分别采用高压喷枪法对月季植株进行侵染、采用真空渗透法对扦插苗以及组培苗进行侵染，通过统计表型数据、RhPDS基因qRT-PCR表达分析，从而比较得出VIGS技术体系的更优方法，结果发现高压喷枪法虽然适用于番茄等叶片具有粘质腺毛的植物，但对于叶片具有革质层的月季并不适用；真空渗透法对于月季叶片具有较好的侵染效果，其中扦插苗虽能够出现一定的沉默效果，但组培苗能够更高效、快速的呈现效果。并且，组培苗在进行侵染操作时，具有体积小，较便捷、易操作的优势。结果显示，采用真空渗透法侵染组培苗是最为快速、高效的VIGS实验方法。为之后VIGS技术体系在月季上的大规模应用奠定了基础。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 北京农学院
<120> 一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法
<130> 2010
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9992
<212> DNA
<213> pTRV2-RhPDS
<400> 1
ataaaacatt gcacctatgg tgttgccctg gctggggtat gtcagtgatc gcagtagaat 60
gtactaattg acaagttgga gaatacggta gaacgtcctt atccaacaca gcctttatcc 120
ctctccctga cgaggttttt gtcagtgtaa tatttctttt tgaactatcc agcttagtac 180
cgtacgggaa agtgactggt gtgcttatct ttgaaatgtt actttgggtt tcggttcttt 240
aggttagtaa gaaagcactt gtcttctcat acaaaggaaa acctgagacg tatcgcttac 300
gaaagtagca atgaaagaaa ggtggtggtt ttaatcgcta ccgcaaaaac gatggggtcg 360
ttttaattaa cttctcctac gcaagcgtct aaacggacgt tggggttttg ctagtttctt 420
tagagaaaac tagctaagtc tttaatgtta tcattagaga tggcataaat ataatacttg 480
tgtctgctga taagatcatt ttaatttgga cgattagact tgttgaacta caggttactg 540
aatcacttgc gctaatcaac atgggagata tgtacgatga atcatttgac aagtcgggcg 600
gtcctgctga cttgatggac gattcttggg tggaatcagt ttcgtggaaa gatctgttga 660
agaagttaca cagcataaaa tttgcactac agtctggtag agatgagatc actgggttac 720
tagcggcact gaatagacag tgtccttatt caccatatga gcagtttcca gataagaagg 780
tgtatttcct tttagactca cgggctaaca gtgctcttgg tgtgattcag aacgcttcag 840
cgttcaagag acgagctgat gagaagaatg cagtggcggg tgttacaaat attcctgcga 900
atccaaacac aacggttacg acgaaccaag ggagtactac tactaccaag gcgaacactg 960
gctcgacttt ggaagaagac ttgtacactt attacaaatt cgatgatgcc tctacagctt 1020
tccacaaatc tctaacttcg ttagagaaca tggagttgaa gagttattac cgaaggaact 1080
ttgagaaagt attcgggatt aagtttggtg gagcagctgc tagttcatct gcaccgcctc 1140
cagcgagtgg aggtccgata cgtcctaatc cctagggatt taaggacgtg aactctgttg 1200
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<211> 30
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<400> 4
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gaggaatcgg cgtgacggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg 4920
tgatgacctg gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc 4980
agaagcacgc cccggtgaat cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg 5040
gcaaccgccg gcagccggtg cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc 5100
agattttttc gttccgatgc tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga 5160
cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga 5220
gcttccagac gggcacgtag aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga 5280
ttacgacctg gtactgatgg cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga 5340
agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt 5400
ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt 5460
aaacaccacg cacgttgcca tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac 5520
ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg 5580
gccggagtac atcgagatcg agctagctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa 5640
gaacccggac gtgctgacgg ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg 5700
ttttctctac cgcctggcac gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa 5760
gacgatctac gaacgcagtg gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg 5820
caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc 5880
tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc 5940
ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg 6000
tctctttcct gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa 6060
cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga 6120
tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct 6180
taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa 6240
agcgcctacc cttcggtcgc tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc 6300
ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca 6360
agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc ctcgcgcgtt 6420
tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc 6480
tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt 6540
gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta 6600
tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag 6660
atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 6720
gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 6780
atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 6840
caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 6900
gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 6960
ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 7020
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 7080
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 7140
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 7200
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 7260
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 7320
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 7380
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 7440
gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 7500
gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgcat tctaggtact aaaacaattc 7560
atccagtaaa atataatatt ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca gtaagtcaaa 7620
aaatagctcg acatactgtt cttccccgat atcctccctg atcgaccgga cgcagaaggc 7680
aatgtcatac cacttgtccg ccctgccgct tctcccaaga tcaataaagc cacttacttt 7740
gccatctttc acaaagatgt tgctgtctcc aagttcctct tcgggctttt ccgtctttaa 7800
aaaatcatac agctcgcgcg gatctttaaa tggagtgtct tcttcccagt tttcgcaatc 7860
cacatcggcc agatcgttat tcagtaagta atccaattcg gctaagcggc tgtctaagct 7920
attcgtatag ggacaatccg atatgtcgat ggagtgaaag agcctgatgc actccgcata 7980
cagctcgata atcttttcag ggctttgttc atcttcatac tcttccgagc aaaggacgcc 8040
atcggcctca ctcatgagca gattgctcca gccatcatgc cgttcaaagt gcaggacctt 8100
tggaacaggc agctttcctt ccagccatag catcatgtcc ttttcccgtt ccacatcata 8160
ggtggtccct ttataccggc tgtccgtcat ttttaaatat aggttttcat tttctcccac 8220
cagcttatat accttagcag gagacattcc ttccgtatct tttacgcagc ggtatttttc 8280
gatcagtttt ttcaattccg gtgatattct cattttagcc atttattatt tccttcctct 8340
tttctacagt atttaaagat accccaagaa gctaattata acaagacgaa ctccaattca 8400
ctgttccttg cattctaaaa ccttaaatac cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca 8460
aagttggcgt ataacatagt atcgacggag ccgattttga aaccgcggtg atcacaggca 8520
gcaacgctct gtcatcgtta caatcaacat gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca 8580
aacccggcag cttagttgcc gttcttccga atagcatcgg taacatgagc aaagtctgcc 8640
gccttacaac ggctctcccg ctgacgccgt cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg 8700
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 8760
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt 8820
actgaattaa cgccgaatta attcctaggc caccatgttg ggcccggcgc gccaagcttg 8880
catgcctgca ggtcaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag aatatcaaag 8940
atacagtctc agaagaccag agggctattg agacttttca acaaagggta atatcgggaa 9000
acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat cgaaaggaca gtagaaaagg 9060
aagatggctt ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct 9120
ctaccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gaacatcgtg gaaaaagaag 9180
acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tggtcaacat ggtggagcac 9240
gacactctcg tctactccaa gaatatcaaa gatacagtct cagaagacca gagggctatt 9300
gagacttttc aacaaagggt aatatcggga aacctcctcg gattccattg cccagctatc 9360
tgtcacttca tcgaaaggac agtagaaaag gaagatggct tctacaaatg ccatcattgc 9420
gataaaggaa aggctatcgt tcaagatgcc tctaccgaca gtggtcccaa agatggaccc 9480
ccacccacga ggaacatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg 9540
gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa 9600
gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga gg 9642
<210> 5
<211> 6791
<212> DNA
<213> pTRV1
<400> 5
ataaaacatt tcaatccttt gaacgcggta gaacgtgcta attggatttt ggtgagaacg 60
cggtagaacg tacttatcac ctacagtttt attttgtttt tctttttggt ttaatctatc 120
cagcttagta ccgagtgggg gaaagtgact ggtgtgccta aaaccttttc tttgatactt 180
tgtaaaaata catacagata caatggcgaa cggtaacttc aagttgtctc aattgctcaa 240
tgtggacgag atgtctgctg agcagaggag tcatttcttt gacttgatgc tgactaaacc 300
tgattgtgag atcgggcaaa tgatgcaaag agttgttgtt gataaagtcg atgacatgat 360
tagagaaaga aagactaaag atccagtgat tgttcatgaa gttctttctc agaaggaaca 420
gaacaagttg atggaaattt atcctgaatt caatatcgtg tttaaagacg acaaaaacat 480
ggttcatggg tttgcggctg ctgagcgaaa actacaagct ttattgcttt tagatagagt 540
tcctgctctg caagaggtgg atgacatcgg tggtcaatgg tcgttttggg taactagagg 600
tgagaaaagg attcattcct gttgtccaaa tctagatatt cgggatgatc agagagaaat 660
ttctcgacag atatttctta ctgctattgg tgatcaagct agaagtggta agagacagat 720
gtcggagaat gagctgtgga tgtatgacca atttcgtgaa aatattgctg cgcctaacgc 780
ggttaggtgc aataatacat atcagggttg tacatgtagg ggtttttctg atggtaagaa 840
gaaaggcgcg cagtatgcga tagctcttca cagcctgtat gacttcaagt tgaaagactt 900
gatggctact atggttgaga agaaaactaa agtggttcat gctgctatgc tttttgctcc 960
tgaaagtatg ttagtggacg aaggtccatt accttctgtt gacggttact acatgaagaa 1020
gaacgggaag atctatttcg gttttgagaa agatccttcc ttttcttaca ttcatgactg 1080
ggaagagtac aagaagtatc tactggggaa gccagtgagt taccaaggga atgtgttcta 1140
cttcgaaccg tggcaggtga gaggagacac aatgcttttt tcgatctaca ggatagctgg 1200
agttccgagg aggtctctat catcgcaaga gtactaccga agaatatata tcagtagatg 1260
ggaaaacatg gttgttgtcc caattttcga tctggtcgaa tcaacgcgag agttggtcaa 1320
gaaagacctg tttgtagaga aacaattcat ggacaagtgt ttggattaca tagctaggtt 1380
atctgaccag cagctgacca taagcaatgt taaatcatac ttgagttcaa ataattgggt 1440
cttattcata aacggggcgg ccgtgaagaa caagcaaagt gtagattctc gagatttaca 1500
gttgttggct caaactttgc tagtgaagga acaagtggcg agacctgtca tgagggagtt 1560
gcgtgaagca attctgactg agacgaaacc tatcacgtca ttgactgatg tgctgggttt 1620
aatatcaaga aaactgtgga agcagtttgc taacaagatc gcagtcggcg gattcgttgg 1680
catggttggt actctaattg gattctatcc aaagaaggta ctaacctggg cgaaggacac 1740
accaaatggt ccagaactat gttacgagaa ctcgcacaaa accaaggtga tagtatttct 1800
gagtgttgtg tatgccattg gaggaatcac gcttatgcgt cgagacatcc gagatggact 1860
ggtgaaaaaa ctatgtgata tgtttgatat caaacggggg gcccatgtct tagacgttga 1920
gaatccgtgc cgctattatg aaatcaacga tttctttagc agtctgtatt cggcatctga 1980
gtccggtgag accgttttac cagatttatc cgaggtaaaa gccaagtctg ataagctatt 2040
gcagcagaag aaagaaatcg ctgacgagtt tctaagtgca aaattctcta actattctgg 2100
cagttcggtg agaacttctc caccatcggt ggtcggttca tctcgaagcg gactgggtct 2160
gttgttggaa gacagtaacg tgctgaccca agctagagtt ggagtttcaa gaaaggtaga 2220
cgatgaggag atcatggagc agtttctgag tggtcttatt gacactgaag cagaaattga 2280
cgaggttgtt ccagcctttt cagctgaatg tgaaagaggg gaaacaagcg gtacaaaggt 2340
gttgtgtaaa cctttaacgc caccaggatt tgagaacgtg ttgccagctg tcaaaccttt 2400
ggtcagcaaa ggaaaaacgg tcaaacgtgt cgattacttc caagtgatgg gaggtgagag 2460
attaccaaaa aggccggttg tcagtggaga cgattctgtg gacgctagaa gagagtttct 2520
gtactactta gatgcggaga gagtcgctca aaatgatgaa attatgtctc tgtatcgtga 2580
ctattcgaga ggagttattc gaactggagg tcagaattac ccgcacggac tgggagtgtg 2640
ggatgtggag atgaagaact ggtgcatacg tccagtggtc actgaacatg cttatgtgtt 2700
ccaaccagac aaacgtatgg atgattggtc gggatactta gaagtggctg tttgggaacg 2760
aggtatgttg gtcaacgact tcgcggtcga aaggatgagt gattatgtca tagtttgcga 2820
tcagacgtat ctttgcaata acaggttgat cttggacaat ttaagtgccc tggatctagg 2880
accagttaac tgttcttttg aattagttga cggtgtacct ggttgtggta agtcgacaat 2940
gattgtcaac tcagctaatc cttgtgtcga tgtggttctc tctactggga gagcagcaac 3000
cgacgacttg atcgagagat tcgcgagcaa aggttttcca tgcaaattga aaaggagagt 3060
gaagacggtt gattcttttt tgatgcattg tgttgatggt tctttaaccg gagacgtgtt 3120
gcatttcgat gaagctctca tggcccatgc tggtatggtg tacttttgcg ctcagatagc 3180
tggtgctaaa cgatgtatct gtcaaggaga tcagaatcaa atttctttca agcctagggt 3240
atctcaagtt gatttgaggt tttctagtct ggtcggaaag tttgacattg ttacagaaaa 3300
aagagaaact tacagaagtc cagcagatgt ggctgccgta ttgaacaagt actatactgg 3360
agatgtcaga acacataacg cgactgctaa ttcgatgacg gtgaggaaga ttgtgtctaa 3420
agaacaggtt tctttgaagc ctggtgctca gtacataact ttccttcagt ctgagaagaa 3480
ggagttggta aatttgttgg cattgaggaa agtggcagct aaagtgagta cagtacacga 3540
gtcgcaagga gagacattca aagatgtagt cctagtcagg acgaaaccta cggatgactc 3600
aatcgctaga ggtcgggagt acttaatcgt ggcgttgtcg cgtcacacac aatcacttgt 3660
gtatgaaact gtgaaagagg acgatgtaag caaagagatc agggaaagtg ccgcgcttac 3720
gaaggcggct ttggcaagat tttttgttac tgagaccgtc ttatgacggt ttcggtctag 3780
gtttgatgtc tttagacatc atgaagggcc ttgcgccgtt ccagattcag gtacgattac 3840
ggacttggag atgtggtacg acgctttgtt tccgggaaat tcgttaagag actcaagcct 3900
agacgggtat ttggtggcaa cgactgattg caatttgcga ttagacaatg ttacgatcaa 3960
aagtggaaac tggaaagaca agtttgctga aaaagaaacg tttctgaaac cggttattcg 4020
tactgctatg cctgacaaaa ggaagactac tcagttggag agtttgttag cattgcagaa 4080
aaggaaccaa gcggcacccg atctacaaga aaatgtgcac gcaacagttc taatcgaaga 4140
gacgatgaag aagttgaaat ctgttgtcta cgatgtggga aaaattcggg ctgatcctat 4200
tgtcaataga gctcaaatgg agagatggtg gagaaatcaa agcacagcgg tacaggctaa 4260
ggtagtagca gatgtgagag agttacatga aatagactat tcgtcttaca tgtatatgat 4320
caaatctgac gtgaaaccta agactgattt aacaccgcaa tttgaatact cagctctaca 4380
gactgttgtg tatcacgaga agttgatcaa ctcgttgttc ggtccaattt tcaaagaaat 4440
taatgaacgc aagttggatg ctatgcaacc acattttgtg ttcaacacga gaatgacatc 4500
gagtgattta aacgatcgag tgaagttctt aaatacggaa gcggcttacg actttgttga 4560
gatagacatg tctaaattcg acaagtcggc aaatcgcttc catttacaac tgcagctgga 4620
gatttacagg ttatttgggc tagatgagtg ggcggccttc ctttgggagg tgtcgcacac 4680
tcaaactact gtgagagata ttcaaaatgg tatgatggcg catatttggt accaacaaaa 4740
gagtggagat gctgatactt ataatgcaaa ttcagataga acactgtgtg cactcttgtc 4800
tgaattacca ttggagaaag cagtcatggt tacatatgga ggagatgact cactgattgc 4860
gtttcctaga ggaacgcagt ttgttgatcc gtgtccaaag ttggctacta agtggaattt 4920
cgagtgcaag atttttaagt acgatgtccc aatgttttgt gggaagttct tgcttaagac 4980
gtcatcgtgt tacgagttcg tgccagatcc ggtaaaagtt ctgacgaagt tggggaaaaa 5040
gagtataaag gatgtgcaac atttagccga gatctacatc tcgctgaatg attccaatag 5100
agctcttggg aactacatgg tggtatccaa actgtccgag tctgtttcag accggtattt 5160
gtacaaaggt gattctgttc atgcgctttg tgcgctatgg aagcatatta agagttttac 5220
agctctgtgt acattattcc gagacgaaaa cgataaggaa ttgaacccgg ctaaggttga 5280
ttggaagaag gcacagagag ctgtgtcaaa cttttacgac tggtaatatg gaagacaagt 5340
cattggtcac cttgaagaag aagactttcg aagtctcaaa attctcaaat ctaggggcca 5400
ttgaattgtt tgtggacggt aggaggaaga gaccgaagta ttttcacaga agaagagaaa 5460
ctgtcctaaa tcatgttggt gggaagaaga gtgaacacaa gttagacgtt tttgaccaaa 5520
gggattacaa aatgattaaa tcttacgcgt ttctaaagat agtaggtgta caactagttg 5580
taacatcaca tctacctgca gatacgcctg ggttcattca aatcgatctg ttggattcga 5640
gacttactga gaaaagaaag agaggaaaga ctattcagag attcaaagct cgagcttgcg 5700
ataactgttc agttgcgcag tacaaggttg aatacagtat ttccacacag gagaacgtac 5760
ttgatgtctg gaaggtgggt tgtatttctg agggcgttcc ggtctgtgac ggtacatacc 5820
ctttcagtat cgaagtgtcg ctaatatggg ttgctactga ttcgactagg cgcctcaatg 5880
tggaagaact gaacagttcg gattacattg aaggcgattt taccgatcaa gaggttttcg 5940
gtgagttcat gtctttgaaa caagtggaga tgaagacgat tgaggcgaag tacgatggtc 6000
cttacagacc agctactact agacctaagt cattattgtc aagtgaagat gttaagagag 6060
cgtctaataa gaaaaactcg tcttaatgca taaagaaatt tattgtcaat atgacgtgtg 6120
tactcaaggg ttgtgtgaat gaagtcactg ttcttggtca cgagacgtgt agtatcggtc 6180
atgctaacaa attgcgaaag caagttgctg acatggttgg tgtcacacgt aggtgtgcgg 6240
aaaataattg tggatggttt gtctgtgttg ttatcaatga ttttactttt gatgtgtata 6300
attgttgtgg ccgtagtcac cttgaaaagt gtcgtaaacg tgttgaaaca agaaatcgag 6360
aaatttggaa acaaattcga cgaaatcaag ctgaaaacat gtctgcgaca gctaaaaagt 6420
ctcataattc gaagacctct aagaagaaat tcaaagagga cagagaattt gggacaccaa 6480
aaagattttt aagagatgat gttcctttcg ggattgatcg tttgtttgct ttttgatttt 6540
attttatatt gttatctgtt tctgtgtata gactgtttga gattggcgct tggccgactc 6600
attgtcttac cataggggaa cggactttgt ttgtgttgtt attttatttg tattttatta 6660
aaattctcaa tgatctgaaa aggcctcgag gctaagagat tattgggggg tgagtaagta 6720
cttttaaagt gatgatggtt acaaaggcaa aaggggtaaa acccctcgcc tacgtaagcg 6780
ttattacgcc c 6791
<210> 6
<211> 386
<212> DNA
<213> RhPDS 386bp
<400> 6
ccggaattcg gactgaactc cgtcgttctg gcgaacaacg aagagacggt gctgcttccg 60
atgaacgagc cggtgtacgg gacgaagagg aagagccaga ttcagacgta cctggagcac 120
aacgaaggcg ccggagtcca gcacctggct ctggtcagcg gagacatatt caggaccttg 180
agggagatga ggaagcggag cggagtcgga ggatttgact tcatgccggc gccgccgccg 240
acgtattacc ggaatttgaa gaagagggcc ggcgatgtgt tgacggatga gcagatcaag 300
gagtgaggag ttggggattt tggttgatag ggatgaccag gggaccctgc ttcagatttt 360
cactaagcct gtgggaggga tccgcg 386
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 18S rRNA F
<400> 7
cctgagaaac ggctaccaca t 21
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 18S rRNA R
<400> 8
caccagactt gccctcca 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> PDS-F2
<400> 9
cgggacgagc gagagcgg 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> PDS-R2
<400> 10
tgaagcatgc acccaactct 20

Claims (5)

1.一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)构建重组病毒质粒pTRV2-RhPDS；
2)利用所述重组质粒pTRV2-RhPDS通过电击转化法转化农杆菌GV3101，含有pTRV1和pTRV2-RhPDS的农杆菌GV3101菌液，按照1:1混合，制备侵染液，其中，备侵染液的过程为：将分别含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-RhPDS的农杆菌GV3101菌液在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基上培养36-48小时，挑取各自单菌落，于5ml含有相同种类和浓度的LB液体培养基培养24小时，转入含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、200μMAS、10mMMES的200mlLB培养基中培养过夜；当菌液的OD600约为0.8时，4000rpm离心10分钟，用含有200μMAS、10mMMES、10mMMgCl2 的悬菌液分别收集菌液,调节各个菌液OD600均为1.0，将含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2的农杆菌GV3101菌液、含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2-RhPDS的农杆菌GV3101菌液按照1:1混合，避光室温静置活化4小时后，侵染液制备完成；
3)将所述侵染液避光室温静置活化4小时后使用真空渗透法侵染月季生根组培苗，其中真空渗透法的步骤为：在真空泵中，将已经生根月季组培苗浸没在侵染液中，真空状态下反复抽吸两次，每次一分钟，最后用灭菌去离子水冲洗2次，侵染完成；
4)将所述步骤3)中侵染后的月季生根组培苗栽种到生根培养基中进行无菌培养30天；
5)从沉默植株的数量效率、植株出现白化时间、RhPDS基因的相对表达量三个方面对所述步骤4)中培养后的月季生根组培苗进行分析比较，从而得到VIGS沉默体系的优化方案。
2.根据权利要求1所述的一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：步骤1)中构建重组质粒pTRV2-RhPDS的方法为：
步骤一，提取月季的总RNA并进行反转录,得到cDNA；
步骤二，用酶切引物对所述cDNA进行PCR扩增,得到RhPDS基因386bp片段；
步骤三，对所述PCR扩增产物和pTRV2质粒进行双酶切，采用连接酶进行过夜连接，重组质粒转化入大肠杆菌中扩繁，然后提取重组质粒，进行双酶切验证。
3.根据权利要求2所述的一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：所述步骤二中所述PCR扩增时的引物1的核苷酸序列为序列表中序列2，所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列3。
4.根据权利要求1所述的一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：所述步骤5)中RhPDS基因的相对表达量采用qRT-PCR方法进行分析，步骤如下：选取pTRV2-RhPDS侵染过的植株提取总RNA，并反转录为cDNA，在RhPDS基因沉默片段以外设计得到引物3、引物4，以18S为内参基因扩增内参基因引物为引物5、引物6，采用qRT-PCR分析检测，得到RhPDS基因的相对表达量。
5.根据权利要求1所述的一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，其特征在于：所述步骤4)中的生根培养基包括50mg/L卡那霉素、300mg/L头孢霉素、1/2MS、0.05mg/LNAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂。
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