CN110923262B - 高粱α-淀粉酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高粱α‑淀粉酶及其编码基因与应用。本发明的高粱α‑淀粉酶的氨基酸酸序列如SEQ ID No.6所示或在此序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列，其基因编码的核苷酸序列如SEQ ID No.1或与该序列80％同源性的序列所示。本发明的高粱α‑淀粉酶在花粉特异性启动子驱动下在花粉发育期表达可提前降解淀粉，无法为花粉萌发提供能量，使得花粉萌发被遏制，导致花粉败育。本发明的高粱α‑淀粉酶可有效防止转基因花粉逃逸，也可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态，同时在杂交制种过程中省去人工去雄步骤，在作物种质资源改良、遗传育种方面具有广阔的应用前景。

Description

高粱α-淀粉酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及花粉特异性表达高粱α-淀粉酶，其可导致花粉败育，并且利用现代生物技术，应用于杂交种子生产技术体系，保证制种质量，提高制种效率，也可应用于防止转基因扩散。

背景技术

植物杂种优势利用是最为经济有效的提高粮食产量的途径之一，虽然几乎所有的农作物都尽可能利用杂种优势，但仍存在一些限制因素，例如选育优良组合难度较大，杂交制种成本高、风险高等特点，导致杂交作物所占的比重仍较小，主要农作物中尤以水稻为甚，其杂种优势商业化应用主要通过上世纪研发的“三系法”到“两系法”育制种路线，尽管“两系法”克服了“三系法”的种质资源利用率低、不育系培育难度大时间长、病害风险高等缺陷，提高了配组自由度，提高了水稻杂种优势利用效率，但“两系法”的温敏不育系易受温度影响，从而易造成大面积制种失败，损失严重，至今不能完全替代“三系法”。“三系法”和“两系法”的上述缺陷仍然是制约水稻杂种优势利用的关键环节，因此，研究人员努力开发新方法提高农作物的杂种优势利用效率，其中创制优良不育系是核心。

植物雄性不育主要体现在花粉败育，它涉及到花器官中雄蕊的发生与发育、绒毡层结构、小孢子形成、花药开裂以及外部生态环境等众多环节或因素，其中花粉发育涉及到众多基因的表达调控，弄清其全过程和分子机理是研究植物雄性不育的基础和关键所在。上世纪90年代初，Mariani等人利用来自烟草的花药绒毡层的特异启动子(TA29)和核糖核酸酶基因(Barnase)重组表达盒转化烟草和油菜，并成功获得雄性不育系，开创了人工制备雄性不育系的新途径(Denis M,Delourme R,Gourret J P,et al.Expression ofengineered nuclear male sterility in Brassica napus(genetics,morphology,cytology,and sensitivity to temperature)[J].Plant Physiology,1993,101(4):1295-1304.)。表明利用其他功能基因通过基因工程方法创制转基因雄性不育植株具备可行性。

在花粉发育后期会在花粉粒中合成淀粉，为花粉萌发和花粉管延伸储备能量。因此，若花粉粒中的淀粉提前被降解，瓦解其能量来源，从而阻碍花粉正常发育及遏制花粉管的萌发与伸长，使其无法完成受精过程，将会导致植物雄性不育。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，在动植物、细菌和真菌中普遍存在。研究人员通过利用基因工程技术，获得了各种淀粉酶基因的cDNA序列(崔锦,马向东(2009)淀粉酶基因的多样性.郑州牧业工程高等专科学校学报,29(2):21-23)。对其多样性研究表明，除来源多样性外，其基因结构和功能方面皆呈现多样性。根据其对淀粉的作用方式不同分为α-淀粉酶，β-淀粉酶，γ-淀粉酶和异淀粉酶等。其中α-淀粉酶属于内切型淀粉酶，可从淀粉分子的内部随机切割α-1，4糖苷键，使淀粉水解成麦芽糖、葡萄糖等，释放能量(Maarel,M.J.E.C.V.D.,Veen,B.V.D.,Uitdehaag,J.C.M.,Leemhuis,H.,&Dijkhuizen,L.Properties and applications ofstarch-converting enzymes of the-amylase family.Journal of Biotechnology,2002,94(2).DOI:10.1016/S0168-1656(01)00407-2)。在成熟花粉中，适量的淀粉酶可水解淀粉，为花粉的正常发育和花粉管的萌发、生长提供能量。相反，若在花粉形成过程中淀粉酶过表达和沉默表达，都会降低花粉能量代谢水平，导致淀粉积累量不足，产生败育花粉。

因此，本发明通过基因工程手段，特异性地调控淀粉酶的时空表达，获得转基因花粉败育植株，实现非转基因不育系的繁育及非转基因杂交种的生产，特别是在控制育性和转基因漂移等方面提供了新的选择。

发明内容

本发明的目的是提供一种高粱α淀粉酶在导致花粉败育及制备转基因花粉败育植株中的应用。

为了达到以上目的，本发明提供的高粱α-淀粉酶，其氨基酸序列为：

a)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；或

b)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明提供了编码高粱α-淀粉酶的基因，是如下：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有80％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与植物花粉败育基因α-淀粉酶核苷酸序列互补的DNA分子，因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明败育基因α-淀粉酶序列或其片段杂交的分离序列包括在本发明中。其中，所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与α-淀粉酶杂交。严格条件是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。

典型地，严格条件是在pH值7.0-8.3下盐浓度低于大约1.5M Na离子，典型地大约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10-50个核苷酸)至少大约30℃，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在30-35％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1％-1％的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4-12小时。

特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的方程估算:Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50％互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1％的错配需Tm降低大约l℃；因此，Tm杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90％的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的Tm，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格度的变化而变化。如果所需的错配程度使Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术应用核酸探针杂交，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法第2章(GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York)。见Sambrook等人(1989)分子克隆:实验室手册(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork)。

所述严格条件优选为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

本发明提供了含有编码上述高粱α-淀粉酶基因的生物材料，其为重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。

本发明提供的上述生物材料还含有转导肽和雄性配子优先型启动子。

进一步地，本发明提供的表达盒含有SEQ ID No.1-3，或1，2，4或1，2，5所示的DNA片段。

其中，SEQ ID No.1所示的序列长度为1263bp的是高粱花粉败育基因α-淀粉酶正向DNA片段；SEQ ID No.2所示的序列长度为174bp的转导肽；SEQ ID No.3所示的序列长度为2737bp的雄性配子优先型启动子PG47,SEQ ID No.4所示的序列长度为2038bp的雄性配子优先型启动子PC32,SEQ ID No.5所示的序列长度为1960bp的雄性配子优先型启动子PCHF15。

本发明含有上述高粱α-淀粉酶重组表达载体可通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织获得独立的转基因细胞或组织，获得含转基因成分的花粉败育的转基因株系。

本发明提供了上述高粱α-淀粉酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在降解植物花粉中淀粉或扰乱植物花粉发育中的应用。

本发明提供了上述高粱α-淀粉酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在诱导植物雄性不育中的应用。

本发明提供了上述高粱α-淀粉酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在制备花粉败育转基因植株中的应用。

所述转基因植物为外源基因在花粉中特异表达的转基因植物，优选为授粉/受精能力增强/削弱的转基因植物，更优选为雄性不育转基因植物。

本发明提供了上述高粱α-淀粉酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在作物育种中的应用。

本发明提供了一种降解植物花粉中淀粉，从而阻止外源基因扩散的方法，将含有高粱α淀粉酶基因的表达盒导入植物中获得转基因花粉败育的转基因植株，使转基因植株花粉无法正常授粉，从而阻止植物花粉中外源基因扩散。

本发明提供了一种利用含有高粱α-淀粉酶基因的转基因植株生产非转基因种子的方法，是将含有高粱α-淀粉酶基因的转基因植株作为杂交作物中保持系授粉给植物雄性不育系，不育系结实收获种子，该种子为非转基因种子，实现不育系繁育或杂交种制种。

所述的高粱α淀粉酶基因的核苷酸序列为：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

所述的植物为禾本科、豆科、锦葵科、十字花科植物。所述植物包括而不限于水稻、玉米、高梁、高粱、燕麦、小麦、粟、甘蔗、大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。

本发明的有益效果在于：(1)花粉败育基因α-淀粉酶分离自高粱，对水稻、玉米、小麦等植物基因工程十分有利，同时作为高粱的内源基因，对高粱的基因工程更是影响巨大。(2)高粱α-淀粉酶花粉粒碘染实验表明，α-淀粉酶能在启动子PG47驱动下，能精确地作用于花粉粒，使得可育花粉和败育花粉的比例符合为1:1。(3)本发明植物α-淀粉酶基因表达调控精确，可控制转基因扩散；可用于雄性不育系的保持和繁殖，同时在杂交制种过程中省去人工去雄步骤，应用前景广阔。

附图说明

图1是实施例2中花粉败育基因高粱α-淀粉酶SBAA2的重组表达载体DX2182-SBAA2构建流程图。

图2是实施例4中水稻花粉碘染照片。WT：野生型水稻中花11花粉碘染；SBAA2败育基因：转高粱α-淀粉酶水稻株系花粉碘染。

图3是实施例5中DX2182-SBAA2转基因水稻自交种子潮霉素筛选结果。ZH11：非转基因对照；13-1(T1),47-1(T1)：均为转高粱α-淀粉酶水稻株系T1代；1/2 MS：生根培养基；1/2 MS+Hn：生根培养基中添加筛选剂潮霉素。

图4是实施例6中DX2182-SBAA2转基因水稻杂交种子潮霉素筛选28d结果。ZH11：非转基因对照；13-1(T2),47-1(T2)：均为转高粱α-淀粉酶水稻株系T2代；1907×13-1，1907×47-1：转高粱α-淀粉酶水稻株系T1代13-1、47-1授粉给非转基因水稻材料1907所获杂交种；1/2 MS：生根培养基；1/2 MS+Hn：生根培养基中添加筛选剂潮霉素。

图5是实施例6中DX2182-SBAA2转基因水稻株系授粉获得杂交种转基因成分PCR检测电泳图。CK-：非转基因对照中花11；CK+：DX2182-SBAA2载体；1-15：随机挑选杂交种幼苗。Hn：潮霉素引物(SEQ ID NO:11-12)，P1：跨PG47启动子与SBAA2引物(SEQ ID NO:13-14)，P2：跨SBAA2和终止子引物(SEQ ID NO:15-16)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。

实施例1高粱α-淀粉酶获取

1、高粱RNA的提取利用Biozol Reagent方法提取高粱RNA：称取0.1g高粱新鲜幼穗组织，加1ml Biozol Reagent混匀，室温静置5min；按每1ml Biozol Reagent加0.2ml氯仿，用力震荡15s，待溶液充分乳化后，再室温静置5min，12000rpm，4℃离心15min；从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中；向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10min,12000rpm，4℃离心10min；弃上清，管壁可现白色沉淀，加0.5ml 75％乙醇(用RNase-free水配置)洗涤，颠倒混匀，10000rpm，4℃离心5min；重复一次，低温干燥，使乙醇挥发；加50μl的RNase-free水溶解沉淀，加入DNase I消化基因组DNA，重复氯仿抽提、异丙醇沉淀至加水溶解过程(步骤同前)，置于-80℃保存。

2、高粱cDNA合成以高粱RNA为模板，利用逆转录酶M-MLV逆转录：(1)冰上配置RNA5-10μl，Olig(dT)2μl，RNase-free H₂O至14.5μl混匀。(2)70℃，5分钟，立刻置于冰上，打开二级结构。(3)加入反转录酶等：5×M-MLV buffer5μl，RNase inhibitor0.5μl，10mMdNTP 4μl，M-MLV(Promega)1μl混匀。(4)42℃，延伸90分钟。70℃，15分钟。获得高粱的cDNA，分装保存于-40℃。注：所有实验用品均为RNase-free。

3.高粱α-淀粉酶扩增通过NCBI数据库获得高粱的α-淀粉酶SBAA2(Sb07g023010)基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO.1所示)，其氨基酸序列(如序列表中SEQ IDNO.6所示)。根据序列设计引物(如序列表中SEQ IDNO.7-8)，引物设计使用GibsonAssembly方法，其中上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复，以便Gibson Assembly连接。以高粱cDNA为模板通过PCR扩增获得，扩增体系及程序如下：2*PCR buffer for KOD FX 25μ1，dNTPs(2mM)10μ1，正/反向引物:(10μM)1.25μl/1.25μl，模板1μl，KOD FX聚合酶0.5μ1，ddH₂O至50μl。PCR程序:预变性94℃3min，变性94℃30s，退火55-65℃40s，延伸68℃1min20s，35个循环，延伸68℃10min。

实施例2花粉败育基因植物双元表达载体DX2182-SBAA2构建

构建流程见图1，将实施例1扩增产物，即引物SEQ ID NO:7-8扩增PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳回收1300bp左右产物，插入DX2182(已公开于中国专利CN106434673A，发明名称：一种植物花药特异性启动子PCHF15及其应用)经MluI和SacI的线性酶切载体中。其中DX2182载体已包含了PG47优化型启动子和终止子，并分别位于MluI和SacI酶切位点的两侧，因此MluI和SacI酶切载体DX2182，回收线性酶切载体，与实施例1扩增的PCR产物按一定的比例连接，最终构建获得包含SBAA2的花粉特异性的表达盒的双元载体。

2X连接试剂盒连接败育基因到DX2182，10μl体系如下：α-淀粉酶PCR产物(50ng)2.5μ1，酶切载体(100ng)2.5μ1，Ligation Mix 5μ1。连接程序：50℃60分钟。转化：取上述连接产物2μ1电击转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，挑选阳性克隆测序，测序正确的重组载体命名为DX2182-SBAA2，其序列如SEQ ID NO.9所示。

实施例3 SBAA2转基因水稻创制

取-70℃保存的农杆菌EHA105于含Rif(25μg/ml)+链霉素(50μg/ml)的YEP平板划线，28℃培养。挑取单菌落接种于含上述抗生素的50ml YEP液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16h。取2ml菌液转接于100ml(含上述抗生素)YEP液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.5。冰上预冷10分钟，5000rpm 10min(冷冻离心机预冷到4℃)。无菌去离子水洗2次(每次10ml)，10％甘油洗1次溶于3ml 10％甘油中。取100μl感受态细胞加1μl实施例2中得到的DX2182-SBAA2质粒，2.5KV电击转化。在含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上培养，挑选阳性克隆，用DX2182-SBAA2载体特异性引物SEQ ID NO:11-12 PCR验证。

验证正确的克隆，通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻中花11(Hiei Y OhtaS,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal 6:271-282)。经共培养、筛选、分化、生根等环节获取T0代转基因幼苗，提取DNA，经PCR验证的转基因阳性植株，自交结实获得T1代，取T1植株进行后续分析。其中DX2182-SBAA2载体含有潮霉素抗性基因，潮霉素抗性基因序列如SEQ ID NO:10所示，可用潮霉素筛选转基因，获得抗性植株；同时还可筛选转基因后代种子，获得其中抗性植株。

实施例4 SBAA2转基因水稻花粉育性分析

配制碘化钾染色液(取2g KI溶于5-10mL蒸馏水中，然后加入1g I₂(用适量的无水乙醇溶解)，待全部溶解后，再加蒸馏水定容至300mL。贮于棕色瓶中备用，使用时按碘化钾：去离子水＝1:1的比例稀释成碘染工作液)。对SBAA2水稻转基因植株的成熟花粉进行染色镜检分析花粉粒育性，具体步骤如下：

1、花粉采集：取充分成熟将要散粉的花药，剥除颖壳，取出花药，置于载玻片上。

2、镜检：取约70μl的碘染工作液滴于花药上，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察。凡被染成蓝黑色的花粉粒为可育花粉粒，呈浅黄色的为败育的花粉粒。

转基因植株的花粉粒经碘化钾染色分析表明可育花粉：败育花粉符合1:1的分离比例，即约50％花粉可染成蓝黑色，表现为正常育性；约50％花粉不能染成蓝黑色，表现为败育花粉(如图2的SBAA2败育基因所示)。而野生型花粉均可染成蓝黑色，是完全可育的(如图2的WT所示)。表明高粱α-淀粉酶能使水稻花粉粒中淀粉降解，使其在发育过程中能量供给不足，导致花粉败育。

实施例5 SBAA2转基因水稻自交种子分离筛选

根据遗传规律，若可育花粉：败育花粉符合1:1的分离比例，自交结实种子即是一半为非转基因种子，一半为转基因种子，因此利用潮霉素对SBAA2转基因水稻株系13-1、47-1的T1代种子进行筛选验证，方案如下：

取野生型对照中花11(ZH11)、转基因株系13-1和47-1(T1)种子，经次氯酸钠消毒后分别铺种于生根培养基(1/2 MS培养基)和添加40mg/L潮霉素(Sigma)的生根培养基中进行筛选，14d后观察并统计存活率(如图3)。统计结果显示：在生根培养基中ZH11能正常生根发芽，存活率为97.00％，13-1和47-1也能正常生根发芽，存活率达到90.00％以上；在潮霉素筛选下ZH11完全被抑制，而13-1株系自交种子部分可以正常生根发芽，存活率为49.50％，13-1株系与47-1株系类似，存活率为53.00％，分离比符合1:1(见表1)。

表1 SBAA2转基因水稻自交种子筛选分离比

实施例6转基因花粉逃逸率检测

为进一步检测SBAA2导致的花粉败育效率，检测其转基因花粉是否逃逸，本实施例通过SBAA2转基因水稻株系授粉给非转基因水稻材料，收获杂交种子，经潮霉素筛选检测(方法同实施例5)是否有杂交种子具备潮霉素抗性，若是，则有转基因花粉逃逸；若无，则表明SBAA2工作效率良好，可防止转基因逃逸。

转基因株系授粉给不育系1907(1907×13-1-和1907×47-1)，分别获得56、42粒杂交种子，用潮霉素筛选杂交种子，14d后观察发现，杂交种子发芽势较强，有一部分长成苗，但继续筛选培养至28天左右时，幼苗逐渐枯黄死亡，但13-1和47-1自交种子中具备抗性的植株可存活并长成植株(如图4)。因此28d统计存活率显示：在生根培养基中ZH11能正常生根发芽，存活率97.50％，13-1和47-1也能正常生根发芽，存活率分别为89.50％、91.00％,1907×13-1和1907×47-1的杂交种子因杂交优势，发芽率(存活率)也较高；在潮霉素筛选下ZH11完全被抑制，而13-1自交种子存活率44.00％，47-1的存活率46.00％，基本分离比符合1:1(见表2)，而1907×13-1和1907×47-1的杂交种子均被抑制，无法存活。

表2.转基因花粉逃逸率检测

为进一步检测杂交种子发芽幼苗为非转基因幼苗，随机选取部分杂交种幼苗，提取基因组DNA，利用3对特异性引物,进行PCR扩增鉴定是否存在转基因元件，结果表明杂交种子幼苗未能扩出转基因区段条带，与阴性对照一致(如图5)，进一步表明没有转基因元件逃逸。

由此证明本发明的高粱α-淀粉酶基因能够降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉败育，可有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其他作物品种。

综上所述，本发明中影响植物雄性生育力α-淀粉酶来自高粱，为首次克隆，并且能够降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，准确性高，效率好，有效阻止转基因作物花粉逃逸；可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态；同时省去了杂交制种过程中人工去雄的步骤，具备较高的实用价值。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 高粱α-淀粉酶及其编码基因与应用

<130> KHP181115619.3

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggctccaaca cggcacgagc ccaggtcctg ttccaggggt tcaactggga gtcttgcaag 60

aagcaaggcg gctggtacaa gtttctccag gcgcaggtgg acgacatcgc cggcgccggc 120

gccacccacg tctggctgcc gccgccatcg cactccgtcg cgccacaggg ctacatgccg 180

gggcggctct acgacctgaa cgcgtccagg tacggcacgg aggcggagct gcggtcgctg 240

atcgccgcgt tcaggggcaa gggcgtggag gccgtggcgg acatcgtcat caaccaccgg 300

tgcgccgaca agaaggacgg ccgcggcgtg tactgcatct tcgagggcgg cggcggcgac 360

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Asn Gly Arg Gly Asn Arg Asp Thr Gly Lys Asp Phe Gly Ala Ala Pro

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Ala Tyr Ile Leu Thr His Pro Gly Ile Pro Ser Ile Phe Tyr Asp His

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Arg Lys Arg Asn Gly Ile His Pro Gly Ser Lys Leu Ser Ile Val Lys

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aaagttaggg ttcaaaagca aaggagcaaa ggaaccgaag ggtgccctga tctggcacac 4140

cggactgtct ggtatgccac cagacagtgt ccggtgcacc tgcaggtcgc gagtcgacct 4200

gcagccaagc ttagcgctgt agctaccagc tactagttca caccttatgt aaagtatttg 4260

ttgcaagaaa agtctaagat gacagcaacc tgctgagaag aacaactgac gatgtcataa 4320

ggagagggag cttttcgata ggtgccgtgc agttcaaaga gttagttagc agtaggatga 4380

agatttttgc acatggcaat gagaagttaa ttatggtgta ggcaacccaa atgaaacacc 4440

aaaatatgca caagacagtt tgttgtattc tgtagtacag aataaactaa agtaatgaaa 4500

gaagatggtg ttagaaaatg aaacaatatt atgagtaatg tgtgagcatt atgggaccac 4560

gaaataaaaa aagaacattt ttatgagcag tgtgttctca atgagccttg aatgttatca 4620

cccaggataa gaaaccctta agcaatgaaa catgcaagcg tttaatgtgc aaagttggca 4680

ttctccacga cataatgcaa aagaagatat aatctatgac atagcaagtc atgcatcatt 4740

tcatgcctct gtcaacctat tcatttctag tcatctaggt aagtatctta agctaaagtg 4800

ttagaacttc ccatacataa gtcataactg atgacaattg ggtgtaacac atgacaaacc 4860

agagagtcaa gcaagataaa gcaaaaggat gtgtacataa aactacagag ctatatgtca 4920

tgttgcgaaa agaggagagc ttataagaca agccatgact caaaaaaaat tcacatgcct 4980

actgtggccc atatatcatg caacaatcca aaaactcaca ggtctcggtg ttgatcgtgt 5040

caacatgtga ccaccctaaa aactcttcac taaatattaa agtattgcta gaacagagct 5100

tcaagatata agtcatgatc accaacaacc atgttcaaaa agaaatagaa agctatggca 5160

cagcaacaaa aagcaaaagc atgcatggat ataatcttta acatcatcca tgtcatattg 5220

caaaagaaag aaagagagaa caatacaaat gatgtgtcaa ttacacatcc atcattatcc 5280

atccaccttc cgtgtaccac acttcatata tcatgagtca cttcatgtct ggacattaac 5340

aaactctatc ttaacattca aatgcatgag actttatctc actataaatg cacaatgatt 5400

tagcattgtt tctcacaaaa ccattcaagt tcattagtac tacaacaaca tggcatccat 5460

aaatcgcccc atagttttct tcacagtttg cttgttcctc ttgtgcaatg gctctctagc 5520

ctccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct 5580

ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac 5640

ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 5700

caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 5760

gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat 5820

cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac 5880

cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg 5940

gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa 6000

gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct 6060

cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa 6120

ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat 6180

ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa 6240

gtaaagcggc cgtgtgaatt acaggtgacc agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt 6300

tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 6360

tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 6420

agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 6480

atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg 6540

gaattaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg 6600

tttattagaa taacggatat ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt 6660

atgtgcatgc caaccacagg gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc aacccctccg 6720

ctgctatagt gcagtcggct tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa acgacatgtc 6780

gcacaagtcc taagttacgc gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc gttttcttgt 6840

cgcgtgtttt agtcgcataa agtagaatac ttgcgactag aaccggagac attacgccat 6900

gaacaagagc gccgccgctg gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg acgaccagga 6960

cttgaccaac caacgggccg aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt tttccgagaa 7020

gatcaccggc accaggcgcg accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctacgccc 7080

tggcgacgtt gtgacagtga ccaggctaga ccgcctggcc cgcagcaccc gcgacctact 7140

ggacattgcc gagcgcatcc aggaggccgg cgcgggcctg cgtagcctgg cagagccgtg 7200

ggccgacacc accacgccgg ccggccgcat ggtgttgacc gtgttcgccg gcattgccga 7260

gttcgagcgt tccctaatca tcgaccgcac ccggagcggg cgcgaggccg ccaaggcccg 7320

aggcgtgaag tttggccccc gccctaccct caccccggca cagatcgcgc acgcccgcga 7380

gctgatcgac caggaaggcc gcaccgtgaa agaggcggct gcactgcttg gcgtgcatcg 7440

ctcgaccctg taccgcgcac ttgagcgcag cgaggaagtg acgcccaccg aggccaggcg 7500

gcgcggtgcc ttccgtgagg acgcattgac cgaggccgac gccctggcgg ccgccgagaa 7560

tgaacgccaa gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg gccaggacga accgtttttc 7620

attaccgaag agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga gccgcccgcg 7680

cacgtctcaa ccgtgcggct gcatgaaatc ctggccggtt tgtctgatgc caagctggcg 7740

gcctggccgg ccagcttggc cgctgaagaa accgagcgcc gccgtctaaa aaggtgatgt 7800

gtatttgagt aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg atgagtaaat 7860

aaacaaatac gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag aaaggcgggt 7920

caggcaagac gaccatcgca acccatctag cccgcgccct gcaactcgcc ggggccgatg 7980

ttctgttagt cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc gtgcgggaag 8040

atcaaccgct aaccgttgtc ggcatcgacc gcccgacgat tgaccgcgac gtgaaggcca 8100

tcggccggcg cgacttcgta gtgatcgacg gagcgcccca ggcggcggac ttggctgtgt 8160

ccgcgatcaa ggcagccgac ttcgtgctga ttccggtgca gccaagccct tacgacatat 8220

gggccaccgc cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat tgaggtcacg gatggaaggc 8280

tacaagcggc ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac gcgcatcggc ggtgaggttg 8340

ccgaggcgct ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc ccgtatcacg cagcgcgtga 8400

gctacccagg cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga atcagaaccc gagggcgacg 8460

ctgcccgcga ggtccaggcg ctggccgctg aaattaaatc aaaactcatt tgagttaatg 8520

aggtaaagag aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt gccggccgtc cgagcgcacg 8580

cagcagcaag gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg ccagccatga agcgggtcaa 8640

ctttcagttg ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg tacgcggtac gccaaggcaa 8700

gaccattacc gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta ccagagtaaa tgagcaaatg 8760

aataaatgag tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat caagaacaac 8820

caggcaccga cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg ccaggcgtaa 8880

gcggctgggt tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac ccccaagccc gaggaatcgg 8940

cgtgacggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg 9000

gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagcacgc 9060

cccggtgaat cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg gcaaccgccg 9120

gcagccggtg cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc 9180

gttccgatgc tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt 9240

ttccgtctgt cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga gcttccagac 9300

gggcacgtag aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga ttacgacctg 9360

gtactgatgg cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga 9420

gacaagcccg gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt ctgccggcga 9480

gccgatggcg gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt aaacaccacg 9540

cacgttgcca tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac ggtatccgag 9600

ggtgaagcct tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg gccggagtac 9660

atcgagatcg agctagctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa gaacccggac 9720

gtgctgacgg ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg ttttctctac 9780

cgcctggcac gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa gacgatctac 9840

gaacgcagtg gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg caagctgatc 9900

gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc tggcccgatc 9960

ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc ctaatgtacg 10020

gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg tctctttcct 10080

gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa cccgtacatt 10140

gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga tataaaagag 10200

aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct taaaacccgc 10260

ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa agcgcctacc 10320

cttcggtcgc tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc ggccgctggc 10380

cgctcaaaaa tggctggcct acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca agccgcgccg 10440

tcgccactcg accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga 10500

cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga 10560

tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc 10620

agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca 10680

gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg 10740

agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 10800

gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 10860

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 10920

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 10980

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 11040

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 11100

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 11160

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 11220

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 11280

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 11340

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 11400

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 11460

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 11520

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 11580

aactcacgtt aagggatttt ggtcatgcat tctaggtact aaaacaattc atccagtaaa 11640

atataatatt ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca gtaagtcaaa aaatagctcg 11700

acatactgtt cttccccgat atcctccctg atcgaccgga cgcagaaggc aatgtcatac 11760

cacttgtccg ccctgccgct tctcccaaga tcaataaagc cacttacttt gccatctttc 11820

acaaagatgt tgctgtctcc caggtcgccg tgggaaaaga caagttcctc ttcgggcttt 11880

tccgtcttta aaaaatcata cagctcgcgc ggatctttaa atggagtgtc ttcttcccag 11940

ttttcgcaat ccacatcggc cagatcgtta ttcagtaagt aatccaattc ggctaagcgg 12000

ctgtctaagc tattcgtata gggacaatcc gatatgtcga tggagtgaaa gagcctgatg 12060

cactccgcat acagctcgat aatcttttca gggctttgtt catcttcata ctcttccgag 12120

caaaggacgc catcggcctc actcatgagc agattgctcc agccatcatg ccgttcaaag 12180

tgcaggacct ttggaacagg cagctttcct tccagccata gcatcatgtc cttttcccgt 12240

tccacatcat aggtggtccc tttataccgg ctgtccgtca tttttaaata taggttttca 12300

ttttctccca ccagcttata taccttagca ggagacattc cttccgtatc ttttacgcag 12360

cggtattttt cgatcagttt tttcaattcc ggtgatattc tcattttagc catttattat 12420

ttccttcctc ttttctacag tatttaaaga taccccaaga agctaattat aacaagacga 12480

actccaattc actgttcctt gcattctaaa accttaaata ccagaaaaca gctttttcaa 12540

agttgttttc aaagttggcg tataacatag tatcgacgga gccgattttg aaaccgcggt 12600

gatcacaggc agcaacgctc tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca 12660

tccgtgtttc aaacccggca gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag 12720

caaagtctgc cgccttacaa cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc 12780

tgtatcgagt ggtgattttg tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg 12840

caggatatat tgtggtgtaa acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac 12900

gtttttaatg tactgaatta acgccgaatt aattcggggg atctggattt tagtactgga 12960

ttttggtttt aggaattaga aattttattg atagaagtat tttacaaata caaatacata 13020

ctaagggttt cttatatgct caacacatga gcgaaaccct ataggaaccc taattccctt 13080

atctgggaac tactcacaca ttattatgga gaaactcgag cttgtcgatc gacagatccg 13140

gtcggcatct actctatttc tttgccctcg gacgagtgct ggggcgtcgg tttccactat 13200

cggcgagtac ttctacacag ccatcggtcc agacggccgc gcttctgcgg gcgatttgtg 13260

tacgcccgac agtcccggct ccggatcgga cgattgcgtc gcatcgaccc tgcgcccaag 13320

ctgcatcatc gaaattgccg tcaaccaagc tctgatagag ttggtcaaga ccaatgcgga 13380

gcatatacgc ccggagtcgt ggcgatcctg caagctccgg atgcctccgc tcgaagtagc 13440

gcgtctgctg ctccatacaa gccaaccacg gcctccagaa gaagatgttg gcgacctcgt 13500

attgggaatc cccgaacatc gcctcgctcc agtcaatgac cgctgttatg cggccattgt 13560

ccgtcaggac attgttggag ccgaaatccg cgtgcacgag gtgccggact tcggggcagt 13620

cctcggccca aagcatcagc tcatcgagag cctgcgcgac ggacgcactg acggtgtcgt 13680

ccatcacagt ttgccagtga tacacatggg gatcagcaat cgcgcatatg aaatcacgcc 13740

atgtagtgta ttgaccgatt ccttgcggtc cgaatgggcc gaacccgctc gtctggctaa 13800

gatcggccgc agcgatcgca tccatagcct ccgcgaccgg ttgtagaaca gcgggcagtt 13860

cggtttcagg caggtcttgc aacgtgacac cctgtgcacg gcgggagatg caataggtca 13920

ggctctcgct aaactcccca atgtcaagca cttccggaat cgggagcgcg gccgatgcaa 13980

agtgccgata aacataacga tctttgtaga aaccatcggc gcagctattt acccgcagga 14040

catatccacg ccctcctaca tcgaagctga aagcacgaga ttcttcgccc tccgagagct 14100

gcatcaggtc ggagacgctg tcgaactttt cgatcagaaa cttctcgaca gacgtcgcgg 14160

tgagttcagg ctttttcata tctcattgcc cccccggatc tgcgaaagct cgagagagat 14220

agatttgtag agagagactg gtgatttcag cgtgtcctct ccaaatgaaa tgaacttcct 14280

tatatagagg aaggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt acgtcagtgg 14340

agatatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga 14400

tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga 14460

tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggtgcc accttccttt tctactgtcc 14520

ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc 14580

tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atattcttgg 14640

agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt tatcacatca atccacttgc tttgaagacg 14700

tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac 14760

cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt 14820

aggtgccacc ttccttttct actgtccttt tgatgaagtg acagatagct gggcaatgga 14880

atccgaggag gtttcccgat attacccttt gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt 14940

ctgagactgt atctttgata ttcttggagt agacgagagt gtcgtgctcc accatgttgg 15000

gcccggcgcg ccgaattccc gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc 15060

ctagtttgcg cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct 15120

aatcataaaa acccatctca taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt 15180

aacgtaattc aacagaaatt atatgataat catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct 15240

taagaaactt tattgccaaa tgtttgaacg atcggggaaa ttcgagctgg gtagcaattc 15300

ccgaggctgt agccgacgat ggtgcgccag gagagttgtt gagct 15345

<210> 10

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt 60

ctctctctac aaatctatct ctctcgagct ttcgcagatc cgggggggca atgagatatg 120

aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc 180

gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta 240

ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt 300

tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg 360

gagtttagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa 420

gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctacaaccgg tcgcggaggc tatggatgcg 480

atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc 540

ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac 600

tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg 660

atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc 720

aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg 780

ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac 810

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cttagccaga cgagcgggtt c 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcttctgcgg gcgatttgt 19

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ataattgcgg gactctaatc ata 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agtggaacct aaagcaggag at 22

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcgatgtcgt ccacctgc 18

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgctttccac ggtggttagt 20

Claims (9)

1.高粱α-淀粉酶在导致水稻花粉败育中的应用，所述高粱α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高粱α-淀粉酶的基因序列如SEQ IDNo.1所示。

3.高粱α-淀粉酶或其编码基因在制备花粉败育转基因水稻中的应用，所述高粱α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

高粱α-淀粉酶的编码基因序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有高粱α-淀粉酶基因的生物材料在制备花粉败育转基因水稻中的应用，所述高粱α-淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述生物材料为重组表达载体、表达盒、重组菌。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的生物材料含有转导肽和雄性配子优先型启动子。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转导肽为SBE信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述雄性配子优先型启动子为PG47、PC32、PCHF15，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、4、5所示。

7.一种调控水稻花粉发育的方法，其特征在于，使水稻表达高粱α-淀粉酶基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的调控是降解水稻花粉中淀粉或诱导水稻雄性不育。

8.一种利用高粱α-淀粉酶降解水稻花粉中淀粉，从而阻止外源转基因成分扩散的方法，其特征在于，将含有高粱α-淀粉酶基因的表达盒导入水稻中获得转基因花粉败育的转基因水稻，使水稻中转基因花粉无法正常授粉，从而阻止水稻花粉中外源基因扩散，

所述的高粱α-淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

9.利用含有高粱α-淀粉酶基因的转基因水稻生产非转基因种子的方法，其特征在于，将含有高粱α-淀粉酶基因的转基因水稻作为杂交作物中保持系授粉给水稻雄性不育系，不育系结实收获种子，该种子为非转基因种子，实现杂交种制种；

所述高粱α-淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

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