CN109679949B - 调控miR156及其靶基因IPA1同时提高水稻抗病与产量的育种方法 - Google Patents

调控miR156及其靶基因IPA1同时提高水稻抗病与产量的育种方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109679949B
CN109679949B CN201811002033.4A CN201811002033A CN109679949B CN 109679949 B CN109679949 B CN 109679949B CN 201811002033 A CN201811002033 A CN 201811002033A CN 109679949 B CN109679949 B CN 109679949B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
mir156
expression
osspl7
osspl14
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811002033.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109679949A (zh
Inventor
杨东雷
刘明明
汪明璇
张笑寒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN201811002033.4A priority Critical patent/CN109679949B/zh
Publication of CN109679949A publication Critical patent/CN109679949A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109679949B publication Critical patent/CN109679949B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种既能提高水稻农业生产性状又能提高白叶枯病抗病能力的基因的应用，包括水稻miR156、水稻miR156的靶基因在提高水稻抗白叶枯病中的应用。并提供一种培育抗白叶枯转基因水稻的方法，该方法包括构建含有OsSPL7或OsSPL14的超表达载体，将构建的超表达载体转化水稻，使水稻OsSPL7或IPA1/OsSPL14表达上调，得到抗白叶枯病转基因水稻；或下调水稻作物中miR156的表达，使miR156的靶基因OsSPL7和OsSPL14(IPA1)表达上调，得到抗白叶枯病转基因水稻。本发明以不影响生长发育甚至可以改善水稻株型，穗型等农艺性状为前提，以microRNA为出发点，提供了一种既影响水稻株型、穗型，又可以增强水稻抗白叶枯病基因资源。

Description

调控miR156及其靶基因IPA1同时提高水稻抗病与产量的育种 方法
技术领域
本发明属于水稻遗传育种领域，具体涉及miR156及其靶基因OsSPL7、IPA1(即OsSPL4),在提高产量的同时增强抗病的育种应用。水稻miR156负调控SPL(Squamosapromoter binding protein like)家族基因的表达，下调miR156的表达会提高靶基因OsSPL7、OsSPL14(IPA1)的表达。利用水稻遗传转化技术，通过miR156靶基因模拟技术(MIMIC)抑制miR156的功能和超表达miR156的两个靶基因OsSPL7和OsSPL14(IPA1)，获得稳定的转基因水稻。结果表明，下调miR156和上调OsSPLs可以增强水稻的白叶枯病抗性和产量。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类广泛存在于植物、动物中的非编码RNA，其长度大约为21-24nt。miRNA的作用是通过与靶基因的messenger RNA(mRNA)互补配对，进而降解mRNA或者抑制mRNA的蛋白翻译，最终下调靶基因的功能。
miR156的靶基因为SPLs(Squamosa promoter binding protein like)，在水稻中SPLs家族有十九个基因，其中11个是miR156的靶基因，分别为OsSPL2，OsSPL3，OsSPL4，OsSPL7，OsSPL11，OsSPL12，OsSPL13，OsSPL14(IPA1)，OsSPL16，OsSPL17，OsSPL18。
水稻中的IPA1/OsSPL14可以通过改变水稻植株的株型提高稻谷产量。微量上调表达IPA1/OsSPL14降低了水稻的分蘖数目，但是增加了有效分蘖数，最终提高水稻产量。OsSPL16的过表达株系可以增加水稻种子宽度提高稻谷产量，OsSPL16的正向调节作用可以促进细胞分裂过程，但水稻的质量下降。OsSPL13蛋白在栽培稻中参与水稻谷粒大小的调控。
之前的科学研究的总体上是植物免疫的科学家重点研究病原菌如何成功入侵宿主以及植物如何启动防御反应这些生物学过程，而植物发育的科学家集中精力研究植物生长发育过程中的分子通路及网络。但是植物免疫与生长同时考虑的科学研究却比较少，造成了实验室中克隆的抗病基因在农业中只有较少的能使用，而参与生长发育的基因在育种中大规模应用有造成农作物比较感病的潜在风险。因此，挖掘和应用既能提高农业生产性状又能提高抗病能力的基因，对于研究植物如何应对外界环境从而改变生长有重要的理论意义，同时对于稳定粮食产量，保证我国粮食安全有重大的现实意义。
作为小RNA的一类microRNA是一类在动物，植物中长21-23nt的小非编码RNA,通过一系列的合成和作用机制，它们可以在转录后降解mRNA或者通过抑制蛋白翻译来行使生物学功能(Li et al.,2014,Ha and Kim,2014,Coruh et al.,2014)。之前的研究表明，miRNA可以在植物或者动物的发育过程中起到重要的调控作用(Li et al.,2014)。近年来，在植物中也发现small RNA 在植物－病原菌相互作用中起到了重要的作用(Katiyar-Agarwaland Jin,2010,Seo et al.,2013)。但是在水稻－白叶枯相互作用中miRNA156所起的作用还未有报道。
综上所述，以不影响生长发育甚至可以改善水稻株型，穗型等农艺性状为前提，以microRNA为出发点，发现研究和利用水稻抗白叶枯病新的抗病基因资源，对于水稻分子设计育种有着重要的意义。
发明内容
本发明目的是针对现有技术的不足，可以提供一种既影响水稻株型、穗型，又可以增强水稻抗白叶枯病基因资源。
本发明第一个目的是提供水稻miR156在调控水稻白叶枯病抗性中的应用。
进一步的，所述水稻miR156的成熟序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述的水稻miR156的前体miR156f的序列如SEQ ID NO.2所示；所述水稻miR156的成熟序列为前体miR156f序列自5’段4bp～23bp的一段RNA序列；编码所述miR156f的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供水稻miR156的靶基因在提高水稻抗白叶枯病中的应用，所述靶基因为OsSPL7和OsSPL14(IPA1)，miR156的靶基因成员中，OsSPL7和OsSPL14(IPA1)与水稻白叶枯病抗性紧密联系，所述OsSPL7序列如SEQ ID NO.4所示，所述OsSPL14(IPA1)序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第三个目的是提供上述任一项所述应用的研究方法，所述研究方法包括以下步骤：
1)上调水稻miR156表达，使其靶基因表达下调；
2)下调水稻miR156表达，使其靶基因表达上调；
3)直接上调水稻miR156的靶基因表达；
4)确定水稻miR156及其靶基因在调控水稻白叶枯病抗性中的功能。
本发明的第四个目的是提供一种培育抗白叶枯转基因水稻的方法，所述方法为上调水稻作物中OsSPL14(IPA1)和/或OsSPL7的表达。
进一步的，所述上调水稻作物中OsSPL7和/或OsSPL14(IPA1)的表达通过以下步骤实现：
构建含有OsSPL7或OsSPL14的超表达载体，将构建的超表达载体转化水稻，使水稻OsSPL7或OsSPL14(IPA1)表达上调，得到抗白叶枯病转基因水稻；
或下调水稻作物中miR156的表达，使miR156的靶基因OsSPL7和OsSPL14(IPA1)表达上调，得到抗白叶枯病转基因水稻。
进一步的，所述下调水稻作物中miR156的表达通过以下步骤实现：
S1：构建含有miR156MIMIC的超表达载体MIM156OE，所述miR156MIMIC为miR156的靶模拟基因，能够竞争性地抑制miR156的表达；
S2：将S1构建的超表达载体MIM156OE转化水稻，特异性下调水稻miR156的表达。
进一步的，S1中所述miR156MIMIC序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明技术方案所实现的有益效果为：
水稻miR156负调控水稻SPL家族基因的表达，下调miR156的表达会提高靶基因OsSPL基因的上调表达。miR156及其靶基因OsSPLs在水稻的生长和发育方面起着关键的调控作用，控制着水稻的株型和穗型，对水稻的产量影响有着非常重要的贡献。
在此基础上，发明人首次发现miR156及其靶基因OsSPLs对水稻的抗病发挥着重要作用。在水稻中，下调miR156和上调OsSPLs基因的表达，可以明显增强对白叶枯病的抗性。
这对水稻育种提供了重要的基因资源，以不影响生长发育甚至可以提高株型、穗型等农艺性状为前提，以microRNA为出发点，提供水稻抗白叶枯病的新的基因资源，平衡水稻发育和抗病，在水稻分子设计育种育成高产高抗水稻新品种中，将发挥重要的作用。
附图说明
图1：实施例1中Northern分析白叶枯病菌PXO99A接菌诱导水稻miR156表达上调；
hpi：(hours post inoculation)接种后小时。U6:RNA上样量内参。
图2：实施例1中荧光定量PCR分析白叶枯病菌PXO99A接菌后，部分miR156靶基因OsSPLs表达呈现动态变化。
图3：实施例2中下调miR156提高有效分蘖数及增强水稻白叶枯病抗性
a.miR156下调表达的三个转基因株系M4，M12和M13及野生型水稻中花11(ZH11)的株型。
b.Northern blot鉴定miR156表达下调。
c.水稻分蘖盛期白叶枯病菌PXO99A剪叶法接菌14天后ZH11及转基因株系的病斑叶片，图片显示转基因株系病斑比野生型缩短约40％-50％。
d.接菌14天后病斑长度统计，显示病斑长度明显缩短。双星号(**)表示转基因株系与野生型对照中花11(ZH11)相比差异显著，P<0.01。
图4：实施例3中上调miR156降低有效分蘖数及减弱水稻白叶枯病抗性
a.miR156上调表达的两个转基因株系miR156fOE-2和miR156fOE-5及野生型水稻中花11(ZH11)的株型。
b.Northern blot鉴定转基因株系miR156表达上调。
c.水稻分蘖盛期白叶枯病菌PXO99A剪叶法接菌14天后ZH11及转基因株系的病斑叶片，图片显示miR156上调表达的转基因株系病斑比野生型增长约10％-20％。
d.接菌14天后病斑长度统计，显示病斑长度明显变长。双星号(**)表示转基因株系与野生型对照中花11(ZH11)相比差异的显著性水平在P<0.01。
图5：实施例4中超表达OsSPL14提高有效分蘖数及增强水稻白叶枯病抗性
a.OsSPL14超表达的三个转基因株系L1，L5和L8及野生型水稻日本晴(NIP)的株型。
b.荧光定量PCR鉴定转基因株系OsSPL14表达上调。
c.水稻分蘖盛期白叶枯病菌PXO99A剪叶法接菌14天后NIP及转基因株系的病斑叶片，图片显示OsSPL14超表达的转基因株系病斑比野生型缩短约40％-60％。
d.接菌14天后病斑长度统计，显示病斑长度明显缩短。双星号(**)表示转基因株系与野生型对照日本晴(NIP)相比差异的显著性水平在P<0.01。
图6：实施例5中上调表达OsSPL7提高有效分蘖数及增强水稻白叶枯病抗性
a.OsSPL7上调表达的三个转基因株系7F-2，7F-5和7F-10及野生型水稻中花11(ZH11)的株型。
b.荧光定量PCR鉴定转基因株系OsSPL7表达上调。
c.水稻分蘖盛期白叶枯病菌PXO99A剪叶法接菌14天后ZH11及转基因株系的病斑叶片，图片显示OsSPL7上调表达的转基因株系病斑比野生型缩短约40％-60％。
d.接菌14天后病斑长度统计，显示病斑长度明显缩短。双星号(**)表示转基因株系与野生型对照ZH11相比差异的显著性水平在P<0.01。
图7：构建含有miR156MIMIC的超表达载体MIM156OE、含有miR156f的超表达载体mi156fOE、含有OsSPL14的超表达载体OsSPL14OE采用的基础载体p1301-35SNos质粒结构示意图
图8：构建含有OsSPL7的超表达载体OsSPL7-OE采用的基础载体pCAMBIA1305.1质粒结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中所涉及的原料，如无特别说明均为市售，所涉及检测方法如无特别说明，则均为常规方法。
涉及的专业名词解释
1、miRNA及其前体：MicroRNA (miRNA)是一类在生物体内普遍存在的非编码、长度约21个核苷酸的小分子RNA,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。miRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300～1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70～90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20～24nt的成熟miRNA。
2、miR156及其前体miR156f：miR156最早在拟南芥中发现的一类20个核苷酸的小分子RNA，在水稻中预测有12个同源的miR156前体基因，分别是miR156a-j。其中miR156f就是其中预测来源于水稻第八号染色体的一个miR156前体基因。在植物中miRNA主要功能是与靶向基因的messenger RNA(mRNA)互补配对，通过降解或者抑制mRNA的翻译来下调其靶基因的功能。miR156的靶基因为SPLs(Souamosa promoter binding protein-like)基因，在水稻中SPLs家族有十九个基因，其中11个是miR156的靶基因，分别为OsSPL2，OsSPL3，OsSPL4，OsSPL7，OsSPL11，OsSPL12，OsSPL13，OsSPL14，OsSPL16，OsSPL17，OsSPL18。
3、靶模拟基因miR156MIMIC：
本发明还提供了一种针对水稻miR156的miR156MIMIC，所述的miR156MIMIC为miR156的靶模拟基因，竞争性地抑制miR156的表达，miR156MIMIC的序列为：(SEQ IDNO.6)。
4、miR156fOE：miR156f over expression，含有水稻miR156f的超表达载体。
5、MIM156OE：含有miR156MIMIC的超表达载体，实现水稻miR156靶基因模拟序列miR156MIMIC超表达，从而对miR156的作用进行干扰。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法构建含有miR156MIMIC的超表达载体MIM156OE。
实施例1 miR156northern分析及OsSPLs表达模式鉴定
分蘖盛期的水稻日本晴叶片注射接种白叶枯病菌PXO99A(OD值为0.6)，分7个时间点(0、6、12、24、48、72、120hpi)取样接菌的叶片，每个时期的样品混三个叶片，提取7个接菌时期的总RNA，用于鉴定miR156和靶基因OsSPLs基因的表达。(hpi：hours postinoculation，接种后小时)
1.1白叶枯病菌PXO99A病菌培养：
PSA培养基
Figure BDA0001783188240000061
1.2 Trizol法提取总RNA：
7个接菌时期所取的水稻叶片样品分别进行如下操作，得到7个接菌时期的总RNA：
(1)称取0.1g新鲜的叶片，用研钵在液氮中迅速研磨，彻底粉碎后迅速转移到1.5mL的离心管(液氮预冷)中。并在离心管中加入1mL Trizol，冰上放置10min；
(2)加入100uL氯仿，剧烈震荡30S，冰上放置5min；
(3)4℃，13000rpm，10min；
(4)转移上清于另一个新1.5ml RNase-Free离心管中，加等体积异丙醇轻轻颠倒混匀，室温放置10min；
(5)4℃，13000rpm，15min；
(6)弃去上清，加入500uL RNase-Free 75％乙醇，洗涤两次；
(7)倒掉乙醇，室温放置约10min；
(8)加50uL RNase-Free水，65℃金属浴保温15min后，-80℃保存备用；
1.3 RNA印迹(Northern blot)分析：
尿素甲叉丙烯酰胺凝胶凝胶制备：
22ml 40％Acr-Bis
21.25g urea
5ml 10xTBE
加水至50ml
加25μl TEMED,250μl 10％过硫酸铵，混匀灌胶。
凝胶约1-2小时后电泳(电泳缓冲液1xTBE)。
样品准备：取1.2提取得到的7个接菌时期的总RNA各30μg，分别加入等体积的上样缓冲液(Ambion,AM8547)。65℃变性5分钟后直接放置冰上，上样，U6为内参，电泳(100V，16h)，转膜(400mA，2h)。
1.4水稻miR156印迹(blotting)分析：
miR156探针制备
直接合成探针序列：gtgctcactctcttctgtca(SEQ ID NO.8)，利用[γ-32P]ATPT4polynucleotide kinase(NEB)末端标记探针序列。
探针杂交：
1)RNA膜首先在杂交炉内38℃预杂交1-3小时。
2)之后加入标记好的探针38℃杂交炉过夜。
3)用2xSSC·0.1％SDS for 10min 38℃洗两次。
4)磷屏压膜，扫膜，检测7个接菌时期的miR156表达。
其他细节步骤都是常规已知的配方和市场常用的试剂盒，没有特殊的处理，不做赘述。
实验结果如图1所示：水稻miR156受白叶枯病菌PXO99A诱导上调表达，且水稻miR156的表达在接种后6小时后表达明显上调。
1.5荧光定量PCR分析白叶枯病菌PXO99A接菌后部分水稻miR156靶基因OsSPLs表达
本研究分为OsSPL2、OsSPL3、OsSPL4、OsSPL7、OsSPL11、OsSPL12、OsSPL14、OsSPL16实验组，
以下为各靶基因实验组定量基因genbank编号及引物序列：
Figure BDA0001783188240000071
Figure BDA0001783188240000081
荧光定量PCR(内参基因泛素基因Ubiqutin都是常规已知的配方和市场常用的试剂盒，没有特殊的处理，不做赘述。
实验结果如图2所示，荧光定量PCR分析白叶枯病菌PXO99A接菌后部分水稻miR156靶基因OsSPLs表达呈现动态变化，且在接菌48h后，OsSPLs表达都上调。
实施例2利用miRNA靶基因模拟技术构建水稻miR156特异性下调的转基因植株
转化用水稻为：野生型水稻中花11(ZH11)。
2.1含有miR156MIMIC的超表达载体MIM156OE构建方法为：
1)用IPSF和IPSR引物克隆拟南芥基因IPS的cDNA序列，通过BamHⅠ和SacⅠ酶切，将该片段连接PBSk载体。
2)利用MIM156-I引物与IPSR引物配对和MIM156R引物与IPSF引物配对，以IPS连接PBSK之后的质粒为模板，扩增出两个含有末端同源的序列。
3)以第二步得到的两段序列为模板，利用重叠PCR的技术，以IPSF和IPSR为引物，扩增出含有MIMIC156序列的IPS片段(IPS-MIMI156)。
4)以IPSF和IPSR扩增得到目的片段，通过BamHⅠ和SacⅠ酶切，把IPS-MIMI156片段连接p1301-35SNos质粒得到水稻miR156靶基因模拟的转基因超表达载体MIM156OE。miR156MIMIC序列如SEQ ID NO.6所示，该载体MIM156OE的全序列见SEQ ID NO.7。
IPSF：GTGGATCCaagaaaaatggccatcccctagc(SEQ ID NO.27)
ISPR：CTGGAGCTCgaggaattcactataaagagaatcg(SEQ ID NO.28)
MIM156-I：cgaagctUGACAGAAGAtagaAGUGAGCATtttctagagggagataa(SEQ IDNO.29)
MIM156-II：cctctagaaaATGCTCACTTCTATCTTCTGTCAagcttcggttcccctcg(SEQ IDNO.30)
2.2转化、侵染方法为：
1.水稻成熟种子去皮，挑选健康完整的种子。2.用70％乙醇清洗浸泡2-3分钟，洗两到三次，然后用10％的次氯酸钠溶液清洗30分钟。3.无菌水洗三到四次。4.将去皮的种子置于无菌滤纸上吹干。5.将吹干的种子摆放到诱导培养基上，黑暗培养15-20天，直到长出黄色较大的愈伤组织。6.剥下愈伤，转至继代培养基上黑暗培养两周。7.共培养。含有阳性质粒载体的农杆菌EHA105与愈伤组织在液体共培养基中轻轻摇晃培养30分钟，共培养后的愈伤组织转移至无菌滤纸晾干。8.晾干后的愈伤组织转移至共培养基中，培养2-3天。9.用含有抗生素特美汀的无菌水清洗愈伤组织后转移至含有50mg/L潮霉素的筛选培养基中，黑暗培养2-3周。转至50mg/L的二筛培养基中黑暗培养，直至长出新的愈伤组织。10.转移新的愈伤组织到分化培养基中，长出水稻苗后转移至生根培养基。11.在生根培养基长至壮苗时移栽到田间。
将超表达载体MIM156OE，通过农杆菌EHA105的介导，遗传转化到野生型水稻中花11(ZH11)中，达到对MIM156进行超表达，从而实现对miR156的功能进行干扰的目的，特异的下调miR156的表达，并因此上调miR156靶基因OsSPLs，包括OsSPL7和OsSPL14的表达。得到三个转基因株系M4，M12和M13。M4，M12和M13与野生型水稻中花11(ZH11)相比，Northernblot鉴定确定miR156表达下调(图3b)。
实验结果如图3所示，miR156下调表达的三个转基因株系M4，M12和M13与野生型水稻中花11(ZH11)株型相比株高变矮，分蘖减少(图3a)。观察水稻分蘖盛期白叶枯病菌PXO99A剪叶法接菌14天后ZH11及转基因株系的病斑叶片，图3c、图3d显示，接菌14天后统计病斑长度，MIM156OE转基因株系病斑比野生型缩短约40％-50％，病斑长度明显缩短。研究确定miR156MIMIC相比其野生型，对水稻白叶枯病存在非常强的抗性。
实施例3 miR156上调的水稻突变体
转化用水稻为：野生型水稻中花11(ZH11)。
3.1含有miR156f的超表达载体miR156fOE构建方法为：
以水稻日本晴DNA做模板，用miR156fOE-F和miR156fOE-R引物克隆水稻miR156的前体miR156f，并连接p1301-35SNos质粒，得到含有miR156f(SEQ ID NO.2所示)的超表达载体mi156fOE。
miR156fOE-F：GGGATCCttttgggtggtggcagttga(SEQ ID NO.31)
miR156fOE-R：GGGTACcaaagccgtctcctccctcc(SEQ ID NO.32)
3.2转化、侵染方法同实施例2。
将miR156fOE载体经过冻融法转化市售的农杆菌EHA105，遗传转化到野生型水稻中花11(ZH11)中，通过超表达miR156的前体miR156f，获得两个miR156过量表达的转基因株系miR156fOE-2和miR156fOE-5。miR156fOE-2和miR156fOE-5及野生型水稻中花11(ZH11)相比，Northern blot鉴定确定miR156表达上调(图4b)。
实验结果如图4所示，miR156上调表达的两个转基因株系miR156fOE-2和miR156fOE-5及野生型水稻中花11(ZH11)的株型相比，植株变矮，分蘖增多(图4a)。观察水稻分蘖盛期白叶枯病菌PXO99A剪叶法接菌14天后ZH11及转基因株系的病斑叶片，图4c、图4d显示，接菌14天后统计病斑长度，显示miR156fOE转基因株系病斑比野生型增长约10％-20％，病斑长度明显变长，对水稻白叶枯病的抗性减弱。
实施例4 OsSPL14上调的水稻材料
转化用水稻为：野生型水稻日本晴(NIP)。
4.1含有OsSPL14的超表达载体OsSPL14OE的构建方法为：
利用Flc-cDNA数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)包含OsSPL14cDNA(AK107191)的克隆，编号为002-125-A04，然后用KpnI和NotI酶切连入pCambia1301-35SN载体上(图7)，用该载体上的35S启动子驱动OsSPL14cDNA超表达。
4.2转化、侵染方法同实施例2。
将OsSPL14OE载体，通过农杆菌EHA105的介导，遗传转化到野生型水稻日本晴(NIP)中，达到对OsSPL14的超表达。得到三个转基因株系L1，L5，L8。L1，L5，L8及野生型水稻日本晴(NIP)相比，荧光定量PCR鉴定转基因株系OsSPL14表达上调。(图5b)。
实验结果如图5所示，OsSPL14超表达的三个转基因株系L1，L5，L8及野生型水稻日本晴(NIP)的株型相比，株高变矮，分蘖减少(图5a)。观察水稻分蘖盛期白叶枯病菌PXO99A剪叶法接菌14天后NIP及转基因株系的病斑叶片，图5c、图5d显示，接菌14天后统计病斑长度，显示OsSPL14-OE转基因株系病斑比野生型缩短约40％-60％，病斑长度明显缩短。研究确定超表达OsSPL14转基因植株相比其野生型，对水稻白叶枯病存在非常强的抗性。
实施例5 OsSPL7上调的水稻材料
转化用水稻为：野生型水稻中花11(ZH11)。
5.1含有OsSPL7的超表达载体OsSPL7-OE的构建方法为：
以水稻日本晴DNA做模板，用SPL7OEF和SPL7OER引物克隆水稻OsSPL7启动子和基因组DNA序列，并连接pCAMBIA1305.1质粒，得到OsSPL7-OE载体。
SPL7OEF：GGGAGCTCggccggtggtgttaacg(SEQ ID NO.33)
SPL7OER：GGGATCCgaccacgcgggcgccctcc(SEQ ID NO.34)
5.2转化、侵染方法为同实施例2。
将OsSPL7-OE载体，通过农杆菌EHA105的介导，遗传转化到野生型水稻中花11(ZH11)中，达到对OsSPL7的超表达。得到三个转基因株系7F-2，7F-5和7F-10。7F-2，7F-5和7F-10及野生型水稻中花11(ZH11)相比，荧光定量PCR鉴定转基因株系OsSPL7表达上调。(图6b)。
实验结果如图6所示，OsSPL7上调表达的三个转基因株系7F-2，7F-5和7F-10及野生型水稻中花11(ZH11)的株型相比，株高变矮，分蘖减少(图6a)。观察水稻分蘖盛期白叶枯病菌PXO99A剪叶法接菌14天后ZH11及转基因株系的病斑叶片，图6c、图6d显示，接菌14天后统计病斑长度，显示OsSPL7-FLAG转基因株系病斑比野生型缩短约40％-60％，病斑长度明显缩短。研究确定超表达OsSPL7转基因植株相比其野生型，对水稻白叶枯病存在非常强的抗性。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 调控miR156及其靶基因IPA1同时提高水稻抗病与产量的育种方法
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
ugacagaaga gagugagcac 20
<210> 2
<211> 186
<212> RNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 2
aguugacaga agagagugag cacacagcgg ccagacugca ucgaucuauc aaucuucccu 60
ucgacaggau agcuagauag aaagaaagag aggccgucgg cggccaugga agagagagag 120
agagagagau gaaaugauga ugaugauaca gcugccgcug cgugcucacu ucucuuucug 180
ucagcu 186
<210> 3
<211> 186
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 3
agttgacaga agagagtgag cacacagcgg ccagactgca tcgatctatc aatcttccct 60
tcgacaggat agctagatag aaagaaagag aggccgtcgg cggccatgga agagagagag 120
agagagagat gaaatgatga tgatgataca gctgccgctg cgtgctcact tctctttctg 180
tcagct 186
<210> 4
<211> 3226
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 4
ttacaaccgc cgccgcagcc tttttcccaa tcggcgctag ttttcgatcc gccgccgtcg 60
gccggagcga agccaagccc gcgcgaccag gtggctgctg ctgtgtaacg acgctagcta 120
gcttagctgc ggtacgttta cacataggtc cgtccgtgtg cggctgccac catggaagga 180
aacggctgcg gcggaagcgg ggcgacacca cgtggtgtcg ttgggatgca ctgggctccc 240
gtcgtcacct cgccgcctag cccgcagccg ccgttcctcc cgccggcgcc atgcaggccc 300
gacgtccaga tgcaacagca aggcgggctg acctgcctca agctcgggaa gcggccgtgc 360
ttctggggtg gcgacggcgc cggccaggtg gcgcagggga gcggcggcgg cggaggcgga 420
ggcggtggtg gttccgcgga tcaggggaag aggaaggaga aggcggcgac ggcggtgccg 480
gtggtgcccc gttgccaggt ggaggggtgc gacattacgc tccagggagt caaggagtac 540
caccggcggc acaaggtgtg cgaggtgcac gccaaggccc cgagggtcgt cgtgcacggc 600
accgagcagc gcttctgcca gcaatgcagc cggtgcgtca atcaccacga tctacgtcac 660
atgtctagct ctgctacacg cgtgctcata gcggtctttc acttgtacgc gcaggttcca 720
cgtgctcgcg gagtttgacg acgccaagaa gagctgccgg cggcggctgg ccgggcacaa 780
cgagaggcgg cggaggagca acgccagcga ggccatggcc aggggctctg cgcacccaca 840
cggtatacac aaaacaaact cctcccgtcc cggccgtaac agttccatta atcatcatac 900
tactagtacg tgtagtacgt acgtactact cccagtaata gttagggaga ccaatggaga 960
ggcaggttag ctgcacaaac aggagcgtac cactcccagt agtaggagta ctggttggtt 1020
tgatgccggg aaacaagggg agagctgcag gtgcgcacca aaaagctcat cgggatgtgt 1080
gagacgctga gagcacagat tttaatgcac gactttatgt gcactgcgct gcctgcctgg 1140
ccggcccagc cagcctgctt gcttggagtg gcagtggctg cgtggccact ggccaggccg 1200
accgtgcata tgatcaccat ggcatcaaca ggaacccgcg cgccgggtgg tcgctgcgca 1260
cgcaacacgg caaacagtgg tttcatccat ccatcttcca ctccttatca agagcctgta 1320
tgcttacgga aatctatact actacgtact agtactacta ctccagtacg catgtacata 1380
catacgcgta caactgtaca gttaattacg aatagttact gtacgaaggt atagtgctat 1440
agcgggactg gccgaaagac ttggacatac ggcggtcgaa tttcatagcg gcattctagg 1500
atattcaagc gtgtattgat tgatattgat atgctttcat gagtatagtt gtactactga 1560
ccttcaaagg taagcacggc tctgcagttc agaaaccttg tatatatgta tactcctttt 1620
gtcccataaa aaaacaatat agtgtcagat atgacttatt ctaatactac gaattttgat 1680
atacatctgt ccagattcat agatttattt ttataggaag gagggagtac tccttttagt 1740
ctaccactac ctttctcttg ttctgagaaa ctattactcc tgcagtagaa aatacagtac 1800
atggtactcc tgctgcactg acatagatcc tgtagatgaa catgccttat attctgtgat 1860
aacttatgta ctccagtatt tatgtggact ttgatttgga gtaggtcctt ctggctgtct 1920
tacagagaaa tattatggaa tgcaagattt aagttagttg cctcaaacaa taaagacatt 1980
aacaatcgta accaccacaa actttcgtgt caacataatc aacaacagca taatgggcct 2040
atcttggtta acaataacat tagtacgtat taccatggac ctaaacttga catcaaggtc 2100
gagtgcacgt ttttactatg ctagtgaccc aaagcccatc agcattattg accacttgaa 2160
acctgttatt tgatcaacac atagacatga tgttgtggaa gatcaggtag cgatcagttt 2220
gtgtaaagat atatagtata gtatcaatta gttgtacccg gtgaacatgc atggttggtt 2280
ggttttaaac tttgtaaatt tggttgcaaa tgatcagggc aagcatgcaa aaatgattgc 2340
ggttgagtaa ccacttcgtt attaggactg atggtgtgca ttatgctttc ttgatatgac 2400
tataacagat ggccacattt ctgtaggcac aatgatatgc ataataacgt gtcgacgttg 2460
ttgttgcagg tatgccggtg ctgggacacg gtttcccgcc gtacggcctg ccgacgtcgt 2520
cggctggtgc tctctctctt ctgtcatcgg ctagagccac cggcccatgg ctgatgccga 2580
cgcccgacat ctccgcccgc tcaagcgcgg cgctcgacga gctcatcgcc gagaaccgcg 2640
cggccctcct ctcgtggcaa ttcttctccg accgacagcc gccaccagct ggccgtccaa 2700
cgggccgcag cccgggctcc gaaacggccg gtggctggca cgcgcacctg caggcgcggc 2760
cgccaccgcc cggcgccgga gggcagcacg agaatcagtc ggggcacgtg acgctcgacc 2820
tcatgcaggc caccaccgcg gcaggaggca gcggcgcgcc gttccggccc gtgccagcga 2880
ggccccccaa ggagggcggc gacgccggct gcacctccga cgcgtggacg ccgtcgccca 2940
tggagggcgc ccgcgtggtc tgagtgtccg acctgccagc cgcgacgtcg ccgcgcgtgc 3000
accacggtcc ctagctcccg tgtcagctgg gcgtgggaag cgatcgatca gtggtgggcg 3060
cgcgcgcacg gctggagctc tgtcccgacg ccgcgcgcag ccgtgcaatc aacttgagtt 3120
cgttggacaa tagtgtctcg tctcgtagca atctatcccg atgtagcagt actggtgcag 3180
tggtggtggt ggtgccacta gctagcaatg ttctattttt tcgctc 3226
<210> 5
<211> 4156
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 5
ttccgtctct ttcctctctc ttctctctcc ccctctcctg gaggagagag aggagaagag 60
gagggggggc cgcgccaaga gccacgcgcg ctacagtctc cttcccaccc gcgaccgcga 120
gcaatggaga tggccagtgg aggaggcgcc gccgccgccg ccggcggcgg agtaggcggc 180
agcggcggcg gtggtggtgg aggggacgag caccgccagc tgcacggtct caagttcggc 240
aagaagatct acttcgagga cgccgccgcg gcagcaggcg gcggcggcac tggcagtggc 300
agtggcagcg cgagcgccgc gccgccgtcc tcgtcttcca aggcggcggg tggtggacgc 360
ggcggagggg gcaagaacaa ggggaagggc gtggccgcgg cggcgccacc gccgccgccg 420
ccgccgccgc ggtgccaggt ggaggggtgc ggcgcggatc tgagcgggat caagaactac 480
tactgccgcc acaaggtgtg cttcatgcat tccaaggctc cccgcgtcgt cgtcgccggc 540
ctcgagcagc gcttctgcca gcagtgcagc aggtcactct ctcactcacc tcgccattgc 600
tgatgtcacc actgcttttg ctttgctttg cttgctctcc ctcctctttc acctatctct 660
cttgtttatt tgcttcttgt tcttgtttag tgctagtaca tgtgttgtta ttgttgtgcc 720
gttttgtctt ttgggttatt gtgttgttgt tactactcgt tttactatag gtttttaagg 780
tttatgagca cggccaccac attagatgca ctgtcaagtg gtgtgtgtgg gacctttcct 840
gctaaaacaa gctgatttca actctctgaa acttcctgca tttcatctat ttttatcttt 900
gattgtgttg ggagtactac actagtagtg ttaatatttt gactggtgct tatgagattt 960
ttaagttggt aggttgatga ggaaaatact cctttatatg gttgagtgat gtgacttgcc 1020
tgtctgcctg cctgcctgcc gctttgcata agattcctct gtgttagtaa gagccactgt 1080
ttatttgtac tggtgcttac tctacttagt taattagcca ttagctataa aattccgttg 1140
atgttgcaag cttagcaatg gccacggtaa gaatgggaga gagaagttgg ctaaagctgt 1200
tgctttgtag tttgtactat atatgtgtct ttgtgttgca agatatgcaa ctcctactat 1260
gctgtgactt gagctcaagg ttttcagtta tctatagatc cttactacta ctgagcatac 1320
taccacttct gtatggtagc atatggtagc atagtccaag ttccaacgcc tcgccagttg 1380
ttcataatct atactaccac ttctgtgcat ttgttacttt tatttaatag tttgtctcat 1440
tagctgacaa gcatatgcct gttttgatat ctgcccctct tgtaatagtc tatggatagc 1500
ttggactgtt tgatgcttta attttttact agcaacactt agggcccctt tgaaatggag 1560
gattagcaaa ggaattttgg aggattcatt ttcctaagga ttttttccta tagagccctt 1620
tgattcatag aaagaggata ggaaaacttc cgtaggattg cattcctatg atcaattcca 1680
taggaaaata agcaagaggt tagacctctt gtgaaacttt cctttgttga gtgtatcttg 1740
tggtataatc aaagggctct tctctccatt tcatgtgttt tcaattcctg taggattgga 1800
aaaacataca acttcaattc ctacgttttt cctattccta tgtttttcct atcctgcgtt 1860
tcaaaggggc ccttaaggat gaagggaagt aagagaaaca tactagagaa tatgtagtag 1920
tatttctaca ttccatattt gtagcactag cccacaaata tctttgcctt gtacttactt 1980
cataccagtt cccccctttt cagagcaaac caacaatttc tgttgcctta tatatctagt 2040
gtcttcgtac taatatatct gttccaaaat gtacctgtcc aaattcatag ctagaaatag 2100
ctttatttag gacggaagta ataactgttg ttagagactt ggttcagact tttggttatg 2160
ttgaggctac tatcatttcc tttacgggcc aaattactac aaatgagaat tcataaaaat 2220
gtcaagattt tatgattgtt gtagctttat ttaggacgga ggtagtaatt gttgttagag 2280
acttggttca gacttttggt tacgttgaag ctactatcat ttcctttatg gtcaaattac 2340
taacaatgag tattcataaa aatgtcaaga ttttataatt gagctgtgcc agtgctaagt 2400
gtgtcactat ctgatgccat aatgcatcat tataaaagcc agatggacca ttagctttta 2460
tgtgtaggac acctgccgtc caattagatg gataaccatc tagtgtttgt gtactgttat 2520
tttaagcccg acatctcaca actccatgaa tgattacagt cttcctttca catggtgtcc 2580
ttttgttgtg ttaggaatag cattttttat ttatgggtgt aattatgaaa ggcactagga 2640
gagttgctgc tttatcttga tgggatttgt agtaatacca tctttaggat gacaagaaat 2700
cttgttctga gttagcatgg gctgcctttt gacctgagct acggtttgct atgtttggct 2760
tgcatcatgc agatctatta ggataataag catataaaag ttgcttgcat tgtgcattgc 2820
ttgttttacc ttgattcatg taggagtaat ttgctcgcca tgcctcgttt tgctttctga 2880
gtcaacagcc aaatttagat gatgtacctt ctgttgcttc aaaaactcag tcactgcaca 2940
gcagcagtgg ataggattca gaatcaatct atccatgatt ctctgttcac ataatatgac 3000
aggttccacc tgctgcctga atttgaccaa ggaaaacgca gctgccgcag acgccttgca 3060
ggtcataatg agcgccggag gaggccgcaa acccctttgg catcacgcta cggtcgacta 3120
gctgcatctg ttggtggtat catcagaggc tcttgttttc tttgcatctt gtgtgtttgt 3180
tggtaactac tggttgcatt cgctgatgtg ttgtttgttg cgattcttga tccagaagag 3240
catcgcaggt tcagaagctt tacgttggat ttctcctacc caagggttcc aagcagcgta 3300
aggaatgcat ggccagcaat tcaaccaggc gatcggatct ccggtggtat ccagtggcac 3360
aggaacgtag ctcctcatgg tcactctagt gcagtggcgg gatatggtgc caacacatac 3420
agcggccaag gtagctcttc ttcagggcca ccggtgttcg ctggcccaaa tctccctcca 3480
ggtggatgtc tcgcaggggt cggtgccgcc accgactcga gctgtgctct ctctcttctg 3540
tcaacccagc catgggatac tactacccac agtgccgctg ccagccacaa ccaggctgca 3600
gccatgtcca ctaccaccag ctttgatggc aatcctgtgg caccctccgc catggcgggt 3660
agctacatgg caccaagccc ctggacaggt tctcggggcc atgagggtgg tggtcggagc 3720
gtggcgcacc agctaccaca tgaagtctca cttgatgagg tgcaccctgg tcctagccat 3780
catgcccact tctccggtga gcttgagctt gctctgcagg ggaacggtcc agccccagca 3840
ccacgcatcg atcctgggtc cggcagcacc ttcgaccaaa ccagcaacac gatggattgg 3900
tctctgtaga ggctgttcca gctgccatcg atctgtcgtc ccgcaaggcg agtcatggaa 3960
ctgaagaacc tcatgctgcc tgcccttatt ttgtgttcaa attttccttt ccagtatgga 4020
aaggaaattc taaggtgact ggcgattaat ctccctgtga tgaataataa tgcgcgccct 4080
tgaactcaat taattgctgt gccgcatcca tctatgtaac tctccatgaa tttttaagta 4140
tcagtgttaa tgctgt 4156
<210> 6
<211> 521
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 6
aagaaaaatg gccatcccct agctaggtga agaagaatga aaacctctaa tttatctaga 60
ggttattcat cttttagggg atggcctaaa tacaaaatga aaactctcta gttaagtggt 120
tttgtgttca tgtaaggaaa gcgttttaag atatggagca atgaagactg cagaaggctg 180
attcagactg cgagttttgt ttatctccct ctagaaaatg ctcacttcta tcttctgtca 240
agcttcggtt cccctcggaa tcagcagatt atgtatcttt aattttgtaa tactctctct 300
cttctctatg ctttgttttt cttcattatg tttgggttgt acccactccc gcgcgttgtg 360
tgttctttgt gtgaggaata aaaaaatatt cggatttgag aactaaaact agagtagttt 420
tattgatatt cttgtttttc atttagtatc taataagttt ggagaatagt cagaccagtg 480
catgtaaatt tgcttccgat tctctttata gtgaattcct c 521
<210> 7
<211> 13090
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 7
gatctgaggg taaatttcta gtttttctcc ttcattttct tggttaggac ccttttctct 60
ttttattttt ttgagctttg atctttcttt aaactgatct attttttaat tgattggtta 120
tggtgtaaat attacatagc tttaactgat aatctgatta ctttatttcg tgtgtctatg 180
atgatgatga tagttacaga accgacgact cgtccgtcct gtagaaaccc caacccgtga 240
aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattga 300
tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt 360
taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg 420
cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt 480
cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta 540
tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtatcac 600
cgtttgtgtg aacaacgaac tgaactggca gactatcccg ccgggaatgg tgattaccga 660
cgaaaacggc aagaaaaagc agtcttactt ccatgatttc tttaactatg ccggaatcca 720
tcgcagcgta atgctctaca ccacgccgaa cacctgggtg gacgatatca ccgtggtgac 780
gcatgtcgcg caagactgta accacgcgtc tgttgactgg caggtggtgg ccaatggtga 840
tgtcagcgtt gaactgcgtg atgcggatca acaggtggtt gcaactggac aaggcactag 900
cgggactttg caagtggtga atccgcacct ctggcaaccg ggtgaaggtt atctctatga 960
actcgaagtc acagccaaaa gccagacaga gtctgatatc tacccgcttc gcgtcggcat 1020
ccggtcagtg gcagtgaagg gccaacagtt cctgattaac cacaaaccgt tctactttac 1080
tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt acgtggcaaa ggattcgata acgtgctgat 1140
ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac tcctaccgta cctcgcatta 1200
cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat ggcatcgtgg tgattgatga 1260
aactgctgct gtcggctttc agctgtcttt aggcattggt ttcgaagcgg gcaacaagcc 1320
gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa cggggaaact cagcaagcgc acttacaggc 1380
gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa ccacccaagc gtggtgatgt ggagtattgc 1440
caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc acgggaatat ttcgcgccac tggcggaagc 1500
aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgcgtc aatgtaatgt tctgcgacgc 1560
tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc ctgaaccgtt attacggatg 1620
gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc agagaaggta ctggaaaaag aacttctggc 1680
ctggcaggag aaactgcatc agccgattat catcaccgaa tacggcgtgg atacgttagc 1740
cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg gagtgaagag tatcagtgtg catggctgga 1800
tatgtatcac cgcgtctttg atcgcgtcag cgccgtcgtc ggtgaacagg tatggaattt 1860
cgccgatttt gcgacctcgc aaggcatatt gcgcgttggc ggtaacaaga aagggatctt 1920
cactcgcgac cgcaaaccga agtcggcggc ttttctgctg caaaaacgct ggactggcat 1980
gaacttcggt gaaaaaccgc agcagggagg caaacaagct agccaccacc accaccacca 2040
cgtgtgaatt acaggtgacc agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa 2100
gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga 2160
attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt 2220
ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg 2280
caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattaaact 2340
atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa 2400
taacggatat ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt atgtgcatgc 2460
caaccacagg gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc aacccctccg ctgctatagt 2520
gcagtcggct tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa acgacatgtc gcacaagtcc 2580
taagttacgc gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc gttttcttgt cgcgtgtttt 2640
agtcgcataa agtagaatac ttgcgactag aaccggagac attacgccat gaacaagagc 2700
gccgccgctg gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg acgaccagga cttgaccaac 2760
caacgggccg aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt tttccgagaa gatcaccggc 2820
accaggcgcg accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctacgccc tggcgacgtt 2880
gtgacagtga ccaggctaga ccgcctggcc cgcagcaccc gcgacctact ggacattgcc 2940
gagcgcatcc aggaggccgg cgcgggcctg cgtagcctgg cagagccgtg ggccgacacc 3000
accacgccgg ccggccgcat ggtgttgacc gtgttcgccg gcattgccga gttcgagcgt 3060
tccctaatca tcgaccgcac ccggagcggg cgcgaggccg ccaaggcccg aggcgtgaag 3120
tttggccccc gccctaccct caccccggca cagatcgcgc acgcccgcga gctgatcgac 3180
caggaaggcc gcaccgtgaa agaggcggct gcactgcttg gcgtgcatcg ctcgaccctg 3240
taccgcgcac ttgagcgcag cgaggaagtg acgcccaccg aggccaggcg gcgcggtgcc 3300
ttccgtgagg acgcattgac cgaggccgac gccctggcgg ccgccgagaa tgaacgccaa 3360
gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg gccaggacga accgtttttc attaccgaag 3420
agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga gccgcccgcg cacgtctcaa 3480
ccgtgcggct gcatgaaatc ctggccggtt tgtctgatgc caagctggcg gcctggccgg 3540
ccagcttggc cgctgaagaa accgagcgcc gccgtctaaa aaggtgatgt gtatttgagt 3600
aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg atgagtaaat aaacaaatac 3660
gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag aaaggcgggt caggcaagac 3720
gaccatcgca acccatctag cccgcgccct gcaactcgcc ggggccgatg ttctgttagt 3780
cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc gtgcgggaag atcaaccgct 3840
aaccgttgtc ggcatcgacc gcccgacgat tgaccgcgac gtgaaggcca tcggccggcg 3900
cgacttcgta gtgatcgacg gagcgcccca ggcggcggac ttggctgtgt ccgcgatcaa 3960
ggcagccgac ttcgtgctga ttccggtgca gccaagccct tacgacatat gggccaccgc 4020
cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat tgaggtcacg gatggaaggc tacaagcggc 4080
ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac gcgcatcggc ggtgaggttg ccgaggcgct 4140
ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc ccgtatcacg cagcgcgtga gctacccagg 4200
cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga atcagaaccc gagggcgacg ctgcccgcga 4260
ggtccaggcg ctggccgctg aaattaaatc aaaactcatt tgagttaatg aggtaaagag 4320
aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt gccggccgtc cgagcgcacg cagcagcaag 4380
gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg ccagccatga agcgggtcaa ctttcagttg 4440
ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg tacgcggtac gccaaggcaa gaccattacc 4500
gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta ccagagtaaa tgagcaaatg aataaatgag 4560
tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat caagaacaac caggcaccga 4620
cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg ccaggcgtaa gcggctgggt 4680
tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac ccccaagccc gaggaatcgg cgtgacggtc 4740
gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt 4800
tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagcacgc cccggtgaat 4860
cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg gcaaccgccg gcagccggtg 4920
cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc gttccgatgc 4980
tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt 5040
cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga gcttccagac gggcacgtag 5100
aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga ttacgacctg gtactgatgg 5160
cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga gacaagcccg 5220
gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg 5280
gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt aaacaccacg cacgttgcca 5340
tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct 5400
tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg 5460
agctagctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa gaacccggac gtgctgacgg 5520
ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg ttttctctac cgcctggcac 5580
gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa gacgatctac gaacgcagtg 5640
gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg 5700
acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc 5760
gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc 5820
tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg tctctttcct gtggatagca 5880
cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa 5940
agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg 6000
atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg 6060
cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc 6120
tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa 6180
tggctggcct acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg 6240
accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 6300
ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 6360
agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 6420
cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 6480
tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 6540
gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 6600
ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 6660
acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 6720
cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 6780
caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 6840
gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 6900
tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 6960
aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 7020
ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 7080
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 7140
tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 7200
tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 7260
ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 7320
aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 7380
aagggatttt ggtcatgcat tctaggtact aaaacaattc atccagtaaa atataatatt 7440
ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca gtaagtcaaa aaatagctcg acatactgtt 7500
cttccccgat atcctccctg atcgaccgga cgcagaaggc aatgtcatac cacttgtccg 7560
ccctgccgct tctcccaaga tcaataaagc cacttacttt gccatctttc acaaagatgt 7620
tgctgtctcc caggtcgccg tgggaaaaga caagttcctc ttcgggcttt tccgtcttta 7680
aaaaatcata cagctcgcgc ggatctttaa atggagtgtc ttcttcccag ttttcgcaat 7740
ccacatcggc cagatcgtta ttcagtaagt aatccaattc ggctaagcgg ctgtctaagc 7800
tattcgtata gggacaatcc gatatgtcga tggagtgaaa gagcctgatg cactccgcat 7860
acagctcgat aatcttttca gggctttgtt catcttcata ctcttccgag caaaggacgc 7920
catcggcctc actcatgagc agattgctcc agccatcatg ccgttcaaag tgcaggacct 7980
ttggaacagg cagctttcct tccagccata gcatcatgtc cttttcccgt tccacatcat 8040
aggtggtccc tttataccgg ctgtccgtca tttttaaata taggttttca ttttctccca 8100
ccagcttata taccttagca ggagacattc cttccgtatc ttttacgcag cggtattttt 8160
cgatcagttt tttcaattcc ggtgatattc tcattttagc catttattat ttccttcctc 8220
ttttctacag tatttaaaga taccccaaga agctaattat aacaagacga actccaattc 8280
actgttcctt gcattctaaa accttaaata ccagaaaaca gctttttcaa agttgttttc 8340
aaagttggcg tataacatag tatcgacgga gccgattttg aaaccgcggt gatcacaggc 8400
agcaacgctc tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc 8460
aaacccggca gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc 8520
cgccttacaa cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt 8580
ggtgattttg tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat 8640
tgtggtgtaa acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg 8700
tactgaatta acgccgaatt aattcggggg atctggattt tagtactgga ttttggtttt 8760
aggaattaga aattttattg atagaagtat tttacaaata caaatacata ctaagggttt 8820
cttatatgct caacacatga gcgaaaccct ataggaaccc taattccctt atctgggaac 8880
tactcacaca ttattatgga gaaactcgag cttgtcgatc gacagatccg gtcggcatct 8940
actctatttc tttgccctcg gacgagtgct ggggcgtcgg tttccactat cggcgagtac 9000
ttctacacag ccatcggtcc agacggccgc gcttctgcgg gcgatttgtg tacgcccgac 9060
agtcccggct ccggatcgga cgattgcgtc gcatcgaccc tgcgcccaag ctgcatcatc 9120
gaaattgccg tcaaccaagc tctgatagag ttggtcaaga ccaatgcgga gcatatacgc 9180
ccggagtcgt ggcgatcctg caagctccgg atgcctccgc tcgaagtagc gcgtctgctg 9240
ctccatacaa gccaaccacg gcctccagaa gaagatgttg gcgacctcgt attgggaatc 9300
cccgaacatc gcctcgctcc agtcaatgac cgctgttatg cggccattgt ccgtcaggac 9360
attgttggag ccgaaatccg cgtgcacgag gtgccggact tcggggcagt cctcggccca 9420
aagcatcagc tcatcgagag cctgcgcgac ggacgcactg acggtgtcgt ccatcacagt 9480
ttgccagtga tacacatggg gatcagcaat cgcgcatatg aaatcacgcc atgtagtgta 9540
ttgaccgatt ccttgcggtc cgaatgggcc gaacccgctc gtctggctaa gatcggccgc 9600
agcgatcgca tccatagcct ccgcgaccgg ttgtagaaca gcgggcagtt cggtttcagg 9660
caggtcttgc aacgtgacac cctgtgcacg gcgggagatg caataggtca ggctctcgct 9720
aaactcccca atgtcaagca cttccggaat cgggagcgcg gccgatgcaa agtgccgata 9780
aacataacga tctttgtaga aaccatcggc gcagctattt acccgcagga catatccacg 9840
ccctcctaca tcgaagctga aagcacgaga ttcttcgccc tccgagagct gcatcaggtc 9900
ggagacgctg tcgaactttt cgatcagaaa cttctcgaca gacgtcgcgg tgagttcagg 9960
ctttttcata tctcattgcc ccccgggatc tgcgaaagct cgagagagat agatttgtag 10020
agagagactg gtgatttcag cgtgtcctct ccaaatgaaa tgaacttcct tatatagagg 10080
aaggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt acgtcagtgg agatatcaca 10140
tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt 10200
gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc 10260
tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggtgcc accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa 10320
gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa 10380
agtctcaata gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atattcttgg agtagacgag 10440
agtgtcgtgc tccaccatgt tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac 10500
gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc 10560
agaggcatct tgaacgatag cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggtgccacc 10620
ttccttttct actgtccttt tgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag 10680
gtttcccgat attacccttt gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt 10740
atctttgata ttcttggagt agacgagagt gtcgtgctcc accatgttgg caagctgctc 10800
tagccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac 10860
gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc 10920
actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt 10980
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacga attctcatgt 11040
ttgacagctt atcatcggat ctagtaacat agatgacacc gcgcgcgata atttatccta 11100
gtttgcgcgc tatattttgt tttctatcgc gtattaaatg tataattgcg ggactctaat 11160
cataaaaacc catctcataa ataacgtcat gcattacatg ttaattatta catgcttaac 11220
gtaattcaac agaaattata tgataatcat cgcaagaccg gcaacaggat tcaatcttaa 11280
gaaactttat tgccaaatgt ttgaacgatc tgcagcccgg gggatccact agttctagag 11340
cggccgccac cgcggtggag ctcggtaccg ggccccccct cgaggtcgac ggtatcgata 11400
agcttgataa actaggtgtt ctctccaaat gaaatgaact tccttatata gaggaagggt 11460
ggattgtgcg tcatccctta cgtcgtgttc tctccaaatg aaatgaactt ccttatatag 11520
aggaagggtg gattgtgcgt catcccttac gtcagtggag atatcacatc aatccacttg 11580
ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc 11640
atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc ttcaacgatg gcctttcctt tatcgcaatg 11700
atggcatttg taggagccac cttccttttc cactatcttc acaataaagt gacagatagc 11760
tgggcaatgg aatccgagga ggtttccgga tattaccctt tgttgaaaag tctcaattgc 11820
cctttggtct tctgagactg tatctttgat atttttggag tagacaagtg tgtcgtgctc 11880
caccatgttg acgaagattt tcttcttgtc attgagtcgt aagagactct gtatgaactg 11940
ttcgccagtc tttacggcga gttctgttag gtcctctatt tgaatctttg actccatggc 12000
ctttgattca gtgggaacta cctttttaga gactccaatc tctattactt gccttggttt 12060
gtgaagcaag ccttgaatcg tccatactgg aatagtactt ctgatcttga gaaatatatc 12120
tttctctgtg ttcttgatgc agttagtcct gaatcttttg actgcatctt taaccttctt 12180
gggaaggtat ttgatttcct ggagattatt gctcgggtag atcgtcttga tgagacctgc 12240
tgcgtaagcc tctctaacca tctgtgggtt agcattcttt ctgaaattga aaaggctaat 12300
ctggggacct gcaggcatgc aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 12360
gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 12420
cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc 12480
gaatgctaga gcagcttgag cttggatcag attgtcgttt cccgccttca gtttagcttc 12540
atggagtcaa agattcaaat agaggaccta acagaactcg ccgtaaagac tggcgaacag 12600
ttcatacaga gtctcttacg actcaatgac aagaagaaaa tcttcgtcaa catggtggag 12660
cacgacacac ttgtctactc caaaaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggca 12720
attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcc ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct 12780
atctgtcact ttattgtgaa gatagtggaa aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat 12840
tgcgataaag gaaaggccat cgttgaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga 12900
cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa 12960
gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg 13020
caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg agagaacacg ggggactctt 13080
gaccatggta 13090
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgctcactc tcttctgtca 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccacggag cggcaagatt c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtagtacggc tcttggaaca c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggctgcaatg ttgatctctc t 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacccgcaac gatgacttta 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtggaagggt gcggggtgga g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaacttggag tgggcctcgc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caatcggcgc tagttttcga 20
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tatgtgtaaa cgtaccgcag ctaag 25
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtttcgcatg ggataataac g 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caaagcattt gacaaacgga ta 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaataccatc gcaagcacaa ag 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
accatgaaac cgactacact g 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cccagccatg ggatactact 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcaaagctgg tggtagtgga 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtcctgagct ccaatgacaa 20
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccatgagaac ggcagagac 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aaccagctga ggcccaaga 19
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgattgatt taaccagtcc atga 24
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtggatccaa gaaaaatggc catcccctag c 31
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ctggagctcg aggaattcac tataaagaga atcg 34
<210> 29
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cgaagctuga cagaagatag aagugagcat tttctagagg gagataa 47
<210> 30
<211> 50
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cctctagaaa atgctcactt ctatcttctg tcaagcttcg gttcccctcg 50
<210> 31
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gggatccttt tgggtggtgg cagttga 27
<210> 32
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gggtaccaaa gccgtctcct ccctcc 26
<210> 33
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gggagctcgg ccggtggtgt taacg 25
<210> 34
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gggatccgac cacgcgggcg ccctcc 26

Claims (6)

1.水稻miR156在调控水稻白叶枯病抗性中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻miR156的成熟序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的水稻miR156的前体miR156f的序列如SEQ ID NO.2所示；所述水稻miR156的成熟序列为前体miR156f序列自5’端4bp~23bp的一段RNA序列；编码所述miR156f的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
4.水稻miR156的靶基因在调控水稻白叶枯病抗性中的应用，其特征在于，所述靶基因为OsSPL7和OsSPL14，所述OsSPL7序列如SEQ ID NO.4所示，所述OsSPL14序列如SEQ IDNO.5所示。
5.一种培育抗白叶枯转基因水稻的方法，其特征在于，所述方法为上调水稻作物中OsSPL7和/或OsSPL14的表达，所述上调水稻作物中OsSPL7和/或OsSPL14的表达通过以下步骤实现：
构建含有OsSPL7或OsSPL14的超表达载体，将构建的超表达载体转化水稻，使水稻OsSPL7或OsSPL14表达上调，得到抗白叶枯病转基因水稻；或下调水稻作物中miR156的表达，使miR156的靶基因OsSPL7和OsSPL14表达上调，得到抗白叶枯病转基因水稻。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述下调水稻作物中miR156的表达通过以下步骤实现：
S1：构建含有miR156MIMIC的超表达载体MIM156OE，所述miR156MIMIC为miR156的靶模拟基因，能够竞争性地抑制miR156的表达；
S2：将S1构建的超表达载体MIM156OE转化水稻，特异性下调水稻miR156的表达；
S1中所述miR156MIMIC序列如SEQ ID NO.6所示。
CN201811002033.4A 2018-08-30 2018-08-30 调控miR156及其靶基因IPA1同时提高水稻抗病与产量的育种方法 Active CN109679949B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811002033.4A CN109679949B (zh) 2018-08-30 2018-08-30 调控miR156及其靶基因IPA1同时提高水稻抗病与产量的育种方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811002033.4A CN109679949B (zh) 2018-08-30 2018-08-30 调控miR156及其靶基因IPA1同时提高水稻抗病与产量的育种方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109679949A CN109679949A (zh) 2019-04-26
CN109679949B true CN109679949B (zh) 2022-05-17

Family

ID=66184463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811002033.4A Active CN109679949B (zh) 2018-08-30 2018-08-30 调控miR156及其靶基因IPA1同时提高水稻抗病与产量的育种方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109679949B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109706155B (zh) * 2018-08-30 2022-04-19 南京农业大学 pOsHEN1::OsSPL14基因表达盒及其构建方法和应用
CN110331145B (zh) * 2019-08-05 2023-07-18 东北林业大学 miR156及其相关生物材料在调控植物抗病性中的应用
CN112501195B (zh) * 2020-11-23 2022-09-13 南京农业大学 水稻miRNA基因smNRT2.3-1的应用
CN112661824B (zh) * 2021-01-22 2022-08-05 北京农学院 百合spl15基因和miR156a及其应用
CN117210494B (zh) * 2023-10-19 2024-04-30 东北林业大学 一种提高白桦抗叶枯病的转基因方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103387982A (zh) * 2012-05-08 2013-11-13 中国科学院上海生命科学研究院 miR156f在调节水稻根和分蘖发育中的应用
CN104450711A (zh) * 2014-12-31 2015-03-25 湖南农业大学 OsmiR156f基因在增加水稻有效分蘖中的应用
WO2016029630A1 (zh) * 2014-08-26 2016-03-03 中国科学院遗传与发育生物学研究所 miR528的调控位点及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103387982A (zh) * 2012-05-08 2013-11-13 中国科学院上海生命科学研究院 miR156f在调节水稻根和分蘖发育中的应用
WO2016029630A1 (zh) * 2014-08-26 2016-03-03 中国科学院遗传与发育生物学研究所 miR528的调控位点及其应用
CN104450711A (zh) * 2014-12-31 2015-03-25 湖南农业大学 OsmiR156f基因在增加水稻有效分蘖中的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Identification of ta-siRNAs and Cis-nat-siRNAs in Cassava and Their Rolein Response to Cassava Bacterial Blight;Andrés Quintero等;《Genomics, Proteomics & Bioinformatics》;20130615;第11卷(第3期);172-181 *
Inducible overexpression of Ideal Plant Architecture1 improves both yield and disease resistance in rice;Mingming Liu等;《Nature Plants》;20190318;第5卷;389-400 *
利用基因组编辑技术创制水稻白叶枯病抗性材料;郝巍等;《植物遗传资源学报》;20180417(第03期);151-158 *
水稻对白叶枯病菌侵染和低氮胁迫反应的共调控因子鉴定;余超;《中国博士学位论文全文数据库基础科学辑》;20141015(第5期);D046-15 *
调控IPA1 培育高产高抗水稻新品种;刘明明等;《第七届长三角植物科学研讨会暨青年学术报告会摘要集》;20181012;第1页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109679949A (zh) 2019-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109679949B (zh) 调控miR156及其靶基因IPA1同时提高水稻抗病与产量的育种方法
CN105838733A (zh) Cas9 介导的香石竹基因编辑载体和应用
CN107129998A (zh) 用于棉花中基因功能性分析的病毒诱导的基因沉默(vigs)
KR20090023669A (ko) 옥수수 이벤트 ｍｉｒ162
CN103343130B (zh) 一种大豆抗病毒基因及其应用
CN111909953B (zh) 用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法
CN109456973A (zh) SpCas9n&amp;PmCDA1&amp;UGI碱基编辑系统在植物基因编辑中的应用
CN108165579B (zh) 一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法
CN113512562B (zh) γ-聚谷氨酸在植物中异源合成提高植物抗逆性和产量的方法
CN106350526A (zh) 大豆圣豆9号MYB转录因子家族基因GmMYB84及其应用
CA2521752A1 (en) Plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
CN114774427B (zh) 一种提高金银花中木犀草素含量的重组基因及其应用
CN101818151B (zh) 一种大豆种子特异性启动子及其应用
CN106754916B (zh) 一种大豆圣豆9号GmNAC15基因的ABA诱导启动子
CN110923235B (zh) 一种控制玉米籽粒灌浆的非编码基因及其应用
CN112708633B (zh) 含有玉米种子荧光报告基团的CRISPR-Cas9基因编辑系统及应用
CN110872584B (zh) 大麦α-淀粉酶及其编码基因与应用
CN114457082B (zh) 一种辣椒NaCl诱导启动子、重组载体及其应用
CN114561388B (zh) 一种辣椒外源aba诱导型启动子、表达载体及其应用
CN110923258A (zh) 一种真姬菇的遗传转化方法
CN110964741B (zh) 一种核定位信号fnb及其在提高碱基编辑效率中的应用
CN110923262B (zh) 高粱α-淀粉酶及其编码基因与应用
CN110257444B (zh) 一种在植物细胞中生产中链脂肪酸的方法
CN106755059B (zh) 一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用
CN108893487A (zh) 一种含有C-Myc蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant