CN110923235B - 一种控制玉米籽粒灌浆的非编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma‑miR159c，碱基序列如SEQ ID NO.1所示；一种控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma‑miR159c的前体，碱基序列如SEQ ID NO.2所示；一对扩增控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma‑miR159c的克隆引物，碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；一种扩增控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma‑miR159c的表达载体pCAMBIA3301::35S::Pre159c，碱基序列如SEQ ID NO.5所示；该基因可以调控玉米籽粒灌浆以及玉米对重金属的抗性；基因过表达，可增大玉米籽粒，增强重金属抗性。

Description

一种控制玉米籽粒灌浆的非编码基因及其应用

技术领域

本发明属于玉米遗传育种技术领域，具体涉及一种控制玉米籽粒灌浆的非编码基因及其应用。

背景技术

玉米(Zea may L.)作为世界上最重要的粮食、饲料和能源作物之一，在保障世界粮食安全、促进经济发展及缓解能源危机等方面发挥着不可替代的作用。籽粒是玉米生物学产量最重要的构成因子，而籽粒发育直接决定了籽粒产量。研究表明，玉米籽粒发育是一个连续的生物学过程，涉及一系列复杂的生理生化代谢，可以分为三个主要时期：(1)授粉后0-15天(0-15DAP)，该时期胚和胚乳细胞快速分裂，主要完成胚和胚乳的细胞学构架，决定了光合产物的潜在积累空间；(2)授粉后15-40天(15-40DAP)籽粒快速灌浆，在此期间的灌浆速率高低决定光合产物积累的速度，有效灌浆时间则决定了光合产物积累的时间；(3)授粉后40-70天(40-70DAP)是籽粒脱水成熟期，这一时期完成由逐步衰老的叶片和茎转化而来的营养物质向籽粒的输送，籽粒生理成熟。

玉米籽粒发育过程由许多调控基因和功能基因构成的复杂调控网络进行控制。通过多种基因之间的相互作用，影响玉米籽粒的细胞构架、灌浆速率、有效灌浆时间等与籽粒发育直接相关的性状，从而造成不同品系材料之间籽粒产量的差异(Santiago etal.2014)；在玉米籽粒发育研究方面，Liu et al.(2011)利用农大108的双亲构建的重组自交系群体进行了两年两点的QTL分析，鉴定出6个遗传稳定的籽粒发育相关QTL；Zhang etal.(2013)利用“永久F2”群体定位了33个遗传稳定的籽粒发育非条件QTL和12个条件QTL；Maitz et al.(2000)通过筛选籽粒发育突变体克隆了玉米2号染色体上的rgf1基因，该基因主要通过减少淀粉积累造成籽粒饱满程度降低；该研究同时表明，细胞快速分裂期(尤其是5-10DAP)的糖分吸收决定rgf1基因型玉米籽粒的发育；通过突变体筛选和图位克隆，Wang et al.(2018)揭示了玉米Urb2基因的自然突变显著影响籽粒长度和生物学产量。

玉米籽粒灌浆相关性状对籽粒大小的遗传改良和玉米单产水平的提高具有重要意义。然而目前在玉米籽粒灌浆相关结构基因和非编码基因克隆方面仍较为欠缺，亟待发掘籽粒灌浆相关基因并探索其调控机制，进而对玉米产量提高的育种实践提供理论和材料支撑。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种控制玉米籽粒灌浆的非编码基因，通过多种手段解析一份人工诱变玉米籽粒灌浆突变体的调控机制，克隆了调控玉米籽粒灌浆和籽粒大小的非编码基因zma-miR159c，并解析其功能；zma-miR159c过表达，一方面会导致其靶基因zmGAMYB转录因子表达量下降，进而使玉米籽粒灌浆加快，籽粒大小增加；另一方面引起玉米幼苗对重金属的抗性增加；可以利用本发明基因构建玉米表达载体，应用于玉米育种，以提高玉米产量以及对重金属的抗性。

本发明的另一目的是提供了非编码基因zma-miR159c与玉米籽粒大小相关联的优异多态性单碱基(SNP)，为该基因在玉米育种中的应用打下理论基础。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR159c，其碱基序列特征如SEQ ID NO.1所示；

本发明提供了一种控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR159c的前体，其碱基序列特征如SEQ ID NO.2所示；

本发明提供了一对扩增控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR159c的克隆引物，其碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

本发明还提供了一种扩增控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR159c的表达载体pCAMBIA3301::35S::Pre159c，其碱基序列如SEQ ID NO.5所示，含zma-miR159c基因的前体碱基序列；

本发明还提供了所述的控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR159c在玉米遗传育种中的应用；

具体地，本发明提供了所述的控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR159c在玉米籽粒大小调控中的应用；

具体地，本发明提供了所述的控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR159c在对重金属抗性的调控中的应用；

具体地，本发明提供了所述的控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR159c在玉米体内对MYB转录因子的表达调控中的应用。

所述的扩增控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR159c的克隆引物SEQ IDNO.3基因序列为miR159c-F5'ATGATTAAGAAAGGCGATCGAA 3'；SEQ ID NO.4基因序列为miR159c-R5'TCAGACAGACAGACAGACAGAGA 3'。

所述的扩增控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR159c的表达载体pCAMBIA3301::35S::Pre159c的模式图如图10所示。

有益效果：

本发明公开了调控玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR59c，并公开了zma-miR159c位点与玉米大籽粒相关，可以用于改良玉米籽粒大小和灌浆；同时克隆获得了其DNA序列及其前体序列，转基因实验证明，该基因过表达会使转基因株系玉米籽粒变大、转基因株系MYB转录因子表达量降低以及对重金属的胁迫的抗性增强；在提高玉米产量的育种以及提高玉米对重金属抗性应用实践方面打下基础。

附图说明

图1.zma-miR159c在玉米自交系郑58籽粒发育不同时期的表达谱；

图2.双酶切pCAMBIA3301和Pre159c示意图(M：DNA 2000 Marker；1，2：双酶切纯化产物)；

图3.部分pCAMBIA3301::35S::Pre159c的菌落PCR验证(M：DNA 2000Marker；1-11：菌落PCR产物；-：阴性对照)；

图4.Pre159c转基因玉米与对照在粒宽、粒长、百粒重的比较；

图5.miR159c的进化树；

图6.miR159c在转基因株系叶片中的表达谱；

图7.zma-miR159c直接剪切的靶基因的T-plot图；

图8.Zma-miR159c的靶基因GAMyb在基因株系叶片中的表达谱；

图9.转基因植株抗砷表型图；

图10.本发明的扩增控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR159c的表达载体pCAMBIA3301::35S::Pre159c的基因构建模式图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述；在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验或检测方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

玉米籽粒灌浆非编码基因zma-miR159c参与玉米籽粒灌浆的发现

对玉米自交系郑58不同发育时期的玉米籽粒进行了small RNA测序，结果如图1所示，其中，X轴为授粉后的时间，以DAP(Days after pollination)表示；Y轴为zma-miR159c的相对表达量，以RPM(Reads pre million)表示。

图1结果显示，zma-miR159c在玉米授粉后不同发育时期表现出持续降低的表达趋势(图1)，荧光定量PCR结果表明zma-miR159c在玉米不同自交系籽粒中具有相同的表达趋势(Jin et al.PLoS ONE,2015)。

实施例2

玉米籽粒灌浆非编码基因zma-miR159c调控玉米籽粒灌浆的确认为构建zma-miR159c过表达载体(Pre159c)，使用zma-miR159c的前体序列连接至pCAMBIA3301载体骨架中。pCAMBIA3301和合成的Pre159c片段经Bgl II和BstE II双酶切后(图2所示，其中酶切位点Bgl II的碱基序列为AGATCT；酶切位点BstE II的碱基序列为GGTGACC)，利用T4 DNA连接酶连接、转化，菌落PCR验证单克隆，验证结果如图3，说明Pre159c连接成功，摇菌提质粒，用于下一步实验检测。

对Pre159c共获得其中的5个阳性转化事件分析发现，和野生型WT(对照组C01)相比，Pre159c的粒长、粒宽和百粒重明显增加(图4)，差异达到显著或极显著水平(表1)。

表1 Pre159c转基因玉米的粒宽、粒长、百粒重的分析

注：***表示与对照(C01)相比，差异达到极显著水平

实施例3

玉米籽粒灌浆非编码基因zma-miR159c的进化保守性

从miRBase(http://www.mirbase.org/)中下载玉米miR159的基因家族成员的成熟序列，采用MEGA7软件对miR159的成熟序列进行多重序列比对，分析进化特征，采用基于参数的邻近法对前体序列构建系统进化树；结果如图5所示。

实施例4

玉米籽粒灌浆非编码基因zma-miR159c的表达分析

(1)RNA的提取与检测

1)称取100mg玉米B73叶片，迅速转移至用液氮预冷研钵中，用研杵充分研磨组织直至研磨成粉末状，期间可补加液氮；将研磨成粉末状的样品转移至离心管中，加入1mLTransZol，用枪反复吹吸混匀；

2)室温放置5min；

3)加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15sec，室温孵育3min；

4)10000rpm 4℃离心15min；

5)转移无色水相于新的离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10min；

6)10000rpm 4℃离心10min，去上清，在管侧和管底形成胶状沉淀；

7)加入1mL 75％DEPC酒精，剧烈涡旋；

8)7500rpm 4℃离心5min；

9)弃上清，室温晾干沉淀(大约5min左右)；

10)沉淀溶于50μL RNA溶解液中；

11)55℃-60℃孵育10min，于-80℃保存样品以备长期使用；

12)RNA纯度、完整性检测和浓度测定。

a纯度检测—分光光度计法：取1μL RNA样品，测定OD值，通过OD260/OD280来检测纯度，OD260/OD230作为参考值；

OD260/OD280在1.9-2.1之间，可以认为纯度较好；

OD260/OD280值小于1.8，则表明蛋白质杂质较多；

OD260/OD280值大于2.2，则表明RNA已经降解；

b RNA完整性检测-琼脂糖凝胶电泳：取RNA样品5μL，1％琼脂糖凝胶电泳检测20min后用凝胶成像系统观察总RNA的5SrRNA，18SrRNA和28SrRNA条带，高质量RNA的电泳三条条带完整，同时28SrRNA的亮度应是18SrRNA的2倍左右。

(2)cDNA的合成

使用TaKaRa公司反转录试剂盒；取经step(1)去除基因组DNA处理后的RNA作为模板，Oligo-dT为引物，利用One Step

miRNAcDNA Synthesis Kit(PerfectReal Time)反转录成cDNA备用。

(3)qRT-PCR验证小RNA

验证miR159c在C01和转基因植株(Pre159c植株)的表达情况，用灵敏度较高的荧光定量PCR对其验证；每个样品均对miR159c、内参基因平行进行3次重复，同时每个样品进行3次生物学重复；试验采用了3次技术性重复，得到的数据中剔除误差最大的一个CT数值，求剩余的两个数值平均值；用2^-ΔΔCT法来计算相对表达量；结果如图6所示，检测Pre159c转基因植株中，miRNA159c的表达量明显高于对照。

实施例5

玉米籽粒灌浆非编码基因zma-miR159c对MYB转录因子的表达调控

利用降解组测序技术对玉米自交系郑58不同发育时期籽粒样品miRNA的靶基因进行了分析，取剪切位点符合与miRNA序列互补的原则且在两个样品重复中同时检测到剪切的基因为miRNA直接作用的靶基因，降解组测序获得zma-miR159c直接剪切靶基因的T-plot图(图7)，其中，X轴表示剪切位点在转录本上的位置(单位：Nt)，Y轴表示检测到被剪切转录本的个数(单位：reads)红色竖线表示这些靶基因被zma-miR159c剪切的位点，黑色竖线表示该转录本存在其他位点断裂(降解)的片段；同时对miR159c的靶基因信息进行分析(表2)。

由图7和表2可以看出，获得zma-miR159c的靶基因共4个转录本，来自2个基因，对这些基因进行GO(Gene Ontology)注释，它们代表2个MYB基因，分别命名为GAMyb1(GRMZM2G028054/Zm00001d012544)，GAMyb3(GRMZM2G139688/Zm00001d043131)。

表2.降解组测序检测到的玉米籽粒灌浆期间miR159c的靶基因

Pre159c转基因植株中，miRNA159c的表达量明显高于对照组，靶基因GAMyb1和GAMyb3基因的表达量低于对照组(如图8所示)。

实施例6

玉米籽粒灌浆非编码基因zma-miR159c对重金属砷胁迫抗性增强

选取籽粒饱满、大小均匀无虫害的种子C01、Pre59c，置于有湿润滤纸的培养皿中催芽72h，发芽条件为温度(25±1)℃、相对湿度75％的生化培养箱。玉米出苗后，选取长势一致健康植株移栽到装有1/2Hoagland(pH 6.0)营养液中，于人工气候室内常规培养，培养条件为:光照/黑暗时间为16h/8h，昼夜温度为28℃/20℃，光照强度为110μmol·m^-2·s^-1，相对湿度为70％。培养期间，持续用真空抽气泵向营养液中泵气，每3天更换一次营养液，在4叶一心期，设置20mg/L浓度的As处理幼苗，每个浓度处理30株长势一致的植株；记录玉米植株的抗砷表型图(图9)。

由图9可以看出，用20mg/L浓度的As处理后，Pre159c玉米的植株较对照组C01(WT)的长势好，说明Pre159c玉米对重金属砷的抗性增加；

最后说明的是以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域的技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或等同替换，只要不脱离本发明的技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一种控制玉米籽粒灌浆的非编码基因及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> DNA/RNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

cggagaaggg agccc 15

<210> 2

<211> 352

<212> DNA/RNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

acgagaaata gatctggtac ctgatcatat cagtagaccg ccacgggaag gaaagggaga 60

gagagagaca gacagacaga cagagaggag ctcccttcaa tccaagcacg agggaaagat 120

gatggcgggc tcatctcccg ggtcatgcac acccatgcaa gtgcagaggt gagcagcggc 180

cattgctgca ccagagaggt atccatgaac cggcagctgc aaccgaccac ttcccctcct 240

ggattggatc gaagggagct cttcgatcgc ctttcttaat catgcatctt cttcttcttc 300

ttcatggctt cattcatccc gtagggtgac ccttaagcat gccatcgagg ct 352

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 3

atgattaaga aaggcgatcg aa 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 4

tcagacagac agacagacag aga 23

<210> 5

<211> 9562

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 5

catggtatat cagtagaccg ccacgggaag gaaagggaga gagagagaca gacagacaga 60

cagagaggag ctcccttcaa tccaagcacg agggaaagat gatggcgggc tcatctcccg 120

ggtcatgcac acccatgcaa gtgcagaggt gagcagcggc cattgctgca ccagagaggt 180

atccatgaac cggcagctgc aaccgaccac ttcccctcct ggattggatc gaagggagct 240

cttcgatcgc ctttcttaat catgcatctt cttcttcttc ttcatggctt cattcatccc 300

gtaggtgacc agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag 360

attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa 420

gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag 480

agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga 540

taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattaaact atcagtgttt 600

gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taacggatat 660

ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt atgtgcatgc caaccacagg 720

gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc aacccctccg ctgctatagt gcagtcggct 780

tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa acgacatgtc gcacaagtcc taagttacgc 840

gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc gttttcttgt cgcgtgtttt agtcgcataa 900

agtagaatac ttgcgactag aaccggagac attacgccat gaacaagagc gccgccgctg 960

gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg acgaccagga cttgaccaac caacgggccg 1020

aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt tttccgagaa gatcaccggc accaggcgcg 1080

accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctacgccc tggcgacgtt gtgacagtga 1140

ccaggctaga ccgcctggcc cgcagcaccc gcgacctact ggacattgcc gagcgcatcc 1200

aggaggccgg cgcgggcctg cgtagcctgg cagagccgtg ggccgacacc accacgccgg 1260

ccggccgcat ggtgttgacc gtgttcgccg gcattgccga gttcgagcgt tccctaatca 1320

tcgaccgcac ccggagcggg cgcgaggccg ccaaggcccg aggcgtgaag tttggccccc 1380

gccctaccct caccccggca cagatcgcgc acgcccgcga gctgatcgac caggaaggcc 1440

gcaccgtgaa agaggcggct gcactgcttg gcgtgcatcg ctcgaccctg taccgcgcac 1500

ttgagcgcag cgaggaagtg acgcccaccg aggccaggcg gcgcggtgcc ttccgtgagg 1560

acgcattgac cgaggccgac gccctggcgg ccgccgagaa tgaacgccaa gaggaacaag 1620

catgaaaccg caccaggacg gccaggacga accgtttttc attaccgaag agatcgaggc 1680

ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga gccgcccgcg cacgtctcaa ccgtgcggct 1740

gcatgaaatc ctggccggtt tgtctgatgc caagctggcg gcctggccgg ccagcttggc 1800

cgctgaagaa accgagcgcc gccgtctaaa aaggtgatgt gtatttgagt aaaacagctt 1860

gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg atgagtaaat aaacaaatac gcaaggggaa 1920

cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag aaaggcgggt caggcaagac gaccatcgca 1980

acccatctag cccgcgccct gcaactcgcc ggggccgatg ttctgttagt cgattccgat 2040

ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc gtgcgggaag atcaaccgct aaccgttgtc 2100

ggcatcgacc gcccgacgat tgaccgcgac gtgaaggcca tcggccggcg cgacttcgta 2160

gtgatcgacg gagcgcccca ggcggcggac ttggctgtgt ccgcgatcaa ggcagccgac 2220

ttcgtgctga ttccggtgca gccaagccct tacgacatat gggccaccgc cgacctggtg 2280

gagctggtta agcagcgcat tgaggtcacg gatggaaggc tacaagcggc ctttgtcgtg 2340

tcgcgggcga tcaaaggcac gcgcatcggc ggtgaggttg ccgaggcgct ggccgggtac 2400

gagctgccca ttcttgagtc ccgtatcacg cagcgcgtga gctacccagg cactgccgcc 2460

gccggcacaa ccgttcttga atcagaaccc gagggcgacg ctgcccgcga ggtccaggcg 2520

ctggccgctg aaattaaatc aaaactcatt tgagttaatg aggtaaagag aaaatgagca 2580

aaagcacaaa cacgctaagt gccggccgtc cgagcgcacg cagcagcaag gctgcaacgt 2640

tggccagcct ggcagacacg ccagccatga agcgggtcaa ctttcagttg ccggcggagg 2700

atcacaccaa gctgaagatg tacgcggtac gccaaggcaa gaccattacc gagctgctat 2760

ctgaatacat cgcgcagcta ccagagtaaa tgagcaaatg aataaatgag tagatgaatt 2820

ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat caagaacaac caggcaccga cgccgtggaa 2880

tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg ccaggcgtaa gcggctgggt tgtctgccgg 2940

ccctgcaatg gcactggaac ccccaagccc gaggaatcgg cgtgacggtc gcaaaccatc 3000

cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt tgaaggccgc 3060

gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagcacgc cccggtgaat cgtggcaagc 3120

ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg gcaaccgccg gcagccggtg cgccgtcgat 3180

taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc gttccgatgc tctatgacgt 3240

gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga 3300

ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga gcttccagac gggcacgtag aggtttccgc 3360

agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga ttacgacctg gtactgatgg cggtttccca 3420

tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt 3480

ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa 3540

agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt aaacaccacg cacgttgcca tgcagcgtac 3600

gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg 3660

ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg agctagctga 3720

ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa gaacccggac gtgctgacgg ttcaccccga 3780

ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg ttttctctac cgcctggcac gccgcgccgc 3840

aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa gacgatctac gaacgcagtg gcagcgccgg 3900

agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga 3960

gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa 4020

cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat 4080

tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg tctctttcct gtggatagca cgtacattgg 4140

gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat 4200

tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc 4260

ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc 4320

tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc tgcgctccct 4380

acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct 4440

acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg 4500

cccacatcaa ggcaccctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 4560

tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc 4620

gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta 4680

gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt 4740

gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg 4800

ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 4860

atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 4920

gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 4980

gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 5040

gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 5100

gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 5160

aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 5220

ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 5280

taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 5340

tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 5400

gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 5460

taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 5520

tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 5580

tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 5640

ggtcatgcat tctaggtact aaaacaattc atccagtaaa atataatatt ttattttctc 5700

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atcctccctg atcgaccgga cgcagaaggc aatgtcatac cacttgtccg ccctgccgct 5820

tctcccaaga tcaataaagc cacttacttt gccatctttc acaaagatgt tgctgtctcc 5880

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cagatcgtta ttcagtaagt aatccaattc ggctaagcgg ctgtctaagc tattcgtata 6060

gggacaatcc gatatgtcga tggagtgaaa gagcctgatg cactccgcat acagctcgat 6120

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agagagactg gtgatttcag cgtgtcctct ccaaatgaaa tgaacttcct tatatagagg 7800

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tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 8940

gttgcgcagc ctgaatggcg aatgctagag cagcttgagc ttggatcaga ttgtcgtttc 9000

ccgccttcag tttagcttca tggagtcaaa gattcaaata gaggacctaa cagaactcgc 9060

cgtaaagact ggcgaacagt tcatacagag tctcttacga ctcaatgaca agaagaaaat 9120

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ctcagaagac caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct 9240

cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg 9300

ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga 9360

cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc 9420

aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc 9480

acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga 9540

gagaacacgg gggactcttg ac 9562

Claims (1)

1.过表达控制玉米籽粒灌浆的非编码基因zma-miR159c在提高重金属砷抗性方面的应用；所述的非编码基因zma-miR159c碱基序列如SEQ ID NO .1所示。

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