KR20130019014A - 옥수수 이벤트 mir162 - Google Patents
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Abstract
MIR162로 명명된 신규한 유전자전이 옥수수 이벤트가 개시된다. 본 발명은 이벤트 MIR162에 특이적인 핵산, 및 MIR162를 생성시키는 옥수수 게놈 내에 삽입된 재조합 작제물과 상기 삽입 부위를 플랭킹하는 게놈 서열의 DNA 서열을 기초로 MIR162 이벤트의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 MIR162의 유전자전이 유전자형을 포함하는 옥수수 식물, 및 MIR162 유전자형을 포함하는 옥수수 식물을 자가교배하거나 다른 옥수수 변종과 교배하여 옥수수 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. MIR162 유전자형을 포함하는 옥수수 식물의 종자도 본 발명의 대상이다. 또한, 본 발명은 MIR162 옥수수 식물을 사용하여 곤충을 방제하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 일반적으로 식물 분자생물학, 식물 형질전환 및 식물 육종 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 유전자전이(transgenic) 유전자형을 포함하는 병충해에 대해 내성을 갖는 유전자전이 옥수수 식물, 및 시료에서 상기 유전자전이 옥수수 식물에 특이적인 핵산의 존재를 검출하는 방법 및 이들의 조합에 관한 것이다.
식물 해충은 전세계의 중요한 농작물 손실의 주요한 요인이다. 곤충을 포함한 비-포유동물성 해충이 만연하여 미국에서만 연간 약 80억 달러가 손실되고 있다. 밭 작물에서의 손실 이외에도, 해충은 야채와 과수의 경작자, 관상화의 생산자, 그리고 가정의 원예 애호가들에게도 걱정거리이다.
해충은 주로 곤충 성장의 억제, 곤충의 섭식 또는 번식의 방지, 또는 곤충의 사멸 유도를 통해 작용하는 화학 살충제를 집중 살포하여 방제된다. 이렇게 하여 양호한 곤충 방제가 달성될 수는 있지만, 이러한 화학 물질들은 때로는 다른 익충에게도 영향을 줄 수 있다. 화학 살충제의 남용으로 생기는 또 다른 문제점은 내성을 갖는 곤충 변종의 출현이다. 이러한 문제점은 다양한 내성 관리 전략에 의해 부분적으로는 완화되었지만, 대안적인 해충 방지제에 대한 필요성이 증가하고 있다. 생물학적 해충 방지제, 예컨대 δ-내독소와 같은 살충 독소 물질을 발현하는 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis , Bt)도 농작물에 적용되어 화학 살충제에 대한 대안적 또는 보충적인 역할을 제공하는 만족스러운 결과를 보여주었다. 이러한 일부 δ-내독소를 암호화하는 유전자를 분리하여 이들을 다른 숙주에서 발현시켰다는 사실은 경제적으로 중요한 해충의 방제를 위한 또 다른 수단을 제공할 수 있음을 보여주었다. 특히, Bt δ-내독소의 발현은 선택된 해충에 대한 식물 보호에 있어서 효과적인 수단을 제공하게 되었고, 이러한 독소 물질을 발현하는 유전자전이 식물은 시판되어, 농가에서 화학적 살충제의 살포량을 감소시킬 수 있게 되었다.
식물의 생장 단계 중에 바실러스 종에 의해 생성된 또 다른 부류의 살곤충성 단백질(영양 살곤충 단백질(Vip; Vegetative insecticidal proteins))도 동정되었다. 참조로서 본원에 인용된 미국특허 제5,877,012호, 제6,107,279호 및 제6,137,033호는 Vip3으로 불리는 새로운 부류의 살곤충성 단백질을 기술하고 있다. 국제공개공보 제WO 98/18932호, 제WO 98/33991호, 제WO 98/00546호 및 제WO 99/57282호를 포함하는 다른 명세서에도 Vip3 부류의 단백질의 현재 동정된 동족체들이 개시되어 있다. Vip3 암호화 서열은 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 검거세미밤나방(BCW; black cutworm, 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon)), 거염벌레(FAW; fall armyworm, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)), 회색담배나방(TBW; tobacco budworm, 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens)), 사탕수수 천공충(SCB; sugarcane borer, 디아트라애 사카랄리스(Diatraea saccharalis)), 가루좀벌레(LCB; lesser cornstalk borer, 엘라스모팔푸스 리그노셀루스(Elasmopalpus lignosellus)) 및 왕담배나방(CEW; corn earworm, 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea))을 포함하는 광범위한 나비목(lepidopteran) 해충에 대해 살곤충 활성을 보유하는 약 88 kDa의 단백질을 암호화하며, 유전자전이 식물, 예를 들어 옥수수(Zea mays)에서 발현된 경우에는 곤충 섭식에 의한 피해로부터 식물을 보호할 수 있게 된다.
현재의 식물 형질전환 방법은 일반적으로 숙주인 식물 게놈 내에 vip3과 같은 이식유전자(transgene)의 무분별한 삽입을 초래하게 된다. 이러한 식물의 게놈 내에 도입된 DNA의 무분별한 삽입은, 게놈에 외래의 DNA가 삽입되어 매우 중요한 본래의 유전자를 변이시키게 되는 경우 치명적인 결과를 초래할 수 있다. 또한, 무작위 삽입 이벤트(event)가 숙주 세포 유전자의 기능을 손상시키지 않는다 하더라도, 삽입된 외부 유전자의 발현은 주위 게놈 DNA에 의한 "전위효과(position effect)"에 의해 영향을 받을 수 있다. 일부의 경우, 유전자는 도입된 유전자로부터의 유효량의 생성물 합성을 막기에 충분히 전위효과가 강한 부위로 삽입된다. 예를 들어, 식물에서는 개별적으로 선택된 이벤트 중에서 염색체 내로 도입된 이종 유전자의 발현 수준이 매우 다양함이 관찰되었다. 또한, 발현의 공간적 또는 시간적 패턴에 있어서의 차이, 예컨대 도입된 유전자 작제물에 존재하는 전사 조절 요소로부터 예상되는 패턴과 일치하지 않을 수 있는 경우와 같이, 다양한 식물 조직에서 상기 이식유전자의 상대적인 발현의 차이가 있을 수 있다. 다른 경우로서는, 유전자 생성물의 과생성이 세포에 악영향을 줄 수 있다. 상기 이러한 잠재적인 문제점들 때문에, 흔히 수백 가지의 서로 다른 이벤트를 제조하여 상업용의 목적하는 이식유전자의 발현 패턴과 수준을 보유하는 단일 이벤트를 스크리닝하는 작업이 흔히 이루어진다. 그러나, 일단 식물의 게놈 내에 상업적으로 사용가능한 부위가 동정되기만 하면, 유해하지 않은 부위로 관심대상 유전자를 표적하는 것이 유리하게 된다.
식물 세포 내에 특정 염색체 부위로 대상 뉴클레오타이드 서열을 표적 삽입시키는 여러 방법이 개시되었다. 부위-특이적 재조합 시스템이 일부 원핵생물 유기체 및 하등 진핵생물 유기체에서 동정되었다. 보통 이러한 시스템은 특정 뉴클레오타이드 서열의 2개의 복사물을 인지하고, 이들 뉴클레오타이드 서열을 절단하고 연결시키는 하나 이상의 단백질을 포함함으로써, 정교한 유전 정보의 부위-특이적 교환이 가능하도록 해준다. 일부 부위-특이적 리컴비나제가 당업계에 공지되어 있다. 이러한 것으로서, 이에 제한되지는 않지만, 예를 들어, 박테리오파지 P1 Cre/lox 시스템 [참조: Austin et al. (1981) Cell 25: 729-736)], 효모 자이고사카로마이세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii)의 pSR1 플라스미드 유래의 R/RS 재조합 효소 시스템 [참조: Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203)], 파지 Mu의 Gin/gix 시스템 [참조: Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176)], 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 2 μm 플라스미드 유래의 FLP/FRT 재조합 효소 시스템(참조: Broach et al. (1982) Cell 29: 227-234) 및 박테리오파지 람다(Lambda) 유래의 Int 재조합 효소(참조: Landy (1989) Annu. Rev. Biochem. 58: 912-949; Landy (1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 699-707; Lorbach et al. (2000) J. Mol. Biol. 296: 1175-1181; 및 WO 01/16345)를 포함한다. 참조로서 본원에 인용된 미국특허공보 제2006/0130179호에 개시된 특히 유용한 부위-특이적 접근법에서는, 람다 인테그라제 매개된 재조합을 사용하고 있다. 상기 방법은 제1 인테그라제 인식 부위를 포함하는 표적 뉴클레오타이드 서열을 식물 세포에 도입하는 단계; 상기 식물 세포에 제2 인테그라제 인식 부위를 포함하는 공여체(donor) 뉴클레오타이드 서열을 도입하는 단계; 및 상기 식물 세포에 인테그라제 또는 인테그라제 복합체를 도입하는 단계를 포함한다. 참조로서 본원에 인용된 미국특허공보 제2006/0253918호에 개시된 다른 유용한 부위-특이적 접근법에서는, 게놈 내에 특정 위치에 하나 이상의 유전자를 통합시키는(유전자 스태킹; gene stacking) 상동 재조합을 사용한다.
이식유전자의 원하는 발현 패턴과 수준을 보유하는 이벤트는 통상적인 육종 방법을 사용한 유성 이종교배에 의해 상기 이식유전자를 다른 유전적 배경으로 유전자 이입(introgression)시키는데 유용하다. 이러한 교배의 자손은 본래의 형질전환체의 이식유전자 발현 특성을 보유하게 된다. 이러한 전략은 국부적인 생장 조건에 잘 적응된 다수의 변종에서 신뢰할 만한 유전자 발현을 확보하기 위해 사용된다. 유성 교배의 자손이 대상 이식유전자를 보유하는지의 여부를 결정하기 위해 특정 이벤트의 존재를 검출할 수 있는 것도 유리할 수 있다. 또한, 특정 이벤트를 검출하는 방법은, 예를 들어 재조합 농작물 유래의 식료품의 시판전 허가 및 품목 표시제를 요하는 규정을 충족하는데 도움이 될 것이다. 이에 제한되지는 않지만, 폴리뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 열 증폭반응(폴리머라제 연쇄 반응(PCR; Polymerase Chain Reaction)) 또는 핵산 프로브를 사용하는 DNA 하이브리드화를 포함하는 널리 알려진 핵산 검출법에 의해 이식유전자의 존재를 검출하는 것이 가능하다. 일반적으로, 다양한 식물 변종을 형질전환시키는데 사용되어 왔던 특정 DNA 작제물 검출용 시약 및 방법론의 단순화 및 통일화를 위해, 이러한 검출 방법들은 보통 빈번히 사용되는 유전 인자들, 예를 들어, 프로모터, 터미네이터(terminator) 및 마커 유전자에 초점을 맞추고 있는데, 그 이유는 많은 DNA 작제물에 있어서 암호화 서열 영역이 상호 교환이 가능하기 때문이다. 그 결과, 이러한 방법들은 암호화 서열에 있어서만 상이한 작제물을 구별하는데는 유용하지 못할 수 있다. 또한, 이러한 방법들은 삽입된 이종성 DNA에 인접한 염색체 DNA("플랭킹(flanking) DNA")의 서열이 공지되어 있지 않다면, 상이한 이벤트들, 특히 동일한 DNA 작제물을 사용하여 생성된 이벤트를 구별하는데 유용하지 못할 수 있다.
상기한 이유로, 유전자전이 옥수수 이벤트에 특이적이며, 생물학적 시료에서 상기 유전자전이 옥수수 이벤트를 동정하고 당해 유전자전이 옥수수 이벤트로부터 핵산을 검출하는데 유용한 신규한 핵산 서열을 포함하는 곤충에 대해 내성을 갖는 유전자전이 옥수수 이벤트 뿐만 아니라, 생물학적 시료에서 이러한 핵산의 검출에 사용하는데 필수적인 시약을 포함하는 키트가 필요하다. 또한, 옥수수 게놈 내에 삽입될 뉴클레오타이드 서열의 표적화 및 그 삽입의 제어가 가능하도록 옥수수 게놈 내에 특이적 표적 부위를 제공할 필요도 있다.
본 발명은 이벤트 MIR162에 특이적인 vip3Aa20 암호화 서열을 포함하는 신규한 유전자전이 유전자형을 포함하는 MIR162로 명명된 형질전환 옥수수(Zea mays) 이벤트에 관한 것이다. vip3Aa20 암호화 서열은 MIR162 옥수수 식물에 대해 곤충 내성을 부여하는 Vip3Aa20 살곤충성 단백질을 암호화한다. 또한, MIR162 이벤트는 옥수수 세포에게 탄소원으로 만노스를 사용할 수 있는 능력을 부여하는 PMI 단백질을 암호화한다. vip3A20 암호화 서열 이외에, 본 발명은 MIR162에 특이적인 다른 핵산도 제공한다. 또한, 본 발명은 MIR162에 특이적인 핵산을 포함하는 유전자전이 옥수수 식물, 당해 유전자전이 옥수수 식물의 종자 및 MIR162에 특이적인 핵산을 포함하는 근교계(inbred) 옥수수를 자가교배하거나 상이한 유전자형의 또 다른 옥수수주(corn line)와 교배시킴으로써 본 발명의 핵산을 포함하는 유전자전이 옥수수 식물을 생산하는 방법을 제공한다. MIR162에 특이적인 핵산을 포함하는 종자 및 이로부터 성장한 옥수수 식물의 샘플이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에 수탁번호 PTA-8166으로 기탁되었다. 본 발명의 유전자전이 옥수수 식물은 당해 발명의 신규한 유전자형에 의해 옥수수 식물에 부여된 특징들 이외에, 상응하는 비-유전자전이된 동질유전자형(isogenic) 옥수수 식물의 모든 형태학적 특징 및 생리학적 특징을 본질적으로 보유할 수 있다. MIR162 옥수수 식물, 조직 및 종자의 생물학적 시료 및 추출물도 본 발명에 의해 제공된다. 또한, 본 발명은 옥수수 게놈 내로 삽입되어 당해 MIR162 이벤트를 유도하는 재조합 발현 카세트의 DNA 서열 및 당해 삽입 부위 측면의 게놈 서열의 DNA 서열을 기초로 하여 생물학적 시료에서 MIR162에 특이적인 핵산의 존재를 검출하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 염색체 상에 특정 위치에 관심대상 유전자를 삽입하는데 유용한 옥수수 염색체 상에 해를 주지 않는 삽입 표적 부위 및 상기 개시된 삽입 부위 또는 그 부근에서의 이종성 핵산의 삽입에 의해 옥수수 게놈을 변화시키는 방법을 제공한다. MIR162 이벤트는 Vip3Aa20와 PMI 단백질의 발현 수준 분석 및 나비목 해충에 대한 MIR162의 효능을 시험하여, 추가로 그 특징이 분석될 수 있다. 또한, 본 발명은 곤충에 내성이 있는 Vip3Aa20와는 다른 형질을 Vip3Aa20 곤충 내성 형질과 조합함으로써, 보다 광범위한 종류의 해충에 대해 내성을 갖는 유전자전이 옥수수 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기한 측면 및 다른 측면들은 하기 상세한 설명으로 보다 명확해 질 것이다.
서열목록에 기재된 서열에 대한 설명
서열번호 1은 MIR162 내의 Vip3Aa20 암호화 서열이다.
서열번호 2는 Vip3Aa20 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 플라스미드 pNOV1300의 서열이다.
서열번호 4 내지 12는 TAQMAN 분석에서 유용한 프라이머와 프로브이다.
서열번호 13은 vip3Aa20 프로브의 서열이다.
서열번호 14는 pmi 프로브의 서열이다.
서열번호 15 내지 37은 본 발명에서 유용한 프라이머이다.
서열번호 38은 vip3Aa20 앰플리콘(amplicon)의 서열이다.
서열번호 39 내지 40은 본 발명에서 유용한 프라이머이다.
서열번호 41은 CJ134/179 5' 앰플리콘의 서열이다.
서열번호 42 내지 43은 본 발명에서 유용한 프라이머이다.
서열번호 44는 vip3Aa20 3' 앰플리콘이다.
서열번호 45는 5' 게놈-삽입부 접합부이다.
서열번호 46은 삽입부에 대한 5' 플랭킹 옥수수 게놈 서열이다.
서열번호 47은 3' 삽입부-게놈 접합부이다.
서열번호 48은 삽입부에 대한 3' 플랭킹 옥수수 게놈 서열이다.
서열번호 49는 MIR162 삽입부 서열 및 플랭킹 서열이다.
서열번호 50 내지 54는 본 발명에서 유용한 프라이머이다.
서열번호 55는 5' PCR 앰플리콘이다.
서열번호 56 내지 58은 본 발명에서 유용한 프라이머이다.
서열번호 59는 3' PCR 앰플리콘이다.
서열번호 60 내지 105는 본 발명에서 유용한 프라이머이다.
서열번호 106은 상기 개시된 염색체 표적 부위를 포함하는 옥수수 5번 염색체 영역의 서열이다.
서열번호 107은 MIR162 내에 이종성 DNA의 삽입에 의해 나타난 옥수수 게놈 서열이다.
하기 정의 및 방법들은 본 발명을 더욱 명확히 규정하고 당업자가 본 발명을 수행함에 있어서 안내를 위해 제공된다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 용어는 당업자가 통상적으로 사용하는 의미에 따라야 할 것이다. 분자생물학의 통상적인 용어의 정의는 문헌[참조: Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1994]을 참조할 수도 있다. 미국특허법시행규칙 1.822(37 C.F.R. §1.822)에 기재된 DNA 염기 및 아미노산에 대한 명명법이 본원에 사용된다.
본원에서 사용된 "증폭"이란 용어는 주형으로서 하나 이상의 핵산 분자를 사용하여, 핵산 분자를 다수의 복사체로 작제하거나 상기 핵산 분자에 대해 상보적인 다수의 복사체를 작제하는 것을 의미한다. 증폭 시스템은 이에 제한되지는 않지만, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 시스템, 리가아제 연쇄 반응(LCR; ligase chain reaction) 시스템, 핵산 서열 기반의 증폭 시스템(NASBA; nucleic acid sequence based amplification, 캐나다 온타리오주 미시소가 소재의 Cangene사 제조), Q-베타 레플리카아제 시스템, 전사-기반의 증폭 시스템(TAS; transcription-based amplification system) 및 쇄 치환 증폭(SDA; strand displacement amplification)을 포함한다. 문헌[참조: Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, D. H. Persing et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1993)]을 참조한다. 증폭 산물은 앰플리콘으로 명명한다.
"암호화 서열"은 mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 센스 RNA 또는 안티센스 RNA와 같은 RNA로 전사되는 핵산 서열이다. RNA는 전사 이후에 유기체 내에서 해독되어 단백질을 생성하는 것이 바람직하다.
본원에서 사용된 "옥수수(corn)"라는 용어는 "Zea mays" 또는 "maize"를 의미하며, 야생형 옥수수 종을 포함하여, 옥수수와 동종교배될 수 있는 모든 식물 변종들을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "검출 키트"는 엄중성이 높은 조건 하에 표적 DNA 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 본 발명의 핵산 프로브 및/또는 프라이머 및 핵산 하이브리드화 또는 증폭 방법을 실행하게 하는데 필요한 다른 물질들을 포함하며, 시료 내에서 MIR162에 특이적인 DNA의 존재 유무를 검출하는데 사용되는 키트를 지칭한다.
본원에서 사용된 유전자전이 "이벤트(event)"란 용어는 식물 세포 또는 조직을 이종성 DNA, 예를 들면 관심대상 유전자를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키고 재생시켜 생산된 재조합 식물을 지칭한다. "이벤트"란 용어는 이종성 DNA를 포함하는 본래의 형질전환체 및/또는 그 형질전환체의 자손을 말한다. "이벤트"란 용어는 상기 형질전환체와 다른 옥수수주 사이의 유성 이종교배에 의해 생성되는 자손도 지칭한다. 반복친(recurrent parent)으로의 반복 역교배 후에도, 형질전환된 친주(parent)의 삽입된 DNA 및 플랭킹 DNA는 당해 교배의 자손에서도 동일한 염색체 위치에 존재한다. 또한, "이벤트"란 용어는 삽입된 DNA와, 삽입 DNA를 포함하는 하나의 친주와 삽입된 DNA를 포함하지 않는 친주의 유성 교배의 결과(예를 들어, 본래의 형질전환체와 그 자가교배로 생성된 자손)로서 관심대상 이식유전자를 포함하는 삽입 DNA를 받아들인 자손에게 이식될 것으로 보이는 상기 삽입 DNA에 바로 인접한 플랭킹 게놈 서열을 포함하는 본래의 형질전환체의 DNA를 지칭한다. 보통, 식물 조직의 형질전환은 다수의 이벤트들을 생성하게 되고, 이들 각각은 식물 세포의 게놈 내에 상이한 위치로 DNA 작제물을 삽입하게 된다. 이식유전자 또는 다른 목적하는 특성의 발현을 기초로 특정 이벤트가 선별된다. 따라서, 본원에서 사용된 "이벤트 MIR162", "MIR162" 또는 "MIR162 이벤트"는 상호 동일한 의미로 사용될 수 있다.
곤충 내성 MIR162 옥수수 식물은, 먼저 수탁번호 PTA-6188로 ATCC에 기탁된 종자로부터 성장한 MIR162 옥수수 식물과 같은 유전자전이 MIR162 옥수수 식물로부터 성장한 옥수수 식물 및 곤충 내성을 부여하는 본 발명의 실시 양태의 발현 카세트를 사용한 형질전환으로 유도된 이의 자손으로 이루어진 제1 친주 옥수수 식물과, 곤충 내성이 결여된 제2 친주 옥수수 식물을 유성 교배하여, 다수의 제1 자손 식물을 생산한 후; 곤충에 내성이 생긴 제1 자손 식물을 선별하여; 상기 제1 자손 식물을 자가교배하여 다수의 제2 자손 식물을 생산한 후; 상기 제2 자손 식물로부터 곤충에 내성이 생긴 식물을 선별하는 단계를 통하여 개량될 수 있다. 이러한 단계에는 추가로 제1 곤충 내성 자손 식물 또는 제2 곤충 내성 자손 식물을 제2 친주 옥수수 식물 또는 제3 친주 옥수수 식물에 역교배하는 단계를 포함하여, 곤충에 내성을 갖는 옥수수 식물을 생산해 낼 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "발현 카세트(expression cassette)"는 적절한 숙주 세포 내에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 직접 발현이 가능한 핵산 분자를 의미하는 것으로, 종결 시그날에 작동가능하게 연결된 관심대상의 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 또한, 이것은 보통 뉴클레오타이드 서열의 적절한 해독에 필요한 서열을 포함한다. 또한, 상기 발현 카세트는 관심대상 뉴클레오타이드 서열의 직접 발현에서 필요하기 보다는 발현 벡터 카세트의 제거를 위해 편리한 제한 부위 때문에 존재하는 서열을 포함할 수 있다. 관심대상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있는데, 이는 발현 카세트 구성요소 중 적어도 하나는 그 나머지 구성요소 중 적어도 하나에 대하여 이종성인 것임을 의미한다. 또한, 발현 카세트는 자연발생적이지만 이종성 발현에 유용한 재조합 형태로 만들어지는 것일 수 있다. 그러나, 일반적으로, 발현 카세트는 숙주에 대해 이종성이다. 즉, 발현 카세트의 특정 핵산 서열은 숙주 세포 내에서 자연적으로 발생하지 않고, 당업계에 공지된 형질전환 방법에 의해 숙주 세포 내로 또는 숙주 세포의 원종(ancestor)으로 도입되어야 한다. 발현 카세트 내의 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구조 프로모터 또는 숙주 세포가 어떤 특정의 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 식물과 같은 다세포 유기체의 경우, 프로모터는 특정의 조직 또는 기관, 또는 발생 단계에도 특이적일 수 있다. 발현 카세트 또는 이의 단편은 식물 내로 형질전환되는 경우 "삽입된 서열" 또는 "삽입 서열"로도 지칭될 수 있다.
"유전자"는 게놈 내에 위치하여, 상기 언급한 암호화 서열 이외에도, 암호화 영역의 발현, 즉 전사 및 해독을 담당하는 주로 조절성인 다른 핵산 서열을 포함할 수 있는 소정의 영역이다. 또한, 유전자는 다른 5' 및 3' 비해독 서열 및 종결 서열을 포함할 수 있다. 추가될 수 있는 요소로는 인트론을 예로 들 수 있다.
"관심대상의 유전자"란 식물 내로 전달되는 경우, 항생제 내성, 바이러스 내성, 곤충 내성, 질병 내성, 또는 기타 해충에 대한 내성, 제초제 내성, 향상된 영양가, 산업 공정에서의 개선된 수행능 및 변화된 번식능과 같은 바람직한 특성을 식물에 부여하는 유전자를 말한다.
본원에서 사용된 "유전자형"은 친주 옥수수 식물로부터 유전되는 유전 물질이며, 반드시 그 유전 물질이 모두 다음 세대의 옥수수 식물 내에서 발현될 필요는 없다. MIR162 유전자형은 식물의 게놈 내로 형질전환된 이종성 유전 물질뿐만 아니라 삽입된 서열의 측면의 유전 물질도 지칭한다.
"이종성" 핵산 서열은, 당해 서열이 도입되는 숙주 세포와는 본래 관련이 없는 핵산 서열로서, 자연 발생적인 핵산 서열의 비자연 발생적인 다수의 복사체도 포함된다.
"동종성" 핵산 서열은, 당해 서열이 도입되는 숙주 세포와 본래 관련이 있는 핵산 서열이다.
"작동가능하게 연결된"이란 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열들이 결합하여 하나의 서열 기능이 나머지 서열의 기능에 영향을 주게 되는 것을 말한다. 예를 들어, 프로모터는 암호화 서열 또는 작용성 RNA의 발현에 영향을 줄 수 있는 경우, 암호화 서열 또는 작용성 RNA와 작동가능하게 연결된 것이다(즉, 이들 암호화 서열 또는 작용성 RNA는 프로모터의 전사적 조절 하에 놓인다). 센스 또는 안티센스 방향성의 암호화 서열은 조절성 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본원에 사용된 "프라이머"는 핵산 하이브리드화에 의해 상보적인 표적 DNA 쇄에 어닐링되어 상기 프라이머와 표적 DNA 쇄 사이에 하이브리드를 형성한 후, DNA 폴리머라제와 같은 폴리머라제에 의해 표적 DNA 쇄를 따라 연장된 분리된 핵산을 말한다. 프라이머쌍 또는 세트는, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 다른 통상적인 핵산 증폭 방법에 의해 핵산 분자의 증폭을 위해 사용될 수 있다.
"프로브"는 방사성 동위원소, 리간드, 화학 발광제 또는 효소와 같은 검출가능한 표지 또는 리포터 분자에 부착되는 분리된 핵산이다. 이같은 프로브는 표적 핵산의 쇄, 본 발명의 경우 옥수수 이벤트 MIR162의 게놈 DNA의 쇄에 상보적이다. MIR162의 DNA는 옥수수 식물 또는 MIR162의 DNA를 포함하는 시료로부터 유래되는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 뿐만 아니라 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하여 당해 표적 DNA 서열의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 다른 프로브 물질을 포함한다.
프라이머 및 프로브는 일반적으로 그 길이가 10 내지 15개 뉴클레오타이드 이상이다. 또한, 프라이머 및 프로브는 그 길이가 20개 이상의 뉴클레오타이드, 또는 25개 이상의 뉴클레오타이드, 또는 30개 이상의 뉴클레오타이드일 수 있다. 이러한 프라이머 및 프로브는 엄중성이 높은 하이브리드화 조건 하에 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화한다. 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브는 표적 서열과 완전히 상보적인 서열을 가질 수 있으나, 표적 서열과 상이하고 표적 서열에 하이브리드화하는 능력을 보유하는 프로브도 통상의 방법에 의해 설계할 수 있다.
본원에서 사용된 유전자 또는 형질 "스태킹(stacking)"이란 목적하는 형질을 하나의 유전자전이주에 조합하는 것을 말한다. 식물 재배업자들은 각기 목적하는 형질들을 보유하는 친주들을 교배시킨 후, 이러한 목적하는 형질을 모두 보유하는 자손들을 동정함으로써 유전자전이 형질을 스태킹하게 되는 것이다. 유전자를 스태킹하는 또 다른 방법은 2개 이상의 유전자를 형질전환 중에 동시에 식물의 세포 핵 내로 이식하는 것이다. 유전자 스태킹의 또 다른 방법은 유전자전이 식물을 또 다른 관심대상 유전자로 다시 형질전환시키는 것이다. 예를 들어, 유전자 스태킹은 두 가지 다른 곤충 내성 형질, 하나의 곤충 내성 형질과 하나의 질병 내성 형질, 또는 하나의 제초제 내성 형질을 조합하는데 사용될 수 있다. 관심대상 유전자 이외에 선택적 마커의 사용도 유전자 스태킹에서 고려될 수 있다.
"엄중성 조건" 또는 "엄중성 하이브리드화 조건"은, 프로브가 그 표적 서열과 다른 서열에 비해 검출가능성이 더 큰 정도로 하이브리드화하는 조건을 의미한다. 엄중 조건은 표적-서열-의존성이며, 폴리뉴클레오타이드의 구조에 따라 다양할 것이다. 하이브리드화 및/또는 세척 조건의 엄중성을 조절함으로써, 프로브에 대해 100% 상보적인 표적 서열이 동정될 수 있다 (상동성 프로빙). 다른 방편으로, 보다 낮은 유사성을 가진 것들도 검출될 수 있도록 서열 내에 미스매칭(mismatching)을 어느 정도 허용하도록 엄중성 조건이 조절될 수도 있다 (이종성 프로빙). 보다 긴 서열은 더 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드화 한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 여러가지 다양한 지침에 대해서는 문헌[참조: Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier: New York; 및 Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York (1995), 및 Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning : A Laboratory Manual (5th Ed. Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]에서도 확인할 수 있다.
특이성은 보통 하이브리드화 후 세척의 함수로서, 최종 세척 용액의 이온 농도 및 온도가 중요한 인자이다. 일반적으로, 엄중성이 높은 하이브리드화 및 세척 조건은 규정된 이온 농도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열융점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮게 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매치된 프로브에 하이브리드화하는 온도이다(규정된 이온 농도 및 pH 하에서). 일반적으로, 엄중성이 높은 조건하에서, 프로브는 이의 표적 서열과 하이브리드화 할 것이지만 다른 서열과는 그러지 아니할 것이다.
서던 또는 노던 블롯에서 필터 상에 100개 이상의 상보적 잔기를 갖는 상보적 핵산의 하이브리드화를 위한 엄중성이 높은 하이브리드화 조건의 예는 42℃에서 1mg의 헤파린과 함께 50%의 포름아미드로 밤새 하이브리드를 수행하는 것이다. 매우 엄중한 세척 조건의 예는 72℃에서 약 15분간의 0.15M NaCl이다. 높은 엄중 세척 조건의 예는 65℃에서 15분간의 0.2×SSC이다(SSC 완충액에 대한 기재에 대해서는 Sambrook, 상기 문헌정보 참조).
본 발명에서 예시적인 하이브리드화 조건은, 7% SDS, 0.25M NaP04, pH 7.2, 67℃에서 하룻밤동안 하이브리드화한 후, 5% SDS, 0.20M NaP04, pH 7.2, 65℃에서 30분간 각각 2회 세척 및 1% SDS, 0.20M NaP04, pH 7.2, 65℃에서 30분간 각각 2회 세척하는 것이다. 예를 들어 100개 이상의 뉴클레오타이드의 듀플렉스(duplex)를 위한 예시적인 중간 정도의 엄중성 세척은 45℃에서 15분간의 1×SSC이다. 예를 들어 100개 이상의 뉴클레오타이드의 듀플렉스에 대한 예시적인 낮은 엄중성 세척은 40℃에서 15분간의 4 내지 6×SSC이다.
약 10개 내지 50개 뉴클레오타이드의 프로브에 있어서, 높은 엄중성 조건은 보통 약 1.0M 미만의 Na 이온의 염 농도, 보통 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0M의 Na 이온 농도이며, 온도는 보통 약 30℃ 이상이다. 또한, 높은 엄중성 조건은 포름아미드 같은 탈안정화제를 부가하여 달성될 수 있다. 일반적으로, 특정 하이브리드화 검정에서 관련성 없는 프로브에 대해 관측되는 것에 대해 시그날 대 노이즈 비가 2×(또는 그 이상)라는 것은 특이적 하이브리드화의 검출을 의미한다. 높은 엄중 조건 하에서 서로 하이브리드화하지 않는 핵산들은, 이들이 암호화하는 단백질들이 실질적으로 동일하다면 실질적으로 동일한 것들이다. 이는 예를 들어, 핵산의 복사체가 유전자 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴(degeneracy)을 사용하여 생성되는 경우에 해당한다.
다음은 본 발명의 기준 뉴클레오타이드와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드하는데 사용될 수 있는 하이브리드화/세척 조건의 예시적 설정이다: 기준 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 50℃에서 7% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 0.5M NaP04, 1 mM의 EDTA와, 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS에서의 세척, 보다 바람직하게는 50℃에서 7% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 0.5M NaP04, 1 mM의 EDTA와, 50℃, 1×SSC, 0.1% SDS에서의 세척, 보다 더 바람직하게는 50℃에서 7% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 0.5M NaP04, 1 mM의 EDTA와, 50℃, 0.5×SSC, 0.1% SDS에서의 세척, 바람직하게는 50℃에서 7% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 0.5M NaP04, 1 mM의 EDTA와, 50℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에서의 세척, 보다 바람직하게는 50℃에서 7% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 0.5M NaP04, 1 mM의 EDTA와, 65℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에서 세척하는 조건하에 기준 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화한다. 본 발명의 서열은 모든 상기 조건을 사용하여 검출될 수 있다. 본 발명을 규정하기 위한 목적상, 엄중성이 높은 조건이 사용된다.
"형질전환(transformation)"은 이종성 핵산을 숙주 세포 또는 유기체 내로 도입하기 위한 방법이다. 특히, "형질전환"은 관심대상의 유기체의 게놈 내로 DNA 분자를 안정적으로 혼입시키는 것을 의미한다.
"형질전환된/유전자전이된/재조합형(transformed/transgenic/recombinant) 숙주"라는 것은, 이종성 핵산 분자가 도입된 세균 또는 식물과 같은 숙주 유기체를 지칭한다. 핵산 분자는 숙주의 게놈 내로 안정적으로 혼입될 수 있거나 핵산 분자는 염색체외 분자로서도 존재할 수 있다. 이러한 염색체외 분자는 자가-복제성일 수 있다. 형질전환된 세포, 조직 또는 식물은 형질전환 공정의 최종 산물 뿐만 아니라, 이의 유전자전이 자손까지 포괄한다. "비-형질전환된", "비-유전자전이된" 또는 "비-재조합형" 숙주는 야생형 유기체, 예를 들면, 이종성 핵산 분자를 함유하지 않는 세균 또는 식물을 지칭한다. 본원에서 사용된 "유전자전이 식물"이란, 널리 공지된 유전자 조작 및 유전자 삽입 기술을 통해, 관심대상의 유전자를 나타내는 핵산의 서열이 식물 게놈 내로, 일반적으로 식물 핵의 염색체 내로, 미토콘드리아 내로, 또는 염색체를 함유하는 기타 소기관 내로, 천연 식물 또는 식물 세포에 정상적으로 존재하는 것보다 많은 복사체 개수로 정상적인 식물 세포와는 다른 유전자 위치에서 혼입된 식물, 식물 세포, 또는 구조화되거나 비구조화된 다수의 식물 세포를 말한다. 유전자전이 식물은, 이러한 핵산 서열이 조작되고 삽입되어 생성되며, 자연 발생적 돌연변이와는 달리, 비자연 발생적 식물 또는 비자연 발생적 유전자형을 갖는 식물을 생산하게 된다. 식물 및 식물 세포의 형질전환을 위한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 전기천공, 미세주입, 아그로박테리움-매개된 형질전환 및 생탄두(ballistic) 형질전환법을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 MIR162에 "특이적인"이라는 용어는 다른 것과 구별되는 MIR162의 특징을 의미한다. 따라서, 이벤트 MIR162에 특이적인 핵산은 다른 비-MIR162 옥수수 식물에서는 발견되지 않는다.
"Vip3" 부류의 단백질은 예를 들어, Vip3Aa, Vip3Ab, Vip3Ac, Vip3Ad, Vip3Ae, VipAf, Vip3Ag, Vip3Ba, Vip3Bb 및 이들의 동족체를 포함한다. "동족체"라는 것은 당해 단백질 또는 폴리펩타이드가 Vip3 부류의 단백질의 다른 구성원들과 특징적인 관계를 보유하고 있다는 것을 의미한다. "Vip3Aa20"는 이벤트 MIR162에 특이적인 Vip3 동족체이다. 이는 식물 형질전환 과정 중에 pNOV1300(서열번호 3)에 포함된 옥수수에 최적화된 vip3Aa19 유전자 내로 도입된 자발적인 돌연변이에 의해 발생되었다.
본 발명은 곤충 방제 단백질, Vip3Aa20, 및 식물이 탄소원으로 만노스를 사용하도록 해주는 포스포만노스 이소머라아제 효소(PMI; phosphomannose isomerase enzyme)를 생산하는 유전적으로 개량된 옥수수주에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신규한 유전자형을 포함하는 MIR162로 명명된 유전자전이 옥수수 이벤트 및 생물학적 시료 내에서 MIR162에 특이적인 핵산을 검출하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 MIR162 유전자형을 포함하는 옥수수 식물, 당해 옥수수 식물로부터 유전자전이된 종자 및 MIR162 유전자형을 포함하는 근교계 옥수수를 자가교배하거나 다른 옥수수주와 교배함으로써 MIR162 유전자형을 포함하는 옥수수 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 MIR162 유전자형을 포함하는 옥수수 식물은 이에 제한되지는 않지만, 검거세미밤나방(BCW, 아그로티스 입실론), 거염벌레(FAW, 스포도프테라 프루기페르다), 회색담배나방(TBW, 헬리오티스 비레센스), 사탕수수 천공충(SCB, 디아트라애 사카랄리스), 가루좀벌레(LCB, 엘라스모팔푸스 리그노셀루스), 왕담배나방(CEW, 헬리코베르파 제아) 및 서부 검거세미밤나방류(WBCW; western bean cutworm, 스트리아코스타 알비코스타(Striacosta albicosta))를 포함하는 광범위한 나비목 해충을 방제하는데 있어서 유용하다. 추가로, 본 발명은 MIR162의 곤충 내성 형질을 동일한 유전자전이 식물에서 다른 곤충 내성 형질과 스태킹하여 곤충 내성 형질만을 보유한 경우보다 곤충 섭식 피해로부터 더욱 보호될 수 있는 옥수수 식물을 유도함으로써, 곤충 섭식 피해로부터 유전자전이 식물을 보호하는 방법을 제공한다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 이벤트 MIR162에 특이적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 이종성 DNA 분자의 10개 이상(예를 들어 15개, 20개, 25개, 50개 또는 그 이상)의 연속 뉴클레오타이드 및 이종성 DNA 분자의 삽입 지점을 플랭킹하는 게놈 DNA의 10개 이상(예를 들어 15개, 20개, 25개, 50개 또는 그 이상)의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 MIR162 내의 게놈 DNA에, 이벤트 MIR162의 게놈 내에 삽입된 이종성 DNA 분자를 연결하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 또한, 이벤트 MIR162의 연속 삽입 서열의 10개 이상의 뉴클레오타이드와 삽입 서열에 인접한 MIR162 이벤트의 플랭킹 DNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열도 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 이벤트 MIR162에 특이적이고 이에 특징적이다. MIR162 이벤트의 게놈 DNA의 핵산 증폭 또는 하이브리드화는 이러한 특이적 뉴클레오타이드 서열을 포함하며 이벤트 MIR162에 특징적인 앰플리콘을 생성하게 된다. 상기 실시 양태의 한 측면에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 55, 서열번호 59 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 이벤트 MIR162의 하나 이상의 접합 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는데, 여기서 상기 접합 서열은 옥수수 게놈 내로 삽입된 이종성 발현 카세트와 당해 삽입 부위를 플랭킹하는 옥수수 게놈의 DNA 사이의 접합부에 걸쳐 있으며, 당해 이벤트에 대해 특징적이다. 상기 실시 양태의 한 측면에서, 상기 접합 서열은 서열번호 45, 서열번호 47 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 서열번호 45, 서열번호 47 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약 11개 내지 약 20개의 연속 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 이벤트 MIR162 내의 옥수수 식물 게놈 내에, 이종성 DNA 분자를 연결하는 분리된 핵산을 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 55, 서열번호 59 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 상기 실시 양태의 한 측면에서, 상기 분리된 핵산 분자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 수탁번호 PTA-8166으로 기탁된 옥수수 종자, 또는 그 종자로부터 성장한 식물에 포함된다.
본 발명의 한 실시 양태에서, 이벤트 MIR162에 특이적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 앰플리콘이 제공된다. 상기 실시 양태의 한 측면에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 55, 서열번호 59 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 이벤트 MIR162를 검출하기 위한 플랭킹 서열 프라이머를 포함한다. 이러한 플랭킹 서열 프라이머는, 5' 또는 3' 플랭킹 서열의 적어도 10 내지 15개의 연속 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 상기 실시 양태의 한 측면에서, 상기 연속 뉴클레오타이드는 서열번호 49의 뉴클레오타이드 1번 내지 1088번(양 끝 서열 포함) 또는 이의 상보체로부터 선택된다(본원에서는 임의로 5' 플랭킹 서열로 명명함). 상기 실시 양태의 또 다른 측면에서, 5' 플랭킹 서열 프라이머는 서열번호 36, 서열번호 39, 서열번호 53, 서열번호 68 내지 80 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 상기 실시 양태의 또 다른 측면에서, 상기 연속 뉴클레오타이드는 서열번호 49의 뉴클레오타이드 9391번 내지 10579번(양 끝 서열 포함), 또는 이의 상보체로부터 선택된다(본원에서는 임의로 3' 플랭킹 서열로 지정함). 본 실시 양태의 또 다른 측면에서, 상기 3' 플랭킹 서열 프라이머는 서열번호 58, 서열번호 97 내지 105 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 시료에서 이벤트 MIR162 DNA 주형의 존재 하에 함께 작용하여 옥수수 이벤트 MIR162에 특징적인 앰플리콘을 생성하는 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머를 포함하는 한쌍의 폴리뉴클레오타이드 프라이머를 포함한다. 본 실시 양태의 한 측면에서, 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머는 서열번호 1 또는 이의 상보체로부터 선택된다. 본 실시 양태의 다른 측면에서, 제1 프라이머 및/또는 제2 프라이머는 서열번호 15 내지 35, 서열번호 37, 서열번호 42 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 실시 양태의 또 따른 측면에서, 상기 앰플리콘은 서열번호 1, 서열번호 38, 서열번호 44 또는 이들의 상보체를 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 시료에서 이벤트 MIR162 DNA 주형의 존재 하에 함께 작용하여 옥수수 이벤트 MIR162에 특징적인 앰플리콘을 생성하는 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머를 포함하는 한쌍의 폴리뉴클레오타이드 프라이머를 포함하는데, 여기서 상기 제1 프라이머 서열은 이벤트 MIR162의 옥수수 식물 게놈으로 삽입된 이종성 DNA 서열의 삽입 지점을 플랭킹하는 옥수수 식물 게놈 서열이거나 이에 상보적이고, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머 서열은 이벤트 MIR162의 게놈으로 삽입된 이종성 DNA 서열이거나 이에 상보적이다.
상기 실시 양태의 한 측면에서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 49의 1번 내지 1088번 위치의 뉴클레오타이드, 서열번호 49의 9391번 내지 10579번 위치의 뉴클레오타이드 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 실시 양태의 추가의 측면에서, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 36, 서열번호 39, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 68 내지 72, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 97 내지 105 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 실시 양태의 또 다른 측면에서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 49의 1089번 내지 9390번 위치의 뉴클레오타이드 또는 이의 상보체의 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 실시 양태의 또 다른 측면에서, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머는 서열번호 15 내지 35, 서열번호 37, 서열번호 40, 서열번호 50 내지 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 63, 서열번호 73, 서열번호 82, 서열번호 96 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기 실시 양태의 또 다른 측면에서, 서열번호 36에 기재된 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 37에 기재된 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머는, 실시예 4에 기재된 바와 같이, 시료 내에서 이벤트 MIR162 DNA 주형의 존재 하에 함께 작용하여 이벤트 MIR162에 대해 특징적인 앰플리콘을 생성한다. 이러한 측면의 한 실시 양태에서, 상기 앰플리콘은 서열번호 38에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 실시 양태의 또 다른 측면에서, 서열번호 39에 기재된 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 40에 기재된 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머는, 실시예 4에 기재된 바와 같이, 시료 내에서 이벤트 MIR162 DNA 주형의 존재 하에 함께 작용하여 이벤트 MIR162에 대해 특징적인 앰플리콘을 생성한다. 이러한 측면의 한 실시 양태에서, 상기 앰플리콘은 서열번호 41에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 실시 양태의 또 다른 측면에서, 서열번호 53에 기재된 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 54에 기재된 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머는, 실시예 5에 기재된 바와 같이, 시료 내에서 이벤트 MIR162 DNA 주형의 존재 하에 함께 작용하여 이벤트 MIR162에 대해 특징적인 앰플리콘을 생성한다. 한 실시 양태에서, 상기 앰플리콘은 서열번호 55에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 실시 양태의 또 다른 측면에서, 서열번호 58에 기재된 제1 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 서열번호 56에 기재된 제2 폴리뉴클레오타이드 프라이머는, 실시예 5에 기재된 바와 같이, 시료 내에서 이벤트 MIR162 DNA 주형의 존재 하에 함께 작용하여 이벤트 MIR162에 대해 특징적인 앰플리콘을 생성한다. 한 실시 양태에서, 상기 앰플리콘은 서열번호 59에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
물론, 당업계의 기술 내에서, MIR162 이벤트에 특징적 서열 증폭용 프라이머 쌍에서 사용가능한 프라이머 서열로서의 사용을 위해, 삽입된 이종성 DNA 서열의 어느 한 말단에 플랭킹하는 게놈 서열 내로 더 나아간 추가의 서열을 수득할 수 있다. 이러한 개시의 목적을 위해, "삽입된 이종성 DNA 서열의 어느 한 말단에 플랭킹하는 게놈 서열내로 더 나아간"이라는 말은, 구체적으로, 삽입된 DNA 서열이 천연 게놈 DNA 서열에 인접한 지점인, 삽입된 이종성 DNA 서열의 말단으로부터 상기 이종성 DNA 서열이 삽입된 특정 염색체의 게놈 DNA 서열 내로 연속적으로 이동하는 것을 일컫는다. 바람직하게는, 삽입 서열의 일부에 상응하거나 이에 상보적인 프라이머 서열은 가장 가까운 플랭킹 서열 접합부를 향하여 DNA 또는 RNA의 개시 쇄의 전사적 연장을 이끌어내야 한다. 결과적으로, 게놈 플랭킹 서열의 일부에 상응하거나 이에 상보적인 프라이머 서열은 가장 가까운 플랭킹 서열 접합부를 향하여 DNA 또는 RNA의 개시 쇄의 전사적 연장을 이끌어낼 수 있어야 한다. 프라이머 서열은 식물의 염색체 또는 게놈 플랭킹 서열 내로 삽입된 이종성 DNA 서열일 수 있거나, 이에 상보적일 수 있다. 당업계의 숙련자는, 게놈 DNA 서열과 삽입된 이종성 DNA 서열 사이의 접합부를 포함하는 특정 플랭킹 서열의 증폭을 위해 고안된 프라이머 한벌의 세트를 사용함으로써 수득될 목적하는 생성물의 성질을 기초로 판단하여, 프라이머 서열이, 삽입된 이종성 DNA 서열에 기재된 서열 또는 서열번호 38에 기재된 서열이어야 하는지 또는 이에 상보적이어야 하는지에 대한 여부에 따른 그 이점을 쉽게 인지할 수 있을 것이다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 서열번호 2를 포함하는 분리된 살곤충성 단백질과 서열번호 2를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 본 실시 양태의 한 측면에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1이다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 분자 및 재조합 벡터에 작동가능하게 연결된 이종성 프로모터를 포함하는 키메라 유전자를 포함하며, 상기 키메라 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 숙주 세포를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 옥수수 핵산을 포함하는 시료에서 이벤트 MIR162에 특이적인 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 (a) 이벤트 MIR162의 게놈 DNA와 함께 핵산 증폭 반응에 사용되는 경우 이벤트 MIR162에 특징적인 앰플리콘을 생성하는 한쌍의 프라이머와, 옥수수 핵산을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행하여 상기 앰플리콘을 생성시키는 단계; 및 (c) 상기 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함한다. 본 실시 양태의 한 측면에서, 상기 앰플리콘은 서열번호 1, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 55, 서열번호 59 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 옥수수 핵산을 포함하는 시료에서 이벤트 MIR162에 특이적인 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 (a) 엄중성이 높은 조건 하에서 이벤트 MIR162의 게놈 DNA와는 하이브리드화하고, 대조군 옥수수 식물의 DNA와는 하이브리드화하지 않는 프로브와, 상기 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 시료 및 프로브에 엄중성이 높은 하이브리드화 조건을 가하는 단계; 및 (c) DNA에의 상기 프로브의 하이브리드화를 검출하는 단계를 포함한다. 검출은 당업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의할 수 있는데, 형광성, 화학발광성, 방사성, 면역학적 검출 방법 등이 포함된다. 하이브리드화가 MIR162 이벤트에 대해 특징적인 앰플리콘을 생산하기 위한 특정 서열의 증폭을 위한 수단으로서 사용하도록 고안된 경우, 당업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의한 앰플리콘의 생산 및 검출은, 하나의 프로브 또는 프라이머가 사용되는 표적 서열, 또는 2개 이상의 프로브 또는 프라이머가 사용되는 표적 서열에 대해 고안된 하이브리드화를 나타내는 것으로 의도된다. "생물학적 시료"라는 용어는 삽입된 이종성 DNA 서열의 두 개의 말단 중 하나 또는 나머지 하나가, 이종성 DNA 서열이 삽입되는 염색체 내의 게놈 DNA 서열(본원에서는 접합 서열로도 칭함)과 접촉하는 지점의 어느 한 쪽에 5개 내지 10개의 뉴클레오타이드를 포함한 핵산을 함유하거나 함유하는 것으로 보이는 시료를 포함한다. 또한, 상기 접합 서열은 2개 이하의 뉴클레오타이드, 즉 삽입된 이종성 DNA 서열 내의 제1 뉴클레오타이드에 인접하고 공유 결합된 플랭킹 게놈 DNA 내의 제1 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 실시 양태의 한 측면에서, 상기 프로브는 서열번호 1, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 55, 서열번호 59 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 생물학적 시료 내에서 이벤트 MIR162에 특이적인 핵산의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 상기 키트는 핵산 검출 방법에서 프라이머 또는 프로브로서 작용하는데 충분한 길이의 연속적인 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 핵산 분자를 포함하며, 시료에서 표적 핵산 서열의 증폭 또는 그 서열에의 하이브리드화 이후 앰플리콘 또는 당해 표적 서열에의 하이브리드화의 검출시, 상기 시료 내의 이벤트 MIR162에 특이적인 핵산 서열의 존재에 특징적이다. 또한, 상기 키트는 핵산 하이브리드화 방법 또는 증폭 방법을 가능하게 하기 위해 필요한 다른 물질을 추가로 포함한다. 본 실시 양태의 한 측면에서, 키트에 포함되는 핵산 분자는 서열번호 1 또는 서열번호 49의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 실시 양태의 다른 측면에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 15 내지 37, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 50 내지 54, 서열번호 56 내지 58, 서열번호 60 내지 105 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 프라이머이다. 본 실시 양태의 또 다른 측면에서, 상기 앰플리콘은 서열번호 1, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 55, 서열번호 59 또는 이들의 상보체를 포함한다. 다양한 검출 방법이 사용될 수 있는데, 여기에는 TAQMAN (Perkin Elmer), 열 증폭, 리가아제 연쇄 반응, 서던 하이브리드화, ELISA 방법과, 비색 및 형광성 검출 방법을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 특히, 본 발명은 MIR162의 게놈 핵산을 포함하는 시료 내에서, 표적 서열의 존재, 즉, 적어도 vip3Aa20 서열 또는 접합 서열의 존재를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 표적 부위에 결합할 수 있거나 이에 실질적으로 인접한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 표적 부위에 폴리뉴클레오타이드의 결합을 검출하기 위한 하나 이상의 수단을 포함한다. 검출 수단은 형광성, 화학발광성, 비색 또는 동위원소 분석일 수 있으며, 적어도 결합을 검출하기 위한 면역학적 방법과 연계될 수 있다. 또한, 키트는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용하여, 시료 내에서 표적 부위의 존재, 즉, 적어도 MIR162의 vip3Aa20 서열 또는 접합 서열의 존재를 검출할 수 있도록 구상되는데, 여기서 상기 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드의 서열은 표적 서열에 인접하거나 표적서열의 약 100개 염기쌍, 또는 약 200개 염기쌍, 또는 약 500개 염기쌍 또는 약 1000개 염기쌍 내의 뉴클레오타이드 서열에 함께 결합하여 서로 연장될 수 있어서, 적어도 상기 표적 부위를 함유하는 앰플리콘을 형성하게 된다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 생물학적 시료 내에서 Vip3Aa20 단백질을 검출하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 (a) 이벤트 MIR162 조직으로부터 단백질을 추출하는 단계; (b) MIR162 이벤트에 의해 생산된 Vip3Aa20 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함하는 면역학적 방법을 사용하여 상기 추출된 단백질을 분석하는 단계; 및 (c) 상기 항체의 Vip3Aa20 단백질에의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 이벤트 MIR162 옥수수 식물, 조직 또는 종자 유래의 생물학적 시료를 포함하는데, 상기 시료는 이벤트 MIR162에 특이적인 뉴클레오타이드 서열이거나 이에 상보적인 서열을 포함하고, 상기 서열은 핵산 증폭 방법 또는 핵산 하이브리드화 방법을 사용하여 상기 시료 내에서 검출가능하다. 본 실시 양태의 한 측면에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 55 또는 서열번호 59인 뉴클레오타이드 서열이거나 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열이다. 본 실시 양태의 다른 측면에서, 상기 시료는 옥수수 가루, 옥수수 분, 옥수수 시럽, 옥수수유, 옥수수 전분, 및 옥수수 부산물을 포함하도록 전체적 또는 부분적으로 가공된 시리얼로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 이벤트 MIR162 옥수수 식물, 조직 또는 종자 유래의 생물학적 시료의 추출물을 포함하는데, 상기 시료는 이벤트 MIR162에 특이적인 뉴클레오타이드 서열이거나 이에 상보적인 서열을 포함한다. 본 실시 양태의 한 측면에서, 상기 당해 서열은 핵산 증폭 방법 또는 핵산 하이브리드화 방법을 사용하여 상기 추출물 내에서 검출가능하다. 본 실시 양태의 다른 측면에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 55 또는 서열번호 59인 뉴클레오타이드 서열이거나 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열이다. 본 실시 양태의 또 다른 측면에서, 상기 시료는 옥수수 가루, 옥수수 분, 옥수수 시럽, 옥수수유, 옥수수 전분, 및 옥수수 부산물을 포함하도록 전체적 또는 부분적으로 가공된 시리얼로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시 양태는 유전자전이 이벤트 MIR162의 유전자형을 포함한는 옥수수 식물, 또는 이의 일부 및 그 종자를 포함하는데, 상기 유전자형은 서열번호 1, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 55, 서열번호 59에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 상보체를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 옥수수 종자의 한 예는 2007년 1월 23일에 기탁되어 ATCC 수탁번호 PTA-8166을 부여받았다. 본 실시 양태의 한 측면에서, 옥수수 식물은 근교계 옥수수주 (inbred corn line) CG5NA58, CG5NA58A, CG3ND97, CG5NA01, CG5NF22, CG4NU15, CG00685, CG00526, CG00716, NP904, NP911, NP948, NP934, NP982, NP991, NP993, NP2010, NP2013, NP2015, NP2017, NP2029, NP2031, NP2034, NP2045, NP2052, NP2138, NP2151, NP2166, NP2161, NP2171, NP2174, NP2208, NP2213, NP2222, NP2275, NP2276, NP2316, BCTT609, AF031, NPH8431, 894, BUTT201, R327H, 2044BT 및 2070BT로부터 유래된다. 그러나, 당업자라면 MIR162 유전자형은 야생형 옥수수종을 비롯한 옥수수와 교배될 수 있는 임의의 식물 변종 내로 도입될 수 있는 것이므로, 이러한 실시 양태의 근교계 주의 상기한 예들이 제한적이지 않다는 사실을 알 수 있을 것이다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 함께 연결되어 연속 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 적어도 제1 및 제2 DNA 서열을 포함하는 옥수수 식물을 포함하는데, 여기서 상기 제1 DNA 서열은 접합 서열 내에 존재하며, 서열번호 49의 뉴클레오타이드 1079번 내지 1098번, 뉴클레오타이드 9381번 내지 9400번 및 이들의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약 11개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 제2 DNA 서열은 서열번호 49 및 이의 상보체에 기재된 이종성 삽입 DNA 서열 내에 존재하며, 상기 제1 및 제2 DNA 서열은 생물학적 시료 내에서 옥수수 이벤트 MIR162 핵산 서열의 존재를 검출하기 위한 뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브로서 유용하다. 본 실시 양태의 한 측면에서, 상기 뉴클레오타이드 프라이머는 옥수수 식물로부터 추출된 주형 DNA의 표적 DNA 서열을 증폭하기 위해 DNA 증폭 방법에 사용되며, 상기 옥수수 식물은 서열번호 45 또는 서열번호 47을 포함하는 DNA 서열에 상응하는 앰플리콘의 생성에 의해 다른 옥수수 식물로부터 동정될 수 있다.
본 발명의 옥수수 식물은, 엄중성이 높은 조건 하에 vip3Aa20 프로브를 사용하여, 식물의 게놈 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 KpnI, EcoRV 또는 NcoI로 동시에 분해하면 각각 대략 8 kb, 13 kb 또는 4.6 kb의 vip3Aa20 하이브리드 밴드를 생성시킬 수 있다는 점을 추가적인 특징으로 한다. 본원 중 예시된 것으로는 서열번호 13에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 vip3Aa20 프로브이다.
본 발명의 옥수수 식물은, 엄중성이 높은 조건 하에 pmi 프로브를 사용하여, 식물의 게놈 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 Acc65I 또는 BamHI로 분해하면 단일 pmi 하이브리드 밴드를 생성시킬 수 있다는 점을 추가적인 특징으로 한다. 본원 중 예시된 것으로는 서열번호 14에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pmi 프로브이다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 MIR162 유전자형이 옥수수 식물에 곤충에 대한 내성 또는 탄소원으로서 만노스를 사용할 수 있는 능력, 또는 곤충에 대한 내성과 탄소원으로서 만노스를 사용할 수 있는 능력 모두를 부여하는 옥수수 식물을 제공한다. 이러한 실시 양태의 한 측면에서, 옥수수 식물에 곤충에 대한 내성을 부여하는 상기 유전자형은 vip3Aa20 유전자를 포함하며, 이러한 양태의 또다른 국면에서, 본 발명의 옥수수 식물에 탄소원으로서 만노스를 사용할 수 있는 능력을 부여하는 유전자전이 유전자형은 pmi 유전자를 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 (a) 제1 친주 옥수수 식물 또는 제2 친주 옥수수 식물이 이벤트 MIR162 DNA를 포함하는, 제1 친주 옥수수 식물과 제2 친주 옥수수 식물을 유성 교배시켜 다수의 제1 세대 자손 식물을 생산하는 단계; (b) 하나 이상의 나비목 해충에 대해 내성인 제1 세대 자손 식물을 선별하는 단계; (c) 상기 제1 세대 자손 식물을 자가교배시켜 다수의 제2 세대 자손 식물을 생산하는 단계; 및 (d) 상기 제2 세대 자손 식물들로부터 하나 이상의 나비목 해충에 대해 내성인 식물을 선별하는 단계를 포함하고, 상기 제2 세대 자손 식물이 서열번호 1, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 55 및 서열번호 59로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 나비목 해충에 대해 내성이 있는 옥수수 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 1, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 55 및 서열번호 59로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 근교계 옥수수주(inbred corn line)의 종자 및 다른 유전자형을 갖는 제2 근교계주(inbred line)의 종자를 파종하는 단계; (b) 상기 파종으로부터 생긴 옥수수 식물을 개화시까지 경작하는 단계; (c) 옥수수 근교계주 중 하나의 식물의 꽃을 제거하는 단계; (d) 상기 2개의 다른 근교계주를 서로 유성 교배시키는 단계; 및 (e) 이렇게 생산된 잡종 종자를 수확하는 단계를 포함하는 잡종 종자의 생산 방법을 제공한다. 본 실시 양태의 한 측면에서, 상기 제1 근교계 옥수수주는 자성 친주를 제공한다. 본 실시 양태의 다른 측면에서, 상기 제1 근교계 옥수수주는 웅성 친주를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 구현된 방법에 의해 생산된 잡종 종자 및 그 종자로부터 성장한 잡종 식물도 포함한다.
당업자는 MIR162의 유전자전이 유전자형이 상이한 유전자전이 유전자형을 포함하는 다른 옥수수주로 육종에 의해 유전자 이입될 수 있다는 것을 알 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 MIR162 옥수수 근교계는 나비목에 대해 내성인 Bt11 이벤트(미국특허 제6,114,608호 및 제6,342,660호, 참조로서 본원에 인용됨)의 유전자전이 유전자형을 포함하는 옥수수 근교계와 교배할 수 있다. 생산된 종자 및 자손 식물들은 스태킹된 곤충 내성 형질과 Cry1Ab와 Vip3Aa20가 조합된 범위의 활성을 가진다. 본 발명에 의해 포함되는 다른 형질의 스태킹에는 MIR162 곤충 내성 형질과 MIR604 곤충 내성 형질(미국특허공보 제2005/0216970호, 2005년 9월 29일 공개됨, 참조로서 본원에 인용됨)의 조합을 포함한다. 생산된 종자 및 자손에서의 상기 스태킹된 형질은 그 범위가 증대된 활성을 식물에 부여한다. 즉, 식물은 나비목 및 딱정벌레목 해충 모두에 대해 내성을 갖게 된다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 해충에 의한 섭식 피해로부터 유전자전이 옥수수 식물을 보호하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 동일한 유전자전이 식물 내에서 Vip3Aa20 곤충 내성 형질을, Vip3Aa20과 상이한 또 다른 곤충 내성 형질과 스태킹하는 것을 포함하며, 이로써 스태킹된 형질은 곤충 내성 형질만을 보유한 경우에서 기대될 수 있는 것보다 곤충 섭식 피해로부터 옥수수 식물을 더욱 보호할 수 있게 되는 것이다. 본 실시 양태의 한 측면에서, 이벤트 MIR162와 이벤트 MIR604를 유성 교배시키거나, 동일한 식물 내로 상기 형질들을 함께 형질전환시킴으로써 이벤트 MIR162에 포함된 Vip3Aa20 곤충 내성 형질을 동일한 유전자전이 옥수수 식물내의 이벤트 MIR604 내에 포함된 Cry3A055 곤충 내성 형질과 스태킹시킨다.
MIR162 근교계와 교배될 수 있는 다른 유전자전이 이벤트의 예로서는, 글리포세이트에 내성인 GA21 이벤트, 글리포세이트 내성/나비목 곤충 내성인 MON802 이벤트, 나비목 내성인 DBT418 이벤트, 웅성 불임 이벤트 MS3, 포스피노트리신 내성 이벤트 B16, 나비목 곤충 내성 이벤트 MON80100, 포스피노트리신 내성 이벤트 T14 및 T25, 나비목 곤충 내성 이벤트 176 및 딱정벌레목 내성 이벤트 MON863을 포함하며, 이들 모두는 당업계에 공지되어 있다. 덧붙여, 기타 조합물 및 스태킹이 본 발명의 유전자전이 유전자형을 사용하여 생성될 수 있으므로, 이들의 예는 제한하는 것으로 생각해서는 안된다.
또한, 당업자는 MIR162 유전자형을 포함하는 유전자전이 옥수수 종자를 살곤충제를 포함하는 다양한 종자 처리 화학물질로 처리하여 Vip3Aa20 단백질의 살곤충 활성을 증대시키거나 상승작용시킬 수 있다는 사실을 알 것이다.
본 발명은 이종성 핵산의 삽입용으로 우수한, 옥수수 게놈 내에 5번 염색체 상의 특정 부위를 개시한다. 또한, 5번 염색체 상의 표적 부위의 위치를 동정하는데 유용한 5' 분자 마커(opie2; 서열번호 106의 뉴클레오타이드 1680번 내지 3338번) 및 3' 분자 마커(gag; 서열번호 106의 뉴클레오타이드 43,275번 내지 45,086번)도 개시된다. 따라서, 본 발명은 이렇게 미리 만들어진 표적 부위 또는 이러한 표적 부위 부근에 관심대상의 이종성 핵산을 도입하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 개시된 표적 부위 또는 이러한 표적 부위 부근에 삽입된 임의의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 옥수수 종자 및/또는 옥수수 식물을 포함한다. 이러한 표적 부위 통합을 달성하기 위한 한가지 선택으로서 본원에서 예시된 vip3Aa20 발현 카세트 대신에 다른 삽입물로 치환하는 것을 들 수 있다. 일반적으로 이와 관련하여, 표적화 상동 재조합이 제한 없이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. "상동 재조합"이란 유사한 뉴클레오타이드 서열(즉, 상동 서열)을 포함하는 당해 부위를 가지는 임의의 뉴클레오타이드 서열의 쌍 사이의 반응, 즉, 이러한 두 분자들이 상호작용(재조합)하여, 새롭게 재조합된 DNA 서열을 형성하는 반응을 말한다. 유사한 뉴클레오타이드 서열의 부위는 각각 본원에서 "상동성 서열"로 언급된다. 일반적으로, 상동 재조합의 빈도는 상동 서열의 길이가 증가함에 따라 증대된다. 따라서, 상동 재조합이 동일하지 않은 두 뉴클레오타이드 서열 사이에서 발생하는 경우, 재조합 빈도(또는 효율)는 두 서열 사이의 일탈이 증가함에 따라 감소하게 된다. 재조합은 각각의 공여체 및 표적 분자 상에서 하나의 상동성 서열을 사용하여 달성될 수 있으며, 이로써 "단일-교차" 재조합 생성물을 생성하게 된다. 다른 방편으로는, 두 상동성 서열을 각각의 공여체 및 표적 분자 상에 위치시킬 수 있다. 공여체 상의 두 상동성 서열과 표적 분자 상의 두 상동성 서열과의 재조합으로 "이중-교차" 재조합 생성물을 생성하게 된다. 공여체 분자 상의 상동성 서열들이, 조작될 서열(예를 들어, 관심대상의 서열)을 플랭킹하는 경우, 상기 표적 분자와의 이중-교차 재조합은 관심대상 서열이 표적 분자 상의 원래의 상동성 서열 간에 존재했던 DNA 서열을 대체한 재조합 생성물을 유도할 것이다. 표적 분자와 공여체 분자 사이에 이중-교차 재조합 이벤트를 통한 DNA 서열의 교환은 "서열 치환"이라고 일컫는다. 이러한 유형의 기법은 예를 들어, 참조로서 본원에 인용된 미국특허공보 제2006/0253918호의 주제이다. 현재 상기 개시된 표적 부위는 동정되었고, 이로써 상기 동정된 표적 부위 근방의 서열을 사용하여, 당업자라면 이종성 핵산의 표적 부위 통합을 위한 다른 방법이 사용될 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다. 이러한 방법들은, 이에 제한되지는 않지만, 미국특허공보 제2007/0039074호 및 제2006/0130179호에 개시되어 있다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 5번 염색체 상에서 서열번호 106의 뉴클레오타이드 1680번 내지 3338번으로 기재된 opie2 분자 마커와 서열번호 106의 뉴클레오타이드 43,275번 내지 45,086번으로 기재된 gag 분자 마커 사이에 위치하는 옥수수 염색체 표적 부위를 포함하는데, 상기 표적 부위는 이종성 핵산을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 상기 옥수수 염색체 표적 부위는 5번 염색체 상에서 서열번호 106의 뉴클레오타이드 25,454번과 25,513번 사이에 위치한다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 염색체 표적 부위는 서열번호 106의 뉴클레오타이드 5,454번 내지 25,454번에 의해 5' 플랭킹되고, 서열번호 106의 뉴클레오타이드 25,513번 내지 45,513번에 의해 3' 플랭킹된다.
한 실시 양태에서, 본 발명은 5번 염색체 상에서 서열번호 106의 뉴클레오타이드 1680번 내지 3338번으로 기재된 opie2 분자 마커와 서열번호 106의 뉴클레오타이드 43,275번 내지 45,086번으로 기재된 gag 분자 마커 사이의 위치에 이종성 핵산을 삽입하는 단계를 포함하는 유전자전이 옥수수 식물의 제조 방법을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 상기 이종성 핵산은 5번 염색체 상에서 서열번호 106의 뉴클레오타이드 25,454번과 25,513번 사이에 삽입된다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 삽입된 이종성 핵산은 서열번호 106의 뉴클레오타이드 5,454번 내지 25,454번에 의해 5' 플랭킹되고, 서열번호 106의 뉴클레오타이드 25,513번 내지 45,513번에 의해 3' 플랭킹된다.
본 발명의 유전자전이 유전자형은 당업계에 공지된 육종 기술을 사용하여 임의의 옥수수 근교계 또는 잡종 내로 도입될 수 있다. 식물 육종의 목적은 다양한 원하는 성질들을 단일 변종 또는 잡종에 조합시키기 위한 것이다. 농작물에 있어서, 이러한 형질은 곤충 및 질병에 대한 내성, 제초제에 대한 내성, 열 및 가뭄에 대한 내성을 포함하고 있어, 작물의 성숙되는 시간을 줄이고, 수확율을 증대시키며, 농작물 품질을 보다 우수하게 할 수 있다. 많은 작물을 기계적으로 수확하기 때문에, 발아 및 종자세, 성장률, 성숙도 및 식물 및 이삭의 높이와 같은 식물 특성의 동질화가 중요하다.
농작물은 식물의 수분작용을 사용한 기술을 통해 육종된다. 식물은 한 꽃의 꽃가루가 동일한 식물의 동일하거나 다른 꽃으로 전달되는 경우에 자가수분된다. 식물은 꽃가루가 다른 식물의 꽃으로부터 오는 경우 교차수분된다.
자가수분되고 여러 세대동안 특정 유형에 대해 선택된 식물은 거의 모든 유전자좌에서 동종접합성이 되어, 동질성을 갖는 군집의 진정한 육종 자손을 생성하게 된다. 2개의 상이한 동종접합주 간의 교배는 많은 유전자좌에 대해 이종접합성일 수 있는, 동질성을 갖는 군집의 잡종 식물을 생성하게 된다. 다수의 유전자좌에서 각각 이종접합성인 2개 식물의 교배는 유전적으로 상이하고 균등하지 않은 잡종 식물의 군집을 생성하게 될 것이다.
옥수수(Zea mays L.)는 자가수분 및 이종수분 기법 모두에 의해 육종될 수 있다. 옥수수는 동일한 식물상에 별도의 수꽃 및 암꽃을 가지며, 이들은 각각 수염과 이삭에 위치하고 있다. 자연적 수분작용은 바람이 수염으로부터 이삭 정상부에서 돌출된 수염으로 꽃가루를 불어주는 경우에 일어난다.
식물에서 웅성 번식력을 조절하는 확실한 방법은 개량된 식물 육종에 대한 기회를 제공하는 것이다. 이것은 특히, 일부 종류의 웅성 불임 시스템에 의존하는 옥수수 잡종의 개발을 위해 절실하다. 육종자에게 유용한 웅성 번식력을 조절하는 여러 선택사항이 있다: 수동조작 또는 기계적 탈웅(또는 웅수 제거), 세포질성 웅성 불임, 유전적 웅성 불임 및 살정제 등.
보통 잡종 옥수수 종자는 수동조작 또는 기계적 웅수 제거를 포함하는 웅성 불임 시스템에 의해 생산된다. 2개의 옥수수 근교계의 호생 스트립을 농작지에 심고 꽃가루 함유 수염을 근교계(자성) 중 하나로부터 제거하였다. 외래 옥수수 꽃가루원으로부터 충분히 분리되어 있는 경우, 웅수 제거된 근교계의 이삭은 다른 근교계(웅성)로부터만 수정될 것이기에, 수득한 종자는 잡종이며 잡종 식물을 형성할 것이다.
노동 집약적이지만 때로는 신뢰할 수 없는 웅수 제거 방법은 당업계에서 유전적 웅성 불임성을 제공하는 많은 방법 중 하나를 사용하여 피할 수 있으며, 이는 그 자체의 이점과 결점을 수반한다. 이러한 방법들은 웅성 조직 특이적 프로모터 또는 번식력에 중요한 유전자를 동정하고 이러한 유전자에 대한 안티센스가 식물에 삽입되는 안티센스 시스템과 연계하여, 세포 독성 물질을 암호화하는 유전자를 식물에 도입하는 것과 같은 다양한 방법을 사용한다[참조: Fabinjanski et al., 유럽특허출원 제89/3010153.8호 공개공보 제329,308호 및 국제공개공보 제WO 90/08828호로서 공개된 PCT국제출원 제PCT/CA90/00037호].
그러나, 웅성 불임 근교계의 사용은 옥수수 잡종의 생산에 있어서 한 요소이다. 당업계에 공지되어 있으며 옥수수 식물 육종 프로그램에서 사용되는 식물 육종 기술은 순환 선별, 역교배, 계통 육종, 제한길이 다형성 개량된 선별, 유전자 마커 개량된 선별 및 형질전환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 옥수수 식물 육종 프로그램에서 옥수수 잡종의 발생은 일반적으로 동종접합성 근교계 주의 발생, 이러한 식물주의 교배 및 당해 교배에 대한 평가를 필요로 한다. 계통 육종 및 순환 선별 육종 방법은 육종 군집으로부터 근교계 주를 발생시키는데 사용된다. 옥수수 식물 육종 프로그램은 2개 이상의 근교계 주 또는 다양한 다른 생식질(germplasm)의 유전적 배경을 육종 풀(pool)로 조합시켜, 이로부터 목적하는 표현형을 자가교배시키고 선별함으로써 새로운 근교계 주가 발생되게 하는 것이다. 새로운 근교계는 다른 근교계 주와 교배되고, 이러한 교배로 유래한 잡종을 평가하여 이들 중 어느 것이 상업성이 있는지를 결정한다. 옥수수 식물 육종 프로그램에서 수행되는 식물 육종 및 잡종 발생은 고가이고 시간 소모적인 과정이다.
계통 육종은 하나에는 결핍되어 있지만 다른 하나가 이를 보완하도록 각각 하나 이상의 목적하는 특성을 갖는 2개의 유전자형을 교배시키는 것에서 출발한다. 2개의 본래의 친주가 모든 목적하는 특성들을 제공할 수 없다면, 다른 공급원이 육종 집단에 포함될 수 있다. 계통 방법에서, 보다 우수한 식물은 자가교배되고 계승되는 세대에서 선별된다. 다음 세대에서는, 자가수분 또는 선별 결과로서 이종접합성 조건은 동종접합성주에게 양보된다. 보통, 계통 육종 방법에서, 5세대 이상의 자가교배 및 선별이 수행된다: F1→F2; F2→F3; F3→F4; F4→F5 등.
순환 선별 육종, 역교배는 예를 들어, 당해 근교계 주를 사용하여 만들어진 근교계 주 및 잡종을 개선시키는데 사용될 수 있다. 역교배는 특정의 원하는 형질을 하나의 근교계 또는 공급원으로부터 당해 형질이 결여된 근교계 주로 이식하는데 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 우수한 근교계 주(순환 친주)를 미지의 당해 형질에 대한 적절한 유전자(들)를 보유하는 공여체 근교계(비순환 친주)로 교배시킴으로써 달성될 수 있다. 이후, 당해 교배 자손은 보다 우수한 순환 친주에 역교배시킨 후, 비순환 친주로부터 이식될 원하는 형질에 대하여 순환 자손 중에서 이를 보유하는 것들을 선별한다. 목적하는 형질에 대한 선별과 함께 5회 이상의 역교배 세대 이후, 자손은 이식된 특성을 조절하는 좌에 대해 동종접합성일 것이지만, 모든 필수 기타 유전자에 대해서는 우수한 친주와 유사할 것이다. 이어서, 최종 역교배 세대를 자가교배시켜 이식된 유전자에 대한 순수한 육종 자손을 생산한다. 상기 이식된 유전자를 함유하는 근교계 주로부터 발생된 잡종은 이식된 유전자가 없는 동일한 근교계로부터 발생된 잡종과 근본적으로 동일하다.
정예의 근교계 주, 즉, 순수한 육종 동종접합성 근교계 주도 육종을 위한 출발 물질 또는 다른 근교계 주를 발생시키는 공급원 집단으로서 사용될 수 있다. 정예의 근교계 주 유래의 당해 근교계 주는 앞서 기술한 계통 육종 및 순환 선별 육종 방법을 사용하여 발생시킬 수 있다. 한 예로서, 역교배 육종을 사용하여 옥수수 식물 육종 프로그램에서 이로부터 유래된 식물주를 개발하는 경우, 정예의 근교계 주는 친주 또는 출발 물질 또는 공급원 군집으로서 사용될 수 있고, 공여체 또는 순환 친주로서 작용할 수 있다.
단일 교배 옥수수 잡종은 각각 서로 다른 하나의 유전자형을 보완하는 유전자형을 갖는 2개의 근교계 주의 교배로부터 수득된다. 제1 세대의 잡종 자손은 F1으로 명명된다. 옥수수 식물 육종 프로그램에서 시판되는 잡종의 발생에서는, F1 잡종 식물만이 모색된다. 바람직한 F1 잡종은 이들의 근교계 친주보다 원기 왕성하다. 이러한 잡종의 원기 또는 잡종 강세는 식물 성장 증가 및 수확율의 증가를 비롯하여 많은 다원유전적 형질에서 나타날 수 있다.
옥수수 식물 육종 프로그램에서 옥수수 잡종의 발생은 하기 3단계를 포함한다: (1) 초기 육종 교배를 위해 다양한 생식질 풀로부터 식물을 선별하는 단계; (2) 수세대동안 육종 교배로부터 선별된 식물을 자가교배시켜 일련의 근교계 주(서로 상이하지만 순수하게 육종되고 매우 균등성을 지님)를 생산하는 단계; 및 (3) 선별된 근교계 주를 다른 근교계 주와 교배시켜 잡종 자손(F1)을 생산하는 단계. 옥수수에서 육종 과정 동안에, 당해 식물주의 원기는 감소된다. 2개의 상이한 근교계 주를 교배시켜 잡종 자손(F1)을 생산하는 경우 원기는 회복된다. 근교계 주의 동종성 및 동질성의 중요한 결과로 볼 수 있는 것은, 한정된 쌍의 근교계 주 간의 잡종은 항상 동일할 것이라는 점이다. 일단 보다 우수한 잡종을 제공하는 근교계 주가 동정된다면, 당해 잡종 종자는 근교계 친주의 동질성이 유지되는 한 제한없이 재생될 수 있다.
단일 교배 잡종은 두 근교계 주가 교배되어 F1 자손을 생산할 때 만들어진다. 이중 교배 잡종은 4종의 근교계 주를 쌍으로 교배한 후(A×B 및 C×D), 상기 두 F1 잡종을 다시 교배(A×B)×(C×D)하여 생산된다. 삼중 교배 잡종은 2종의 근교계 주를 교배한 후(A×B), 생성된 F1 잡종을 제3 근교계와 교배(A×B)×C 하는 것에 의한 3종의 근교계 주로부터 생산된다. F1 잡종에 의해 나타나는 대부분의 잡종 원기는 다음 세대(F2)에서 상실된다. 그 결과, 잡종 유래의 종자는 묘목으로 사용되지 않는다.
잡종 종자 생산은 자성 식물에 의해 생산되는 꽃가루를 제거하거나 불활성화시킬 필요가 있다. 꽃가루의 불완전한 제거 또는 불활성화는 자가 수분의 가능성을 제공한다. 이러한 우연히 자가 수분된 종자가 의도와는 달리 수확되어 잡종 종자와 함께 포장될 수 있다.
일단 종자를 심으면, 이러한 자가 수분된 식물을 동정하고 선별할 수 있다. 이러한 자가 수분된 식물은 잡종을 생산하는데 사용된 자성 근교계 주와 유전적으로 균등할 것이다.
보통 이러한 자가 수분된 식물은 이들의 감소된 원기로 인해 동정 및 선별될 수 있다. 웅성 자가수분체는 더 작은 식물의 높이, 작은 이삭 크기, 이삭 및 낟알의 형태, 옥수수 속의 색상, 또는 기타 특성을 비롯하여, 생장 및/또는 번식 특성에 있어서 덜 원기 왕성한 외관에 의해 동정될 수 있다.
이러한 자가 수분주의 동정은 분자 마커 분석을 통해 달성될 수도 있다. 그 내용이 참조로서 본원에 인용된 문헌[참조: "The Identification of Female Selfs in Hybrid Maize: A Comparison Using Electrophoresis and Morphology", Smith, J.S.C. 및 Wych, R.D., Seed Science and Technology 14, pp.1-8(1995)]을 참조할 수 있다. 이러한 기법들을 통해, 자가 수분주의 동형성은 게놈을 따라 다양한 유전자 좌에서 대립 유전자 조성을 분석함으로써 입증될 수 있다. 이들 방법은 본원에 개시된 본 발명의 신속한 동정에 적절하다. 문헌[참조: "Identification of Atypical Plants in Hybrid Maize Seed by Postcontrol and Electrophoresis" Sarca, V. et al., Probleme de Genetica Teoritica si Aplicata Vol.20(1) p.29-42]도 참조할 수 있다.
당업자에게 이미 명백해진 바와 같이, 상기한 것들은, 본 발명의 유전자전이 유전자형을 다른 옥수수 주에 유전자 이입시키고자 하는 자들에 의해 본 발명의 근교계가 수득될 수 있는 다양한 방법 중 일부에 해당될 뿐이다. 다른 방법들도 유용할 수 있으며, 상기 예들은 단지 설명하기 위한 것이다.
하기 실시예로 하나 이상의 본 발명의 바람직한 실시 양태를 설명하지만, 이로써 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명은 광범위한 종류의 해충에 대해 내성을 갖는 유전자전이 옥수수 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
실시예
1.
MIR162
이벤트의 형질전환 및 선별
MIR604 이벤트는 근교계 옥수수(Zea mays) 주의 아그로박테리움 매개의 형질전환에 의해 생산되었다. 미성숙 배아를 플라스미드 pNOV1300(서열번호 3)의 DNA 단편을 사용하여, 참조로서 본원에 인용된 문헌[참조: Negrotto et al., Plant Cell Reports 19: 798-803, 2000]에 기재된 바와 같이 근본적으로 형질전환시켰다. pNOV1300은 탠덤 발현 카세트를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 제1 발현 카세트는 옥수수의 포스포에놀피루베이트 카복실라아제 유전자(GenBank? 등록번호 X15239)의 PEPC Intron #9에 추가로 작동가능하게 연결된 vip3Aa19 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 제1 인트론(GenBank? 등록번호 S94464)을 포함하는, 옥수수 폴리유비퀴틴 유전자의 ZmUbiInt 프로모터 영역(참조: Matsuoka and Minami, 1989. European J. Of Biochem. 181:593-598)과 꽃양배추 모자이크 바이러스 게놈(GenBank? 등록번호 AF140604와 유사)의 35S RNA의 35S 종결자 서열을 포함한다. 이의 기능은 폴리아데닐화 서열을 제공하는 것이다(참조: Franck et al., 1980. Cell 21:285-294). pNOV1300 내의 vip3Aa19 유전자는 옥수수에 대한 바람직한 코돈(참조: Murray et al., 1989)의 사용을 돕도록 합성된 합성 옥수수-최적화된 vip3Aa 암호화 서열(참조: Estruch, et al., 1999)을 포함한다. 식물 형질전환에서 사용된 상기 합성 vip3Aa19 암호화 서열은 284번 위치에서 하나의 아미노산에서 차이가 있는 것을 제외하고는 토양 세균인 바실러스 투린기엔시스 균주 AB88(미국특허 제5,877,012호)에서 발견되는 천연 vip3Aa1 암호화 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는데, 천연 vip3Aa1 암호화 서열은 라이신을 암호화하는 반면, 합성 vip3Aa19 암호화 서열은 이 위치에서 글루타민을 암호화한다. 상기 vip3Aa19 암호화 서열은 나비목 곤충에 대한 내성을 제공하는 곤충 방제 단백질인 Vip3Aa19를 암호화한다. 제2 발현 카세트는 만노스-6-포스페이트의 프럭토스-6-포스페이트로의 이성질화를 촉진하는(참조: Negrotto et al., 2000) 포스포만노스 이소머라아제(GenBank? 등록번호 M15380)를 암호화하는 pmi 암호화 서열(E. coli manA로도 알려짐)에 작동가능하게 연결된 ZmUbiInt 프로모터로 이루어져 있다. pmi 암호화 서열은 추가로 노팔린 신타아제 3' 말단 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열에 작동가능하게 연결된다.
미성숙 배아는 8일 내지 12일된 이삭으로부터 절개하고 형질전환을 위해 새로운 매질로 세정하였다. 배아는 형질전환 벡터 pNOV1300을 함유하는 아그로박테리움 세포의 현탁액과 혼합하고 30초 동안 볼텍싱하여 추가로 5분 동안 항온배양하였다. 과량의 아그로박테리움을 함유하는 용액을 흡인한 후, 배아를 비선택성 배양 배지를 함유하는 플레이트로 옮겼다. 배아를 암실에서 2 내지 3일 동안 22℃에서 잔류 아그로박테리움과 함께 공동배양하였다. 배아를 티카르실린(100 mg/㎖) 및 질산은(1.6 mg/ℓ)이 보충된 배양 배지로 이동시키고 암실에서 10일 동안 항온배양하였다. 배형성 캘러스를 생산하는 배아는 만노스를 함유하는 세포 배양 배지로 옮겼다.
재생된 모종을 항생제 내성 스펙티노마이신(spec) 유전자의 부재, 및 pmi와 vip3Aa19 유전자 모두의 존재 여부에 대하여 TAQMAN? PCR 분석(실시예 2 참조)으로 시험하였다. 형질전환 과정 도중에 두 돌연변이가 vip3Aa19 암호화 서열로 도입되었는데, 이중 하나가 Vip3Aa19 단백질 내에 아미노산 변화를 초래하였다는 것이 후에 밝혀졌다(실시예 4 참조). 따라서, 이벤트 MIR162에 특이적인 이러한 신규한 vip3Aa 암호화 서열을 vip3Aa20으로 명명하였다. 상기 vip3Aa20 암호화 서열은 vip3Aa19 유전자에 의해 암호화되는 메티오닌 잔기 대신에 129번 위치에서 이소루이신을 암호화한다.
두 이식유전자에 대해 양성이고 spec 유전자에 대해 음성인 식물을 추가 성장을 위해 온실로 옮겼다. 양성 이벤트를 동정하고 거염벌레에 대한 곤충 생검을 사용하여 스크리닝하였다. 살곤충성 이벤트는 TAQMAN 분석에 의해 그 복제수로 특성을 분석하였다. 단일 복사체 이식유전자를 갖는지의 여부, ELISA에 의해 확인된 바와 같은 우수한 단백질 발현의 여부 및 거염벌레에 대한 우수한 살곤충 활성을 갖는지의 여부를 기초로 하는 추가적인 분석을 위해 MIR162를 선택하였다.
MIR162 이벤트의 육종 계통은 하기와 같다: T0 MIR162 식물(×NPH8431) →→ NPH8431 (MIR162)F1 (×NP2161) → NP2161(MIR162)F1 (×NP2161) → NP2161 (MIR162) BC1F1 (×B9620) → F1(×B9620) → BC1F1 (×B9620) → BC2F1 (×B9620) → BC3F1 (×B9620) → BC4F1 (×B9620). BC4 세대의 식물 재료를 서던 분석, 복제수 결정 및 삽입 DNA의 서열분석을 위해 사용하였다. 실험의 음성 대조군은 BC4 세대의 10개의 음성 분리계 식물로 이루어졌다.
실시예
2.
TAQMAN
PCR
에 의한
MIR162
검출
TAQMAN 분석은 근본적으로 참조로서 본원에 인용된 문헌[참조: Ingham et al., Biotechniques, 31:132-140, 2001]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략히 설명하면, 게놈 DNA를 근본적으로 제조업자의 지침에 따라 Puregene? 게놈 DNA 추출 키트(미네소타주 미네아폴리스 소재, Gentra Systems사 제조)를 사용하여 유전자전이 및 비-유전자전이 옥수수 식물 잎으로부터 분리하였으나, 단, 모든 단계는 1.2 ㎖의 96웰 플레이트에서 수행하였다. 건조된 DNA 펠릿을 TE 완충액(10 Mm 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 재현탁시켰다.
TAQMAN PCR 반응은 96웰 플레이트에서 수행하였다. 내인성 옥수수 유전자 대조군을 위해, 옥수수(Zea mays) 알콜 디하이드로게나제(adhI) 암호화 서열(Genbank 등록번호 AF044295)에 특이적인 프라이머 및 프로브를 설계하였다. 당업자는 다른 옥수수 유전자가 내인성 대조군으로 사용될 수 있음을 알 것이다. 반응은 복합적인 방식으로 vip3Aa 및 adhI 또는 pmi 및 adhI를 동시에 증폭시켰다. 각 시료에 대해, 마스터 혼합물은, 각각 최종 농도가 900nM인 프라이머와 각각 최종 농도가 100nM인 프로브 및 최종 부피가 70㎕가 되도록 물이 보충된 35㎕의 2×TAQMAN Universal PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems)와 20㎕의 추출된 게놈 DNA를 배합하여 생성시켰다. 상기 혼합물을 96웰 증폭 플레이트에 각각 20㎕씩 3개의 동일 웰에 분배하고 광학적으로 투명한 열 밀봉막(Marsh Bio Products)으로 밀봉하였다. PCR을 하기의 증폭 파라미터를 사용하여 ABI Prism 7700 장치에서 수행하였다: 50℃에서 2분 및 95℃에서 10분 후, 95℃에서 15초로 35회 및 60℃에서 1분.
TAQMAN 분석의 결과는 MIR162가 vip3Aa20 유전자의 1개 복사체와 pmi 유전자의 1개 복사체를 가진다는 것을 보여주었다.
TAQMAN PCR 반응에 사용된 프라이머 및 프로브를 표 1에 나타낸다.
실시예
3. 서던
블롯에
의한
MIR162
검출
서던 분석을 위해 사용되는 게놈 DNA는 근본적으로 참조로서 본원에 인용된 문헌[참조: Thomas et al. (Theor. Appl. Genet. 86:173-180, 1993)]의 방법을 사용하여 MIR162의 BC4 세대인 10개 식물의 잎 조직 풀(pool)로부터 분리하였다. DNA 분리를 위해 사용된 모든 식물은 각각 TAQMAN PCR(실시예 2에 기재된 바와 같음)을 사용해 분석하여 vip3Aa20 유전자 및 pmi 유전자의 존재를 확인하였다. 음성 분리체 대조군을 위해, DNA를 BC4 세대인 음성 분리체의 잎 조직 풀로부터 분리하였다. 이러한 음성 분리체 식물은 각각 TAQMAN PCR을 사용하여 분석하여 vip3Aa20 유전자 및 pmi 유전자의 부재를 확인하였으나, 예상된 바와 같이 내인성 옥수수 adhI 유전자에 대해서는 양성이었다.
서던 분석은 통상적인 분자생물학 기술을 사용하여 수행하였다[참조: Chomczynski, P. 1992. Analytical Biochemistry 201:34-139]. 게놈 DNA(7.5㎍)를, 본 실험에서 사용되는 특정 프로브에 상응하는 암호화 서열 내에서가 아닌, 이벤트 MIR162 삽입체 내에서 분해하는 제한 효소로 분해하였다. 이러한 방법으로 MIR162에 혼입된, 각 서던 분석에 사용된 특정 프로브에 상응하는 각 유전자의 복제수를 결정할 수 있게 된다.
삽입체로부터 알고 있는 크기로 단편이 잘라질 수 있도록 제한 효소로 삽입체를 분해하는 또 다른 일련의 제한 효소 분해 작업을 수행하였다. 이러한 방법은 MIR162 내에 존재하는 각 암호화 서열의 단일 복사체의 존재에 대한 추가적인 증거를 제공하며, MIR162 삽입체에 가깝게 연결될 수 있는 삽입체의 일부 복사체의 검출을 가능하게 한다. 아가로스 겔 전기영동 및 Zeta-Probe? GT 막(Bio-Rad, Cat. No.162-0195)으로의 알칼리성 이동 후, 전장 PCR 생성된 요소 프로브를 사용하여 하이브리드화를 수행하였다. 프로브는 MegaPrimeTM 시스템(Amersham Biosciences, Cat. No. RPN1607)을 사용한 랜덤 프라이밍을 통해 32P로 표지시켰다. 65℃에서 하이브리드화를 수행한 후, 2×SSC, 0.1% SDS에서 여러번 세척 이후 0.1×SSC, 0.1% SDS에서 세척하였다. 그런 다음 막은 자기방사법(autoradiography)에 적용되었다.
각 서던 분석에는 3개의 대조군 시료가 포함된다: (1) 요소-특이적 프로브와 교차 하이브리드화할 수 있는 임의의 내인성 옥수수(Zea mays) 서열을 동정하는데 사용되는 음성 (비-형질전환된) 분리체 유래의 DNA; (2) 옥수수 게놈 내에 하나의 단일 유전자 복사체를 검출하는데 있어서 실험의 감도를 입증하기 위해, 플라스미드 크기를 기준으로 하나의 복사체 수와 동일한 분해된 pNOV1300의 양이 도입된 음성 분리체 유래의 DNA; 및 (3) 실험의 감도를 입증하기 위한 것뿐만 아니라 하이브리드화에 대한 양성 대조군으로 역할을 하기 위해, 플라스미드 크기를 기준으로 하나의 복사체 수와 동일한 분해된 pNOV1300 플라스미드.
서던 분석의 결과로 MIR162 삽입체가 vip3Aa20 유전자와 pmi 유전자의 단일 복사체를 포함하며 pNOV1300 골격 서열은 포함하지 않는다는 것이 입증되었다. vip3Aa19 프로브(서열번호 13)를 vip3Aa20 서던 분석을 위해 사용하였다. vip3Aa19와 vip3Aa20의 뉴클레오타이드 서열에서 2개의 뉴클레오타이드가 상이하며, 99.9%는 동일하다. 따라서, vip3Aa19 프로브는 엄중성 조건 하에 MIR162에 존재하는 vip3Aa20 서열에 하이브리드화된다. vip3Aa19 프로브, KpnI 및 EcoRV 분해를 사용하여, 각각 약 8 kb와 13 kb 크기의 단일 하이브리드화 밴드가 생성되었다. 또한, NcoI 이중 분해로 4.6 kb의 예상되는 크기와 일치하는 단일 하이브리드화 밴드가 생성되었다. pmi 프로브(서열번호 14), Acc65I 및 BamHI 분해를 사용하여, 각각 약 4 kb와 6 kb의 크기의 단일 하이브리드화 밴드가 생성되었다. 또한, XmaI + HindIII 이중 분해로 8.1 kb의 예상되는 크기와 일치하는 단일 하이브리드화 밴드가 생성되었다. 또한, 8.1 kb의 XmaI + HindIII pNOV1300 밴드 (양성 대조군)는 예상했던 바와 같이 vip3Aa19와 pmi 프로브와 하이브리드화하였다. 플라스미드 전용 레인에 일부 DNA 래더(ladder) 프로브와의 교차 하이브리드화가 검출되었다. 보통 시판되는 DNA 래더는 이러한 실험에서 관찰된 바와 같이 플라스미드 대조군 서열과 교차 하이브리드화될 수 있는 일부 벡터 서열을 포함할 수 있으나, 이것은 본 연구의 발견에 영향을 주지는 않는다. 마지막으로, pNOV1300 골격 프로브가 하이브리드화하지 않았다는 것은 형질전환 과정 중에 MIR162 내로 임의의 pNOV1300 벡터 골격 서열의 혼입이 없었다는 것을 입증한다.
실시예
4.
이종성
DNA
삽입체의
서열분석
이벤트 MIR162에 삽입된 이종성 DNA 삽입체 내의 vip3Aa와 pmi 암호화 서열의 뉴클레오타이드 서열을, 삽입체의 전체 온전성, 기능성 요소들과의 연속성을 입증하고 임의의 각각의 염기쌍 변화를 검출하기 위해 결정하였다. 암호화 서열을 BC4 세대에서 유래한 DNA로부터 증폭시켰다. PCR 증폭은 Expand High Fidelity PCR 시스템(Roche, Cat. No. 1732650) 또는 PfuUltraTM Hotstart High-Fidelity DNA 폴리머라아제 (Stratagene, Cat. No. 600390)를 사용하여 수행하였다. 각 PCR 생성물을 개별적으로 pCR?-XL-TOPO 벡터(Invitrogen, Cat. No. K4700-20) 또는 pCR?-BluntII-TOPO 벡터 (Invitrogen, Cat. No. K2800-20)로 클로닝하고 각 PCR 생성물에 대한 3개의 분리된 클론을 동정하고 서열분석하였다. ABI BigDye? 1.1 또는 Big Dye 3.1 dGTP(GC-풍부 주형용) 화학을 사용하는 ABI3730XL 분석기를 사용하여 서열분석하였다. 서열 분석은 워싱턴 대학의 Phred, Phrap 및 Consed 패키지를 사용하여 10,000 염기당 1개 미만의 오류율로 수행하였다(참조: Ewing and Green, 1998, Genome Research 8:186-194). 각 유전자에 대한 최종 컨센서스(consensus) 서열은 3개의 개별 클론의 서열 데이터를 종합해 각 유전자에 대한 하나의 컨센서스 서열을 생성함으로써 결정하였다. 서열 정렬은 하기의 파라미터를 가지고 ClustalW 프로그램을 사용하여 수행하였다: 스코어링 매트릭스 블로섬(scoring matrix blosum) 55, 갭 개방 벌점(gap opening penalty) 15, 갭 연장 벌점(gap extension penalty) 6.66(참조: Thompson et al, 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680).
vip3Aa20의 전체 암호화 서열을 프라이머 MOV3Aa-01-5': 5'ATGAACAAGAACAACACCAA3'(서열번호 15)와 MOV3Aa-01-3': 5'CTACTTGATGCTCACGTCGTAG3'(서열번호 16) 및 2370bp 생성물을 만들어 내는 PfuUltra Hotstart 효소를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 앰플리콘을 표 2에 제시된 프라이머들을 사용하여 서열분석하였다.
다른 두 PCR 반응은 vip3Aa20의 전체 암호화 서열과 중첩되었다. vip3Aa20의 5' 말단을 프라이머 162INSERT-F2: 5'ACACCAATGATGCAAATAGGC3' (서열번호 36)와 VIP_R4 5'GAAGGTGTTCAGGTAGAACTCGAAG3' (서열번호 37) 및 Expand High Fidelity 효소를 사용하여 PCR 증폭으로 커버하였다. 제2 반응으로 vip3Aa20의 3' 말단을 커버하였다; 상기 생성물을 프라이머 VIP-F3: 5'GGTGCTGTTCGAGAAGAGGT3' (서열번호 42)와 PMI_REV1: 5'CGATTTATCACTCTCAATCACAT3' (서열번호 43) 및 Expand High Fidelity 효소를 사용하여 증폭시켰다. 이러한 반응으로 생성된 앰플리콘은 각각2946 bp의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 38) 및 2577 bp의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 44)을 포함하였다.
컨센서스 서열 데이터는 MIR162를 형질전환하는데 사용되는 pNOV1300 내의 vip3Aa 암호화 서열(vip3Aa19로 명명됨)과 비교할 때, MIR162 내의 vip3Aa 암호화 서열(vip3Aa20으로 명명됨) 내에 2개의 뉴클레오타이드 변화가 있음을 보여주었다. 제1 뉴클레오타이드 변화인, G에서 T로의 돌연변이는 vip3Aa19 암호화 서열 (서열번호 3)의 387번 위치에서 발생하였다. 이 돌연변이는 Vip3Aa19의 129번 위치의 메티오닌이 Vip3Aa20의 이소루이신으로 변화되게 하였다(M129I). 제2 뉴클레오타이드 변화인, G에서 C로의 돌연변이는 암호화 서열의 1683번 위치에서 발생하나, 아미노산의 변화를 초래하지는 않았다. 따라서, vip3Aa20 암호화 서열 및 Vip3Aa20 단백질은 MIR162 이벤트에 특이적이며, MIR162 유전자전이 유전자형을 포함하는 임의의 식물을 동정하는데 사용될 수 있다. MIR162의 pmi 암호화 서열은 형질전환 플라스미드 pNOV1300의 것과 동일하였다. Vip3Aa20과 Vip3Aa19 살곤충성 단백질의 정렬을 표 3에 나타낸다.
실시예
5.
플랭킹
DNA
서열의 분석
공지된 서열의 코어 영역에 인접한 알려지지 않은 DNA 서열을 증폭하기 위한 다수의 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 역(inverse) PCR (iPCR) [참조: Ochman et. al., Genetics 120:621-623 (1988); Triglia et. al., Nucleic Acids Res. 16:8186 (1988)], 팬핸들(panhandle) PCR [참조: Jones and Winistorfer, Nucleic Acids Res. 20:595-600 (1992); Jones and Winistorfer, Biotechniques 23:132-138 (1997)], 카세트 라이게이션-앵커드(cassette ligation-anchored) PCR [참조: Mueller and Wold, Science 246:780-786 (1989)], 벡터레트(Vectorette)-PCR [참조: Riley et. al., Nucleic Acids Res. 18:2887-2890 (1990)], 노블-알루(novel-Alu)-PCR [참조: Puskas et. al., Nucleic Acids Res. 22:3251-3252 (1994)] 및 써멀 어시메트릭 인터레이스드(Thermal Asymmetric Interlaced) PCR (TAIL-PCR) [참조: Liu and Whittier, Genomics 25:673-681 (1995)]를 포함한다.
이벤트 MIR162 내에 삽입된 이종성 DNA를 플랭킹하는 옥수수 게놈 DNA 서열을 증폭하는데 사용되는 한 방법은, 참조로서 본원에 인용된 문헌[참조: Riley et al., Nucleic Acids Res. 18:2887-2890 (1990)]에 기술된 바와 같이 근본적으로 벡터레트 PCR를 사용하는 것이다.
PCR 표준 절차를 사용하여 5' 플랭킹 서열 및 접합 서열을 확인하였다. 하기 프라이머 쌍 또는 이의 상보체를 사용하여 하기 서열을 확인하였다: 162INSERT-F2: 5'ACACCAATGATGCAAATAGGC3' (서열번호 36)/ VIP_R4: 5'GAAGGTGTTCAGGTAGAACTCGAAG3' (서열번호 37) 및 CJB179: 5'ATGCAAATAGGCTGGGAATAGTC3' (서열번호 39)/ CJB134: 5'GTACCAGCTTGCTGAGTGGCT3' (서열번호 40). 생성된 앰플리콘은 서열번호 41에 나타난 서열을 가지며 서열번호 45의 5' 접합 서열을 포함한다. 다른 프라이머 서열도 플랭킹 서열 및 접합 서열을 확인하는데 사용할 수 있다. 이 방법을 사용하여, MIR162 삽입체는 서열번호 46에 나타난 옥수수 게놈 서열의 뉴클레오타이드 1040번 내지 1088번에 의해 5' 플랭킹됨을 알 수 있었다.
이벤트 MIR162의 보다 넓은 영역의 5' 플랭킹 서열을 Seegene DNA Walking SpeedUpTM Premix 키트(제조업자의 설명에 따름)를 사용하여 생성하였다.
제1 PCR 반응을 제조업자에 의해 제공된 DW-ACP 1, 2, 3 또는 4 프라이머 중 하나를 가지고 프라이머 FE1002: 5'CGTGACTCCCTTAATTCTCCGCT3' (서열번호 50)를 사용하여 4개의 개별 시험관에서 독립적으로 수행하였다. 하기 시약들을 얼음 위의 PCR 시험관에서 혼합하였다: 100㎍의 MIR162 게놈 DNA, 4㎕의 2.5μM DW-ACP (DW-ACP 1, 2, 3 또는 4의 각각 하나씩), 4㎕의 2.5μM FE1002, 19㎕의 증류수 및 25㎕의 2×SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. 상기 시험관들을 미리 가열된(94℃) 써멀 사이클러(thermal cycler)에 넣었다. 하기 프로그램을 사용하여 PCR을 완수하였다: 94℃에서 5분, 42℃에서 1분 및 72℃에서 2분 동안 1회, 94℃에서 40초, 55℃에서 40초 및 72℃에서 90초 동안 30회, 72℃에서 7분 동안 1회. PCR 생성물을 엑소뉴클레아제(Exonuclease) I과 슈림프 알칼라인 포스파타아제(Shrimp Alkaline Phosphatase)를 사용하여 정제하였다.
제2 PCR 반응을 키트의 제조업자에 의해 제공된 DW-ACPN 프라이머를 가지고 프라이머 FE1003: 5'GATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTT3' (서열번호 51)를 사용하여 4개의 개별 시험관에서 독립적으로 수행하였다. 하기 시약들을 얼음 위의 PCR 시험관에서 혼합하였다: 3㎕의 정제된 PCR 생성물, 1㎕의 10μM DW-ACPN, 1㎕의 10μM FE1003, 5㎕의 증류수 및 10㎕의 2×SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. 상기 시험관들을 미리 가열된(94℃) 써멀 사이클러에 넣었다. 하기 프로그램을 사용하여 PCR을 완수하였다: 94℃에서 5분 동안 1회, 94℃에서 40초, 60℃에서 40초 및 72℃에서 90초 동안 35회, 72℃에서 7분 동안 1회.
제3 PCR 반응을 키트의 제조업자에 의해 제공된 Universal 프라이머를 가지고 프라이머 FE1004: 5'GATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT3' (서열번호 52)를 사용하여 4개의 개별 시험관에서 독립적으로 수행하였다. 하기 시약들을 얼음 위의 PCR 시험관에서 혼합하였다: 2㎕의 정제된 PCR 생성물, 1㎕의 10μM Universal 프라이머, 1㎕의 10μM FE1004, 6㎕의 증류수 및 10㎕의 2×SeeAmpTM ACPTM Master Mix II. 상기 시험관들을 미리 가열된(94℃) 써멀 사이클러에 넣었다. 하기 프로그램을 사용하여 PCR을 완수하였다: 94℃에서 5분 동안 1회, 94℃에서 40초, 60℃에서 40초 및 72℃에서 90초 동안 35회, 72℃에서 7분 동안 1회.
10㎕의 PCR 생성물을 에티듐 브로마이드를 포함하는 1% 아가로스 겔 상에서 전개시켰다. 제조업자의 설명에 따라 Qiagen Qiaquick 겔 추출 키트를 사용하여 아가로스 겔로부터 적절한 밴드를 추출하여 정제하였다. 상기 추출된 DNA를 제조업자의 지시에 따라 Invitrogen TOPO-XL 클로닝 벡터 내로 클로닝하였다. 상기 클론을 이.콜라이 내로 형질전환시켰고, 상기 플라스미드 DNA를 제조업자의 지시에 따라 Qiagen Miniprep 키트로 밤새 성장시킨 후 세포로부터 추출하였다. 상기 플라스미드를 마지막 서열분석 실행에 사용하였다.
새로운 프라이머를 게놈 DNA로부터 전체 1 kb의 플랭킹 서열을 증폭하기 위해 이종성 DNA 삽입체 내에서 프라이머로 사용될 미리 알려지지 않은 새로운 서열 내에서 고안하였다. 플랭킹 서열 프라이머 162DWConf3: 5'CCTGTGTTGTTGGAACAGACTTCTGTC3' (서열번호 53) 및 삽입 DNA 프라이머 FE0900: 5'GGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC3' (서열번호 54)를 확인을 위해 5' 플랭킹 서열을 포함하는 핵산 분자를 증폭하는데 사용하였다. 생성된 앰플리콘의 서열은 서열번호 55에 기재되어 있다. 상기 5' 앰플리콘은 서열번호 45에 기재된 5' 접합 서열을 포함한다. 10㎕의 PCR 생성물(앰플리콘)을 에티듐 브로마이드를 포함하는 1% 아가로스 겔 상에서 전개시켰다. 제조업자의 설명에 따라 Qiagen Qiaquick 겔 추출 키트를 사용하여 아가로스 겔로부터 적절한 밴드를 추출하여 정제하였다. 상기 추출된 DNA를 제조업자의 지시에 따라 Invitrogen TOPO-XL 클로닝 벡터 내로 클로닝하였다. 상기 클론을 이.콜라이 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 제조업자의 지시에 따라 Qiagen Miniprep 키트로 배지에서 밤새 성장시킨 후 세포로부터 추출하였다. 3개의 플라스미드가 표 4에 제시된 프라이머들을 사용하여 완전히 서열분석되었다. 상기 플라스미드 서열은 완전히 확인된 5' 플랭킹 서열을 생성하기 위해 정렬하였다. 상기 방법을 사용하여, 대략 1 kb의 5' 플랭킹 서열(서열번호 46)이 결정되었다.
이벤트 MIR162의 3' 플랭킹 서열을 Clonetech GenomeWalkerTM Universal 키트(Clonetech Laboratories, Inc.)를 제조업자의 설명에 따라 사용하여 생성하였다.
먼저, GenomeWalker "라이브러리"로 알려진 클로닝되지 않은, 어댑터-연결된(adaptor-ligated) 게놈 DNA 단편의 풀을 구축하였다. MIR162 게놈 DNA를 하기와 같이 제한 효소(DraI, EcoRV, PvuII, StuI 및 XmnI)를 사용하여 분해시킴으로써 각 라이브러리를 구축하였다: 예를 들어, 25㎕의 MIR162 게놈 DNA (0.1㎍/㎕), 8㎕의 제한 효소 (10 유닛/㎕), 10㎕의 제한 효소 완충액(10X) 및 57㎕의 증류수를 시험관에서 혼합하여 37℃에서 밤새 항온처리하였다.
이후, DNA를 페놀/클로로포름 추출을 수회 실시하여 정제하였다. 최종적으로, 상기 DNA를 침전시켜 에탄올로 세척하여 건조시킨 후 20㎕의 TE 완충액에 용해시켰다.
MIR162 게놈 DNA에 GenomeWalker 어댑터 말단을 연결시키기 위해, 4㎕의 분해, 정제된 게놈 DNA를 1.9㎕의 GenomeWalker 어댑터(25μM), 1.6㎕의 10X 라이게이션 완충액 및 0.5㎕의 T4 DNA 리가아제(6 유닛/㎕)와 혼합하였다. 이 반응물을 16℃에서 밤새 항온처리하였다. 상기 반응을 70℃에서 5분간 항온처리하여 중지하였다. 반응이 중지된 후, 72㎕의 TE를 각 시험관에 첨가하고 내용물을 완전히 혼합하였다.
제1 PCR 반응을 제조업자에 의해 제공된 프라이머 AP1과, 알려진 이종성 삽입 DNA 서열 내에서 고안된 다른 프라이머(Round 1 "유전자 특이적 프라이머" 또는 "GSP1")를 사용하여 수행하였다. 하기 시약들을 얼음 위의 PCR 시험관 내에서 혼합하였다: 1㎕의 적절한 MIR162 DNA 라이브러리, 1㎕의 10μM AP1, 1㎕의 10μM GSP1, 1㎕의 10 mM dNTPs, 5㎕의 10X Advantage 2 PCR 완충액, 1㎕의 BD Advantage 2 폴리머라아제 및 40㎕의 증류수. PCR을 하기 프로그램을 사용하여 완수하였다: 94℃에서 25초 및 72℃에서 4분 동안 7회, 94℃에서 25초 및 67℃에서 4분 동안 32회, 67℃에서 4분 동안 1회. 각 1차 PCR 반응을 1㎕의 1차 PCR 생성물을 49㎕의 증류수와 함께 첨가하여 50배 희석하였다. 유효한 반응물은 (1) DraI 및 XmnI 라이브러리와 GSP1 프라이머 162GW3F1: 5'TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCCG3' (서열번호 56) 및 프라이머 AP1이었다.
제2 PCR 반응을 제조업자에 의해 제공된 프라이머 AP2와, 알려진 이종성 삽입 DNA 서열 내에서 고안된 다른 프라이머(Round 2 "유전자 특이적 프라이머" 또는 "GSP2")를 사용하여 수행하였다. 하기 시약들을 얼음 위의 PCR 시험관 내에서 혼합하였다: 1㎕의 적절한 희석된 1차 PCR 생성물, 1㎕의 10μM AP2, 1㎕의 10μM GSP2, 1㎕의 10 mM dNTPs, 5㎕의 10X Advantage 2 PCR 완충액, 1㎕의 BD Advantage 2 폴리머라아제 및 40㎕의 증류수. PCR을 하기 프로그램을 사용하여 완수하였다: 94℃에서 25초 및 72℃에서 4분 동안 5회, 94℃에서 25초 및 67℃에서 4분 동안 20회, 67℃에서 4분 동안 1회. 유효한 반응물은 (1) DraI 및 XmnI 라이브러리와 GSP2 프라이머 162GW3F2: 5'AAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG3' (서열번호 57) 및 프라이머 AP2이었다.
10㎕의 PCR 생성물을 에티듐 브로마이드를 포함하는 1% 아가로스 겔 상에서 전개시켰다. 제조업자의 설명에 따라 Qiagen Qiaquick 겔 추출 키트를 사용하여 아가로스 겔로부터 적절한 밴드를 추출하여 정제하였다. 상기 추출된 DNA를 제조업자의 지시에 따라 Invitrogen TOPO-XL 클로닝 벡터 내로 클로닝하였다. 상기 클론을 이.콜라이 내로 형질전환시켰고, 상기 플라스미드 DNA를 제조업자의 지시에 따라 Qiagen Miniprep 키트로 밤새 성장시킨 후 세포로부터 추출하였다. 상기 플라스미드를 마지막 서열분석 실행에 사용하였다.
새로운 프라이머를 게놈 DNA로부터 대략 1 kb의 3' 플랭킹 서열을 증폭하기 위해 삽입 DNA 내에서 프라이머로 사용될 미리 알려지지 않은 새로운 서열 내에서 고안하였다. 삽입 DNA 프라이머 162GW3F1: 5'TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCCG3' (서열번호 56) 및 3' 플랭킹 서열 프라이머 1623'GWR1: 5CTGGTGAACCGATTTTTACGGAGG3' (서열번호 58)을 확인을 위해 3' 플랭킹 서열을 포함하는 핵산 분자를 증폭하는데 사용하였다. 생성된 앰플리콘의 서열은 서열번호 59에 기재되어 있다. 상기 3' 앰플리콘은 서열번호 47에 기재된 3' 접합 서열을 포함한다. 10㎕의 PCR 앰플리콘을 에티듐 브로마이드를 포함하는 1% 아가로스 겔 상에서 전개시켰다. 제조업자의 설명에 따라 Qiagen Qiaquick 겔 추출 키트를 사용하여 아가로스 겔로부터 적절한 밴드를 추출하여 정제하였다. 상기 추출된 DNA를 제조업자의 지시에 따라 Invitrogen TOPO-XL 클로닝 벡터 내로 클로닝하였다. 상기 클론을 이.콜라이 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 제조업자의 지시에 따라 Qiagen Miniprep 키트로 배지에서 밤새 성장시킨 후 세포로부터 추출하였다. 3개의 플라스미드가 표 5에 제시된 프라이머들을 사용하여 완전히 서열분석되었다. 상기 플라스미드 서열은 완전히 확인된 3' 플랭킹 서열(서열번호 48)을 생성하기 위해 정렬하였다.
실시예
6.
ELISA
에 의한
MIR162
내의
Vip3Aa20
단백질의 검출
추출물을 MIR162의 잎, 뿌리, 속, 낟알, 수염, 꽃가루 및 전체 식물로부터 제조하였다. 상기 추출물들을, 면역 친화성을 사용하여 정제된 염소 항-Vip3A와 단백질 A로 정제된 래빗 항-Vip3A 폴리클로날 항체를 사용한 ELISA을 사용하여, 당업계에 공지된 ELISA 절차대로 Vip3Aa20에 대해 정량 분석하였다. Vip3Aa20은 모든 성장 단계에 걸쳐 분석된 모든 조직에서 검출되었다. 개화기 및 종자 성숙기에 전체 식물 내에서 검출된 Vip3Aa20 단백질의 평균 농도는 각각 10㎍/g 생중량(fresh weight) 및 16㎍/g 생중량이었다. 개화기 잎의 Vip3Aa20 단백질의 평균 농도는 22㎍/g 생체중이었다.
실시예
7.
MIR162
의 농작지 효능
MIR162 이벤트를 거염벌레(FAW, 스포도프테라 프루기페르다), 왕담배나방(CEW, 헬리코베르파 제아), 검거세미밤나방(BCW, 아그로티스 입실론) 및 유럽 조명충 나방(ECB; European corn borer, 오스트리니아 누빌랄리스(Ostrinia nubilalis))에 대한 효능에 대해 농작지에서 시험하였다. MIR162 이벤트의 생산력을, 에이커(acre) 당 11.2g a.i.의 양으로 살포되는 통상적인 살곤충제 표준 물질인 Warrior?(Syngenta, Inc.), cry1Ab 유전자를 포함하는 유전자전이 옥수수 이벤트 Bt11, 및 MIR162 근교계 주와 Bt11 근교계 주를 교배하여 생산된 Bt11×MIR162 잡종의 생산력과 비교하였다.
미국 대륙의 주된 옥수수 경작지를 대표하는 13개 주에서 28개의 시험군을 파종하였다. 시험군들은 블록 당 4개의 반복구(replicated plot)를 가지도록 하는 난괴법(randomized complete block design)으로 파종되었다. 밭은 반복구 처리 당 17.5 로우(row) 피트였다. 파종 밀도는 대략 에이커 당 30,000 종자였다. 면역 진단 스트립을 사용하여 서로 다른 처리 군들에서 Vip3Aa20 및 Cry1Ab 단백질의 존재 또는 부재를 확인하였다.
군집성이 충분히 높은 시험군에는 천연 해충 감염을 사용하였으며, 그렇지 않은 시험군에서는 인공적 감염을 수행하였다. BCW 시험군에서는 V1-V2의 2개의 2 내지 3령(齡) 유충을 사용한 인공 감염을 수행하였다. 밭을 감염 후 3일, 7일 및 14일로 구분하였다. BCW 피해를 부분 피해 식물 및 완전 절단된 식물로서 기록하였다. FAW 밭을 감염 후 또는 대조군 식물에서 3령 유충이 관찰된 후 7일 및 14일로 등급을 나누었다. 하기의 평가 기준을 사용하여 FAW 및 CEW 잎 손상 정도를 평가하였다:
0.01 - 가시적인 잎 손상은 없음
1 - 일부 잎에 핀 구멍 정도의 손상(pin-hole damage)
2 - 일부 잎에 소량의 총상 구멍 정도의 손상(shot-hole damage)
3 - 여러 잎에 총상 구멍 정도의 손상
4 - 일부 잎에 총상 구멍 정도의 피해 및 병변
5 - 여러 잎의 병변
6 - 여러 잎의 큰 병변
7 - 일부 잎의 큰 병변 및 일부분 섭식으로 인한 제거
8 - 여러 잎의 큰 병변 및 일부분 섭식으로 인한 제거
9 - 대부분의 잎의 큰 병변 및 일부분 섭식으로 인한 제거
식물 손상을 제1 및 제2 세대 ECB 모두에 대해 평가하였다. 하기 평가 기준을 보통 3 내지 4령 유충의 경우의 제1 세대 손상에 대한 등급을 위해 사용하였다:
1 - 가시적인 잎 손상은 없음
2 - 일부 잎에 소량의 총상 구멍 정도의 손상
3 - 여러 잎에 흔한 총상 구멍 정도의 손상
4 - 여러 잎에 총상 구멍 정도의 피해 및 늘어난 병변
5 - 여러 잎의 늘어난 병변
6 - 여러 잎에서 약 2.5 cm의 늘어난 병변
7 - 잎의 약 절반에 흔한 길어진 병변
8 - 잎의 약 2/3에 흔한 길어진 병변
9 - 대부분의 잎에 길어진 병변
제2 세대 ECB 손상을 인공 감염 후 3주 내지 4주 또는 산란기 말에 평가하였다. 하기에 대한 측정을 하였다: 살아있는 유충의 수/줄기, 살아있는 유충의 수/이삭자루, 살아있는 유충의 수/이삭, 터널 수/줄기, 누적 터널 길이(cm)/줄기, 누적 터널 길이(cm)/이삭자루, 터널 수/이삭, 누적 터널 길이 낟알 손상(cm)/이삭 및 %감염 식물.
CEW 시험군은 일반적으로 천연 감염 수준을 증대시키기 위해 파종하였다. 대조군 식물 상의 CEW 유충이 L5-L6 성장 단계에 있는 경우에 이삭에 대한 섭식 피해를 평가하였다. 이삭 등급은 이삭마다 관찰된 유충의 수 및 이삭의 끝에서 가장 많이 파괴된 평균 낟알에서 측정된 가시적인 낟알 섭식의 길이를 기록하는 것을 포함하였다.
BCW 농작지 시험군의 결과를 표 6에 나타내었다. 3% 미만의 MIR162 식물과 Bt11×MIR162 식물이 BCW 유충에 의해 잘려나갔다. 유의적인 수의 Bt11 및 대조군 식물이 잘려나갔다. MIR162 유전자형을 포함하는 식물은 통상의 살곤충제 처리된 식물보다 BCW 섭식 피해를 덜 받았다.
FAW 농작지 시험군 결과를 표 7에 나타내었다. FAW 섭식 피해는 0.01 내지 9의 등급으로 평가하였다. MIR162 잡종의 평균 섭식 피해는 매우 낮아(<1), Bt11 및 통상의 살곤충제 처리에서 관찰된 평균 피해보다 현저히 낮았다. 이러한 시험군에서 곤충의 밀도는 대략 식물당 50 내지 100 마리의 신생 유충을 둔 것으로 매우 높았다. Bt11은 피해를 일부 보호할 수 있는 반면, 통상적인 살곤충제 처리로서는 보호할 수 없었으며, 대조군과 동일한 정도의 피해를 유지하였다.
제1 세대 ECB 피해에 대해 평가한 시험군의 결과를 표 8에 나타내었다. ECB 섭식 피해는 1 내지 9의 등급으로 등급화하였다. 이러한 시험군에서는, MIR162가 ECB 섭식 피해에 대해 최소한의 보호만을 제공하였다. Bt11은 ECB 섭식 피해로부터 식물을 완전하게 보호하였다. Bt11×MIR162 식물은 Bt11 식물과 동일한 수준으로 보호되었다. 통상적인 살곤충제 처리는 MIR162 형질보다는 양호한 보호를 제공하였으나, Bt11에 의한 것보다는 현저히 덜한 보호를 제공하였다.
제2 세대 ECB 피해 결과를 표 9에 나타내었다. 섭식 피해를 각 옥수수 줄기에서 축적된 터널 길이로서 평가하였다(하나 이상의 터널이 발견되는 경우에는 터널 길이를 합산하였음). Bt11 및 Bt11×MIR162 처리는 줄기 천공에 대한 강한 보호를 제공하였던 반면, MIR162 단독 또는 살곤충제 처리에 의해서는 천공에 대한 보호를 제공하지 못하였다.
CEW 피해에 대한 시험군의 결과를 표 10에 나타내었다. 섭식 피해는 이삭 끝에서 가장 많이 파괴된 평균 이삭까지 측정된, 이삭 당 낟알 피해의 길이로서 등급화하였다. 현저한 이삭 피해는 Bt11, 살곤충제 및 표준구(check plot)에서 관찰되었다. Bt11은 비처리된 표준구와 비교하여 어느 정도 보호를 제공하였으며 통상적인 살곤충제 처리에 의해 제공되는 보호에 필적할 정도였다. MIR162 및 Bt11×MIR162는 이삭을 CEW 섭식 피해에 대한 거의 완전한 보호를 제공하였다.
실시예
8. 서부
검거세미밤나방류에
대한
MIR162
의 효능
Cry1Ab 단백질을 생산하는 현재 시판되는 유전자전이 이벤트는 서부 검거세미밤나방류에 대한 허용가능한 수준의 보호를 제공하지 못한다. 따라서, MIR162 단독의 경우 및 다른 유전자전이 유전자형과 스태킹한 경우에 있어 WBCW에 대한 효능을 시험하였다.
WBCW 알을 야생에서 포획한 암컷 나방으로부터 수집하였다. 유충을 실험에 사용하기 전까지 반합성 검거세미밤나방 식이법으로 먹이를 주었다. 옥수수 식물을 농작지에서 경작하였다. 하기에 대한 측정을 수행하였다: MIR162, Bt11, MIR604, MIR162×Bt11, MIR162×MIR604, MIR604×Bt11, Force?(Syngenta, Inc.), 식물에 살포한 음성 등치선(isoline)에 대한 통상적인 살곤충제, 및 두 음성 대조군 등치선. MIR604는 옥수수 뿌리벌레(corn rootworm, 디아브로티카 종(Diabrotica spp.)) 유충에 대해 활성인 단백질을 암호화하는 cry3A055 유전자를 포함하는 신규한 유전자전이 옥수수 이벤트이다(2005년 9월 29일 공개된 미국특허공보 제2005/0216970호에 개시되어 있으며, 본 문헌은 참조로서 본원에 인용된다).
본 실험에 있어서, 각 처리군 및 반복구에서, 성장한 옥수수 식물로부터 2인치의 녹색 수염 및 옥수수 껍질을 잘라내었다. 갈색의 말단 수염을 제거하고 옥수수 껍질은 버렸다. 약 1.5 인치의 수염을 14㎖의 플라스틱 컵에 각각 넣었다. 이후 각 컵에 하나의 유충을 넣고 컵을 밀봉하였다. 3 내지 6령 범위인 여러 다른 성장 단계에 있는 유충을 시험하였다. 수염과 유충을 담고 있는 컵은 실험 기간 동안 자연적인 일중 길이 및 실온으로 유지시켰다. 8일 후 유충의 생존에 대해 기록하였다. 실험마다 처리를 4회 반복하였다.
WBCW 실험의 결과를 표 11에 나타내었다. 음성 등치선 및 통상적인 살곤충제 처리된 수염 상에서의 WBCW의 생존은 거의 100%였다. 동일한 식물에서 단독 또는 조합된 Bt11 및 MIR604 수염에 대한 WBCW 유충의 생존은 음성 등치선 상에서의 생존과 다르지 않았다. WBCW 유충의 생존은 MIR162의 수염을 유충에서 먹인 경우에 감소하였다. 동일한 식물에서 MIR162×Bt11의 조합은 MIR162 단독의 경우보다 생존을 더 감소시키지는 않았다. 그러나, 놀랍게도, 동일한 식물에서 MIR162 유전자전이 유전자형을 MIR604 유전자전이 유전자형과 스태킹한 경우, 유충의 치사율이 MIR162 또는 MIR604 단독의 경우에 비해 현저히 증가하였다.
실시예
9. 옥수수에서 표적 통합을 위한 이벤트
MIR162
삽입 부위의 사용
서열번호 46 및 서열번호 48에 개시된 MIR162 플랭킹 서열을 사용하여 옥수수 게놈 데이터베이스를 검색하였다. Contig 13(서열번호 106) 상의 5번 염색체(NCBI 등록번호 AC185313)의 BAC 클론(CH201-307P5) 상에서 두 플랭킹 서열이 동일하게 매치되었다. 보다 구체적으로, MIR162 삽입체는 5번 염색체 상에서 5' 분자 마커(본원에서는 opie2 마커로 명명됨; 서열번호 106의 뉴클레오타이드 1680번 내지 3338번)와 3' 분자 마커(본원에서는 gag 마커로 명명됨; 서열번호 106의 뉴클레오타이드 43,275번 내지 45,086번) 사이에 존재한다. 이러한 정보를 사용하여, MIR162에 삽입된 이종성 DNA가 5' 플랭킹 서열 (서열번호 106의 뉴클레오타이드 1번 내지 25,454번)과 3' 플랭킹 서열 (서열번호 106의 뉴클레오타이드 25,513번 내지 51,328번) 사이에 위치한 옥수수 게놈 DNA의 58개의 뉴클레오타이드, 서열번호 106(또한 서열번호 107에서 보여지듯이)의 뉴클레오타이드 25,455번 내지 25,512번을 대체할 것을 결정하였다.
농작지 조건 하에서 여러 세대에 걸친 이벤트 MIR162의 일관된 작물학적 효능은 MIR162 삽입 부위 근방에서 동정된 이러한 영역이 관심대상의 다른 유전자전이 유전자의 표적화 통합을 위해 좋은 게놈 좌를 제공한다는 것을 시사한다. 이러한 표적화 통합은 소위 "전위효과" 및 숙주 내로 이식유전자의 도입시 게놈 내에서 돌연변이의 발생 위험의 문제점을 극복하게 해준다. 이러한 표적화 통합의 추가적인 이점으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 숙주 게놈 내의 중요한 자리에 이식유전자의 우연한 삽입으로 야기되는 비이상성을 나타내지도 않으면서, 원하는 수준의 이식유전자의 발현을 나타내는 유전자전이 식물을 수득하기 전에 스크리닝되고 검사되어야 하는 다수의 형질전환 이벤트의 수를 감소시킬 수 있다는 것이다. 더욱이, 이러한 표적화 통합은 정예의 식물주의 육종에 두 유전자 모두 효율성을 부여하는 이식유전자의 스태킹을 허용한다.
상기 개시된 교시를 사용하여, 당업자는 MIR162 내의 부위와 동일한 5번 염색체 상의 삽입 부위에 또는 MIR162 내에 삽입 부위에 근접한 부위에 관심대상의 이종성 핵산을 위치시키기 위해 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 한가지 방법이 미국특허공보 제2006-0253918호(그 내용 전체가 참조로서 본원에 인용됨)에 개시되어 있다. 간략히 설명하면, 삽입 부위에 대해 20 Kb 이하의 5' 플랭킹 게놈 서열(서열번호 106의 뉴클레오타이드 5,454번 내지 25,454번) 및 삽입 부위에 대해 20 Kb 이하의 3' 플랭킹 게놈 서열(서열번호 106의 뉴클레오타이드 25,513번 내지 45,513번)이 상동 재조합을 통해 5번 염색체 상의 게놈 좌에 삽입될 관심대상의 유전자를 플랭킹하는데 사용된다. 이러한 서열은 좌측 보더(border)(LB)와 우측 보더(RB) 반복 서열과 같은 T-DNA 보더 반복 서열 및 T-DNA 전달 효능을 향상시키기 위한 다른 부스터 서열에 의해 추가로 플랭킹될 수 있다. 관심대상 유전자(들)는 식물에 해로운 영향을 주지않고 일관된 유전자전이 발현 수준을 부여하기 위해 MIR162 삽입 부위에서와 똑같이 대체될 수 있거나 MIR162 삽입 부위 근방의 20Kb 영역 내에 있는 어느 곳에서나 대체될 수 있다. 관심대상 유전자 및 플랭킹 서열을 포함하는 DNA 벡터는 이에 제한되지는 않으나 아그로박테리움 매개된 형질전환을 포함하는 당업자에게 공지된 여러 방법들 중 하나를 사용하여 식물 세포 내로 전달될 수 있다. MIR162 표적 부위로의 DNA 벡터의 삽입은 이에 제한되지는 않으나 공동발현 또는 재조합 개선 유전자의 상향 조절 또는 내인성 재조합 억제 유전자의 하향 조절을 포함하는 여러 방법들 중 하나를 사용하여 추가로 향상될 수 있다. 추가로, 게놈 내에 특정 서열의 절단은 상동 재조합 빈도를 증가시키는데 사용될 수 있으므로, MIR162 삽입 부위 및 그의 플랭킹 영역으로의 삽입은 이러한 서열의 절단을 위한 천연 또는 고안된 서열 특이적 엔도뉴클레아제의 발현에 의해 개선될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 교시를 사용하여, 임의의 이종성 핵산이 옥수수 5번 염색체 상에서 서열번호 106의 뉴클레오타이드 25,454번과 45,513번 사이에 위치한 표적 부위 또는 이러한 부위 근방의 표적 부위에 삽입될 수 있다.
실시예 10. 유전자 발현의 안정화를 위한 이벤트 MIR162 삽입 부위 및 플랭킹 서열의 사용
MIR162 삽입 부위를 플랭킹하는 게놈 서열은 옥수수 및 기타 작물의 다른 게놈 자리에 이식유전자로서 삽입된 경우, 다른 관심 유전자의 발현을 발현을 안정화시키는데 사용될 수도 있다. 구체적으로, 삽입 부위에 대해 20 Kb 이하의 5' 플랭킹 게놈 서열(서열번호 106의 뉴클레오타이드 5,454번 내지 25,454번) 및 삽입 부위에 대해 20 Kb 이하의 3' 플랭킹 게놈 서열(서열번호 106의 뉴클레오타이드 25,513번 내지 45,513번)이 식물의 게놈 내에 삽입될 관심대상 유전자를 플랭킹하는데 사용된다. 이러한 서열은 좌측 보더(LB)와 우측 보더(RB) 반복 서열과 같은 T-DNA 보더 반복 서열 및 T-DNA 전달 효능을 향상시키기 위한 다른 부스터 서열에 의해 추가로 플랭킹될 수 있다. 관심대상 유전자(들)는 일관된 유전자전이 발현 수준을 부여하기 위해 MIR162 삽입 부위에서와 똑같이 대체될 수 있거나 MIR162 삽입 부위 근방의 20Kb 영역 내에 있는 어느 곳에서나 대체될 수 있다. 관심대상 유전자 및 MIR162 삽입 부위 플랭킹 서열을 포함하는 DNA 벡터는 이에 제한되지는 않으나 원형질체 형질전환, 생탄두 충격법(biolistic bombardment) 및 아그로박테리움 매개된 형질전환을 포함하는 당업자에게 공지된 여러 방법들 중 하나를 사용하여 식물 세포 내로 전달될 수 있다. 상기 전달된 DNA는 식물 게놈 내로 무작위로 통합될 수 있으며 인공 염색체 또는 미니 염색체와 같은 독립적으로 분리된 유전적 유닛의 일부로서 존재할 수도 있다. 관심대상 유전자 및 MIR162 삽입 부위 플랭킹 서열을 포함하는 DNA 벡터는 식물 세포로 전달될 수 있다. 따라서, 관심대상 유전자를 MIR162 삽입 부위를 플랭킹하는 게놈 서열로 둘러쌈으로써, 이러한 유전자의 발현은 쌍떡잎 식물 또는 옥수수와 같은 외떡잎 식물과 같은 유전자전이 숙주 식물에서 안정화되는 것이다.
기탁
출원인은 상기 개시된 이벤트 MIR162의 옥수수 종자를 미국 버지니아주 20110 마나사스 블러바드 유니버시티 1801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에 부다페스트 조약에 따라 2007년 1월 23일에 ATCC 수탁번호 PTA-8166으로 기탁하였다. 상기 기탁은 수탁자에게 30년 동안, 또는 최후 요청 후 5년 동안, 또는 특허의 존속 기간 동안의 기간 중 긴 기간으로 유지될 것이며, 그 동안 필요하다면 대체될 수 있다. 출원인은 ATCC에 기탁된 물질의 사용에 대해서 아무런 제한을 부여하지 않으나, 출원인은 생물학적 물질의 양도 또는 그의 상업상 운송에 대해서 법이 부과하는 임의의 제한을 포기할 권한은 없다. 출원인은 본 특허 또는 식물품종보호법(Plant Variety Protection Act, 7 USC 2321 이하)하에 부여된 그 권리에 대한 침해에 대해서는 그 권리를 포기하지 않는다.
본원 명세서에 언급된 모든 공개문헌 및 특허출원은 각각의 개별적인 공개문헌 또는 특허출원이 구체적으로 그리고 별개로 본원에 참고로서 인용되는 바와 같은 맥락으로 참조로서 본원에 인용된다.
<110> Syngenta Participations AG
<120> Corn event MIR162
<130> 71133WOPCT
<150> US 60/810,499
<151> 2006-06-03
<160> 107
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 2370
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> vip3Aa20 coding sequence
<400> 1
atgaacaaga acaacaccaa gctgagcacc cgcgccctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcgacctgac cctggacgag atcctgaaga accagcagct gctgaacgac 180
atcagcggca agctggacgg cgtgaacggc agcctgaacg acctgatcgc ccagggcaac 240
ctgaacaccg agctgagcaa ggagatcctt aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctg 300
aacgacgtga acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcgcgtgta cctgccgaag 360
atcaccagca tgctgagcga cgtgattaag cagaactacg ccctgagcct gcagatcgag 420
tacctgagca agcagctgca ggagatcagc gacaagctgg acatcatcaa cgtgaacgtc 480
ctgatcaaca gcaccctgac cgagatcacc ccggcctacc agcgcatcaa gtacgtgaac 540
gagaagttcg aagagctgac cttcgccacc gagaccagca gcaaggtgaa gaaggacggc 600
agcccggccg acatcctgga cgagctgacc gagctgaccg agctggcgaa gagcgtgacc 660
aagaacgacg tggacggctt cgagttctac ctgaacacct tccacgacgt gatggtgggc 720
aacaacctgt tcggccgcag cgccctgaag accgccagcg agctgatcac caaggagaac 780
gtgaagacca gcggcagcga ggtgggcaac gtgtacaact tcctgatcgt gctgaccgcc 840
ctgcaggccc aggccttcct gaccctgacc acctgtcgca agctgctggg cctggccgac 900
atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac ttgaacaagg agaaggagga gttccgcgtg 960
aacatcctgc cgaccctgag caacaccttc agcaacccga actacgccaa ggtgaagggc 1020
agcgacgagg acgccaagat gatcgtggag gctaagccgg gccacgcgtt gatcggcttc 1080
gagatcagca acgacagcat caccgtgctg aaggtgtacg aggccaagct gaagcagaac 1140
taccaggtgg acaaggacag cttgagcgag gtgatctacg gcgacatgga caagctgctg 1200
tgtccggacc agagcgagca aatctactac accaacaaca tcgtgttccc gaacgagtac 1260
gtgatcacca agatcgactt caccaagaag atgaagaccc tgcgctacga ggtgaccgcc 1320
aacttctacg acagcagcac cggcgagatc gacctgaaca agaagaaggt ggagagcagc 1380
gaggccgagt accgcaccct gagcgcgaac gacgacggcg tctacatgcc actgggcgtg 1440
atcagcgaga ccttcctgac cccgatcaac ggctttggcc tgcaggccga cgagaacagc 1500
cgcctgatca ccctgacctg taagagctac ctgcgcgagc tgctgctagc caccgacctg 1560
agcaacaagg agaccaagct gatcgtgcca ccgagcggct tcatcagcaa catcgtggag 1620
aacggcagca tcgaggagga caacctggag ccgtggaagg ccaacaacaa gaacgcctac 1680
gtcgaccaca ccggcggcgt gaacggcacc aaggccctgt acgtgcacaa ggacggcggc 1740
atcagccagt tcatcggcga caagctgaag ccgaagaccg agtacgtgat ccagtacacc 1800
gtgaagggca agccatcgat tcacctgaag gacgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860
gacaccaaca acaacctgga ggactaccag accatcaaca agcgcttcac caccggcacc 1920
gacctgaagg gcgtgtacct gatcctgaag agccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac 1980
aacttcatca tcctggagat cagcccgagc gagaagctgc tgagcccgga gctgatcaac 2040
accaacaact ggaccagcac cggcagcacc aacatcagcg gcaacaccct gaccctgtac 2100
cagggcggcc gcggcatcct gaagcagaac ctgcagctgg acagcttcag cacctaccgc 2160
gtgtacttca gcgtgagcgg cgacgccaac gtgcgcatcc gcaactcccg cgaggtgctg 2220
ttcgagaaga ggtacatgag cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac caccaagttc 2280
gagaaggaca acttctacat cgagctgagc cagggcaaca acctgtacgg cggcccgatc 2340
gtgcacttct acgacgtgag catcaagtag 2370
<210> 2
<211> 789
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vip3Aa toxin
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(789)
<223> Vip3Aa20 protein produced by MIR162
<400> 2
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Ile Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile
530 535 540
Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His
565 570 575
Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
595 600 605
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly
675 680 685
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg
690 695 700
Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
705 710 715 720
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
740 745 750
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
755 760 765
Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr
770 775 780
Asp Val Ser Ile Lys
785
<210> 3
<211> 14405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid pNOV1300
<400> 3
atgaacaaga acaacaccaa gctgagcacc cgcgccctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcgacctgac cctggacgag atcctgaaga accagcagct gctgaacgac 180
atcagcggca agctggacgg cgtgaacggc agcctgaacg acctgatcgc ccagggcaac 240
ctgaacaccg agctgagcaa ggagatcctt aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctg 300
aacgacgtga acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcgcgtgta cctgccgaag 360
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tacctgagca agcagctgca ggagatcagc gacaagctgg acatcatcaa cgtgaacgtc 480
ctgatcaaca gcaccctgac cgagatcacc ccggcctacc agcgcatcaa gtacgtgaac 540
gagaagttcg aagagctgac cttcgccacc gagaccagca gcaaggtgaa gaaggacggc 600
agcccggccg acatcctgga cgagctgacc gagctgaccg agctggcgaa gagcgtgacc 660
aagaacgacg tggacggctt cgagttctac ctgaacacct tccacgacgt gatggtgggc 720
aacaacctgt tcggccgcag cgccctgaag accgccagcg agctgatcac caaggagaac 780
gtgaagacca gcggcagcga ggtgggcaac gtgtacaact tcctgatcgt gctgaccgcc 840
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atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac ttgaacaagg agaaggagga gttccgcgtg 960
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agcgacgagg acgccaagat gatcgtggag gctaagccgg gccacgcgtt gatcggcttc 1080
gagatcagca acgacagcat caccgtgctg aaggtgtacg aggccaagct gaagcagaac 1140
taccaggtgg acaaggacag cttgagcgag gtgatctacg gcgacatgga caagctgctg 1200
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agcaacaagg agaccaagct gatcgtgcca ccgagcggct tcatcagcaa catcgtggag 1620
aacggcagca tcgaggagga caacctggag ccgtggaagg ccaacaacaa gaacgcctac 1680
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atcagccagt tcatcggcga caagctgaag ccgaagaccg agtacgtgat ccagtacacc 1800
gtgaagggca agccatcgat tcacctgaag gacgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860
gacaccaaca acaacctgga ggactaccag accatcaaca agcgcttcac caccggcacc 1920
gacctgaagg gcgtgtacct gatcctgaag agccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac 1980
aacttcatca tcctggagat cagcccgagc gagaagctgc tgagcccgga gctgatcaac 2040
accaacaact ggaccagcac cggcagcacc aacatcagcg gcaacaccct gaccctgtac 2100
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gtgtacttca gcgtgagcgg cgacgccaac gtgcgcatcc gcaactcccg cgaggtgctg 2220
ttcgagaaga ggtacatgag cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac caccaagttc 2280
gagaaggaca acttctacat cgagctgagc cagggcaaca acctgtacgg cggcccgatc 2340
gtgcacttct acgacgtgag catcaagtag gagctctaga tctgttctgc acaaagtgga 2400
gtagtcagtc atcgatcagg aaccagacac cagactttta ttcatacagt gaagtgaagt 2460
gaagtgcagt gcagtgagtt gctggttttt gtacaactta gtatgtattt gtatttgtaa 2520
aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa atccaggggt accagcttgc 2580
atgcctgcag tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta gagataatga gcattgcatg 2640
tctaagttat aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa gtgcagttta 2700
tctatcttta tacatatatt taaactttac tctacgaata atataatcta tagtactaca 2760
ataatatcag tgttttagag aatcatataa atgaacagtt agacatggtc taaaggacaa 2820
ttgagtattt tgacaacagg actctacagt tttatctttt tagtgtgcat gtgttctcct 2880
ttttttttgc aaatagcttc acctatataa tacttcatcc attttattag tacatccatt 2940
tagggtttag ggttaatggt ttttatagac taattttttt agtacatcta ttttattcta 3000
ttttagcctc taaattaaga aaactaaaac tctattttag tttttttatt taataattta 3060
gatataaaat agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt taagaaatta 3120
aaaaaactaa ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg ttaaacgccg 3180
tcgacgagtc taacggacac caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg ccaagcgaag 3240
cagacggcac ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc cgctccaccg 3300
ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc ggagcggcag acgtgagccg 3360
gcacggcagg cggcctcctc ctcctctcac ggcaccggca gctacggggg attcctttcc 3420
caccgctcct tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa atagacaccc cctccacacc 3480
ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa 3540
tccacccgtc ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt cctccccccc cccccctctc 3600
taccttctct agatcggcgt tccggtccat ggttagggcc cggtagttct acttctgttc 3660
atgtttgtgt tagatccgtg tttgtgttag atccgtgctg ctagcgttcg tacacggatg 3720
cgacctgtac gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca gtgtttctct ttggggaatc 3780
ctgggatggc tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc atgatttttt ttgtttcgtt 3840
gcatagggtt tggtttgccc ttttccttta tttcaatata tgccgtgcac ttgtttgtcg 3900
ggtcatcttt tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga tgtggtctgg ttgggcggtc 3960
gttctagatc ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt ggatttatta attttggatc 4020
tgtatgtgtg tgccatacat attcatagtt acgaattgaa gatgatggat ggaaatatcg 4080
atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat gcatatacag agatgctttt 4140
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agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg 4260
tcatacatct tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat 4320
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ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt 5940
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tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt ttacaccaca atatatcctg ccaccagcca 6180
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cgatgctatt cggaagaacg gcaactaagc tgccgggttt gaaacacgga tgatctcgcg 6360
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ctgtcgatct tgagaactat gccgacataa taggaaatcg ctggataaag ccgctgagga 6540
agctgagtgg cgctatttct ttagaagtga acgttgacga tcgtcgaccg taccccgatg 6600
aattaattcg gacgtacgtt ctgaacacag ctggatactt acttgggcga ttgtcataca 6660
tgacatcaac aatgtacccg tttgtgtaac cgtctcttgg aggttcgtat gacactagtg 6720
gttcccctca gcttgcgact agatgttgag gcctaacatt ttattagaga gcaggctagt 6780
tgcttagata catgatcttc aggccgttat ctgtcagggc aagcgaaaat tggccattta 6840
tgacgaccaa tgccccgcag aagctcccat ctttgccgcc atagacgccg cgcccccctt 6900
ttggggtgta gaacatcctt ttgccagatg tggaaaagaa gttcgttgtc ccattgttgg 6960
caatgacgta gtagccggcg aaagtgcgag acccatttgc gctatatata agcctacgat 7020
ttccgttgcg actattgtcg taattggatg aactattatc gtagttgctc tcagagttgt 7080
cgtaatttga tggactattg tcgtaattgc ttatggagtt gtcgtagttg cttggagaaa 7140
tgtcgtagtt ggatggggag tagtcatagg gaagacgagc ttcatccact aaaacaattg 7200
gcaggtcagc aagtgcctgc cccgatgcca tcgcaagtac gaggcttaga accaccttca 7260
acagatcgcg catagtcttc cccagctctc taacgcttga gttaagccgc gccgcgaagc 7320
ggcgtcggct tgaacgaatt gttagacatt atttgccgac taccttggtg atctcgcctt 7380
tcacgtagtg aacaaattct tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga tcttcttgtc 7440
caagataagc ctgcctagct tcaagtatga cgggctgata ctgggccggc aggcgctcca 7500
ttgcccagtc ggcagcgaca tccttcggcg cgattttgcc ggttactgcg ctgtaccaaa 7560
tgcgggacaa cgtaagcact acatttcgct catcgccagc ccagtcgggc ggcgagttcc 7620
atagcgttaa ggtttcattt agcgcctcaa atagatcctg ttcaggaacc ggatcaaaga 7680
gttcctccgc cgctggacct accaaggcaa cgctatgttc tcttgctttt gtcagcaaga 7740
tagccagatc aatgtcgatc gtggctggct cgaagatacc tgcaagaatg tcattgcgct 7800
gccattctcc aaattgcagt tcgcgcttag ctggataacg ccacggaatg atgtcgtcgt 7860
gcacaacaat ggtgacttct acagcgcgga gaatctcgct ctctccaggg gaagccgaag 7920
tttccaaaag gtcgttgatc aaagctcgcc gcgttgtttc atcaagcctt acggtcaccg 7980
taaccagcaa atcaatatca ctgtgtggct tcaggccgcc atccactgcg gagccgtaca 8040
aatgtacggc cagcaacgtc ggttcgagat ggcgctcgat gacgccaact acctctgata 8100
gttgagtcga tacttcggcg atcaccgctt ccctcatgat gtttaactcc tgaattaagc 8160
cgcgccgcga agcggtgtcg gcttgaatga attgttaggc gtcatcctgt gctcccgaga 8220
accagtacca gtacatcgct gtttcgttcg agacttgagg tctagtttta tacgtgaaca 8280
ggtcaatgcc gccgagagta aagccacatt ttgcgtacaa attgcaggca ggtacattgt 8340
tcgtttgtgt ctctaatcgt atgccaagga gctgtctgct tagtgcccac tttttcgcaa 8400
attcgatgag actgtgcgcg actcctttgc ctcggtgcgt gtgcgacaca acaatgtgtt 8460
cgatagaggc tagatcgttc catgttgagt tgagttcaat cttcccgaca agctcttggt 8520
cgatgaatgc gccatagcaa gcagagtctt catcagagtc atcatccgag atgtaatcct 8580
tccggtaggg gctcacactt ctggtagata gttcaaagcc ttggtcggat aggtgcacat 8640
cgaacacttc acgaacaatg aaatggttct cagcatccaa tgtttccgcc acctgctcag 8700
ggatcaccga aatcttcata tgacgcctaa cgcctggcac agcggatcgc aaacctggcg 8760
cggcttttgg cacaaaaggc gtgacaggtt tgcgaatccg ttgctgccac ttgttaaccc 8820
ttttgccaga tttggtaact ataatttatg ttagaggcga agtcttgggt aaaaactggc 8880
ctaaaattgc tggggatttc aggaaagtaa acatcacctt ccggctcgat gtctattgta 8940
gatatatgta gtgtatctac ttgatcgggg gatctgctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga 9000
cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga 9060
tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc 9120
agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca 9180
gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg 9240
agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 9300
gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 9360
tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 9420
aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 9480
aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 9540
ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 9600
tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 9660
agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 9720
gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 9780
tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 9840
acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 9900
tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 9960
caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 10020
aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 10080
aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 10140
ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 10200
agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 10260
atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 10320
cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 10380
aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 10440
cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 10500
aacgttgttg ccattgctgc aggggggggg gggggggggt tccattgttc attccacgga 10560
caaaaacaga gaaaggaaac gacagaggcc aaaaagctcg ctttcagcac ctgtcgtttc 10620
ctttcttttc agagggtatt ttaaataaaa acattaagtt atgacgaaga agaacggaaa 10680
cgccttaaac cggaaaattt tcataaatag cgaaaacccg cgaggtcgcc gccccgtaac 10740
ctgtcggatc accggaaagg acccgtaaag tgataatgat tatcatctac atatcacaac 10800
gtgcgtggag gccatcaaac cacgtcaaat aatcaattat gacgcaggta tcgtattaat 10860
tgatctgcat caacttaacg taaaaacaac ttcagacaat acaaatcagc gacactgaat 10920
acggggcaac ctcatgtccc cccccccccc ccccctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg 10980
tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 11040
cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 11100
ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 11160
ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 11220
tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat 11280
agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 11340
atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 11400
gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 11460
aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 11520
tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 11580
aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 11640
gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 11700
cttcaagaat tggtcgacga tcttgctgcg ttcggatatt ttcgtggagt tcccgccaca 11760
gacccggatt gaaggcgaga tccagcaact cgcgccagat catcctgtga cggaactttg 11820
gcgcgtgatg actggccagg acgtcggccg aaagagcgac aagcagatca cgcttttcga 11880
cagcgtcgga tttgcgatcg aggatttttc ggcgctgcgc tacgtccgcg accgcgttga 11940
gggatcaagc cacagcagcc cactcgacct tctagccgac ccagacgagc caagggatct 12000
ttttggaatg ctgctccgtc gtcaggcttt ccgacgtttg ggtggttgaa cagaagtcat 12060
tatcgcacgg aatgccaagc actcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa 12120
tggacgaacg gataaacctt ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct 12180
cttttctctt aggtttaccc gccaatatat cctgtcaaac actgatagtt taaactgaag 12240
gcgggaaacg acaatctgat catgagcgga gaattaaggg agtcacgtta tgacccccgc 12300
cgatgacgcg ggacaagccg ttttacgttt ggaactgaca gaaccgcaac gttgaaggag 12360
ccactcagca agctggtaca agcttgcatg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc 12420
ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt 12480
tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct 12540
acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg 12600
aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt 12660
atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac 12720
ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa 12780
tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct 12840
attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa 12900
attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag 12960
tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 13020
agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg 13080
acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 13140
gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc 13200
accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 13260
gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca 13320
cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc 13380
cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt 13440
tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc 13500
cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa 13560
cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat 13620
cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt 13680
caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt 13740
gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact 13800
acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg 13860
aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgcgggttt 13920
tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg 13980
ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt 14040
tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag tttaagatgg 14100
atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac 14160
atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat 14220
aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc 14280
agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt 14340
tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcaggtcgac tctagaggat 14400
ccacc 14405
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - vip3Aa TAQMAN primer
<400> 4
caccttcagc aacccgaact a 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemmicall synthesized - vip3Aa TAQMAN primer rev
<400> 5
gcttagcctc cacgatcatc tt 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - vip3Aa TAQMAN probe
<400> 6
gtcctcgtcg ctgcccttca cct 23
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - pmi TAQMAN primer for
<400> 7
ccgggtgaat cagcgttt 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - pmi TAQMAN primer rev
<400> 8
gccgtggcct ttgacagt 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - pmi TAQMAN probe
<400> 9
tgccgccaac gaatcaccgg 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - ZmADH-267 TAQMAN primer for
<400> 10
gaacgtgtgt tgggtttgca t 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - ZmADH-267 TAQMAN primer rev
<400> 11
tccagcaatc cttgcacctt 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized -ZmADH-267 TAQMAN probe
<400> 12
tgcagcctaa ccatgcgcag ggta 24
<210> 13
<211> 2370
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - vip3Aa20 probe
<400> 13
atgaacaaga acaacaccaa gctgagcacc cgcgccctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcgacctgac cctggacgag atcctgaaga accagcagct gctgaacgac 180
atcagcggca agctggacgg cgtgaacggc agcctgaacg acctgatcgc ccagggcaac 240
ctgaacaccg agctgagcaa ggagatcctt aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctg 300
aacgacgtga acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcgcgtgta cctgccgaag 360
atcaccagca tgctgagcga cgtgatgaag cagaactacg ccctgagcct gcagatcgag 420
tacctgagca agcagctgca ggagatcagc gacaagctgg acatcatcaa cgtgaacgtc 480
ctgatcaaca gcaccctgac cgagatcacc ccggcctacc agcgcatcaa gtacgtgaac 540
gagaagttcg aagagctgac cttcgccacc gagaccagca gcaaggtgaa gaaggacggc 600
agcccggccg acatcctgga cgagctgacc gagctgaccg agctggcgaa gagcgtgacc 660
aagaacgacg tggacggctt cgagttctac ctgaacacct tccacgacgt gatggtgggc 720
aacaacctgt tcggccgcag cgccctgaag accgccagcg agctgatcac caaggagaac 780
gtgaagacca gcggcagcga ggtgggcaac gtgtacaact tcctgatcgt gctgaccgcc 840
ctgcaggccc aggccttcct gaccctgacc acctgtcgca agctgctggg cctggccgac 900
atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac ttgaacaagg agaaggagga gttccgcgtg 960
aacatcctgc cgaccctgag caacaccttc agcaacccga actacgccaa ggtgaagggc 1020
agcgacgagg acgccaagat gatcgtggag gctaagccgg gccacgcgtt gatcggcttc 1080
gagatcagca acgacagcat caccgtgctg aaggtgtacg aggccaagct gaagcagaac 1140
taccaggtgg acaaggacag cttgagcgag gtgatctacg gcgacatgga caagctgctg 1200
tgtccggacc agagcgagca aatctactac accaacaaca tcgtgttccc gaacgagtac 1260
gtgatcacca agatcgactt caccaagaag atgaagaccc tgcgctacga ggtgaccgcc 1320
aacttctacg acagcagcac cggcgagatc gacctgaaca agaagaaggt ggagagcagc 1380
gaggccgagt accgcaccct gagcgcgaac gacgacggcg tctacatgcc actgggcgtg 1440
atcagcgaga ccttcctgac cccgatcaac ggctttggcc tgcaggccga cgagaacagc 1500
cgcctgatca ccctgacctg taagagctac ctgcgcgagc tgctgctagc caccgacctg 1560
agcaacaagg agaccaagct gatcgtgcca ccgagcggct tcatcagcaa catcgtggag 1620
aacggcagca tcgaggagga caacctggag ccgtggaagg ccaacaacaa gaacgcctac 1680
gtggaccaca ccggcggcgt gaacggcacc aaggccctgt acgtgcacaa ggacggcggc 1740
atcagccagt tcatcggcga caagctgaag ccgaagaccg agtacgtgat ccagtacacc 1800
gtgaagggca agccatcgat tcacctgaag gacgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860
gacaccaaca acaacctgga ggactaccag accatcaaca agcgcttcac caccggcacc 1920
gacctgaagg gcgtgtacct gatcctgaag agccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac 1980
aacttcatca tcctggagat cagcccgagc gagaagctgc tgagcccgga gctgatcaac 2040
accaacaact ggaccagcac cggcagcacc aacatcagcg gcaacaccct gaccctgtac 2100
cagggcggcc gcggcatcct gaagcagaac ctgcagctgg acagcttcag cacctaccgc 2160
gtgtacttca gcgtgagcgg cgacgccaac gtgcgcatcc gcaactcccg cgaggtgctg 2220
ttcgagaaga ggtacatgag cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac caccaagttc 2280
gagaaggaca acttctacat cgagctgagc cagggcaaca acctgtacgg cggcccgatc 2340
gtgcacttct acgacgtgag catcaagtag 2370
<210> 14
<211> 1176
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - pmi probe
<400> 14
atgcaaaaac tcattaactc agtgcaaaac tatgcctggg gcagcaaaac ggcgttgact 60
gaactttatg gtatggaaaa tccgtccagc cagccgatgg ccgagctgtg gatgggcgca 120
catccgaaaa gcagttcacg agtgcagaat gccgccggag atatcgtttc actgcgtgat 180
gtgattgaga gtgataaatc gactctgctc ggagaggccg ttgccaaacg ctttggcgaa 240
ctgcctttcc tgttcaaagt attatgcgca gcacagccac tctccattca ggttcatcca 300
aacaaacaca attctgaaat cggttttgcc aaagaaaatg ccgcaggtat cccgatggat 360
gccgccgagc gtaactataa agatcctaac cacaagccgg agctggtttt tgcgctgacg 420
cctttccttg cgatgaacgc gtttcgtgaa ttttccgaga ttgtctccct actccagccg 480
gtcgcaggtg cacatccggc gattgctcac tttttacaac agcctgatgc cgaacgttta 540
agcgaactgt tcgccagcct gttgaatatg cagggtgaag aaaaatcccg cgcgctggcg 600
attttaaaat cggccctcga tagccagcag ggtgaaccgt ggcaaacgat tcgtttaatt 660
tctgaatttt acccggaaga cagcggtctg ttctccccgc tattgctgaa tgtggtgaaa 720
ttgaaccctg gcgaagcgat gttcctgttc gctgaaacac cgcacgctta cctgcaaggc 780
gtggcgctgg aagtgatggc aaactccgat aacgtgctgc gtgcgggtct gacgcctaaa 840
tacattgata ttccggaact ggttgccaat gtgaaattcg aagccaaacc ggctaaccag 900
ttgttgaccc agccggtgaa acaaggtgca gaactggact tcccgattcc agtggatgat 960
tttgccttct cgctgcatga ccttagtgat aaagaaacca ccattagcca gcagagtgcc 1020
gccattttgt tctgcgtcga aggcgatgca acgttgtgga aaggttctca gcagttacag 1080
cttaaaccgg gtgaatcagc gtttattgcc gccaacgaat caccggtgac tgtcaaaggc 1140
cacggccgtt tagcgcgtgt ttacaacaag ctgtaa 1176
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - MOV3Aa-01-5' primer
<400> 15
atgaacaaga acaacaccaa 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - MOV3Aa-01-3' primer
<400> 16
ctacttgatg ctcacgtcgt ag 22
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 17
acgagcagaa ccaggtgc 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 18
ggtgaagaag gacggcag 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 19
acctgtcgca agctgctggg 20
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 20
tggacaagct gctgtgtc 18
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 21
tgcaggccga cgagaacag 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 22
tgatccagta caccgtgaa 19
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 23
accctgaccc tgtaccag 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 24
gtgttgccgc tgatgttg 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 25
cgtactcggt cttcggct 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 26
ctgcaggcca aagccgtt 18
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 27
tcgccgtaga tcacctcg 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemcially synthesized
<400> 28
gcttgcgaca ggtggtca 18
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 29
ttgctgctgg tctcggtgg 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 30
cgttggcgat cttaaggat 19
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 31
gcaagccatc gattcac 17
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 32
gcaacaccct gaccctg 17
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 33
tctacgacgt gagcatcaag 20
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 34
gtagaagtgc acgatcggg 19
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemcially synthesized
<400> 35
cggtgctggt ccagttg 17
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemcially synthesized - 162INSERT-F2 primer
<400> 36
acaccaatga tgcaaatagg c 21
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - VIP_R4 primer
<400> 37
gaaggtgttc aggtagaact cgaag 25
<210> 38
<211> 2946
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemcially synthesized - vip3Aa20 5' amplicon
<400> 38
acaccaatga tgcaaatagg ctgggaatag tctgtctaat agtttgagtg aatcatgtca 60
ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc atgagcggag aattaaggga 120
gtcacgttat gacccccgcc gatgacgcgg gacaagccgt tttacgtttg gaactgacag 180
aaccgcaacg ttgaaggagc cactcagcaa gctggtacaa gcttgcatgc ctgcagtgca 240
gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa 300
aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca 360
tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt 420
ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac 480
aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat 540
agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg gtttagggtt 600
aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt agcctctaaa 660
ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata taaaatagaa 720
taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa 780
acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac 840
ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca 900
tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg 960
ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc 1020
ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc 1080
tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc 1140
tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca 1200
cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc ttctctagat 1260
cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga 1320
tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca 1380
gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta 1440
gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt 1500
ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat 1560
gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag 1620
tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc 1680
atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct aggataggta 1740
tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt cgcttggttg 1800
tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta gaatactgtt 1860
tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat 1920
agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg 1980
gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg 2040
agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct tgatatactt 2100
ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt catacgctat 2160
ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg 2220
caggtcgact ctagaggatc caccatgaac aagaacaaca ccaagctgag cacccgcgcc 2280
ctgccgagct tcatcgacta cttcaacggc atctacggct tcgccaccgg catcaaggac 2340
atcatgaaca tgatcttcaa gaccgacacc ggcggcgacc tgaccctgga cgagatcctg 2400
aagaaccagc agctgctgaa cgacatcagc ggcaagctgg acggcgtgaa cggcagcctg 2460
aacgacctga tcgcccaggg caacctgaac accgagctga gcaaggagat ccttaagatc 2520
gccaacgagc agaaccaggt gctgaacgac gtgaacaaca agctggacgc catcaacacc 2580
atgctgcgcg tgtacctgcc gaagatcacc agcatgctga gcgacgtgat taagcagaac 2640
tacgccctga gcctgcagat cgagtacctg agcaagcagc tgcaggagat cagcgacaag 2700
ctggacatca tcaacgtgaa cgtcctgatc aacagcaccc tgaccgagat caccccggcc 2760
taccagcgca tcaagtacgt gaacgagaag ttcgaagagc tgaccttcgc caccgagacc 2820
agcagcaagg tgaagaagga cggcagcccg gccgacatcc tggacgagct gaccgagctg 2880
accgagctgg cgaagagcgt gaccaagaac gacgtggacg gcttcgagtt ctacctgaac 2940
accttc 2946
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - CJB179 Primer
<400> 39
atgcaaatag gctgggaata gtc 23
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - CTRB3116 Reverse Primer
<400> 40
gtaccagctt gctgagtggc t 21
<210> 41
<211> 209
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - CJB134/179 5' amplicon
<400> 41
atgcaaatag gctgggaata gtctgtctaa tagtttgagt gaatcatgtc actgatagtt 60
taaactgaag gcgggaaacg acaatctgat catgagcgga gaattaaggg agtcacgtta 120
tgacccccgc cgatgacgcg ggacaagccg ttttacgttt ggaactgaca gaaccgcaac 180
gttgaaggag ccactcagca agctggtac 209
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemcially synthesized - VIP-F3 primer
<400> 42
ggtgctgttc gagaagaggt 20
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - PMI_REV1 primer
<400> 43
cgatttatca ctctcaatca cat 23
<210> 44
<211> 2577
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemcially synthesized - vip3Aa20 3' amplicon
<400> 44
ggtgctgttc gagaagaggt acatgagcgg cgccaaggac gtgagcgaga tgttcaccac 60
caagttcgag aaggacaact tctacatcga gctgagccag ggcaacaacc tgtacggcgg 120
cccgatcgtg cacttctacg acgtgagcat caagtaggag ctctagatct gttctgcaca 180
aagtggagta gtcagtcatc gatcaggaac cagacaccag acttttattc atacagtgaa 240
gtgaagtgaa gtgcagtgca gtgagttgct ggtttttgta caacttagta tgtatttgta 300
tttgtaaaat acttctatca ataaaatttc taattcctaa aaccaaaatc caggggtacc 360
agcttgcatg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca 420
ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg 480
cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata taatctatag 540
tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga catggtctaa 600
aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg 660
ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt ttattagtac 720
atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt acatctattt 780
tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ttttatttaa 840
taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa 900
gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta 960
aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca 1020
agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc 1080
tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg 1140
tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct acgggggatt 1200
cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct 1260
ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca accagatctc 1320
ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc 1380
ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact 1440
tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac 1500
acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg 1560
gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg 1620
tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg 1680
tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg 1740
ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt 1800
ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga 1860
aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga 1920
tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct 1980
agatcggagt agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat 2040
gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga 2100
taggtataca tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc 2160
tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat 2220
tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt 2280
agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc 2340
tgttgtttgg tgttacttct gcagggatcc ccgatcatgc aaaaactcat taactcagtg 2400
caaaactatg cctggggcag caaaacggcg ttgactgaac tttatggtat ggaaaatccg 2460
tccagccagc cgatggccga gctgtggatg ggcgcacatc cgaaaagcag ttcacgagtg 2520
cagaatgccg ccggagatat cgtttcactg cgtgatgtga ttgagagtga taaatcg 2577
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' junction sequence between corn genome and insert DNA
<400> 45
tgaatcatgt cactgatagt 20
<210> 46
<211> 1088
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' flanking sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(236)
<223> 5' flanking sequence
<400> 46
tcctgtgttg ttggaacaga cttctgtctc ttctggtgat cataaatatt taaatgaacc 60
agttgtgttg gaaaatgttg ttttcttttg tctctagact ggaaagcgga gttctcgtca 120
acacggttct ttcaactagg gatgaaagtg gtaatccgaa ttgttagtac aaatttaata 180
ttttaaaata gatatgtata aaattttatg ttgatctttt ttatgttatc aagcacatta 240
gtataaatta gtataaatat gaataaaata ttacataaaa tgttttatgt attatttggt 300
ccctacaaca taaatagttg aaaaaattac taaatttgtt ttcgaatcta tatcgaagtt 360
tatatctatt atttaagaaa aatataggat gaaaaggttt atcttttatg aatctttaca 420
agctggatct tataaacaag aaaataaatt tatattgtag attttatatc ctatttattc 480
gcaatcaaag aaaagcgact aaaaaactga ttaccgagta aatactgttt ccaaccgttt 540
tcgtccctac tatcaacgcc ttctcccaac cgcagtcgat ctgtccgtct gtatcaggcg 600
cagcggcacc cctgctgttc gactatctag accatagaat attttaggta tacaataatt 660
ttagttccac gctagaacat tttagttaga ataataacaa gatttgctat tgatgtagga 720
ctcgcccgtc actgtctaaa aaagcattct gtcggtctta ttctttaggc atcagcgggt 780
gtactatctc atttttccta tcatattcct cagtactctg ttaagtataa atggtctatt 840
ttacatgatg aactaataaa actaattaag gatcctaact ttttgtgaag gtaatttgga 900
tcattatgca ttaccatcct acgtatacct gctgcagcag catctgcgta agcacagcct 960
agatatatgc ttctgtgtgg actgaaagga gactttgttt atcaattagt atactcccaa 1020
aaaactgatg acaccaatga tgcaaatagg ctgggaatag tctgtctaat agtttgagtg 1080
aatcatgt 1088
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' junction sequence between insert DNA and corn genome
<400> 47
aaacgtccgc catggtctga 20
<210> 48
<211> 1189
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' flanking sequence
<400> 48
catggtctga aggcaacaga taaggcatac tgggccttgt ggtagttgtt ttactgggcc 60
tttttgtatg atctataaaa ttcactggga tcaacccgga gaggaatggc agcagatgca 120
gtccccaggg tcctccgtcg ccgcctgagc acccggcacc cgcgctgaac cggagaggga 180
cgcgcggacg ccgtgcagct ggtgcggagg gggctgtggc agatgaggat gagacgcgta 240
cgtggctggg aaggccagca ggccaccggg tcttcgtcca gcccggcgcg agtggacagg 300
actagagatg gcaacggtta caaacccgct gggttttacc gtcccaaacc cgtacccgtg 360
aaaaatatct atgcccatta aaaaacccgt acccatgacg ggtttgagat tttgcccaaa 420
cccgtaccca tcgggttaac gggtacccat gggttacccg cgggtttcat ctccaatata 480
cctgttcttc tcataatcaa taagtatcgt aatgattaat gatatcatga tccaaaatct 540
atgtaatgaa caacgagttc atgatttggt ataaaaatta ttagtagaga gaatgaaata 600
caaataataa gttgtataat taagtgacct tgcactaagt tatccatcca tcacatatat 660
aacgctagta aaaactataa tatcaagcaa gcaacactct caccgactac tgatacattc 720
accaattgat aaaaaatatg aagtaaataa ggaataacaa gtttgttgtt cgtttataaa 780
ataaaatgac aatatgcact aggtttggtc gggtttaaaa aacccacggg ttcacgggtt 840
tgggtactat aggaacaaac ccgtacccat aaacccattg ggtacagatt tatgcccgtt 900
aacaaaccca tgggtatgaa aattgaccca aacctatacc ctaatggggt aaaaacccat 960
cgggtttcgg atttcgggta cccattgcca tctctagaca ggacaacctc ggccggtcct 1020
gtatgtaggc caccagcatc ggccagttgg tacatccagc cggggtcagg tcacttttac 1080
tcgtctcaat cagacaatca ccgtccacca acgaacgcca acgttgtcac ttgtcaggtc 1140
ggttgagact tgtatttttt tttgtcctcc gtaaaaatcg gttcaccag 1189
<210> 49
<211> 10579
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vip3Aa20 Event MIR162 insert and flanking sequences
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1088)
<223> 5' flanking sequence of event MIR162
<400> 49
tcctgtgttg ttggaacaga cttctgtctc ttctggtgat cataaatatt taaatgaacc 60
agttgtgttg gaaaatgttg ttttcttttg tctctagact ggaaagcgga gttctcgtca 120
acacggttct ttcaactagg gatgaaagtg gtaatccgaa ttgttagtac aaatttaata 180
ttttaaaata gatatgtata aaattttatg ttgatctttt ttatgttatc aagcacatta 240
gtataaatta gtataaatat gaataaaata ttacataaaa tgttttatgt attatttggt 300
ccctacaaca taaatagttg aaaaaattac taaatttgtt ttcgaatcta tatcgaagtt 360
tatatctatt atttaagaaa aatataggat gaaaaggttt atcttttatg aatctttaca 420
agctggatct tataaacaag aaaataaatt tatattgtag attttatatc ctatttattc 480
gcaatcaaag aaaagcgact aaaaaactga ttaccgagta aatactgttt ccaaccgttt 540
tcgtccctac tatcaacgcc ttctcccaac cgcagtcgat ctgtccgtct gtatcaggcg 600
cagcggcacc cctgctgttc gactatctag accatagaat attttaggta tacaataatt 660
ttagttccac gctagaacat tttagttaga ataataacaa gatttgctat tgatgtagga 720
ctcgcccgtc actgtctaaa aaagcattct gtcggtctta ttctttaggc atcagcgggt 780
gtactatctc atttttccta tcatattcct cagtactctg ttaagtataa atggtctatt 840
ttacatgatg aactaataaa actaattaag gatcctaact ttttgtgaag gtaatttgga 900
tcattatgca ttaccatcct acgtatacct gctgcagcag catctgcgta agcacagcct 960
agatatatgc ttctgtgtgg actgaaagga gactttgttt atcaattagt atactcccaa 1020
aaaactgatg acaccaatga tgcaaatagg ctgggaatag tctgtctaat agtttgagtg 1080
aatcatgtca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc atgagcggag 1140
aattaaggga gtcacgttat gacccccgcc gatgacgcgg gacaagccgt tttacgtttg 1200
gaactgacag aaccgcaacg ttgaaggagc cactcagcaa gctggtacaa gcttgcatgc 1260
ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 1320
agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 1380
tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 1440
tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 1500
gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 1560
ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 1620
gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 1680
agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 1740
taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 1800
aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 1860
cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 1920
cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 1980
acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 2040
ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 2100
gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 2160
ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 2220
cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 2280
ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 2340
ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 2400
ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 2460
gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 2520
agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 2580
atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 2640
tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 2700
tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 2760
aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 2820
cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 2880
gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 2940
acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 3000
gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 3060
tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 3120
tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 3180
catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 3240
gttacttctg caggtcgact ctagaggatc caccatgaac aagaacaaca ccaagctgag 3300
cacccgcgcc ctgccgagct tcatcgacta cttcaacggc atctacggct tcgccaccgg 3360
catcaaggac atcatgaaca tgatcttcaa gaccgacacc ggcggcgacc tgaccctgga 3420
cgagatcctg aagaaccagc agctgctgaa cgacatcagc ggcaagctgg acggcgtgaa 3480
cggcagcctg aacgacctga tcgcccaggg caacctgaac accgagctga gcaaggagat 3540
ccttaagatc gccaacgagc agaaccaggt gctgaacgac gtgaacaaca agctggacgc 3600
catcaacacc atgctgcgcg tgtacctgcc gaagatcacc agcatgctga gcgacgtgat 3660
gaagcagaac tacgccctga gcctgcagat cgagtacctg agcaagcagc tgcaggagat 3720
cagcgacaag ctggacatca tcaacgtgaa cgtcctgatc aacagcaccc tgaccgagat 3780
caccccggcc taccagcgca tcaagtacgt gaacgagaag ttcgaagagc tgaccttcgc 3840
caccgagacc agcagcaagg tgaagaagga cggcagcccg gccgacatcc tggacgagct 3900
gaccgagctg accgagctgg cgaagagcgt gaccaagaac gacgtggacg gcttcgagtt 3960
ctacctgaac accttccacg acgtgatggt gggcaacaac ctgttcggcc gcagcgccct 4020
gaagaccgcc agcgagctga tcaccaagga gaacgtgaag accagcggca gcgaggtggg 4080
caacgtgtac aacttcctga tcgtgctgac cgccctgcag gcccaggcct tcctgaccct 4140
gaccacctgt cgcaagctgc tgggcctggc cgacatcgac tacaccagca tcatgaacga 4200
gcacttgaac aaggagaagg aggagttccg cgtgaacatc ctgccgaccc tgagcaacac 4260
cttcagcaac ccgaactacg ccaaggtgaa gggcagcgac gaggacgcca agatgatcgt 4320
ggaggctaag ccgggccacg cgttgatcgg cttcgagatc agcaacgaca gcatcaccgt 4380
gctgaaggtg tacgaggcca agctgaagca gaactaccag gtggacaagg acagcttgag 4440
cgaggtgatc tacggcgaca tggacaagct gctgtgtccg gaccagagcg agcaaatcta 4500
ctacaccaac aacatcgtgt tcccgaacga gtacgtgatc accaagatcg acttcaccaa 4560
gaagatgaag accctgcgct acgaggtgac cgccaacttc tacgacagca gcaccggcga 4620
gatcgacctg aacaagaaga aggtggagag cagcgaggcc gagtaccgca ccctgagcgc 4680
gaacgacgac ggcgtctaca tgccactggg cgtgatcagc gagaccttcc tgaccccgat 4740
caacggcttt ggcctgcagg ccgacgagaa cagccgcctg atcaccctga cctgtaagag 4800
ctacctgcgc gagctgctgc tagccaccga cctgagcaac aaggagacca agctgatcgt 4860
gccaccgagc ggcttcatca gcaacatcgt ggagaacggc agcatcgagg aggacaacct 4920
ggagccgtgg aaggccaaca acaagaacgc ctacgtggac cacaccggcg gcgtgaacgg 4980
caccaaggcc ctgtacgtgc acaaggacgg cggcatcagc cagttcatcg gcgacaagct 5040
gaagccgaag accgagtacg tgatccagta caccgtgaag ggcaagccat cgattcacct 5100
gaaggacgag aacaccggct acatccacta cgaggacacc aacaacaacc tggaggacta 5160
ccagaccatc aacaagcgct tcaccaccgg caccgacctg aagggcgtgt acctgatcct 5220
gaagagccag aacggcgacg aggcctgggg cgacaacttc atcatcctgg agatcagccc 5280
gagcgagaag ctgctgagcc cggagctgat caacaccaac aactggacca gcaccggcag 5340
caccaacatc agcggcaaca ccctgaccct gtaccagggc ggccgcggca tcctgaagca 5400
gaacctgcag ctggacagct tcagcaccta ccgcgtgtac ttcagcgtga gcggcgacgc 5460
caacgtgcgc atccgcaact cccgcgaggt gctgttcgag aagaggtaca tgagcggcgc 5520
caaggacgtg agcgagatgt tcaccaccaa gttcgagaag gacaacttct acatcgagct 5580
gagccagggc aacaacctgt acggcggccc gatcgtgcac ttctacgacg tgagcatcaa 5640
gtaggagctc tagatctgtt ctgcacaaag tggagtagtc agtcatcgat caggaaccag 5700
acaccagact tttattcata cagtgaagtg aagtgaagtg cagtgcagtg agttgctggt 5760
ttttgtacaa cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa 5820
ttcctaaaac caaaatccag gggtaccagc ttgcatgcct gcagtgcagc gtgacccggt 5880
cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata 5940
ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc tttatacata tatttaaact 6000
ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata tcagtgtttt agagaatcat 6060
ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt attttgacaa caggactcta 6120
cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt ttgcaaatag cttcacctat 6180
ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt ttagggttaa tggtttttat 6240
agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag cctctaaatt aagaaaacta 6300
aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata aaatagaata aaataaagtg 6360
actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa ctaaggaaac atttttcttg 6420
tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg agtctaacgg acaccaacca 6480
gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg gcacggcatc tctgtcgctg 6540
cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac ttgctccgct gtcggcatcc 6600
agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg caggcggcct cctcctcctc 6660
tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc tccttcgctt tcccttcctc 6720
gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt ccccaacctc gtgttgttcg 6780
gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa 6840
ggtacgccgc tcgtcctccc cccccccccc tctctacctt ctctagatcg gcgttccggt 6900
ccatggttag ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg 6960
ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga 7020
ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg aatcctggga tggctctagc cgttccgcag 7080
acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc 7140
tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt 7200
cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt 7260
tcaaactacc tggtggattt attaattttg gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat 7320
agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg 7380
cgggttttac tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt 7440
gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga atactgtttc aaactacctg 7500
gtgtatttat taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt 7560
aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg 7620
catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta 7680
ttataataaa caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg atgatggcat 7740
atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc cctgccttca tacgctattt atttgcttgg 7800
tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt tacttctgca gggatccccg 7860
atcatgcaaa aactcattaa ctcagtgcaa aactatgcct ggggcagcaa aacggcgttg 7920
actgaacttt atggtatgga aaatccgtcc agccagccga tggccgagct gtggatgggc 7980
gcacatccga aaagcagttc acgagtgcag aatgccgccg gagatatcgt ttcactgcgt 8040
gatgtgattg agagtgataa atcgactctg ctcggagagg ccgttgccaa acgctttggc 8100
gaactgcctt tcctgttcaa agtattatgc gcagcacagc cactctccat tcaggttcat 8160
ccaaacaaac acaattctga aatcggtttt gccaaagaaa atgccgcagg tatcccgatg 8220
gatgccgccg agcgtaacta taaagatcct aaccacaagc cggagctggt ttttgcgctg 8280
acgcctttcc ttgcgatgaa cgcgtttcgt gaattttccg agattgtctc cctactccag 8340
ccggtcgcag gtgcacatcc ggcgattgct cactttttac aacagcctga tgccgaacgt 8400
ttaagcgaac tgttcgccag cctgttgaat atgcagggtg aagaaaaatc ccgcgcgctg 8460
gcgattttaa aatcggccct cgatagccag cagggtgaac cgtggcaaac gattcgttta 8520
atttctgaat tttacccgga agacagcggt ctgttctccc cgctattgct gaatgtggtg 8580
aaattgaacc ctggcgaagc gatgttcctg ttcgctgaaa caccgcacgc ttacctgcaa 8640
ggcgtggcgc tggaagtgat ggcaaactcc gataacgtgc tgcgtgcggg tctgacgcct 8700
aaatacattg atattccgga actggttgcc aatgtgaaat tcgaagccaa accggctaac 8760
cagttgttga cccagccggt gaaacaaggt gcagaactgg acttcccgat tccagtggat 8820
gattttgcct tctcgctgca tgaccttagt gataaagaaa ccaccattag ccagcagagt 8880
gccgccattt tgttctgcgt cgaaggcgat gcaacgttgt ggaaaggttc tcagcagtta 8940
cagcttaaac cgggtgaatc agcgtttatt gccgccaacg aatcaccggt gactgtcaaa 9000
ggccacggcc gtttagcgcg tgtttacaac aagctgtaag agcttactga aaaaattaac 9060
atctcttgct aagctgggag ctcgatccgt cgacctgcag atcgttcaaa catttggcaa 9120
taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg 9180
ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg 9240
gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag 9300
cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tccccgggtc 9360
tagacaattc agtacattaa aaacgtccgc catggtctga aggcaacaga taaggcatac 9420
tgggccttgt ggtagttgtt ttactgggcc tttttgtatg atctataaaa ttcactggga 9480
tcaacccgga gaggaatggc agcagatgca gtccccaggg tcctccgtcg ccgcctgagc 9540
acccggcacc cgcgctgaac cggagaggga cgcgcggacg ccgtgcagct ggtgcggagg 9600
gggctgtggc agatgaggat gagacgcgta cgtggctggg aaggccagca ggccaccggg 9660
tcttcgtcca gcccggcgcg agtggacagg actagagatg gcaacggtta caaacccgct 9720
gggttttacc gtcccaaacc cgtacccgtg aaaaatatct atgcccatta aaaaacccgt 9780
acccatgacg ggtttgagat tttgcccaaa cccgtaccca tcgggttaac gggtacccat 9840
gggttacccg cgggtttcat ctccaatata cctgttcttc tcataatcaa taagtatcgt 9900
aatgattaat gatatcatga tccaaaatct atgtaatgaa caacgagttc atgatttggt 9960
ataaaaatta ttagtagaga gaatgaaata caaataataa gttgtataat taagtgacct 10020
tgcactaagt tatccatcca tcacatatat aacgctagta aaaactataa tatcaagcaa 10080
gcaacactct caccgactac tgatacattc accaattgat aaaaaatatg aagtaaataa 10140
ggaataacaa gtttgttgtt cgtttataaa ataaaatgac aatatgcact aggtttggtc 10200
gggtttaaaa aacccacggg ttcacgggtt tgggtactat aggaacaaac ccgtacccat 10260
aaacccattg ggtacagatt tatgcccgtt aacaaaccca tgggtatgaa aattgaccca 10320
aacctatacc ctaatggggt aaaaacccat cgggtttcgg atttcgggta cccattgcca 10380
tctctagaca ggacaacctc ggccggtcct gtatgtaggc caccagcatc ggccagttgg 10440
tacatccagc cggggtcagg tcacttttac tcgtctcaat cagacaatca ccgtccacca 10500
acgaacgcca acgttgtcac ttgtcaggtc ggttgagact tgtatttttt tttgtcctcc 10560
gtaaaaatcg gttcaccag 10579
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - FE1002 primer
<400> 50
cgtgactccc ttaattctcc gct 23
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - FE1003 primer
<400> 51
gatcagattg tcgtttcccg cctt 24
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - FE1004 primer
<400> 52
gattgtcgtt tcccgccttc agtt 24
<210> 53
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - 162_DW_Conf3 primer
<400> 53
cctgtgttgt tggaacagac ttctgtc 27
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - FE0900 primer
<400> 54
ggctccttca acgttgcggt tctgtc 26
<210> 55
<211> 1230
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - 5' PCR amplicon
<400> 55
cctgtgttgt tggaacagac ttctgtctct tctggtgatc ataaatattt aaatgaacca 60
gttgtgttgg aaaatgttgt tttcttttgt ctctagactg gaaagcggag ttctcgtcaa 120
cacggttctt tcaactaggg atgaaagtgg taatccgaat tgttagtaca aatttaatat 180
tttaaaatag atatgtataa aattttatgt tgatcttttt tatgttatca agcacattag 240
tataaattag tataaatatg aataaaatat tacataaaat gttttatgta ttatttggtc 300
cctacaacat aaatagttga aaaaattact aaatttgttt tcgaatctat atcgaagttt 360
atatctatta tttaagaaaa atataggatg aaaaggttta tcttttatga atctttacaa 420
gctggatctt ataaacaaga aaataaattt atattgtaga ttttatatcc tatttattcg 480
caatcaaaga aaagcgacta aaaaactgat taccgagtaa atactgtttc caaccgtttt 540
cgtccctact atcaacgcct tctcccaacc gcagtcgatc tgtccgtctg tatcaggcgc 600
agcggcaccc ctgctgttcg actatctaga ccatagaata ttttaggtat acaataattt 660
tagttccacg ctagaacatt ttagttagaa taataacaag atttgctatt gatgtaggac 720
tcgcccgtca ctgtctaaaa aagcattctg tcggtcttat tctttaggca tcagcgggtg 780
tactatctca tttttcctat catattcctc agtactctgt taagtataaa tggtctattt 840
tacatgatga actaataaaa ctaattaagg atcctaactt tttgtgaagg taatttggat 900
cattatgcat taccatccta cgtatacctg ctgcagcagc atctgcgtaa gcacagccta 960
gatatatgct tctgtgtgga ctgaaaggag actttgttta tcaattagta tactcccaaa 1020
aaactgatga caccaatgat gcaaataggc tgggaatagt ctgtctaata gtttgagtga 1080
atcatgtcac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 1140
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 1200
aactgacaga accgcaacgt tgaaggagcc 1230
<210> 56
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - 162_GW_3_F1 primer
<400> 56
tctcttgcta agctgggagc tcgatccg 28
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - 162_GW_3_F2 primer
<400> 57
aagattgaat cctgttgccg gtcttgcg 28
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized162_3'GW_R1 primer
<400> 58
ctggtgaacc gatttttacg gagg 24
<210> 59
<211> 1518
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - 3' PCR amplicon
<400> 59
tctcttgcta agctgggagc tcgatccgtc gacctgcaga tcgttcaaac atttggcaat 60
aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 120
tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg 180
tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 240
gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat ccccgggtct 300
agacaattca gtacattaaa aacgtccgcc atggtctgaa ggcaacagat aaggcatact 360
gggccttgtg gtagttgttt tactgggcct ttttgtatga tctataaaat tcactgggat 420
caacccggag aggaatggca gcagatgcag tccccagggt cctccgtcgc cgcctgagca 480
cccggcaccc gcgctgaacc ggagagggac gcgcggacgc cgtgcagctg gtgcggaggg 540
ggctgtggca gatgaggatg agacgcgtac gtggctggga aggccagcag gccaccgggt 600
cttcgtccag cccggcgcga gtggacagga ctagagatgg caacggttac aaacccgctg 660
ggttttaccg tcccaaaccc gtacccgtga aaaatatcta tgcccattaa aaaacccgta 720
cccatgacgg gtttgagatt ttgcccaaac ccgtacccat cgggttaacg ggtacccatg 780
ggttacccgc gggtttcatc tccaatatac ctgttcttct cataatcaat aagtatcgta 840
atgattaatg atatcatgat ccaaaatcta tgtaatgaac aacgagttca tgatttggta 900
taaaaattat tagtagagag aatgaaatac aaataataag ttgtataatt aagtgacctt 960
gcactaagtt atccatccat cacatatata acgctagtaa aaactataat atcaagcaag 1020
caacactctc accgactact gatacattca ccaattgata aaaaatatga agtaaataag 1080
gaataacaag tttgttgttc gtttataaaa taaaatgaca atatgcacta ggtttggtcg 1140
ggtttaaaaa acccacgggt tcacgggttt gggtactata ggaacaaacc cgtacccata 1200
aacccattgg gtacagattt atgcccgtta acaaacccat gggtatgaaa attgacccaa 1260
acctataccc taatggggta aaaacccatc gggtttcgga tttcgggtac ccattgccat 1320
ctctagacag gacaacctcg gccggtcctg tatgtaggcc accagcatcg gccagttggt 1380
acatccagcc ggggtcaggt cacttttact cgtctcaatc agacaatcac cgtccaccaa 1440
cgaacgccaa cgttgtcact tgtcaggtcg gttgagactt gtattttttt ttgtcctccg 1500
taaaaatcgg ttcaccag 1518
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 60
ttcacgggag actttatctg 20
<210> 61
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 61
ccgattcatt aatgcag 17
<210> 62
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 62
acgtaaaacg gcttgtc 17
<210> 63
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 63
gtttaaactg aaggcgg 17
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 64
aataatatca ctctgtacat cc 22
<210> 65
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 65
gttgtaaaac gacgg 15
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 66
taggcacccc aggcttta 18
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 67
aattgaattt agcggccg 18
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 68
ggtccctaca acataaatag 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 69
ttcgtcccta ctatcaacgc 20
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 70
ctttaggcat cagcgggt 18
<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 71
agcatctgcg taagcaca 18
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 72
ctgatgacac caatgatgc 19
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 73
gatcagattg tcgtttccc 19
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 74
gcatcattgg tgtcatcag 19
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 75
tgtgcttacg cagatgct 18
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 76
acccgctgat gcctaaag 18
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 77
gcgttgatag tagggacgaa 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 78
ctatttatgt tgtagggacc 20
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 79
ctagactgga aagcggag 18
<210> 80
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 80
ccactttcat ccctagttg 19
<210> 81
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 81
gattgaatcc tgttgcc 17
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 82
tctcataaat aacgtcatgc 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 83
tctgtggata accgtattac 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 84
agtaacatag atgacaccgc 20
<210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 85
ccagtgtgct ggaattcg 18
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 86
ccagtgtgat ggatatctgc 20
<210> 87
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 87
ccagtgtgct ggaattcg 18
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 88
ccagtgtgat ggatatctgc 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 89
gtgtgctgga attcgccctt 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 90
tatctgcaga attcgccctt 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 91
gtgtgctgga attcgccctt 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 92
tatctgcaga attcgccctt 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 93
gtgtgctgga attcgccctt 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 94
tatctgcaga attcgccctt 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 95
gtgtgctgga attcgccctt 20
<210> 96
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 96
ggtcttgcga tgattatc 18
<210> 97
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 97
gagaggaatg gcagcaga 18
<210> 98
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 98
catgacgggt ttgagatt 18
<210> 99
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 99
aatctcaaac ccgtcatg 18
<210> 100
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 100
tctgctgcca ttcctctc 18
<210> 101
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized
<400> 101
gatcaacccg gagaggaat 19
<210> 102
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - b05104h sequenceing primer
<400> 102
ccatgacggg tttgagat 18
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - b05105c sequenceing primer
<400> 103
caaccgacct gacaagtgac 20
<210> 104
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - b05105e sequenceing primer
<400> 104
atctcaaacc cgtcatgg 18
<210> 105
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically synthesized - b05105f sequencing primer
<400> 105
attcctctcc gggttgatc 19
<210> 106
<211> 51328
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> misc_feature
<222> (1680)..(3338)
<223> opie2 marker
<220>
<221> misc_feature
<222> (25455)..(25512)
<223> Maize genomic sequence displaced by MIR162 heterologous DNA.
<220>
<221> misc_feature
<222> (43275)..(45086)
<223> gag marker
<400> 106
agatctagag attcgtcatt tgtagaaagg atagaaaggt gattgctagg aagttagggg 60
caaaatgcaa gggtgataaa acttgcattt ggatccctaa ggaaattgtg actaaccttg 120
taggacccaa caagagttgg gtacctaagt cccaagccta aatttgcctt gcaggtttat 180
gcatccgggg gttcaagctg gattattgat agcggatgca caaaccatat gacgggggag 240
aagaagatgt tcacctccta tgtcaagaat aaggattccc aagattcaat tatattcggt 300
gatgggaatc aaggcaaggt aaaagggtta ggtaaaattg caatttctaa tgagcactcc 360
atatctaatg tgtttttagt agagtctctc agatataatt tgctatctgt tagtcaatta 420
tgcaacatgg ggtataactg tctatttacc aatgtagatg tgtctgtctt tagaagaagt 480
gatggttcac tagcttttaa gggtgtatta gacggcaaac tttatttagt tgattttgca 540
aaagaagagg ccggtctaga tgcatgctta atagctaaga ctagcatggg ctggctgtgg 600
catcgccgct tagcacatgt ggggatgaag aaccttcaca agcttctaaa gggagaacac 660
gtgataggtt tgactaatgt gcaattcgaa aaagatagac cttgtgcagc ttgtcaagca 720
gggaaacagg tgggaagcgc tcatcacacc aaaaatgtga tgacaacatc aagacccctg 780
gagctgctac atatggacct cttcggaccc gtcgcctatc tgagcatagg aggaagtaag 840
tatggtctag ttatcgttga tgacttttcc cgcttcactt gggtgttctt tttgcaggat 900
aaatctgaaa cccaagggac cctcaagcgc ttcctcagga gatctcaaaa tgagtttgag 960
ctcaaggtga agaagataag gagcgacaac gggtccgagt tcaagaacct tcaagtggag 1020
gagttccttg aggaggaagg gatcaagcac gagttctccg ctccctacac accacagcaa 1080
aatggtgtgg tagagaggaa gaacatgacg ctaatcgata tggcgagaac gatgcttgga 1140
gaattcaaga cccccgagtg tttctggtcg gaagccgtga acacggcttg ccacgccatc 1200
aacagggtct accttcaccg cctcctcaag aagacgtcgt atgagcttct aaccggtaac 1260
aaacccaatg tatcttactt tcgtgtattt gggagcaaat gctacattct agtgaagaag 1320
ggtagaaatt ctaagtttgc tcccaaagct gtagaagggt ttttgttagg ttatgactca 1380
aatacaaagg cgtatagagt cttcaacaaa tcatcgggtt tggttgaaat ctctagcgac 1440
gttgtatttg atgagactaa tggctctcca agagagcaag ttgttgattg tgatgatgta 1500
gatgaagaag atgttccaac ggctgctata cgaaccatgg cgattggaga agtgcggcca 1560
caggaacaag atgaacgaga tcaaccttct tcctcaacaa cggtgcatcc cccaactcaa 1620
gacgatgaac aggttcatca acaggaggca tgtgatcaag gggagcacaa gatgatcatg 1680
tgatggagga agaagcgcaa ccggcacctc caacccaagt tcgagcgatg attcaaagga 1740
atcatcccgt cgatcaaatt ctgggtgata ttagcaaggg agtaactact cgatctcgat 1800
tagttaattt ttgtgagcat tactcctttg tctcttctat tgagcctttc agggtagaag 1860
aggccttgct agatccggac tgggtgttag ccatgcagga ggaactcaac aacttcaagc 1920
gcaatgaagt ttggacactg gtgcctcgtc ccaagcaaaa tgttgtggga accaagtggg 1980
tgttccgcaa caaacaggac gagcacgggg tggtgacgag gaacaaggct cgacttgtgg 2040
caaaaggtta tgcccaagtc gcaggtttgg actttgagga gacgtttgct cctgtggcta 2100
ggctagagtc aattcgcatc ttgctagcat atgccgctca ccactctttc aggttgtacc 2160
aaatggatgt gaagagcgct ttcctcaacg ggccgatcaa ggaagaggtg tacgtggagc 2220
aaccccctgg cttcgaggat gaacggtacc ccgaccacgt gtgtaagctc tctaaggcgc 2280
tctatggact taagcaagcc ccaagagcat ggtatgaatg ccttagagac tttttacttg 2340
ctaatgcttt caaggttggg aaagccgatc caactctgtt cactaagaca tgtgatggtg 2400
atttgtttgt gtgccaaatt tatgtcgacg acataatatt tggttctact aaccaaaagt 2460
cttgtgaaga gtttagcagg gtaatggcgc agaaattcga gatgtcaatg atgggcgagt 2520
tgaactactt ccttgggttc caagtgaagc aactcaagga tggcaccttc atctcccaaa 2580
cgaagtacac gcaagatcta ctaaagcggt ttgggatgaa ggacgccaag cccgcaaaga 2640
ctccgatggg gaccgacgga cacaccgacc tcaacaaagg aggtaagtcc gttgatcaaa 2700
aagcataccg gtcaatgata ggttctttac tttacttatg tgctagtaga ccggatatta 2760
tgcttagcgt atgcatgtgt gctagatttc aatccgatcc taaggagtgt cacttagtgg 2820
cggtgaagcg aattattaga tatttggttg ctacgccttg cttcgggctc tggtatccaa 2880
aggggtctac ctttgacctg gttggatact cagattccga ctatgttgga tgtaaggtcg 2940
ataggaagag tacatcgggg acgtgccaat tcttaggaag gtccctggtg tcgtggaact 3000
ctaagaaaca aacctccgtt gccctatcca ccgctgaggc cgagtatgtt gccgcaggac 3060
agtgttgcgc gcaactactt tggatgaggc aaaccctccg ggactttggc tacaatctga 3120
gcaaagtccc actcctatgt gacaatgaga gtgctatccg catggcggaa aatcctgttg 3180
aacacagccg cacaaagcac atagacatcc ggcatcactt tttgagagac caccagcaaa 3240
agggagatat cgaagtgttt catgttagca ccgagaacca gctagctgat atcgaagtgt 3300
ttcatgttag caccgagaac cttttgcagg ctgcgtagta agctaaatgt cttagattcg 3360
cggaacttgg attgaattgt agcatacatg tgtttatgcc tttgatcatg ttcattctgc 3420
attttgttgc ttattgtggt gctcaagttg tacaaacact ccctggatct cacaagtccg 3480
ttgcaaagtg atgctgagag cacctagagg gggggtgaat aggtgatcct gtaaaaactt 3540
aacttatagc cacaaaaact tgttaaaggt tagcacaata attgccaagt ggctaaagag 3600
gagatcttgc acaatacgat tatcacagag aattcaacac agaggagaca tagtgattta 3660
tcccgtggtt cggccaagta caaaacttgc ctacttccac gttgtggcgt cccaacggac 3720
gagggttgca atcaaccctt ctcaagcggt ccaaagaccc acttgaatac cacggtgttt 3780
ttgccttgct tatctttatc ccacttacga ggaatctcca cagattggag tctctcgccc 3840
ttacacttaa gattcacaaa gaagcacgga gtaagggagg gaagcaacac acacaaatcc 3900
acagcgaaat gcgcacacac acggccaaga atcgagctca aagactatct cacagtttct 3960
cacaagaaca gagctcgaat cacttagaat cacaaacgga tgcgcaaaga ctgagtgtgg 4020
atgatcaaga atgctcaaag gttgcttggt gtctccctcc atgcgtctag gggtcccttt 4080
tatagcccca aggcagctag gagccgttga gaacaaatct ggaaggccat ctttgccttc 4140
tgtcgtcggg cgcaccggac agtccggtgc ccgattcctt tccttaattg gcgaagccga 4200
ccgttgcaga tgcgggagcc gttggcgcac cggacatgtc cggtgcacac cggacagtcc 4260
ggtgccccct tccgaccgtt ggctcggcca cgtgtcccgc gcagatcgcg cggtcgaccg 4320
ttggctcagc cgaccgttgg ctcaccggac agtccggtgc acaccggaca gtccggtgca 4380
caccggacag tccggtgaat tttagccgta cgccgtcagc aaattcccga gagcggcctc 4440
ttcggccaag gcagcctggc gcaccggaca ctgtccggtg caccaccgga cagtccggtg 4500
ccccagaccg aaacagcctc ttggctgtac acagccaagt cttctcttct cttcttcttt 4560
ctgtttctaa cacttagaca aatatattag tacacaaaac caatgtacta aggcttagaa 4620
acataccttt gctctagatt ttcactttgt tcatccatgg gcattgattc acatttaagc 4680
acttgtgttg acactcaatc accaaaatac ttagaaatgg cccaagggca catttccctt 4740
tcagatgcac agtttgaggg ggagatgtgt tacaacttga ccctttgaga ctaaccgtat 4800
gcttgagttt gcttgtttta gtctcaaagg agaattaaaa gggaaaaggt ggacttggac 4860
catgaaagac ttccactgca ctccgatgag agggtagctt attccaagtt catctcatgt 4920
actcttattg cctttgtatt cttattgaag attttggtga ggcaatgggg ttcttgggcc 4980
aagattgatc ctgttttggt gcttgatgcc aaagggggag aaaataaggg ccaaagcaat 5040
aaatggatca gctaccactt gagaaatttt gaaaacagta gaatagagct tttggtttgt 5100
caaatctctt ttgttgtctc ttttgtcaaa agttggcctc ttgtggggag aagtgttgat 5160
tatgggaaaa agggggagtt tttgaaatct ttcctttgga atgactctcc ttatgcttca 5220
acatgtgtgt ttgacttaga gatagagatt tgagtttgat ttgcaaaaac aaaccaagtg 5280
gtggcaaagg atgatccata tatgccaaat tgaatcaaaa taaatttgag tttttatttg 5340
aagtaatatt gcacttgttc tagttgcttt atgtagtgtt ggcataaatc accaaaaagg 5400
gggagattga aagggaaatg tgcccttggg ccatttctaa gtattttggt gattgagtgc 5460
caacacaagt gcttaaatgt gaattcatgt ttatggatga ataaagtgaa aatcaagagc 5520
aaaggtatgt ttctaagtct tagtacattg gttttgtgta ctaatatact tgtctaagta 5580
ttggaaacag gaagaaaaag aaaagaaaag agttggctgt gtacagccaa gaggctgttt 5640
cggtctgggg caccggactg tccggtggtg caccggacag tgtccggtgg tgcaccggac 5700
agtgtccggt gcgccaggct gcctcggccg aagtagccgc tctcgggaat tcgctgacgg 5760
cgtacgacta taattcaccg gactgtccgg tgtgcaccgg actgtccggt gtgcaccgga 5820
ctgtccggtg agccaacggt cggccgggcc aacggtcggc cgcgcgatct gcgcgtgaca 5880
cgtggccgag ccaacggcta gaagggggca ccggactgtc cggtgtgcac cggacatgtc 5940
cggtgcgcca acggctctct ggcgggcaac gggcggctgc gccattttag gaaggaaatc 6000
gggcaccgga cagtgtccgg tgtgcaccgg actgtccggt gcgcccgacg acagaaggca 6060
aggatggcct tccagatttg ttctcaacgg ctcctagctg tcttggggct ataaaaggga 6120
cccctaggcg catggaggag tacaccaagc attcctacaa cattcctaag caccaagaca 6180
tcgatctcac gcattcgttt cattgtgata gcatctagag ctcttgttga gttgcgaact 6240
ctttgagttg tgttgcgagc tcttgttgcg acttgtgtgc gtgttgttgc tctgatcttt 6300
tgaagtcttg tgtgcgttgc tcattccccc tttgctctgt gttctttgtg aacttcaatt 6360
gtaagggcga gaggctccaa gttgtggaga ttcctcgcaa acgggattga gaaaaaaagc 6420
aagcaaaaca ccgtggtatt caagtgggtc tttggaccgc ttgagagggg ttgattgcaa 6480
ccctcgtccg ttgggacgcc acaacatgga gtaggcaagc gttggtcttg gccgaaccac 6540
gggataaacc actgtgtcgt ctctgtgatt gatctcttgt ggtattgtgt tttgttgaga 6600
ctcctttcta gccacttggc atttattgtg ctaacactta acaagttttt gtggctataa 6660
gtttaagttt tacaggatca cctattcacc ccccccccct ctaggtgttc tcacctatgc 6720
acccgtagct aggcttgagt caattcgcat attattggcc tatgctactt accatggctt 6780
taagctttat caaatggacg tgaaaagtgc cttcctcaac ggaccaatca aggaagaggt 6840
ctatgttgag caacctcccg gctttgaaga cagtgagtat cctaaccatg tttataggct 6900
ctctaaggcg ctttatgggc tcaagcaagc cccaagagca tggtatgaat gccttagaga 6960
tttccttatc gctaatggct tcaaagtcgg caaggccgat cctactctat ccactaaaac 7020
tcttgacaat gatttgtttg tatgccaaat ttatgttgat gatatcatat ttgggtctac 7080
taacgaatct acttgtgagg aatttagtag gatcatgaca cagaaattcg agatgtctat 7140
gatgggggag ttgaaatatt tcttaggatt tcaagtgaag caactccaag agggcacctt 7200
cattagccaa acgaagtaca ctcaagacat tctaaacaag tttggaatga aggatgccaa 7260
gcccatcaaa acacccatgg gaacaaatgg gcatctcggc ctcgacacgg gaggtaagtc 7320
cgtggatcaa aaggtatacc ggtcgatgat tggttcattg ctttatttat gtgcatctcg 7380
accggacatt atgctttccg tatgcatgtg tgcaagattc caatccgacc ctaaggaatc 7440
ccaccttacg gccgtaaaac gaatcttgag atatttggct tatactccta agtttgggct 7500
ttggtaccct cggggatcca cttttgattt aattggttat tccgatgctg attgggcggg 7560
gtgtaagatt aataggaaga gcacatcggg gacttgccag ttcttgggaa gatccttggt 7620
gtcttgggct tcaaagaagc aaaattcggt tgctctttcc accgccgaag ccgagtacat 7680
tgccgcaggt cattgttgcg cgcaattgct ttggatgagg caaaccctgc gggactatgg 7740
ttacaaatta accaaagtcc ctttgctatg tgataatgag agtgcaatca aaatggccga 7800
caatcccgtc gagcatagcc gcactaagca catagccatt cggtatcatt ttcttaggga 7860
tcaccaacaa aagggagata tcgagatttc ttatattaac actaaagatc aattagccga 7920
tatctttacc aagcctcttg atgaacaaac ttttaccaaa cttaggcatg agctcaatat 7980
tcttgattcg cgcaattttt tttgctagat tgcacacgta gctcatttat atacctttga 8040
tcatatctct ttcatatgct atgactaatg tgtttttcaa gtccatttca caccaagtca 8100
taggtatatt gaaagggaat tggagttttc ggcgaagaca aaggcttcca ctccgtaact 8160
catcctttgc catcgctcca agaaaaggac cttgtctttg ggggagagag taaaagccca 8220
aagcaaaagg actggacttc gtctttggta taatcttaac tcatttactt atgaccaaag 8280
gggaagatag tacttctatg ggctctaatg attccgtttt tggcgattca tgccaaaggg 8340
ggagaaagta tgagcccaaa gcaaaaggac cgcaccacca ccaatttcaa aaacttagtg 8400
ctttctaaga gtatttatca attggtatcc tattgtgttc aaaaggagga gaaaattagt 8460
tttttcaaaa atgtatatca aaaccctctt gaacactaag aggtggatct cctttagggg 8520
gaattttttg ttaagtcaaa ggaaaagcat ttgaaacagg gggagaaaat ttcaaatctt 8580
gaaaatgctt tgcaaactct tattcattta cctttgacta tttgcaaaag atcttttgaa 8640
atggatttac aaaaagaatt tgcaaaaaca aaacatgtgg tgcaaacgtg gtccaaaatg 8700
ttaaataaga aagaaacaat ccatgcatat cttgtaagta gttatattgg ctcaattcca 8760
agcaaccttt acacttacat tatgcaaact agttcaatta tgcacttcta tatttgcttt 8820
ggtttgtgtt ggcatcaatc accaaaaagg gggagattga aagggaatta ggcttacacc 8880
tagttcctaa ataattttgg tggttgaatt gaccaacaca aataattgga ctaactagtt 8940
tgcccaagtg tatagattat acaggtgtaa aaggttcaca ctcagccaat aaaaagacca 9000
agttttggat tcaacaaagg agcaaagggg caaccgaagg cacccctggt ctggcgcacc 9060
ggactgtccg gtgtgccacc ggacatgtcc ggtgcaccag ggggactcag actcaaactc 9120
gccaccttcg ggaatttcca gaggcgactc ggctataatt caccggactg tccggtgtac 9180
accggacatg tccggtgctc caaggaaggt cggcctcagg aactcgccag cctcgggttt 9240
tctccctcgc cgctccgcta taattcaccg gactgtccgg tgtgcaccgg actgtccggt 9300
gcaacctcgg agcaacggct acttcgcgcc aacggctacc tgcaacggca tttaatgcgc 9360
gcgcagcacg cgcaggagtc agaatcgccc atgctggcac accggacagc aaacagtaca 9420
tgtccggtgt gcaccggaca cccaggtggg cccacaagtc agaagctcca acggtcagaa 9480
tccaacggca gtgatgacgt ggcagggggc accggactgt ccggtgtgca ccggactgtc 9540
cggtgcgcca tcgaacagac agcctcccaa cggccacttt tggtggttgg ggctataaat 9600
accccaacca ccccaccatt cattgcatcc aagttttcca cttctcaacc acttacaaga 9660
gctaggcatt caattctaga cacacccaaa gtgatcaaat cctctccaat tcaacacaaa 9720
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tcaattcatc aatcttaaca agcaaatcaa cattatcatc tctaagattg ggaattgaaa 51300
catcaccaaa tatgtgaatc aaccttaa 51328
<210> 107
<211> 58
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 107
cactgtgcgt cctctgcagg cagttgttga catgagcgca tcgtcactgc tgaatcgc 58
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- 5번 염색체 상에서 서열번호 106의 뉴클레오타이드 1680번 내지 3338번으로 기재된 opie2 분자 마커와 서열번호 106의 뉴클레오타이드 43,275번 내지 45,086번으로 기재된 gag 분자 마커 사이에 위치하는 옥수수 염색체 표적 부위로서, 이종성 핵산을 포함하는 옥수수 염색체 표적 부위.
- 제1항에 있어서, 상기 표적 부위가 서열번호 106의 뉴클레오타이드 25,454번과 25,513번 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 옥수수 염색체 표적 부위.
- 제1항에 있어서, 상기 표적 부위가 서열번호 106의 뉴클레오타이드 5,454번 내지 25,454번에 의해 5' 플랭킹되고, 서열번호 106의 뉴클레오타이드 25,513번 내지 45,513번에 의해 3' 플랭킹되는 것을 특징으로 하는 옥수수 염색체 표적 부위.
- 5번 염색체 상에서 서열번호 106의 뉴클레오타이드 1680번 내지 3338번으로 기재된 opie2 분자 마커와 서열번호 106의 뉴클레오타이드 43,275번 내지 45,086번으로 기재된 gag 분자 마커 사이의 위치에 이종성 핵산을 삽입함을 포함하는 유전자전이 (transgenic) 옥수수 식물의 생산 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 이종성 핵산이 5번 염색체 상에서 서열번호 106의 뉴클레오타이드 25,454번과 25,513번 사이에 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 삽입된 이종성 핵산이 서열번호 106의 뉴클레오타이드 5,454번 내지 25,454번에 의해 5' 플랭킹되고, 서열번호 106의 뉴클레오타이드 25,513번 내지 45,513번에 의해 3' 플랭킹되는 것을 특징으로 하는 방법.
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