MX2010008977A - Adn genomico vegetal flanqueador de evento spt y metodos para identificar el evento spt. - Google Patents

Abstract

Se proveen composiciones y métodos relacionados con plantas transgénicas que comprenden tecnología de producción de semillas. Específicamente, se proveen plantas de maíz que contienen un evento E6611.32.1.38 que confiere tecnología de producción de semillas. La planta que aloja el evento E6611.32.1.38 en la citada ubicación cromosómica comprende las uniones genómicas/transgénicas descritas. El ADN genómico transgénico flanqueador del evento integrado E6611.32.1.38 se puede usar para diseñar ensayos que serán específicos para el evento E6611.32.1.38. La caracterización del sitio de inserción genómico del evento E6611.32.1.38 provee una eficiencia de cultivo mejorada y permite el uso de marcadores moleculares para rastrear la inserción transgénica en la población de reproducción y su progenie. Se proveen diversos métodos y composiciones para la identificación, la detección y el uso del evento de maíz E6611.32.1.38.

Description

ADN GENÓMICO VEGETAL FLANQUEADOR DE EVENTO SPT Y MÉTODOS PARA IDENTIFICAR EL EVENTO SPT CAMPO DE LA INVENCIÓN Las realizaciones de la presente invención se relacionan con el campo de la biología molecular vegetal. Más específicamente, las realizaciones de esta invención se relacionan con plantas de maíz transgénicas que contienen un evento de tecnología de producción de semillas (SPT, Seed Production Technology) y ADN genómico vegetal flanqueador de la secuencia transgénica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se conoce que la expresión de genes foráneos en plantas es influenciada por su ubicación en el genoma vegetal, quizás debido a la estructura de la cromatina (por ejemplo, heterocromatina) o de la proximidad de los elementos reguladores transcripcionales (por ejemplo, reforzadores) próximos al sitio de integración (Weising, y otros, (1988) Ann. Rev. Genet 22:421—477). Al mismo tiempo, la presencia del transgén en diferentes ubicaciones en el genoma influencia el fenotipo completo de la planta en diferentes formas. Por esta razón, a menudo es necesario examinar un gran número de eventos para poder identificar un evento caracterizado por la expresión óptima de un gen de interés introducido. Por ejemplo, se ha observado en las plantas y en otros organismos que puede existir una amplia variación en los niveles de expresión de un gen introducido entre los eventos. También pueden existir diferencias en los patrones de expresión temporales y espaciales, por ejemplo, diferencias en la expresión relativa de un transgén en varios tejidos vegetales, que puede no corresponder a los patrones esperados a partir de los elementos reguladores transcripcionales en la construcción del gen introducido. También se observa que la inserción del transgén puede afectar la expresión génica endógena. Por estas razones, es común producir cientos a miles de diferentes eventos y examinar aquellos eventos para detectar un solo evento que tenga niveles de expresión transgénica y patrones deseados para fines comerciales. Un evento que tenga niveles o patrones deseados de expresión transgénica es útil para introgredir el transgén en otros entornos genéticos por cruzamiento sexual usando métodos convencionales de reproducción. La progenie de dichas cruzas mantiene las características de la expresión transgénica del transformante original. Esta estrategia se usa para asegurar la expresión génica confiable en un número de variedades que se adaptan bien a las condiciones de cultivo locales.

Sería ventajoso poder detectar la presencia o ausencia de un evento particular en una planta o semilla, o progenie de dichas plantas o semillas, no solamente con respecto al transgén en sí mismo, sino también con respecto a su ubicación en el genoma de una semilla o planta huésped. Sería particularmente ventajoso poder detectar la presencia de un evento para determinar si la progenie de una cruza sexual contiene un transgén de interés. Asimismo, un método para detectar un evento particular podría ayudar a cumplir con las reglamentaciones que requieren aprobación pre-mercado y rotulación de alimentos derivados de plantas de cultivos recombinantes, o para uso en el monitoreo ambiental, monitoreo de rasgos en cultivos en el campo, o monitoreo de productos derivados de una cosecha de cultivo, así como también para uso en asegurar el cumplimiento de las partes sujetas a términos reglamentados o contractuales. Los métodos de detección específico de eventos pueden identificar una unión única entre el ADN insertado y el genoma receptor.

BREVE SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN El maíz ha sido modificado mediante la inserción del evento SPT como se describe en la presente. Las descripciones relevantes también fueron provistas en la Publicación de solicitud de patente estadounidense Número US2009/0038026; y en la Publicación de solicitud de patente estadounidense Número 2006/0288440. Los elementos genéticos en el T-ADN de PHP24597, usados para crear el evento E6611.32.1.38, se resumen en la Tabla 12.

Se proveen composiciones y métodos relacionados con plantas de maíz transgénicas que contienen el ADN exógeno específico que fue introducido mediante transformación estándar del maíz, que se citan en la presente como "evento de tecnología de producción de semillas (SPT)" o "evento E6611.32.1.38" o "E6611.32.1.38" o "evento DP-32138-1" o "DP-32138-1" o "evento 32138" o "32138". Las plantas o semillas transformadas también se pueden citar como "32138" o "maíz 32138". También se proveen construcciones útiles para generar eventos transgénicos, y materiales y métodos útiles para identificar eventos transgénicos particulares que generan plantas transgénicas que comprenden el evento SPT.

También se proveen las semillas depositadas con Número de Depósito de Patente de ATCC PTA-9158 y plantas, células vegetales, partes vegetales, productos vegetales y granos derivados de las mismas. El(los) solicitante(s) ha(n) hecho un depósito de al menos 2500 semillas de evento de maíz 32138 (designado como E6611.32.1.38) con el American Type Culture Collection (ATCC®), Manassas, VA 20110-2209 USA, el 15 de abril del 2008, y los depósitos fueron asignados con el Número de Depósito de ATCC PTA-9158. Estos depósitos se mantendrán bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes. Estos depósitos se realizaron meramente a conveniencia de las personas versadas en el arte y no implican la aceptación de que se requiere un depósito de acuerdo con el Código Estadounidense 35 U.S.C. §112. Las semillas depositadas en ATCC el 15 de abril del 2008 se tomaron del depósito mantenido por Pioneer Hi-Bred International, Inc., 7250 NW 62 Avenue, Johnston, IA 50131-1000. El acceso a este depósito estará disponible durante la vigencia de la solicitud para el Comisario de Patentes y Marcas y las personas determinadas por el Comisario que tengan autorización, ante un pedido. Antes la aprobación de cualquiera de las reivindicaciones de la solicitud, el(los) solicitante(s) hará disponible al público, en virtud del Código 37 C.F.R. §1.808, la(s) muestra(s) del depósito realizado. Este depósito de semillas del evento de maíz 32138 se mantendrá en el depositorio en ATCC, que es un depositorio público, durante un período de 30 años, o 5 años después del pedido más reciente, o durante el período en vigencia de la patente, cualquiera fuese el más extenso, y será reemplazo si se torna no viable durante ese período. Además, el(los) solicitante(s) ha(n) alcanzado todos los requisitos del Código Estadounidense 37 C.F.R. §§1.801 - 1.809, incluyendo proveer la indicación de la viabilidad de la muestra al realizar el depósito. El(los) solicitante(s) no tiene(n) autoridad para anular cualquier restricción impuesta por la ley sobre la transferencia de material biológico o su transporte en el comercio. El(los) solicitante(s) no tiene(n) autoridad para anular cualquier infracción de sus derechos otorgados bajo esta patente o los derechos aplicables al evento 32138 bajo el Acta de Protección de Variedades Vegetales (7 USC 2321 , y siguientes). Se prohibe la multiplicación no autorizada de semillas. La semilla puede ser regulada.

Una realización adicional de la invención se relaciona con las secuencias flanqueadoras específicas descritas en la presente, que se pueden usar para desarrollar métodos de identificación específicos de E6611.32.1.38 en muestras biológicas. Otras realizaciones se refieren a las regiones flanqueadoras de borde izquierdo y/o borde derecho del E6611.32.1.38, que se pueden usar para el desarrollo de sondas y cebadores específicos. Otra realización de la invención se refiere a los métodos de identificación de la presencia de E6611.32.1.38 en muestras biológicas que se basan en el uso de dichas sondas o cebadores específicos.

De acuerdo con otra realización de la invención, se proveen los métodos para detectar la presencia de ADN correspondiente al evento E6611.32.1.38 en una muestra. En una realización particular, los métodos comprenden: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con un conjunto de cebadores de ADN que, cuando se usa en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico extraído de una planta que comprende el evento E6611.32.1.38, produce un amplicón que diagnostica el evento E6611.32.1.38; (b) realizar a reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de esta manera el amplicón y (c) detectar el amplicón.

Una molécula de ADN que comprende la región de inserción flanqueadora/transgénica novedosa, por ejemplo, la secuencia indicada en la Figura 11 , o una molécula homologa o complementaria a la misma, es una realización de esta invención.

Las realizaciones adicionales comprenden secuencias de ADN que comprenden las regiones flanqueadoras novedosas y las regiones flanqueadoras de inserción/transgénicas de la SEQ ID NO: 1 o Figura 11. Las secuencias de ADN que comprenden una longitud suficiente de polinucleótidos de secuencia de inserción transgénica y una longitud suficiente de polinucleótidos de secuencia genómica de maíz/flanqueadora de SEQ ID NO: 1 o Figura 11 que son útiles como secuencias cebadoras para la producción de un diagnóstico de producto amplicón para plantas que comprenden el evento E6611.32.1.38 son realizaciones adicionales de la invención.

Otras realizaciones de la invención incluyen las secuencias de ADN que comprenden al menos 11 o más nucleótidos de la porción transgénica de la secuencia de ADN de la región T-ADN del maíz 32138, o complementos del mismo, y una longitud similar de la secuencia de ADN de maíz flanqueadora indicada en la SEQ ID NO: 1 o Figura 11 , o complementos de la misma. Estas secuencias de ADN pueden ser útiles como cebadores de ADN en métodos de amplificación de ADN. Los amplicones producidos usando estos cebadores son diagnóstico para el evento E6611.32.1.38. Por ende, las realizaciones de la invención también incluyen los amplicones producidos por los cebadores de ADN homólogos o complementarios a la región T-ADN transferida del maíz 32138 individual o en combinación con las secuencias flanqueadoras identificadas.

De acuerdo con otra realización de la invención, se proveen los métodos para detectar la presencia de una molécula de ADN correspondiente al evento E661 1.32.1.38 en una muestra, dichos métodos comprenden: (a) poner en contacto la muestra que comprenden el ADN extraído de una planta con una sonda de ADN, dicha sonda comprende una molécula que se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación con ADN extraído del evento E6611.32.1.38 y no se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación con un ADN de planta control; (b) someter la muestra y la sonda bajo condiciones rigurosas de hibridación y (c) detectar hibridación de la sonda al ADN. Más específicamente, otra realización de la invención comprende métodos para detectar la presencia de una molécula de ADN correspondiente al evento E661 1.32.1.38, evento en una muestra; dichos métodos consisten en (a) poner en contacto la muestra, que comprende ADN extraído de una planta de maíz, con una molécula de sonda de ADN que consiste de secuencias que son únicas para el evento, por ejemplo, secuencias de unión, en donde dicha molécula de sonda de ADN se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación con ADN extraído de una planta que comprende el evento de maíz E6611.32.1.38 y no se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación con un ADN de planta control de maíz; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones rigurosas de hibridación y (c) detectar hibridación de la sonda al ADN.

Otra realización de la invención se relaciona además con un kit de detección de ADN para identificar el Evento E661 1.32.1.38 en muestras biológicas. El kit comprende un primer cebador que reconoce específicamente la región flanqueadora de borde izquierdo o derecho del E661 1.32.1.38, y un segundo cebador que reconoce específicamente una secuencia en el ADN foráneo del E661 1.32.1.38, para uso en un protocolo de identificación de PCR. Otra realización de la invención se relaciona con un kit para identificar el evento E661 1.32.1.38 en las muestras biológicas; dicho kit comprende una sonda específica que tiene una secuencia que corresponde o es complementaria a, una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con una región específica del evento E661 1.32.1.38. La secuencia de la sonda corresponde a una región específica que comprende parte de la región flanqueador 5' o 3' del evento E661 1.32.1.38.

Otras realizaciones de la invención se relacionan con usar los métodos y kits comprendidos por las realizaciones de la presente invención para diferentes fines, tal como, mas sin limitarse a, los siguientes: identificar el evento E6611.32.1.38 en plantas, material vegetal o productos tales como, mas sin limitarse a, alimentos o productos alimenticios (frescos o procesados) que comprenden o derivan de material vegetal; identificar el material vegetal transgénico para los fines de segregación entre el material transgénico y no transgénico; y determinar la cantidad de material vegetal que comprende el evento de maíz E6611.32.1.38. Los kits también pueden contener los reactivos y materiales necesarios para el funcionamiento del método de detección.

En otro aspecto, la presente invención provee un método para producir plantas progénicas que comprenden el Evento E6611.32.1.38. Las plantas progénicas pueden ser plantas endogámicas o híbridas. En otra aplicación, la presente invención provee un método para realizar reproducción marcador-asistida para el Evento E66 .32.1.38. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se provee una planta de maíz transformada en forma estable que comprende el Evento E6611.32.1.38.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra un mapa plásmido de PHP24597. El tamaño del plásmido es de 52869 bp.

La Figura 2 ilustra un mapa de la región de T-ADN del plásmido PHP24597. Las ubicaciones de las sondas utilizadas se ilustran como cuadrados en la parte inferior del mapa y se identifican a continuación: Número Nombre de la sonda 1 promotor 5126 2 Ms45 3 promotor Pg47 4 zm-bt1 5 zm-aa1 6 terminador In2-1 7 reforzador 35S 8 promotor Ltp2 9 DsRed2 10 terminador pinll La Figura 3 ilustra un mapa de la inserción en el maíz DP-32138-1 y un esquema de la digestiones de restricción de la inserción basado en los datos del análisis Southern blot de este estudio. Se indican los sitios enzimáticos de restricción Bam I, Bgí W, Bmt I, EcoR I, Hinú III, y Xho I. El análisis de Southern blot indicó una sola copia del T-ADN PHP24597 insertado en el genoma del maíz. Las ubicaciones de los sitios enzimáticos fuera de la región del T-ADN no deben escalar. Un asterisco (*) indica que las ubicaciones relativas de estos sitios enzimáticos son inciertas debido al gran tamaño de los fragmentos generados a partir de estos sitios. Las líneas verticales punteadas indican los sitios BamH I y Bgl II ubicados fuera de la unión de borde izquierdo que demostraron digestión bloqueada en los Southern blots.

La Figura 4 ilustra un diagrama esquemático de PHP24597 sin sitios de restricción. La Figura 5 ilustra un diagrama esquemático de la región del T-ADN de PHP24597, indicando la región genómica Ms45 y los genes zm-aa1 y DsRed2(Alt1 ) junto con sus respectivos elementos reguladores. El tamaño del T-ADN es de 9920 bp.

La Figura 6 ilustra un mapa esquemático del T-ADN del plásmido PHP24597 con la ubicación de cebadores (08-0-2544/08-0-2582) usada para PCR construcción-específico. La Figura no se dibuja a escala. El tamaño del T-ADN es de 9950 bp.

La Figura 7 muestra los resultados del análisis de PCR construcción-específico del ADN de la hoja del maíz 32138 y maíz de control no modificado genéticamente. La amplificación por PCR se realizó con un conjunto de cebadores 08-0-2544/08-0-2582 que dirigen la unión única de promotor 5126 / gen s45 del T-ADN PHP24597 presente en el maíz 32138. El tamaño esperado del amplicón es de 233 bp. Las muestras fueron cargadas como sigue: Asignaciones de corrida: Corrida Muestra 11 planta de maíz 3 32138 12 planta de maíz 4 32138 13 planta de maíz 5 32138 14 En blanco 15 Control no templado 16 En blanco 17 PHP24597 8 En blanco 9 planta de maíz 1 32138 10 planta de maíz 2 32138 La Figura 8 muestra los resultados del análisis de PCR de gen invertasa del maíz del ADN de la hoja del maíz 32138 y el maíz de control no modificado genéticamente. La amplificación por PCR del gen invertasa de maíz endógeno con el conjunto de cebadores 02-O-197/02-O-198, que dirige el gen invertasa de maíz, se usó como control positivo para amplificación por PCR. El tamaño esperado del amplicón es de 225 bp. Las muestras fueron cargadas como sigue: Asignaciones de las corridas: La Figura 9 muestra la sensibilidad del análisis por PCR para el maíz 32138 para las muestras del ADN de hoja.

La amplificación por PCR se realizó con un conjunto de cebadores 08-0-2544/08-0-2582 que dirigen la unión única del promotor 5126 / gen Ms45 del T-ADN PHP24597 presente en el maíz 32138. El tamaño esperado del amplicón es de 233 bp. Las muestras fueron cargadas de la siguiente manera con cantidad reducida de ADN de maíz 32138 (Corridas 3-10), y ADN de control no modificado genéticamente (Corrida 12).: Asignaciones de las corridas La Figura 10 es una representación esquemática de las regiones de borde genómicas y de inserción secuenciadas en el maíz 32138. El diagrama indica los fragmentos de PCR generadas a partir del ADN genómico del maíz 32138 que se clonaron y secuenciaron: Fragmento A (07-0-2286/07-0-2277), Fragmento B (08-0-2329/08-0-2398), Fragmento C (08-0-2402/07-0-2024), Fragmento D (08-0-2505/08-0-2504) y Fragmento E (08-0-2408/08-0-2526). La línea punteada vertical representa la unión de inserción/borde genómico. Los Fragmentos F (08-0-2528/08-0-2538) y G (08-0-2539/08-0-2530) representan las regiones de borde genómicas 5' y 3', respectivamente. La Figura 10 no se dibuja a escala.

La Figura 1 1 ilustra la secuencia de las regiones de borde genómicas y de inserción del T-ADN en el maíz 32138. Las regiones de borde genómicas 5' y 3' son subrayadas: bp 1 a 21 14 y bp 1 19997 a 13998, respectivamente. La corriente ascendente en forma directa de la inserción completa en las posiciones 21 15-1 1996, dentro de la "región de borde genómica" es una inserción parcial del T-ADN, como se ilustra en la Figura 15.

La Figura 12 muestra los resultados del análisis por PCR de las regiones de borde genómicas 5' y 3' en el maíz 32138 y las plantas control de maíz. 12A: el par de cebadores 08-0-2528/08-0-2538 amplifica un producto de PCR (294 bp) del AND genómico flanqueador 5'. Las muestras fueron cargadas como sigue: 12B: el par de cebadores 08-0-2539/08-0- 2530 amplifica un producto de PCR (297 bp) de la región de borde genómica 3'. Las muestras fueron cargadas como sigue: La Figura 13 es un mapa esquemático del plásmido PHP24597 que indica los sitios enzimáticos de restricción EcoR I y BamH I con las posiciones de los pares de base. Las regiones de borde derecho y borde izquierdo flanquean el T-ADN (Figura 2) que se espera sea transferido durante la transformación mediada por Agrobacterium. La ubicación de las sondas usadas para análisis Southern está indicada como letras en cuadrados dentro del mapa plásmido. A: sonda de RB; B: sonda de LB; C: sonda de spc; D: sonda de virG; E: sonda de tet. Las ubicaciones de enzimas adicionales usadas para análisis son las siguientes: La Figura 14 es un mapa esquemático del T-ADN del PHP24597 que indica sitios enzimáticos de restricción para BamH I, Bmt I, EcoR I, y Hind III y las regiones reguladores y codificadoras de Ms45, zm-aa1 y DsRed2(Alt1 ). El tamaño del T-ADN es de 9950 bp.

Las ubicaciones de las sondas utilizadas se ilustran como cuadrados enumerados debajo del mapa y se identifican de la siguiente manera: La Figura 15 es un esquema que muestra en detalla la secuencia flanqueadora 5' y el sitio de inserción. Se proveen las caracterizaciones alternativas de la inserción parcial de 23bp o 27 bp.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 es la región de 13.998 pares de base del maíz 32138, que comprende 2114 bp de la secuencia de borde genómica 5', 2002 bp de la secuencia de borde genómica 3', y 9882 bp del T-ADN insertado del PHP24597.

Las SEQ ID NOs: 2-5 son secuencias cebadoras usadas en las reacciones PCR; véase también la Tabla 17.

Las SEQ ID NOs: 6-19 son secuencias cebadoras usadas en las reacciones PCR; véase también la Tabla 16.

La SEQ ID NO: 20 es la secuencia de aminoácidos deducida de la traducción de los exones empalmados del gen Ms45 del plásmido PHP24597. La proteína MS45 de longitud completa es de 412 aminoácidos de longitud y pesa aproximadamente 47kDa.

La SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos deducida de la traducción del péptido de tránsito zm-bt1 + región zm-aa1 del plásmido PHP24597. El producto de traducción completo, incluyendo péptido de tránsito (aminoácidos 1-75) es de 495 aminoácidos de longitud y pesa aproximadamente 54 kDa. La proteína ZM-AA1 procesada, con el péptido de tránsito extraído, es de 420 aminoácidos de longitud y pesa aproximadamente 46 kDa.

Las SEQ ID NOS: 22 y 23 son cebadores delanteros y traseros, respectivamente, para un método qPCR para detectar el evento 32138.

La SEQ ID NO: 24 es la secuencia para una sonda marcada por fluorescencia para un método qPCR para detectar el evento 32138.

La SEQ ID NO: 25 es un amplicón obtenido usando las SEQ ID Nos: 22-24 en el método de PCR para detectar el evento 32138. El amplicón empalma la unión 3'.

Las SEQ ID NOS: 26 y 27 son cebadores delanteros y traseros, respectivamente, para un método basado en gel para detectar el evento 32138.

La SEQ ID NO: 28 es un amplicón obtenido usando las SEQ ID Nos: 26 y 27 en el método basado en gel para detectar el evento 32138. El amplicón empalma la unión 3'.

Las SEQ ID Nos. 29 y 30 son cebadores delanteros y traseros, respectivamente, para la detección del evento 32138.

La SEQ ID No: 31 es la secuencia para una sonda marcada por fluorescencia para detección del evento 32138.

SEQ ID NO: 32 es un amplicón obtenido usando las SEQ ID Nos: 29-31 para detectar el evento 32138.

La SEQ ID NO: 33 es la secuencia de aminoácidos deducida de la traducción del gen DsRed2(Alt1) del plásmido PHP24597. La proteína DsRED2 es de 225 aminoácidos de longitud y pesa aproximadamente 26 kDa.

La SEQ ID NO: 34 representa el T-ADN del PHP24597 con las repeticiones de los bordes derecho e izquierdo indicadas. La descripción y posición de los elementos genéticos se provee en la Tabla 12.

La SEQ ID NO: 35 ilustra la secuencia codificadora de DsRed2(Alt1) como fue indicada.

La SEQ ID NO: 36 ilustra una secuencia de inserción parcial y flanqueadora de borde izquierdo del evento 32138.

La SEQ ID NO: 37 ilustra una secuencia de inserción parcial y flanqueadora de borde derecho del evento 32138.

ABREVIATURAS Ciertas abreviaturas utilizadas en la presente, incluyen las siguientes: 5126 Gen antero-específico del maíz Bp Par de base DIG Digoxigenina ID identificador In2-1 Gen bencenosulfonamida-inducible 2-1 del maíz Kb Kilobase o par de kilobase LB Borde del T-ADN izquierdo Ltp2 Gen de proteína 2 de transferencia de lípidos aleurona- específico de Hordeum vulgare Ms45 Gen restaurador de fertilidad del maíz Ms45 genómico Gen Ms45 y región no traducida 3' asociada NaOH Hidróxido de sodio NCBI Centro Nacional de Información Biotecnológica PCR Reacción en cadena de la polimerasa pin\\ Gen inhibidor de la proteinasa II del Solanum tuberosum RB Borde del T-ADN derecho SDS Dodecilsulfato sódico SSC 0,015 M de citrato de sodio, 0,15 M de cloruro de sodio, pH 7,0 T-ADN ADN transferido zm-aa1 Versión truncada del gen a-amilasa del maíz zm-bt1 Péptido de tránsito del gen Brittle-1 del maíz DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las siguientes definiciones y métodos se proveen para definir la presente invención y guiar a las personas versadas en el arte en la práctica de la presente invención. A menos que se indique lo contrario, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por parte de las personas de conocimiento común en el arte relevante.

Como se usa en la presente, el término "evento E661 1.32.1.38 específico" se refiere a una secuencia de polinucleotidos adecuada para identificar en forma discriminada el evento E661 1.32.1.38 en las plantas, material vegetal, o en productos tales como, mas sin limitarse a, alimentos o productos alimenticios (frescos o procesados) que comprenden o derivan de, material vegetal.

Como se usa en la presente, el término "maíz" es cualquier planta de maíz que incluye todas las variedades vegetales que se pueden reproducir con el maíz. Como se usan en la presente, el término "planta" incluye las plantas completas, células vegetales, órganos vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejido celular vegetal de los cuales las plantas se pueden regenerar, callos vegetales, matas vegetales y células vegetales que están intactos en las plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutas, tallos, raíces, nervaduras, anteras y similares. Las partes de las plantas transgénicas que se entiende están dentro del alcance de la invención comprenden, por ejemplo, células vegetales, protoplastos, tejidos, callos, embriones así como también flores, tallos, frutas, hojas y raíces que originan plantas transgénicas o su progenie previamente transformadas con una molécula de ADN de la invención y, por ende, que consisten al menos en parte de células transgénicas. El grano intenta representar la semilla madura producida por los criadores comerciales con fines que no sean el cultivo o la reproducción de las especies. La progenie, variantes y mutantes de las plantas regeneradas también están incluidos dentro del alcance de la invención, siempre que estas plantas comprendan un evento E6611.32.1.38. La clase de plantas que se pueden usar en los métodos para la invención por lo general es tan amplia como la clase de plantas superiores aptas para técnicas de transformación, incluyen tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas.

"Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras que anteceden (secuencias no codificadoras 5') y proceden (secuencias no codificadoras 3') la secuencia codificadora. El "gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. El "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias codificadoras y reguladoras que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por ende, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que derivan de diferentes fuentes o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que derivan de la misma fuente, pero dispuestas en forma diferente de la encontrada en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. "Foráneo" se refiere al material que no es normalmente encontrado en la ubicación de interés. Por ende, el "ADN foráneo" puede comprender ADN recombinante y/o introducido de manera nueva, ADN redispuesto de la planta. Los genes foráneos pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que ha sido introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación. Este sitio en el genoma de la planta en donde se ha insertado un ADN recombinante puede ser citado como "sitio de inserción" o "sitio blanco".

"ADN flanqueador" puede comprender ya sea ADN genómico naturalmente presente en un organismo tal como una planta, o ADN foráneo (heterólogo) introducido por medio del proceso de transformación, por ejemplo fragmentos asociados con el evento de transformación. Por lo tanto el ADN flanqueador puede incluir una combinación de ADN nativo y foráneo.

Una "región flanqueadora " o "secuencia flanqueadora " o "región de borde genómica" o "secuencia de borde genómica" como se usa en la presente se refiere a una secuencia de al menos 3, 5, 10, 11 , 15, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 1000, 1500, 2000, 2500 o 5000 pares de base o más, que está ubicada ya sea inmediatamente corriente arriba o corriente abajo de, y contigua con, la molécula de ADN de inserción foránea original. Cuando esta región flanqueadora está ubicada corriente abajo, también puede citarse como "flanco de borde izquierdo" o "flanco 3"' o "región de borde genómica 3"' o "secuencia de borde 3' genómica", y similares. Cuando esta región flanqueadora está ubicada corriente arriba, también puede ser citada como "flanco de borde derecho " o "flanco 5"' o "región de borde genómica 5 " o "secuencia de borde 5' genómica", y similares. Los ejemplos no limitativos de las regiones flanqueadoras del evento E6611.32.1.38 se establecen en la SEQ ID No: 1 (bp 1-2114 y bp 11 ,997-13,998) y la Figura 11 (véanse regiones subrayadas).

Los procedimientos de transformación que llevan a la integración aleatoria del ADN foráneo generarán transformantes que contienen diferentes regiones flanqueadoras características de, y únicas para, cada transformante. Cuando el ADN recombinante es introducido en una planta a través de cruzamiento tradicional, las regiones flanqueadoras por lo general no cambiarán. Los transformantes también contendrán uniones únicas entre una parte del ADN de inserción heterólogo y el ADN genómico, o dos (2) partes de ADN genómico, o dos (2) partes de ADN heterólogo. Una "unión" es un punto en donde dos (2) fragmentos de ADN específicos se unen. Por ejemplo, existe una unión en donde el ADN de inserción se une al ADN flanqueador. Un punto de unión también existe en un organismo transformado en donde dos (2) fragmentos de ADN se unen en forma conjunta de manera que se modifica a partir del encontrado en el organismo nativo. El "ADN de unión" se refiere al ADN que comprende un punto de unión. Los puntos de unión para el evento E32138 son evidentes a partir de la Figura 11 y la Figura 15.

Como se usa en la presente, "heterólogo" con referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que se origina a partir de una especie foránea o, si es de la misma especie, se modifica en forma sustancial de su forma nativa en composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor ligado en forma operable a una secuencia de nucleótidos heterólogo, puede ser de una especie diferente de la que derivó la secuencia de nucleótidos o, si es de la misma especie o especie análoga, el promotor no es naturalmente encontrado como ligado en forma operable a la secuencia de nucleótidos. Una proteína heteróloga puede originarse a partir de especies foráneas o, si es de la misma especie, o especie análoga, es sustancialmente modificada a partir de su forma original.

"Secuencias reguladoras" se refiere a secuencias nucleotídicas ubicadas corriente arriba (secuencias no codificadoras 5'), en o corriente abajo (secuencias no codificadoras 3') de una secuencia codificadora, y que influencia la transcripción, el procesamiento o estabilidad del ARN, o traducción de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.

"Promotor" se refiere a una secuencia nucleotídica capaz de controlar la expresión de una secuencia codificadora o ARN funcional. En general, una secuencia codificadora está ubicada 3' con respecto a una secuencia. La secuencia promotora puede comprender elementos próximos y corriente arriba más dístales. Los elementos corriente arriba más dístales a menudo se citan como reforzadores. En consecuencia, un "reforzador" es una secuencia nucleotídica que puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo para reforzar el nivel de actividad o especificidad de tejido de un promotor. Los promotores pueden estar derivados en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprende segmentos nucleótidos sintéticos. Se entiende por parte de las personas versadas en el arte que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores que pueden hacer que un fragmento de ácido nucleico sea expresado en la mayoría de los tipos celulares, por lo general la mayoría de las veces se citan como "promotores constitutivos". Nuevos promotores de varios tipos útiles en las células vegetales están constantemente siendo descubiertos; numerosos ejemplos pueden ser encontrados en la recopilación realizada por Okamuro y Goldberg, (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. Se reconoce además que, como en la mayoría de los casos, los bordes exactos de las secuencias reguladoras no han sido completamente definidos, los fragmentos de ácido nucleico de diferentes longitudes pueden tener idéntica actividad promotora.

La "secuencia líder de traducción" se refiere a una secuencia nucleotídica ubicada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificadora. La secuencia líder de traducción está presente en la corriente arriba del mARN totalmente procesado de la secuencia de inicio de traducción. La secuencia líder de traducción puede afectar numerosos parámetros que incluyen procesamiento de la transcripción primaria a mARN, estabilidad de mARN y/o eficiencia de traducción. Los ejemplos de secuencias líderes de traducción han sido descritos (Turner y Foster, (1995) Mol. Biotechnol. 3:225-236).

Las "secuencias no codificadoras 3"' se refieren a secuencias nucleotídicas ubicadas corriente debajo de una secuencia codificadora e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras señales reguladores de codificación capaces de afectar el procesamiento de mARN y expresión génica. La señal de poliadenilación por lo general se caracteriza por efectuar la adición tractos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de mARN. El uso de diferentes secuencias no codificadoras 3' es ejemplificado por Ingelbrecht, y otros, (1989) Plant Ce// 1 :671-680.

Una "proteína" o "polipéptido" es una cadena de aminoácidos dispuesta en un orden específico determinado por la secuencia codificadora en un polinucleótido que codifica el polipéptido.

Una "construcción de ADN" es un ensamblado de moléculas de ADN enlazadas en forma conjunta que brinda uno o más casetes de expresión. La construcción de AND puede ser un plásmido que posibilita la auto replicación en una célula bacteriana y contiene varios sitios de restricción de enzima endonucleasa que son útiles para introducir moléculas de ADN que brindan elementos genéticos funcionales, es decir, promotores, reforzadores, intrones, líderes, secuencias codificadoras, regiones de terminación 3', entre otros; o una construcción de ADN puede ser un ensamblado lineal de moléculas de ADN, tal como un cásete de expresión. El cásete de expresión contenido en una construcción de ADN comprende los elementos genéticos necesarios para brindar transcripción de un ARN mensajero. El cásete de expresión se puede diseñar para expresión en células procariontes o eucariontes. Los casetes de expresión de las realizaciones de la presente invención son diseñados para expresión en células vegetales.

Las moléculas de ADN de las realizaciones de la invención pueden estar provistas en casetes de expresión para expresión en un organismo de interés. El cásete puede incluir secuencias reguladoras 5' y 3' enlazadas en forma operable a una secuencia codificadora. "Ligadas en forma operable" intenta significar un enlace funcional entre dos o más elementos. Por ejemplo, un enlace operable entre un polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. La secuencia reguladora enlazada en forma operable puede iniciar y mediar la transcripción del polinucleótido de interés. Los elementos enlazados en forma operable pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se usa para hacer referencia a la unión de dos regiones codificadoras de proteínas, enlazados en forma operable intenta significar que las regiones codificadoras están en el mismo marco de lectura. El cásete puede contener en forma adicional al menos un gen adicional a ser cotransformado en el organismo. En forma alternativa, el(los) gen(es) adicional(es) se puede(n) proveer en múltiples casetes de expresión o múltiples construcciones de ADN. Dicho cásete de expresión puede estar provisto con una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para que la inserción del polinucleótido se realice bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El cásete de expresión puede contener en forma adicional genes marcadores seleccionares.

El cásete de expresión puede incluir en la dirección 5' a 3' de transcripción, una región reguladora transcripcional y traduccional (es decir, un promotor), una región codificadora, y una región de terminación transcripcional y traduccional funcional en plantas. La región reguladora transcripcional (por ejemplo, el promotor) puede ser nativa o análoga o foránea o heteróloga al organismo huésped. En forma adicional, el promotor puede ser la secuencia natural o, en forma alternativa, una secuencia sintética. Los casetes de expresión pueden contener en forma adicional secuencias líder 5' en la construcción del cásete de expresión. Dichas secuencias líderes pueden actuar para afianzar la traducción. Las regiones reguladoras (por ejemplo, promotores, regiones reguladoras transcripcionales, regiones de estabilidad o procesamiento de ARN, intrones, señales de poliadenilación y regiones de terminación traduccional) y/o la región codificadora puede ser nativa/análoga o heteróloga a la célula huésped o una a la otra.

Al preparar el cásete de expresión, varios fragmentos de ADN pueden ser manipulados, a fin de brindar las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, como sea apropiado, en el marco de lectura apropiado. Con este fin, se pueden emplear adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN u otras manipulaciones pueden estar implicadas para brindar los sitios de restricción convenientes, extracción de ADN superfluo, extracción de sitios de restricción, o similares. Con este propósito, pueden estar implicadas la mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, alineamiento, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones. El cásete de expresión también puede comprender un gen marcador seleccionare para la selección de células transformadas. Los genes marcadores se utilizan para la selección de células o tejidos transformados.

Debe entenderse que, como se usa en la presente, el término "transgénico" incluye cualquier célula, línea celular, callos, tejido, parte vegetal o planta, cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia de un ácido nucleico heterólogo incluyendo los transgénicos inicialmente alterados de esta forma así como también los creados por cruzas sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término "transgénico" como se usa en la presente no comprende la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) mediante métodos convencionales de reproducción de plantas o por eventos de ocurrencia natural tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.

Un "evento" transgénico es producido por la transformación de células vegetales con una construcción heteróloga de ADN, que incluye un cásete de expresión de ácido nucleico que comprende un transgén de interés, la regeneración de una población de plantas generada por la inserción del transgén en el genoma de la planta y selección de una planta particular caracterizada por inserción en una ubicación de genoma particular.

Típicamente, un número de células vegetales es transformado, produciendo una población de plantas a partir de la cual se selecciona una planta particular. El término "evento" se refiere al transformante original y progenie del transformante que incluye el ADN exógeno insertado en una ubicación única y particular en el genoma, es decir, evento de ADN. El término "evento" también se refiere a la progenie producida por cruzas sexuales, autopolinización, o cruzamiento retrógrado repetido, en donde al menos una de las plantas usadas en la reproducción es de cualquier generación del transformante original que contiene el ADN del evento.

Un evento está caracterizado en forma fenotípica por la expresión del transgén. A nivel genético, un evento es parte de la conformación genética de una planta. El término "evento" también se refiere a la progenie producida por cruza sexual entre el transformante y otra variedad en donde la progenie incluye el ADN heterólogo. Incluso después del cruzamiento retrógrado repetido a un progenitor recurrente, el ADN insertado y ADN flanqueador del progenitor transformado están presentes en la progenie de la cruza en la misma ubicación cromosómica. El término "evento" también se refiere al ADN del transformante original, que comprende el ADN insertado y la secuencia flanqueadora inmediatamente adyacente al ADN insertado, que se esperaría fuera transferido a una progenie que recibe el ADN insertado que incluye el transgén de interés como resultado de una cruza sexual de una línea progenitora que incluye el ADN insertado (por ejemplo, el transformante original y progenie generada de la autofecundación) y una línea progenitora que no contiene el ADN insertado.

Por ende, un "evento" transgénico es una planta que comprende y está definida por un "ADN de evento". De esta manera, el "Evento E6611.32.1.38" comprende " ADN de Evento E6611.32.1.38". Una planta puede comprender dos o más ADN de eventos diferentes y, por ende, comprender dos o más eventos diferentes. Asimismo, una planta que carece de un determinado evento X de transgén no comprende ese ADN de evento X en cuestión. El ADN de evento puede ser transferido de planta a planta, generación a generación, por cualquier esquema, método o herramienta de reproducción conocidos para las personas versadas en el arte de la reproducción de plantas.

La transformación de las plantas típicamente utiliza un marcador seleccionable y método de selección para distinguir las células transformadas del cultivo de las células no transformadas. En algunos casos, el gen marcador seleccionable permanece en la planta transgénica; en otros casos, es deseable extraer el gen marcador seleccionable u otras secuencias introducidas en el ADN exógeno. La recombinación homologa es un método útil para la deleción de genes marcadores que residen en una planta transgénica (patente US número 6.580.019, incorporada a la presente a modo de referencia en su totalidad). Otra herramienta útil para extraer secuencias de una planta implica el uso de enzimas de recombinasa específicas de sitio y sus sitios blanco específicos de sitio respectivos.

Un número de sistemas de recombinasa específica de sitio diferente se podrían emplear de acuerdo con la presente invención, que incluye, mas no se limita a, el sistema Cre/lox del bacteriófago P1 y el sistema FLP/FRT de levadura. El bacteriófago P1 Cre/lox y los sistemas FLP/FRT de levadura constituyen dos sistemas particularmente útiles para integración o escisión específica de sitio de transgenes. En estos sistemas, una recombinasa (Cre o FLP) interactúa de manera específica con su secuencia de recombinación específica de sitio respectiva (lox o FRT, respectivamente) para invertir o separar las secuencias de intervención. La secuencia para cada uno de estos dos sistemas es relativamente corta (34 bp para lox y 47 bp para FRT) y por ende, conveniente para uso con vectores de transformación. Se ha demostrado que los sistemas de recombinasa de FLP/FRT y Cre/lox funcionan de manera eficiente en células vegetales. En una realización particular, un sistema recombinasa de Cre/lox es empleado para extraer secuencias marcadoras seleccionares, particularmente un gen marcador NPT II flanqueado por los sitios de recombinación de lox P. (Russell, y otros, (1992) Mol. Gen. Genet. 234:45 59).

Se proveen moléculas de ADN que comprenden al menos una parte del ADN de inserción heterólogo y ADN flanqueador genómico de plantas (mencionados en la presente como una "secuencia de unión" o "unión").

El término "ADN de Evento E6611.32.1.38" se refiere a un segmento de ADN que comprende una inserción del T-ADN de la Figura 2 (ver también, bp 21 15-1 1.996 de SEQ ID NO: 1) en una particular ubicación en el genoma y ADN flanqueador adyacente que se esperaría fuera transferido a una planta progénica de una planta progenitora que contiene el ADN insertado. Más específicamente, el ADN del evento E661 1.32.1.38 también se refiere a cada una de las regiones de ADN que incluyen una interfaz del ADN genómico nativo de la planta y el ADN transgénico integrado en el genoma de la planta, por ejemplo, una región alrededor de una interfaz en donde el extremo 5' están en el ADN genómico nativo y el extremo 3' está en el ADN transgénico integrado. Asimismo, la secuencia del ADN exógeno puede ser alterada mientras reside en su ubicación particular en un genoma huésped, por ejemplo, una parte de la secuencia puede ser cambiada, delecionada o amplificada y aún constituir dicho ADN del evento, siempre que dicho ADN exógeno continúe residiendo en la misma ubicación en el genoma.

Una planta E661 1.32.1.38 puede ser reproducida primero cruzando sexualmente las primeras y segundas plantas progenitoras. La primera planta progenitora es una planta cultivada a partir de la planta E661 1.32.1.38 transgénica o progenie de la misma, es decir, derivada de la transformación con los casetes de expresión de las realizaciones de la presente invención que confieren tecnología de producción de semillas. La primera planta progenitora es polinizada por una segunda planta progenitora, produciendo de esta manera una pluralidad de primeras plantas progénicas, y se selecciona una primera planta progénica que comprende el evento SPT. La primera planta progénica puede autofecundarse, produciendo de esta manera una pluralidad de segundas plantas progénicas; y a partir de las segundas plantas progénicas se selecciona una planta que comprende el evento SPT. Estos pasos pueden incluir de manera adicional el cruzamiento retrógrado de una planta progénica que comprende el evento SPT a la segunda planta progenitora o a una tercera planta progenitora, produciendo de esta manera una planta que comprende el evento SPT. El evento SPT se transmite a través de los gametos hembra, no los gametos macho.

Dos plantas transgénicas diferentes también pueden cruzarse sexualmente para producir una descendencia que contiene dos genes exógenos de segregación independiente. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigotas para ambos genes exógenos. El cruzamiento retrógrado de una planta progenitora y el cruzamiento con una planta no transgénica también están contemplados, como lo está la propagación vegetativa. Las descripciones de otros métodos de reproducción que son comúnmente usados para diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de las varias referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox, ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

El término "germoplasma" se refiere a un individuo, un grupo de individuos, o un clon que representa el genotipo, variedad, especie o cultivo, o el material genético de los mismos.

Una "línea" o "cepa" es un grupo de individuos de idéntico parentesco que por lo general son endogámicos a varios grados y que por lo general son isogénicos o casi isogénicos.

Las líneas de maíz endogámicas son típicamente desarrolladas para uso en la producción de híbridos de maíz y para uso como germpolasma en poblaciones de reproducción para la creación de nuevas y distintas líneas de maíz endogámicas. Las líneas de maíz endogámicas se usan a menudo como blanco para la introgresión de rasgos novedosos a través de técnicas de reproducción tradicional y/o introgresión molecular. Las líneas de maíz endogámicas necesitan ser altamente homogéneas y reproducibles para ser útiles como progenitores de híbridos comerciales. Muchos métodos analíticos se encuentran disponibles para determinar la homocigocidad y la estabilidad fenotípica de las líneas endogámicas.

La frase "plantas híbridas" se refiere a las plantas que se generan de una cruza entre individuos genéticamente diferentes.

Como se usa en la presente "cruzados" o "cruza" quiere significar la fusión de los gametos, por ejemplo, mediante polinización para producir progenie (es decir, células, semillas o plantas) en el caso de las plantas. El término abarca tanto las cruzas sexuales (la polinización de una planta por una planta genéticamente distinta) y la autofecundación (auto-polinización, es decir, cuando el polen y el óvulo son de la misma planta o de plantas genéticamente idénticas).

El término "introgresión" se refiere a la transmisión de un alelo deseado de un locus genético de un entorno genético a otro. En un método, los alelos deseados pueden ser introgredidos a través de la cruza sexual entre dos progenitores, en donde al menos uno de los progenitores tiene el alelo deseado en su genoma.

"Transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el genoma de un organismo huésped, que genera una herencia genéticamente estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados son mencionados como organismos "transgénicos". Los ejemplos de los métodos para transformación vegetal incluyen transformación mediada por Agrobacterium (De Blaere, y otros, (1987) Meth. Enzymol. 143:277) y tecnología de transformación de aceleración de partículas o "disparo de genes" (Klein, y otros, (1987) Nature (London) 327:70-73; Patente US N.° 4.945.050, incorporada a la presente a modo de referencia). Los métodos de transformación adicional se revelan a continuación.

En consecuencia, los polinucleótidos aislados de la invención pueden ser incorporados en construcciones recombinantes, típicamente construcciones de ADN, que son capaces de la introducción en, y replicación en, una célula huésped. Dicha construcción puede ser un vector que incluye un sistema de replicación y secuencias que son capaces de transcripción y traducción de una secuencia codificadora de polipéptido en una determinada célula huésped. Un número de vectores adecuados para transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas ha sido descrito en, por ejemplo, Pouwels, y otros, (1985; Supp. 1987) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Weissbach y Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, (Academic Press, New York); y Flevin, y otros, (1990) Plant Molecular Biology Manual (Kluwer Academic Publishers). Típicamente, los vectores de expresión de plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control transcripcional de las secuencias reguladoras 5' y 3' y un marcador seleccionable dominable. Dichos vectores de expresión de plantas también pueden contener una región reguladora promotora (por ejemplo, una región reguladora que controla expresión inducible o constitutiva, regulada de acuerdo con medio o desarrollo, o especifica de célula o de tejido), un sitio inicial del comienzo de la transcripción, un sitio de fijación a ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de transcripción y/o una señal de poliadenilación.

Una "sonda" es un polinucleótido aislado al cual se une un marcador detectable convencional o una molécula informante, por ejemplo, un isótopo radioactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima. Dicha sonda es complementaria a una hebra de un polinucleótido blanco, por ejemplo, en algunas realizaciones, a una hebra de ADN aislado del evento E6611.32.1.38 ya sea de una planta o de una muestra que incluye ADN del evento. Las sondas incluyen no sólo ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se fijan específicamente a una secuencia de ADN blanco y se pueden usar para detectar la presencia de esa secuencia de ADN blanco.

Como se usa en la presente, los "cebadores" son polinucleótidos aislados que se alinean a una hebra de ADN blanco complementaria por hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ADN blanco, luego se extiende a lo largo de la hebra de ADN blanco mediante una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Los pares de cebadores se refieren a su uso para amplificación de un polinucleótido blanco, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Polimerase Chain Reaction) u otros métodos convencionales de amplificación de ácido nucleico. LA "PCR" o "reacción en cadena de la polimerasa" es una técnica usada para la amplificación de segmentos específicos de ADN (véase las Patentes US Nos. 4.683.195 y 4.800.159; incorporadas en la presente a modo de referencia). Cualquier combinación de los cebadores revelados en la presente se puede usar de manera tal que el par permita la detección de un evento E661 1.32.1.38 o región específica. Los ejemplos no limitativos de los pares de cebadores incluyen SEQ ID NOS: 6 y 7, 8 y 9, 10 y 1 1 , 12 y 13, 14 y 15, 16 y 17 y 18 y 19, como se ilustra en la Tabla 16.

Las sondas y cebadores tienen la longitud de nucleótidos suficiente para fijarse a la secuencia de ADN blanco y detectar de manera específica y/o identificar un polinucleótido que tiene un evento E661 1.32.1.38. Se reconoce que las condiciones de hibridación o condiciones de reacción pueden ser determinadas por el operador para alcanzar este resultado. En general, se usan 5, 8, 1 1 , 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 nucleótidos o más, o entre alrededor de 1 1-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-100, 100-200, 200-300, 300^100, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800 o más nucleótidos de longitud. Dichas sondas y cebadores se pueden hibridar específicamente con una secuencia blanco bajo condiciones rigurosas de hibridación. Las sondas y cebadores pueden tener identidad de secuencia completa de ADN de nucleótidos contiguos con la secuencia blanco, aunque las sondas que difieren de la secuencia blanco de ADN y retienen la habilidad de detectar de manera específica y/o identificar una secuencia blanco de ADN pueden estar diseñadas por métodos convencionales. En consecuencia, las sondas y cebadores pueden compartir alrededor de 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia o complementariedad con el polinucleótido blanco, o pueden diferir de la secuencia blanco por 1 , 2, 3, 4, 5, 6 o más nucleótidos contiguos. Las sondas se pueden usar como cebadores, pero están generalmente diseñadas para fijarse al ADN o ARN blanco y no se usan en un proceso de amplificación.

Los cebadores específicos se pueden usar para amplificar un fragmento de integración para producir un amplicón que se puede usar como una "sonda específica" para identificar el evento E661 1.32.1.38 en muestras biológicas. En forma alternativa, una sonda se puede usar durante la reacción PCR para permitir la detección del evento de amplificación (es decir, una sonda Taqman o una sonda MGB, denominada PCR en tiempo real). Cuando la sonda se híbrida con los polinucleótidos de una muestra biológica bajo condiciones que permiten la fijación de la sonda a la muestra, esta fijación se puede detectar y por ende permitir una indicación de la presencia del evento E6611.32.1.38 en la muestra biológica. Dicha identificación de sonda fijada ha sido descrita en el arte. En una realización, la sonda especifica es una secuencia que, bajo condiciones optimizadas, se híbrida específicamente a una región dentro la región flanqueadora 5' o 3' del evento y comprende también una parte del ADN foráneo contiguo con la misma. La sonda específica puede comprender una secuencia de al menos 80%, entre 80 y 85%, entre 85 y 90%, entre 90 y 95% o entre 95 y 100% idéntica (o complementaria) a una región específica del evento E6611.32.1.38. Un ensayo de PCR en tiempo real cuantitativo para el evento E6611.32.1.38 puede comprender, por ejemplo, el par de cebadores de las SEQ ID NOS: 29 y 30 y la sonda fluorescente de la SEQ ID NO: 31.

Los métodos para preparar y usar sondas y cebadores se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da. ed, vol. 1-3, ed. Sambrook, y otros, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. 1989 (de aquí en adelante, "Sambrook, y otros, 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, y otros, Greene Publishing y Wiley-lnterscience, New York, 1992 (con actualizaciones periódicas) (de aquí en adelante, "Ausubel, y otros, 1992"); e Innis, y otros, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Los pares de cebadores en PCR pueden derivar de una secuencia conocida, por ejemplo, usando programas de computación destinados a tal fin tal como la herramienta de análisis de cebadores en PCR en Vector NTI versión 6 (Informax Inc., Bethesda Md.); Primerselect (DNASTAR Inc., Madison, Wis.) y Primer (Versión 0.5, 1991 , Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Además, la secuencia puede ser visualmente escaneada y los cebadores son manualmente identificados usando lineamientos conocidos por la persona versada en el arte.

Como se usa en la presente, "kit" se refiere a un conjunto de reactivos para llevar a cabo las realizaciones del método de la invención, más particularmente, la identificación y/o la detección del evento E661 1.32.1.38 en muestras biológicas. El kit se puede usar, y sus componentes pueden ser específicamente ajustados, a los fines de control de calidad (por ejemplo, pureza de los lotes de semillas), detección del evento E661 1.32.1.38 en material vegetal, o material que comprende o deriva de un material vegetal, tal como, mas sin limitarse a, alimentos o productos alimenticios. "Material vegetal" como se usa en la presente, se refiere al material que se obtiene o deriva de una planta.

En realizaciones específicas, se provee un kit para identificar el evento E661 1.32.1.38 en una muestra biológica. El kit comprende un primer y un segundo cebador, en donde el primer y el segundo cebador amplifican un polinucleótido que comprende una región específica de ADN flanqueador y/o E661 1.32.1.38. En otras realizaciones, el kit también comprende un polinucleótido para la detección de la región específica de ADN flanqueador y/o E6611.32.1.38. El kit puede comprender, por ejemplo, un primer cebador que comprende un fragmento de un polinucleótido de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4 o 5 en donde el primer o el segundo cebador comparte suficiente identidad de secuencia o complementariedad con el polinucleótido para amplificar dicha región específica de ADN flanqueador y/o E661 1.32.1.38. El par de cebadores puede comprender un fragmento de SEQ ID NO: 1 y un fragmento de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-3 y 6-19. Los cebadores pueden ser de cualquier longitud suficiente para amplificar la región de E6611.32.1.38 que incluye, por ejemplo, al menos 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 15 ó 30 o alrededor de 7-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40^5 nucleótidos o más.

También se proveen kits de detección de ADN que comprenden al menos un polinucleótido que puede detectar de manera específica una región específica de ADN flanqueador y/o E6611.32.1.38, en donde dicho polinucleótido comprende al menos una molécula de ADN de suficiente longitud de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a la SEQ ID NO: 1.

Los cebadores y sondas basados en el ADN flanqueador y secuencias de inserción revelados en la presente se pueden usar para confirmar (y, de ser necesario, para corregir) las secuencias reveladas por métodos convencionales, por ejemplo, por re-clonación y secuenciamiento de dichas secuencias. Los cebadores y sondas de ácido nucleico de la presente invención se hibridan bajo condiciones rigurosas a una secuencia blanco de ADN. Cualquier método convencional de hibridación o amplificación de ácido nucleico puede ser usado para identificar la presencia de ADN de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico o fragmentos de las mismas son capaces de específicamente hibridarse con otras moléculas de ácido nucleico bajo ciertas circunstancias. Como se usa en la presente, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de específicamente hibridarse una a otra si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico anti-paralelo, bicatenario.

En las técnicas de hibridación, se emplea todo o parte de un polinucleótido que se híbrida en forma selectiva a un polinucleótido blanco que tiene un evento específico de E6611.32.1.38. Por "condiciones rigurosas" o "condiciones rigurosas de hibridación" cuando se hace referencia a una sonda de polinucleótido, significa las condiciones bajo las cuales una sonda se híbrida a su secuencia blanco a un grado detectablemente superior que a otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces por sobre el entorno). Con respecto a la amplificación de un polinucleótido blanco (por ejemplo, por PCR) que usa un par de cebadores de amplificación particular, "las condiciones rigurosas" son condiciones que permiten que el par de cebadores se hibride con el polinucleótido blanco al cual un cebador que tiene la secuencia tipo silvestre correspondiente (o su complemento) se fijaría y preferentemente produzca un producto de amplificación identificable (el amplicón) que tiene una región específica E6611.32.1.38 en una reacción de amplificación térmica de ADN. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en distintas circunstancias. Al controlar la rigurosidad de la hibridación y/o condiciones de lavado, se pueden identificar las secuencias blanco que son 100% complementaria con la sonda (sondeo homólogo). En forma alternativa, las condiciones rigurosas se pueden ajustar para permitir que algunas secuencias no combinen para que se detecten niveles más bajos dé identidad (sondeo heterólogo). Por lo general, una sonda es menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud o menos de 500 nucleótidos de longitud.

Como se usa en la presente, una secuencia sustancialmente complementaria o idéntica es un polinucleótido que específicamente se híbrida a la molécula de ácido nucleico con la cual está siendo comparado, o su complemento, respectivamente, bajo condiciones de alta rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad apropiada que promueven la hibridación de ADN, por ejemplo, 6X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido por un lavado de 2XSSC a 50 °C, son conocidas para las personas versadas en el arte o se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Típicamente, condiciones rigurosas para la hibridación y detección serán aquellas en las cuales la concentración de sal es inferior a 1 ,5 M de ion Na, típicamente aproximadamente 0,01 a 1 ,0 de concentración iónica Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente de 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente de 60 °C para sondas largas (por ejemplo, superiores a 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también se pueden alcanzar con el agregado de agentes de desestabilización tales como formamida. Las condiciones de rigurosidad baja ejemplificativas incluyen hibridación con una solución tampón de 30 a 35% de formamida, 1 de NaCI, 1 % de SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en 1X a 2X de SSC (20X SSC = 3,0 M de NaCI/0,3 M de cítrato de trisodio) de 50 a 55 °C. Las condiciones de rigurosidad moderada ejemplificativas incluyen hibridación en 40 a 45% de formamida, 1 ,0 M de NaCI, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en 0,5X a 1X de SSC de 55 a 60 °C. Las condiciones de rigurosidad alta ejemplificativas incluyen hibridación en 50% de formamida, 1 M de NaCI, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en 0,1X de SSC de 60 a 65 °C. En forma opcional, los tampones de lavado puede comprender aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 1% de SDS. La duración de hibridación es generalmente menor a aproximadamente 24 horas, usualmente aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será al menos una duración de tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio.

En las reacciones de hibridación, la especificidad es típicamente la función de lavados post-hibridación, los factores críticos siendo la fuerza iónica y la temperatura de solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, el Tm (punto de fusión térmica) puede ser aproximado de la ecuación de Meinkoth y Wahl, (1984) Anal. Biochem. 138:267- 284: Tm = 81 ,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) - 0,61 (% forma) - 500/L; en donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, la forma % es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de base. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica definida y pH) a la cual el 50% de una secuencia blanco complementaria se híbrida a una sonda perfectamente combinada. La Tm es reducida por aproximadamente 1 °C para cada 1 % de no combinación; por ende, las condiciones de Tm, hibridación, y/o lavado se pueden ajustar para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm se puede reducir 10 °C. Por lo general, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser aproximadamente 5 °C menores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica definida y pH. No obstante, las condiciones severamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1 , 2, 3 ó 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de rigurosidad baja pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11 , 12, 13, 14, 15 ó 20 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Usando esta ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y Tm deseada, las personas versadas en el arte entienden que las variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o lavado están inherentemente descritas. Si el grado deseado de los resultados de no combinación en una Tm de menos de 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), es óptimo incrementar la concentración de SSC para que se pueda usar una temperatura superior. Una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York) y Ausubel, y otros, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York). Véase, Sambrook, y otros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) y Haymes, y otros, (1985) En: Nucleic Acid Hybridization, a Practica! Approach, IRL Press, Washington, D.C.

Como se usa en la presente, se dice que las moléculas exhiben "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas de polinucleótidos es complementaria con un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridarse una a otra con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan alineadas una a otra bajo al menos condiciones convencionales de "baja rigurosidad". En forma similar, se dice que las moléculas son "complementarias" si se pueden hibridar una a otra con estabilidad suficiente para permitir que permanezcan alineadas una a otra bajo condiciones convencionales de "alta rigurosidad". Las condiciones de rigurosidad convencionales son descritas por Sambrook, y otros, 1989, y por Haymes, y otros, In: Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985). Por ende es posible alejarse de la complementariedad completa, siempre que esto no excluya completamente la capacidad de las moléculas de formar una estructura bicatenaria. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, necesita solamente ser suficientemente complementaria en secuencia para poder formar una estructura bicatenaria bajo el solvente particular y las concentraciones de sal empleadas.

Cualquiera de los polinucleotidos y fragmentos y variantes de los mismos empleados en los métodos y composiciones pueden compartir la identidad de secuencia con una región de la inserción de transgén del evento E6611.32.1.38, una secuencia de unión del evento E6611.32.1.38, o una secuencia flanqueadora del evento E6611.32.1.38. Los métodos para determinar la relación de varias secuencias son conocidos. Como se usa en la presente, "secuencia la de referencia" es una secuencia definida usada para comparación de la secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o toda la secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de secuencia de cDNA o gen de longitud completa, o la secuencia de cDNA o gen completa. Como se usa en la presente, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleotidos, en donde la secuencia de polinucleotidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios) comparada con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para alineamiento óptimo de los dos polinucleotidos. En general, la ventana de comparación es de al menos 20 nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o más larga. Las personas versadas en el arte entienden que, a fin de evitar alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleotidos, se introduce típicamente una penalización por espacios y se sustrae del número de combinaciones.

Los métodos para alineamiento de secuencias para comparación son conocidos en el arte. Por ende, la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre cualquiera de las dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitativos de dichos algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller, (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineamiento local de Smith, y otros, (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineamiento mundial de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de alineamiento search-for-local de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y AltschuI, (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264, modificado como en Karlin y AltschuI, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

Las implementaciones por computadora de estos algoritmos matemáticos se puede utilizar para la comparación de las secuencias a fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, mas no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gen (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de programas de GCG Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA). Los alineamientos que usan estos programas se pueden realizar usando los parámetros por defecto. El programa CLUSTAL es bien descrito por Higgins, y otros, (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins, y otros, (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet, y otros, (1988) Ácido nucleicos Res. 16:10881-90; Huang, y otros, (1992) CABIOS 8:155-65 y Pearson, y otros, (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de yers y Miller, (1988) supra. Una tabla de residuos en peso A PAM120, una penalización por espacio de longitud de 12 y una penalización por espacio de 4 se pueden usar con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de AltschuI, y otros, (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y AltschuI, (1990) supra. Las búsquedas de nucleótidos en BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias nucleotídicas homologas a una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de la invención. Las búsquedas de proteínas en BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineamientos con espacios con fines de comparación, se puede usar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en AltschuI, y otros, (1997) Ácido nucleicos Res. 25:3389. En forma alternativa, se puede usar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Véase, AltschuI, y otros, (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTN para secuencias nucleotídicas, BLASTX para proteínas). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov. El alineamiento también se puede realizar manualmente por inspección.

A menos que se indique lo contrario, los valores de similitud/identidad de secuencia provistos en la presente se refieren al valor obtenido usando GAP Versión 10 usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia nucleotídica usando GAP Weight de 50 y Longitud Weight de 3 y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando GAP Weight de 8 y Longitud Weight de 2, y la matriz de puntuación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente de los mismos. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencia que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera un alineamiento que tiene combinaciones de residuo de aminoácidos o nucleótidos idénticas y un porcentaje de identidad de secuencia idéntica cuando se compara con el correspondiente alineamiento generado por GAP Versión 10.

GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza el número de combinaciones y minimiza el número de espacios. GAP considera todos los posibles alineamientos y posiciones de los espacios y crea el alineamiento con el mayor número de bases combinadas y los menores espacios. Permite brindar una penalización por creación de espacios y una penalización por extensión de espacios en unidades de bases combinadas. GAP debe crear una compensación del número de combinaciones de penalización por creación de espacios para cada espacio que inserta. Si se elige una penalización por extensión de espacios mayor a cero, GAP debe, además, crear una compensación para cada vacío insertado de la longitud del espacio multiplicado por la penalización por extensión de espacios. Los valores de penalización por creación de espacios y los valores de penalización por extensión de espacios por defecto en la Versión 10 del Paquete de programas GCG Wisconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias nucleotídicas la penalización por creación de espacios por defecto es 50 mientras que la penalización por extensión de espacios por defecto es 3. Las penalizaciones por creación y por extensión de espacios se puede expresar como un número entero seleccionados de los números enteros que consisten de 0 a 200. En consecuencia, por ejemplo, las penalizaciones por creación y por extensión de espacios puede ser 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más.

GAP presenta un miembro de la familia de los mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún miembro tiene una mejor calidad. GAP muestra cuatro figuras de mérito para alineamientos: Calidad, Proporción, Identidad y Similitud (Quality, Ratio, Identity and Similarity). La Calidad es la métrica maximizada para alinear las secuencias. La Proporción es la Calidad dividida por el número de bases en el segmento más corto. El porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que verdaderamente combinan. El porcentaje de similitud es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que cruzan los espacios se ignoran. Una similitud es puntuada cuando el valor de matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor o igual a 0,50, el umbral de similitud. La matriz de puntuación usada en la Versión 10 del Paquete de programas de GCG Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (véase, Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915).

Como se usa en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando están alineadas para máxima correspondencia por sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa en referencia a las proteínas, se reconoce que las posiciones de residuos que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras, cuando los residuos de aminoácidos están sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por ende, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustaren forma ascendente para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservadoras tienen "secuencia similitud" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son conocidos para las personas versadas en el arte. Típicamente, esto implica la puntuación de una sustitución conservadora como parcial en vez de una combinación total, por ende incrementando el porcentaje de identidad de secuencia. Por ende, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico tiene una puntuación de 1 y una sustitución no conservadora tiene una puntuación de cero, se da a la sustitución conservadora una puntuación entre cero y 1. La puntuación de sustituciones conservadoras es calculada, por ejemplo, como se implemento en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).

Como se usa en la presente, el "porcentaje de identidad de secuencia" es calculado determinando el número de posiciones al cual la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácidos idénticos aparece en ambas secuencias para obtener el número de posiciones combinadas, dividiendo el número de posiciones combinadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100.

Como se usa en la presente, "ADN amplificado" o "amplicón" se refiere al producto de amplificación del polinucleótido de un polinucleótido blanco que es parte de un templado de ácido nucleico. Por ejemplo, para determinar si una planta obtenida de una cruza sexual contiene el evento E6611.32.1.38, el ADN extraído de la muestra de tejido de la planta puede ser sometido a un método de amplificación de polinucleótido usando un par de cebadores de ADN que incluye un primer cebador derivado de la secuencia flanqueadora adyacente al sitio de inserción del ADN heterólogo insertado, y un segundo cebador derivado del ADN heterólogo insertado, para producir un amplicón que diagnostica la presencia del ADN del evento E6611.32.1.38. Por "diagnosticar" se refiere un evento E6611.32.1.38, el uso de cualquier método o ensayo que discrimina entre la presencia y ausencia de un evento E6611.32.1.38 en una muestra biológica. En forma alternativa, el segundo cebador puede derivar de la secuencia de unión. En otras realizaciones, los pares de cebadores pueden derivar de la secuencia flanqueadora en ambos lados del ADN insertado a fin de producir un amplicón que incluye el polinucleótido de inserción entero de la construcción de expresión así como la secuencia flanqueadora de la inserción transgénica. El amplicón es de una longitud y tiene una secuencia que también diagnostica el evento (es decir, tiene un ADN de unión a partir de un evento E6611.32.1.38). El amplicón puede variar en longitud de la longitud combinada de los pares de cebadores más un par de base de nucleótido a cualquier longitud de amplicón producible por un protocolo de amplificación de ADN. Un miembro de un par de cebadores derivados de la secuencia flanqueadora se puede localizar a una distancia de la secuencia de ADN insertado; esta distancia puede variar de un par de base de nucleótido hasta los bordes de la reacción de amplificación, o aproximadamente veinte mil pares de base de nucleótido. El uso del término "amplicón" específicamente excluye los dímeros de cebadores que se pueden formar en la reacción de amplificación térmica de ADN.

La amplificación del ácido nucleico se puede lograr mediante cualquier de los varios métodos de amplificación del ácido nucleico conocidos en el arte, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Una variedad de métodos de amplificación es conocida en el arte y se describe, inter alia, en las Patentes US Nos. 4.683.195 y 4.683.202 y en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis, y otros, Academic Press, San Diego, 1990. Los métodos de amplificación por PCR han sido desarrollados para amplificar hasta 22 Kb del ADN genómico y hasta 42 Kb del ADN del bacteriófago (Cheng, y otros, (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :5695-5699). Estos métodos así como también los otros métodos conocidos en el arte de amplificación de ADN pueden ser usados en la práctica de las realizaciones de la presente invención. Se entiende que un número de parámetros en un protocolo de PCR específico puede necesitar ajustarse a condiciones de laboratorio específicas y puede ser levemente modificado y todavía permitir la recolección de resultados similares. Estos ajustes serán evidentes a las personas versadas en el arte.

El amplicón producido por estos métodos puede ser detectado mediante una pluralidad de técnicas, que incluyen, mas no se limitan a, análisis de bit genético (Nikiforov, y otros, (1994) Nucleic Acid Res. 22:4167-4175) en donde el oligonucleotido del ADN está diseñado para superponer tanto la secuencia de ADN flanqueadora adyacente y la secuencia de ADN insertada. El oligonucleotido es inmovilizado en pocilios de una placa de micropocillos. Después de la PCR de la región de interés (usando un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia flanqueadora adyacente) un producto de PCR monocatenario puede ser hibridado con el oligonucleotido inmovilizado y servir como templado para la reacción de extensión de base individual usando ADN polimerasa y ddNTPs marcados específicos para la próxima base esperada. La lectura puede ser fluorescente o basada en ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia de inserción/flanqueadora debido a la amplificación, hibridación y extensión de base individual exitosas.

Otro método de detección es la técnica de pirosecuenciamiento como lo describe Winge (Innov. Pharma. Tech. 00: 18-24, 2000). En este método, se diseña un oligonucleotido que superpone el ADN adyacente y la unión de ADN de inserción. El oligonucleotido se híbrida con un producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia flanqueadora) y se incuba en presencia de un ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Los dNTP se agregan en forma individual y los resultados de la incorporación generan una señal clara, que es medida. Una señal clara indica la presencia de la secuencia flanqueadora/de inserción del transgén debido a la amplificación, hibridación, y extensión de base múltiple o individual exitosas.

La polarización por fluorescencia como es descrita por Chen, y otros, {Genoma Res. 9:492-498, 1999) es también un método que se puede usar para detectar un amplicón de la invención. Usando este método se diseña un oligonucleótido que superpone la unión de ADN insertada y flanqueadora. El oligonucleótido se híbrida con un producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en la secuencia de ADN insertada y uno en la secuencia de ADN flanqueadora) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa y un ddNTP marcado por fluorescencia. Los resultados de la extensión de base individual genera la incorporación del ddNTP. La incorporación se puede medir como un cambio en la polarización usando un fluorómetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia flanqueadora/de inserción del transgén debido a la amplificación, hibridación y extensión de base individual exitosas.

Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) se describe como un método para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN y se entiende completamente en las instrucciones provistas por el fabricante. Brevemente, se diseña una sonda de oligonucleótido FRET que superpone la unión de ADN flanqueadora y de inserción. La sonda de FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN de inserción y uno en la secuencia genómica flanqueadora) se someten a un ciclo en presencia de una polimerasa termoestable y dNTPs. La hibridación de la sonda FRET genera clivaje y liberación de la fracción fluorescente lejos de la fracción de correlación en la sonda de FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueadora/de inserción del transgén debido a amplificación y hibridación exitosas.

Los faros moleculares han sido desarrollados para uso en la detección de secuencias como se describe en Tyangi, y otros, {Nature Biotech. 14:303-308, 1996). Brevemente, se diseña una sonda de oligonucleótido de FRET que superpone la unión de ADN flanqueadora y de inserción. La estructura única de la sonda de FRET genera que contenga una estructura secundaria que mantiene las fracciones fluorescentes y de correlación en íntima proximidad. La sonda de FRET y cebadores de PCR (un cebador de la secuencia de ADN de inserción y uno en la secuencia flanqueadora) se someten a un ciclo en presencia de una polimerasa termoestable y dNTPs. Después de la amplificación por PCR exitosa, la hibridación de la sonda de FRET con la secuencia blanco genera la extracción de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de las fracciones fluorescentes y de correlación. Se genera una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueadora/de inserción del transgén debido a la amplificación e hibridación exitosas.

Una reacción de hibridación que usa una sonda específica a una secuencia encontrada en el amplicón es otro método más, usado para detectar el amplicón producido por una reacción de PCR.

Muchas modificaciones y otras realizaciones de la invención establecidas en la presente serán evidentes para la persona versada en el arte al cual pertenece la misma, y que tienen el beneficio de las enseñanzas presentadas en esta divulgación y dibujos asociados. Por ende, debe entenderse que la invención no se limita a las realizaciones específicas reveladas y que las modificaciones y otras realizaciones están destinadas a ser incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque en la presente se utilizan términos específicos, se usan solamente en sentido genérico y descriptivo, y no a fin de limitarla.

Se proveen las composiciones y los métodos relacionados con las plantas transgénicas que comprenden el evento SPT. Se proveen, específicamente, las plantas, y más particularmente, las plantas de maíz, que tienen el evento E6611.32.1.38. Una planta de maíz que tiene el evento E6611.32.1.38 ha sido modificada por la inserción del evento de tecnología de producción de semillas. El evento SPT E6611.32.1.38 comprende el promotor 5126 que opera el ADN genómico MS45, el promotor PG47 que opera el ZM-BT1 TP que codifica el péptido de tránsito Brittlel enlazado a ZM-AA1 que codifica alfa-amilasa, y el reforzador CaMV35S combinado con el promotor LTP2 para operar DS-RED2 (ALT1) que codifica una variante de la proteína fluorescente roja de DISCOSOMA sp. (Véase, la Figura 1 ; véase, también, la Solicitud de patente US N.° 11/833.363 presentada el 3 de agosto del 2007, y publicada el 5 de febrero del 2009, como 2009/0038026; y la Publicación de solicitud de patente US N.° 2006/0288440.) La inserción de evento mapea el cromosoma 3 a 84,1 a 84,5, entre marcadores MZA 12392 y MZA 2358. Por ende, una planta que comprende el evento E6611.32.1.38 exhibe capacidad reforzada de tecnología de producción de semillas.

Los polinucleótidos que confieren la tecnología de producción de semillas se enlazan a la misma construcción de ADN y se insertan e una posición caracterizada en el genoma de maíz y, por ende, producir el evento E6611.32.1.38. La planta que aloja el evento E661 1.32.1.38 en la ubicación cromosómica citada comprende las uniones genómicas/transgénicas como se indica en la SEQ ID NO: 1 y Figuras 11 y 15. La caracterización del sitio de inserción genómica del evento E661 1.32.1.38 brinda una eficiencia de reproducción reforzada y permite el uso de marcadores moleculares para rastrear la inserción del transgén en las poblaciones de reproducción y progenie de las mismas. En la presente se proveen varios métodos y composiciones para la identificación, detección, y uso de las plantas, partes vegetales, semillas y productos de granos que contienen el evento de maíz E6611.32.1.38.

En algunas realizaciones, los polinucleótidos que confieren el evento de maíz E6611.32.1.38 se manipulan en una pila molecular. En otras realizaciones, la pila molecular comprende además al menos un polinucleótido transgénico molecular. Dicho polinucleótido puede conferir aspectos adicionales de tecnología de producción de semillas o puede conferir un rasgo no relacionado.

En ciertas realizaciones, la planta se apila con una combinación de secuencias polinucleotídicas de interés a fin de crear plantas con una combinación de rasgos deseada. Un rasgo, como se usa en la presente, se refiere al fenotipo derivado de una secuencia particular o grupos de secuencias. Las combinaciones generadas pueden incluir además múltiples copia de cualquiera o más de los polinucleótidos de interés.

En algunas realizaciones, el evento de maíz E661 1.32.1.38 también se puede combinar con al menos otro rasgo para producir plantas que comprenden además una variedad de combinaciones de rasgos deseadas que incluyen, mas no se limitan a, rasgos deseables para alimento animal tales como contenido de aceite (por ejemplo, Patente US N.° 6.232.529); contenido de aminoácidos balanceado (por ejemplo, hordotioninas (Patente US Nos. 5.990.389; 5.885.801 ; 5.885.802 y 5.703.409; Patente US N.° 5.850.016); alta lisina en cebada (Williamson, y otros, (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO 98/20122) y proteínas de alta metionina (Pedersen, y otros, (1986) J. Biol. Chem. 261 :6279; Kirihara, y otros, (1988) Gene 71 :359 y Musumura, y otros, (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); capacidad de digestión incrementada por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificada (Solicitud de patente US N.° 10/053.410, presentada el 7 de noviembre de 2001); y tioredoxinas (Solicitud de patente US N.° 10/005.429, presentada el 3 de diciembre de 2001 )); cuya divulgación se incorporan en la presente a modo de referencia. Las combinaciones de rasgos deseados también incluyen contenido de ácido linolénico bajo; véase, por ejemplo, Dyer, y otros, (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:224-230 y contenido de ácido oleico alto; véase, por ejemplo, Fernández-Moya, y otros, (2005) J. Agrie. Food Chem. 53:5326-5330.

En otras realizaciones, el evento de maíz E661 1.32.1.38 también se puede combinar con otros rasgos deseados tales como, por ejemplo, genes de desintoxicación de fumonisina (Patente US N.° 5,792,931), genes de resistencia a enfermedad y virulencia (Jones, y otros, (1994) Science 266:789; Martin, y otros, (1993) Science 262:1432; Mindrinos, y otros, (1994) Cell 78:1089) y rasgos deseables para procesamiento o productos de proceso tales como aceites modificados (por ejemplo, genes desnaturase de ácido graso (Patente US N.° 5.952.544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG fosforilasas (AGPase, ADPG pyrophosphorylases), sintasas de almidón (SS, Starch Synthases), enzimas ramificadas de almidón (SBE, Starch Branching Enzymes) y enzimas no ramificadas de almidón (SDBE, Starch Debranching Enzimas)); y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, Patente US N.° 5.602.321 ; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert, y otros, (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) que facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs)); cuya divulgación se incorpora en la presente a modo de referencia. Se podría combinar los polinucleótidos de tecnología de producción de semillas con polinucleótidos que brindan rasgos agrónomos tales como esterilidad masculina (por ejemplo, véase, Patente US N.° 5.583.210), fuerza del tallo mejorada, tiempo de florecimiento alterado o rasgos de tecnología de transformación tales como regulación del ciclo celular o direccionamiento del gen (por ejemplo, WO 99/61619, WO 00/17364 y WO 99/25821 ); cuya divulgación se incorpora a la presente a modo de referencia.

En otra realización, el evento de maíz E661 1.32.1.38 también se puede combinar con la secuencia Regí o una variante biológicamente activa o fragmento de la misma. La secuencia Regí es un gen de resistencia al pudrimiento de tallo por antracnosis en maíz. Véase, por ejemplo, Solicitud de patente US N.° 1 1/397.153. 11/397.275 y 1 1/397.247, cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia.

Estas combinaciones apiladas se pueden crear mediante cualquier método que incluye, mas no se limita a, reproducir plantas mediante cualquier metodología convencional o transformación genética. Si las secuencias se apilan por transformación genética de plantas, las secuencias polinucleotídicas de interés se pueden combinar en cualquier momento y en cualquier orden. Los rasgos se pueden introducir en forma simultánea en un protocolo de cotransformacion con los polinucleótidos de interés provistos por cualquier combinación de los casetes de transformación. Por ejemplo, si van a introducirse dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes de transformación separados (trans) o contenidas en el mismo cásete de transformación (cis). La expresión de las secuencias se puede llevar a cabo en el mismo promotor o mediante diferentes promotores. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprima la expresión del polinucleótido de interés. Esto se puede combinar con cualquier combinación de casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de rasgos en la planta. Se reconoce además que las secuencias polinucleotídicas se pueden apilar a una ubicación genómica deseada usando un sistema de recombinación específica de sitio. Véase, por ejemplo, W099/25821 , W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853, todas las cuales se incorporan en la presente a modo de referencia.

Como se usa en la presente, el término "polinucleótido" no está destinado a limitarse a los polinucleótidos que comprenden ADN. Las personas versadas en el arte reconocen que los polinucleótidos pueden comprender ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Dichos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas de ocurrencia natural como los análogos sintéticos. Los polinucleótidos provistos en la presente también abarcan todas las formas de secuencias que incluyen, mas no se limitan a, formas monocatenarias, formas bicatenarias, horquillas, estructuras de falsos nudos y similares.

Se proveen polinucleótidos aislados que se pueden usar en varios métodos para la detección y/o identificación del evento de maíz E6611.32.1.38. Un polinucleótido "aislado" o "purificado" o porción biológicamente activa del mismo, es sustancial o esencialmente libre de los componentes que normalmente acompañan o interactúan con el polinucleótido como se encuentra en su medioambiente de ocurrencia natural. Por ende, un polinucleótido aislado o purificado es sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando es producido por técnicas recombinantes o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan en forma química.

En realizaciones específicas, se proveen polinucleótidos que comprenden secuencias de ADN de unión como se indica en la SEQ ID NO: 1 y Figuras 11 y 15. Los fragmentos y variantes de secuencias de ADN de unión son adecuados para identificar en forma discriminada el evento E6611.32.1.38. Como se discute en la presente, dichas secuencias encuentran uso como cebadores y/o sondas.

En otras realizaciones, se proveen los polinucleótidos que pueden detectar un evento E6611.32.1.38 o una región específica E6611.32.1.38. Dichas secuencias incluyen cualquier polinucleótido establecido en las SEQ ID NOS: 2-3, 6-19 y variantes y fragmentos del mismo. Los fragmentos y variantes de polinucleótidos que detectan un evento E6611.32.1.38 o una región específica E6611.32.1.38 son adecuados para identificar en forma discriminada el evento E6611.32.1.38. Como se discute en la presente, dichas secuencias encuentran uso como cebadores y/o sondas. También se proveen secuencias de cebadores o sondas de nucleótidos de ADN o que consisten de una secuencia establecida en las SEQ ID NO: 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 31 , o un complemento de la misma.

"Variantes" intenta significar secuencias sustancialmente similares. Para los polinucleótidos, una variante comprende un polinucleótido que tiene deleciones (es decir, truncaciones) en el extremo 5' y/o 3'; deleción y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos en el polinucleótido nativo y/o sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo.

Se proveen métodos y composiciones para identificar el evento E6611.32.1.38. Dichos métodos encuentran uso en identificar y/o detectar un evento E6611.32.1.38 en cualquier material biológico. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, métodos para confirmar pureza de semilla y métodos para examinar semillas en un lote de semillas para un evento E6611.32.1.38. En una realización, se provee un método para identificar el evento E6611.32.1.38 en una muestra biológica y comprende poner en contacto la muestra con un primer y un segundo cebador y, amplificar un polinucleótido que comprende una región específica E6611.32.1.38.

Una muestra biológica puede comprender cualquier muestra en la que se desea determinar si el ADN que tiene el evento E66 1.32. .38 está presente. Por ejemplo, una muestra biológica puede comprender cualquier material vegetal o material que comprende o deriva de un material vegetal tal como, mas sin limitarse a, alimentos o productos alimenticios. En realizaciones específicas, la muestra biológica comprende un tejido de maíz.

Los cebadores y sondas basados en el ADN flanqueador y secuencias de inserción reveladas en la presente se pueden usar para confirmar (y, de ser necesario, corregir) las secuencias reveladas por métodos convencionales, por ejemplo, por re-clonación y secuenciamiento de dichas secuencias. Las sondas y cebadores de polinucleótidos detectan específicamente una secuencia de ADN blanco. Cualquier método convencional de hibridación o amplificación de ácido nucleico se puede usar para identificar la presencia de ADN de un evento transgénico en una muestra. Por "detectar de manera específica" se intenta significar que el polinucleótido puede ser usado ya sea como un cebador para amplificar una región específica E6611.32.1.38 o bien el polinucleótido se puede usar como una sonda que se híbrida bajo condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene un evento E6611.32.1.38 o una región específica E661 1.32.1.38. El nivel o grado de hibridación que permite la detección específica de un evento E6611.32.1.38 o una región específica de un evento E661 1.32.1.38 es suficiente para distinguir el polinucleótido con la región específica de E6611.32.1.38 a partir de un polinucleótido que carece de esta región y, de esta manera, permitir identificar en forma discriminada un evento E661 1.32.1.38. Por "comparte suficiente identidad de secuencia o complementariedad" para permitir la amplificación de un evento específico E661 1.32.1.38, se intenta significar que la secuencia comparte al menos 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad o complementariedad con un fragmento o a través de la longitud completa del polinucleótido que tiene la región específica de E6611.32.1.38.

Con respecto a la amplificación de un polinucleótido blanco (por ejemplo, por PCR) que usa un par de cebadores de amplificación particular; "condiciones rigurosas" son las condiciones que permiten que el par de cebadores se hibride con el polinucleótido blanco a la cual un cebador que tiene la correspondiente secuencia de tipo silvestre (o su complemento) se fijaría y, preferentemente, produzca un producto identificable de amplificación (el amplicón) que tiene una región específica de E66 1.32.1.38 en reacción de amplificación térmica de ADN. En un enfoque de PCR, los cebadores de oligonucleótidos se pueden diseñar para uso en reacciones por PCR para amplificar una región específica de E6611.32.1.38. Los métodos para diseñar los cebadores por PCR y clonación por PCR son generalmente conocidos en el arte y se revelan en Sambrook, y otros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Véase también, Innis, y otros, eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Los métodos para amplificación se describen en las Patentes US N.° 4.683.195, 4.683.202 y Chen, y otros, (1994) PNAS 91 :5695-5699. Estos métodos así como otros métodos conocidos en el arte de la amplificación de ADN se pueden usar en la práctica de la invención. Se entiende que un número de parámetros en un protocolo específico de PCR puede necesitar ser ajustado a condiciones específicas de laboratorio y puede ser modificado levemente y aún así permitir la recolección de resultados similares. Estos ajustes son evidentes para una persona versada en el arte.

El polinucleótido amplificado (amplicón) puede tener cualquier longitud que permita la detección del evento E661 1.32.1.38 o una región específica de E6611.32.1.38. Por ejemplo, el amplicón puede ser de aproximadamente 10, 50, 100, 200, 300, 500, 700, 100, 2000, 3000, 4000, 5000 nucleótidos de longitud o más largo. En realizaciones específicas, se detecta la región específica del evento E6611.32.1.38.

Cualquier cebador se puede emplear en los métodos provistos en la presente que permita que una región específica de E661 1.32.1.38 sea amplificada y/o detectada. Por ejemplo, en realizaciones específicas, un cebador comprende un fragmento de un polinucleótido de las SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 29 ó 30 en donde el cebador comparte suficiente identidad de secuencia o complementariedad con el polinucleótido para amplificar dicha región específica flanqueadora de ADN o E6611.32.1.38. Un par de cebadores puede comprender un fragmento de SEQ ID NO: 1 y un fragmento de SEQ ID NO: 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 29 ó 30. Los cebadores pueden tener cualquier longitud suficiente para amplificar una región de E6611.32.1.38 que incluye, por ejemplo, al menos 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 15 ó 30 o aproximadamente 7-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45 nucleótidos o más.

Como se discute en la presente, cualquier método para amplificar por PCR el evento o región específica de E6611.32.1.38 se puede emplear, incluyendo por ejemplo, PCR en tiempo real. Véase, por ejemplo, Livak, y otros, (1995) Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probé system for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR methods and Applications. 4:357-362; Patente US N.° 5.538.848; Patente US N.° 5.723.591 ; Applied Biosystems User Bulletin No. 2, "Relative Quantitation of Gene Expression", P/N 4303859; y, Applied Biosystems User Bulletin No. 5, "Multiplex PCR with Taqman VIC Probes," P/N 4306236; cada uno de los cuales se incorpora en la presente a modo de referencia.

Por ende, en realizaciones específicas, se provee un método para detectar la presencia del evento E661 1.32.1.38 o progenie del mismo en una muestra biológica. El método comprende (a) extraer una muestra de ADN a partir de la muestra biológica; (b) proveer un par de moléculas cebadoras de ADN; (c) proveer condiciones de reacción de amplificación de ADN; (d) realizar la reacción de amplificación de ADN, produciendo así una molécula de amplicón de ADN y (e) detectar la molécula de amplicón de ADN, en donde la detección de dicha molécula de amplicón de ADN en la reacción de amplificación de ADN indica la presencia de evento de maíz E661 1.32.1.38. A fin de que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, necesita solamente ser suficientemente complementaria en secuencia para poder formar una estructura bicatenaria estable bajo las concentraciones de sal y solvente particulares empleadas.

También se proveen los métodos para detectar la presencia de ADN correspondiente al evento E6611.32.1.38 en una muestra. En una realización, el método comprende (a) poner en contacto la muestra biológica con una sonda de polinucleótido que se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación con ADN de evento de maíz E661 1.32.1.38 y específicamente detecta el evento E661 1.32.1.38; (b) someter la muestra y sonda a condiciones rigurosas de hibridación y (c) detectar hibridación de la sonda con el ADN, en donde la detección de hibridación indica la presencia del evento E661 1.32.1.38.

Las realizaciones se definen en forma adicional en los siguientes Ejemplos. Debe entenderse que estos Ejemplos se brindan solamente a modo de ilustración. A partir de la discusión anterior y estos Ejemplos, la persona versada en el arte puede entender las características esenciales de esta invención y sin alejarse del espíritu y alcance de la misma, puede hacer varios cambios y modificaciones de las realizaciones para adaptarla a varios usos y condiciones. Por ende, varias modificaciones a las realizaciones, asimismo con respecto a las ilustradas y descritas en la presente, serán evidentes a las personas versadas en el arte a partir de la presente descripción. Dichas modificaciones también están destinadas a ser incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Caracterización del Evento DP-32138-1 El evento de maíz (Zea mays L.) DP-32138-1 , también mencionado como maíz 32138, ha sido producido por transformación mediada por Agrobacterium con el plásmido PHP24597 (Figura 1) esencialmente como se describe en Zhao, y otros, (2001) Molecular Biology (anteriormente Molecular Breeding) 8:323-333; Patente US N.° 5.981.840; y publicación de patente PCT W098/32326, todas las cuales se incorporan en la presente a modo de referencia. La región T-ADN de este plásmido está representada de manera esquemática en la Figura 2 y su secuencia se provee en la SEQ ID NO: 34. Un resumen de los elementos genéticos y sus posiciones en el plásmido PHP24597 y en el T-ADN se describen en las Tablas 1 1 y 12, respectivamente. La transformación generó la inserción de los tres casetes de genes que contenían una secuencia genómica restauradora de fertilidad, Ms45, el gen a-amilasa, Zm-aa1 y el gen DsRed2 (Alt 1 ) como un marcador visible. Estos tres casetes de genes son elementos de un sistema de producción de semillas para crear líneas masculinas estériles para la generación de una semilla híbrida sin necesidad de despenechar plantas en forma manual o mecánica.

El primer cásete contiene la secuencia genómica Ms45, que es una región de ADN genómico de maíz que comprende el gen Ms45 y región no traducida 3' asociada (Albertsen, y otros, 1993; Albertsen, y otros, 1995). El gen Ms45 incluye cuatro exones con tres intrones que se extraen mediante empalme. La expresión de la proteína MS45 codificada por el gen Ms45 en la membrana de la antera es requerida para la producción de polen masculino fértil por la planta de maíz (Cigan, y otros, 2001). La proteína MS45 de cadena completa está comprendida por 412 aminoácidos y tiene un peso molecular de aproximadamente 47 kDa (SEQ ID NO: 20). La expresión del gen Ms45 está controlada por el promotor 5126 antera-específico de maíz (Cigan y Albertsen, 1997). El terminador para el gen Ms45 es la secuencia de región no traducida 3' endógena de Ms45 del genoma de maíz, que se incluye en la secuencia genómica Ms45 (Albertsen, y otros, 1993).

El segundo cásete contiene un gen de maíz a-amilasa {zm-aa1) truncado que codifica la proteína ZM-AA1. La región que codifica zm-aa1 es precedida por el péptido de tránsito del gen de maíz Brittle-1 (zm-bt1) (Sullivan, y otros, 1991 ) que dirige la proteína ZM-AA1 al amiloplasto. La proteína ZM-AA1 previene la acumulación de almidón en el grano de polen naciente, previniendo de esta manera que el polen se desarrolle y germine normalmente. El producto de traducción completo, que incluye péptido de tránsito, comprende 495 aminoácidos y tiene un peso molecular de aproximadamente 54 kDa (SEQ ID NO: 21). La proteína ZM-AA1 procesada con el péptido de tránsito extraído es de 420 residuos de aminoácidos de longitud y tiene un peso molecular de aproximadamente 46 kDa. La proteína ZM-AA1 procesada difiere de la proteína nativa porque carece de los 21 residuos de aminoácidos N-terminales encontrados en la proteína nativa, que incluye el residuo de metionina inicial. La expresión del gen zm-aa1 y péptido de tránsito unido es controlada por el promotor Pg47, que es la región reguladora 5' del gen poligalacturonasa polen-específico de maíz (Pg47) (Alien y Lonsdale, 1993). El terminador para el gen zm-aa1 es la secuencia terminadora 3' del gen In2-1 de maíz (Hershey y Stoner, 1991).

El tercer cásete contiene el gen DsRed2(Alt1). El gen DsRed2(Alt1) es una versión modificada del gen DsRed2 original (Clontechniques, 2001 ) en el cual el sitio de restricción BsfE II interno fue extraído sin alterar la secuencia de aminoácidos de la proteína sobreexpresada. La secuencia codificadora DsRed2(Alt1) se provee en la SEQ ID NO: 35. El gen DsRed2 (Alt1) codifica la proteína DsRed2. La expresión de la proteína DsRed2 en la capa de aleurona de la semilla de maíz produce una coloración roja en las semillas que contienen la inserción de ADN, permitiendo la diferenciación de la semilla que contiene el evento DP-32138-1 durante la selección de semillas. La proteína DsRed2 de longitud completa tiene una longitud de 225 aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 26 kDa (SEQ ID NO: 33). La expresión del gen DsRed2(Alt1) es controlada por el promotor de proteína de transferencia lipídica (Ltp2), que brinda transcripción aleurona-específica del gen (Kalla, y otros, 1994). Ubicada 5' al promotor Ltp2 es la región reforzadora el virus mosaico del coliflor (reforzador CaMV 35S) (Franck, y otros, 1980; Odell, y otros, 1985). El terminador para el gen DsRed2(Alt1) es la secuencia terminadora 3' del gen inhibidor de la proteinasa II de Solanum tuberosum (terminador p/nll) (Keil, y otros, 1986; An, y otros, 1989).

Análisis Southern blot de Evento 32 38 - Métodos El análisis Southern blot fue realizado en maíz DP-32138-1 para confirmar el número de copia de inserción e integridad y para generar un mapa de enzimas de restricción física de la inserción. Las muestras de ADN genómico de las plantas individuales de maíz DP-32138-1 fueron analizadas por digestión con enzimas de restricción Bam I, Bgl II, Bmt I, EcoR I, Hiñó III y Xho I, y digestiones dobles con BamH \IH¡nú III y Bgl U/Hind III. Estas digestiones fueron hibridadas con sondas con la región genómica Ms45 y los genes zm-aa1 y DsRed2(Alt1), junto con los elementos genéticos remanentes en el T-ADN con inclusión del promotor 5126, promotor Pg47, péptido de tránsito zm-bt1, terminador In2-1, reforzador CaMV 35S, promotor Ltp2, y terminador pinW. El análisis con Bmt I y Xho I, sitios de examen en el genoma de borde, indicó que una copia simple del T-ADN PHP24597 está presente en el maíz DP-32138-1. El análisis EcoR I indicó que el T-ADN PHP24597 se había insertado intacto en el genoma, ya que los sitios de restricción EcoR I internos estaban presentes. El análisis con las enzimas remanentes se usó junto con estos datos para crear un mapa de restricción física de la inserción de T-ADN en él maíz DP-32138-1.

Sustancias de evaluación Las sustancias de evaluación en este estudio fueron definidas como semilla roja T1 S1 de maíz DP-32138-1 , número de log PHI T-F-07-132C. Todas las semillas fueron obtenidas de Pioneer Hi-Bred International, Inc. (Pioneer, Johnston, IA) y la información de pedigrí se encuentra en archivo con los reproductores empleados. La sustancia de evaluación usada en este estudio fue seleccionada de una población de segregación por su color rojo para asegurar que contuviera el evento DP-32138-1.

Sustancias de control Las sustancias de control fueron definidas como semilla de líneas de maíz que no son genéticamente modificadas. Las líneas no modificadas tienen entornos genéticos representativos del entorno de la sustancia de evaluación; no obstante, no contienen las inserciones DP-32138-1. Todas las semillas se obtuvieron de Pioneer y la información de pedigrí se encuentra en archivo con los reproductores empleados.

Sustancias de referencia El plásmido PHP24597 se usó como control positivo para análisis Southern para verificar hibridación de sonda y confirmar los tamaños de los fragmentos internos con respecto al T-ADN insertado. El ADN plásmido usado fue preparado a partir de reservas de plásmido obtenidas de Pioneer. Las reservas de plásmido eran copias del plásmido usadas para transformación para producir maíz DP-32138-1 y fueron digeridas con enzimas de restricción para confirmar el mapa del plásmido. Las sondas usadas en este estudio fueron derivadas de este plásmido o de un plásmido que contiene elementos genéticos equivalentes.

Los marcadores de peso molecular de ADN para electroforesis en gel y análisis Southern blot fueron usados para determinar los pesos moleculares y cantidades de fragmentos de ADN aproximados. Para el análisis Southern, el marcador de peso molecular del ADN VII, marcado por digoxigenina (DIG) (Roche, Indianápolis, IN), se usó como un tamaño estándar para hibridar fragmentos. Los fragmentos F?174 RF ADN/Hae III fueron usados para determinar suficiente migración en el gel agarosa para análisis Southern. Se usó Low Mass ADN Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) como estándar de cuantificación aproximada.

Recolección de muestras Diez semillas, cada una de T-F-07-132C, C-F-07-131C y C-F-07-69C, fueron plantadas en las cámaras de cultivo del Regulatory Science en la DuPont Experimental Station (Wilmington, DE) para producir tejido vegetal para extracción y análisis. Se plantó una semilla por maceta, y la maceta se identificó en forma única con número de estudio, identificar vegetal, iniciales de la persona que plantó las semillas y fecha de plantación. Todas las plantas se cultivaron con luz, temperatura y agua reguladas para el crecimiento saludable de la planta.

La primera cosecha de hojas de las plantas ocurrió cuando las plantas eran muy pequeñas (estadio de hoja V2-V3). Para cada planta de control y de sustancia de evaluación, se recolectó suficiente material de hoja del punto de cultivo anteriormente mencionado y se ubicó en tubos Geno/Grinder™ (SPEX CertiPrep, Inc., Metuchen, NJ) en hielo seco. Las muestras fueron luego transferidas a un congelador y se mantuvieron congeladas (<-50 °C) hasta el procesamiento. Las segundas y terceras recolecciones de hojas se realizaron después de que las plantas se habían re-cultivado en forma suficiente y antes de la etapa R1 ; la hoja más joven fue recolectada y ubicada en una bolsa pre-rotulada, re-sellable. Las bolsas de muestreo fueron ubicadas directamente en hielo seco. Las muestras se transfirieron luego a un congelador y se mantuvieron congeladas (<-50 °C) hasta el procesamiento. El tejido de hoja congelado de las plantas de maíz de control Hi-ll se mantuvo de los estudios internos anteriores. Todas las muestras de hojas se rotularon en forma única con el identificador de planta, fecha de cosecha, número de estudio, e iniciales del cosechador.

Análisis PCR específico de evento El ADN fue extraído de cada muestra de hoja usando el kit de PCR Extract-N-Amp™ usando el procedimiento descrito (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). La PCR en tiempo real se realizó en cada muestra de ADN usando un sistema PCR en tiempo real rápido ABI PRISM® 7500 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Los conjuntos de sonda y cebador TaqMan® fueron diseñados para detectar una secuencia blanco del evento DP-32138-1. Asimismo, un segundo conjunto de sonda y cebador TaqMan® para un gen endógeno de maíz de referencia fue usado para confirmar la presencia de ADN amplificable en cada reacción. El análisis consistió de determinación de PCR en tiempo real cuantitativo de pruebas cualitativas positivas/negativas. El ADN extraído fue evaluado usando concentraciones de sonda y cebador optimizadas y validadas en mezcla maestra de TaqMan® Universal PCR, No AmpErase® UNG (Applied Biosystems, Inc.). La incubación inicial se realizó a 95 °C durante 10 minutos seguido de 40 ciclos como sigue: 95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 minuto.

La determinación positiva o negativa para el evento se basó en la comparación del ciclo umbral CT {threshold cycle) de la PCR blanco de inserción con la del blanco de referencia endógeno de maíz. Si los blancos del evento y de PCR endógenos se amplificaron por sobre el umbral CT, entonces la planta se puntuó como positiva para el evento. Si el blanco endógeno se amplificó y el blanco del evento no lo hizo, entonces la planta se puntuó como negativa. Si ningunos de los blancos se amplificaron para una muestra particular, entonces se determinó como una muestra de calidad pobre o que falló, y el ensayo fue repetido.

Extracción y cuantificación de ADN El ADN genómico fue extraído del tejido de hoja de las plantas de control y evaluación. El tejido fue pulverizado en tubos que contenían perlas de trituración usando un instrumento Geno/Grinder™ (SPEX CertiPrep, Inc.) y el ADN genómico se aisló usando procedimiento estándar para tampón de extracción de urea. Después de la extracción, el ADN fue cuantificado en un espectrofluorómetro usando reactivo Pico Green® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) y visualizado en un gel agarosa para confirmar los valores del análisis de Pico Green y para determinar la calidad del ADN.

Digestión y separación electroforética del ADN Para la caracterización de la inserción de DP-32138-1 , se extrajeron muestras de ADN genómico tanto de las plantas de control como de las de evaluación con BamH I, Bgl II, Bmt I, EcoR I, Hinú III y Xho I o una combinación de dos enzimas de restricción: BamH l/H/nd III y Bgl UIHinó III (New England Biolabs, Ipswich, MA).

Después de la digestión con la enzima de restricción, los fragmentos producidos fueron separados de manera electroforética por tamaño a través de un gel agarosa y se usó un estándar de peso molecular [F?174 RF ADWHae Fragmentos III (Invitrogen)] para determinar la migración y separación suficiente de los fragmentos en el gel.

Transferencia Southern Los geles agarosa que contenían los fragmentos de ADN separados fueron depurados, desnaturalizados y neutralizados in situ, y transferidos a una membrana de nylon en 20x de tampón de SSC usando el método como se describe para el sistema de transferencia descendente rápida TURBOBLOTTER™ (Schleicher y Schuell, Keene, NH). Después de la transferencia a la membrana, el ADN se fijó a la membrana por intracruzamiento UV (Stratalinker, Stratagene, La Jolla, CA).

Marcación de sonda e Hibridación Southern Blot Los fragmentos de ADN fijados a la membrana de nylon fueron detectados como bandas discretas al ser hibridados a una sonda marcada. Las sondas usadas para hibridación Southern están provistas en la Tabla 1 y sus ubicaciones se ilustran en la Figura 2. Las sondas para la región genómica Ms45, gen zm-aa1, gen DsRed2(Alt1), promotor 5126, promotor Pg47, promotor Ltp2, péptido de tránsito zm-bt1, terminador In2-1, terminador pin\\ y elementos reforzadores CaMV 35S fueron usados para hibridación Southern. Una sonda que contenía el péptido de tránsito zm-bt1 combinado con el gen zm-aa1 (sonda zm-bt1-aa1) fue usada para análisis preliminar Southern blot en vez de sondas separadas para los dos elementos. Los fragmentos de los elementos fueron generados por PCR del plásmido PHP24597 usando cebadores específicos y fueron purificados por gel (Qiagen, Valencia, CA). A excepción del promotor Pg47, cada sonda cubrió la mayoría del elemento genético respectivo, con solamente regiones pequeñas que quedan fuera debido a los requerimientos impuestos por el procedimiento de marcación por PCR. Las sondas de ADN fueron generadas a partir de estos fragmentos por PCR que incorporaron un nucleótido marcado por digoxigenina (DIG), [DIG-11]-dUTP, en el fragmento. La marcación por PCR de los fragmentos aislados se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos provistos en el kit de síntesis de sonda PCR DIG (Roche).

Las sondas marcadas fueron hibridadas con el ADN blanco en las membranas de nylon para detección de los fragmentos específicos usando los procedimientos esencialmente como se describen en la solución DIG Easy Hyb (Roche). El marcador VII de peso molecular de ADN marcado por DIG (Roche), visible después de la detección por DIG como se describe a continuación, se usó para determinar el tamaño del fragmento de hibridación en los Southern blots.

Detección de las sondas hibridadas Las sondas marcadas por DIG, hibridadas con ADN fijado a la membrana de nylon después de rigurosos lavados, y los estándares de ADN marcados por DIG fueron visualizados usando un sistema de detección de ácido nucleico quimioluminiscente de CDP-Star con conjunto de tampón de bloqueo y lavado DIG (Roche). Los blots fueron expuestos a película de rayos X para uno o más puntos para detectar fragmentos de hibridación y para visualizar los estándares de peso molecular. Las imágenes fueron capturadas digitalmente por detección con el analizador de imagen luminiscente LAS-3000 (Fujifilm Medical Systems, Stamford, CT). Las imágenes digitales fueron comparadas con exposición de película de rayos X como verificación para uso en este informe. Los tamaños de las bandas detectadas fueron documentos para cada digestión y cada sonda.

Separación de sondas e hibridaciones posteriores Después de la hibridación y la detección, las membranas fueron separadas de la sonda marcada por DIG para preparar el blot para posterior re-hibridación a una sonda diferente. Las membranas fueron lavadas brevemente en agua destilada, desionizada y luego separadas en una solución de 0,2 M de NaOH y 0,1% de SDS a 37 °C con agitación constante. Las membranas fueron luego lavadas con 2x de SSC y usadas directamente para hibridaciones posteriores o bien almacenadas para uso posterior. El procedimiento de separación basado en álcali remueve en forma efectiva las sondas marcadas con DIG álcali-voluble usadas en estos experimentos.

Análisis Southern blot de evento 32138 - Resultados y Discusión Confirmación de genotipo y análisis Southern Blot preliminar de Plantas mantenedoras T1S1 de DP-32138-1 Todas las plantas individuales fueron evaluadas en cuanto a la presencia de la inserción de DP-32138-1 por análisis de PCR evento-específica. Todas las diez plantas DP-32138-1 T1 S1 fueron positivas para la inserción. Los resultados de los ensayos de PCR específica de evento para las plantas DP-32138-1 se resumen en la Tabla 2. Todas las plantas de control resultaron negativas para la inserción DP-32138-1 (datos no ilustrados). Los resultados del análisis de PCR específica de evento sustancian el examen visual de las semillas. Asimismo, estos resultados PCR específica de evento también verifican que el borde izquierdo de la inserción de T-ADN PHP24597 permanezca estable en las plantas que contienen la inserción DP-32138-1.

El AND genómico extraído de las diez plantas individuales DP-32138-1 y 21 plantas de control (diez plantas diez plantas 705, y una planta Hi-ll) fue analizado por Southern blots preliminares en cuanto a la presencia de los elementos genéticos Ms45 genómicos, zm-bt1-aa1 y DsRed2(Alt1). El ADN de estas plantas fue digerido con EcoR I o Bam I, analizado en blot, y sondeados con sondas Ms45, zm-bt1-aa1 y DsRed2. Los resultados de estos Southern blots correspondieron directamente con los resultados de los ensayos de PCR evento-específica. Todas las plantas DP-32138-1 contenían los elementos genéticos Ms45 Genómico, zm-bt1-aa1, y DsRed2(Alt1) (Tabla 2) y las plantas de control fueron negativas para los genes (datos no ilustrados). Este análisis Southern blot preliminar también indicó que el ADN insertado era idéntico en todas las plantas DP-32138-1 , ya que el patrón de banda con cada prueba era idéntico para todas las plantas. Como las muestras de planta de control en una línea endogámica particular tenía diferentes patrones de hibridación, estos blots también se usaron para seleccionar controles para los análisis Southern blot descritos a continuación y confirmaron que los controles seleccionados representarían todas las bandas debido al genoma endógeno. La hibridación de los blots de muestra con una sonda para la secuencia codificadora zm-bt1-aa1 generó muchas bandas endógenas en superposición que también se vieron en las plantas de control. Esta sonda se dividió en sondas separadas zm-bt1 y zm-aa1 para uso en la caracterización detallada de un subconjunto de muestras de ADN en este estudio como se describe a continuación.

Análisis Southern Blot detallado de DP-32138-1 Un total de seis enzimas de restricción fueron seleccionadas para use en un análisis Southern blot detallado de maíz DP-32138-1 : BamH \, Bgl W, Bmt \, EcoR I, Hind III y Xho I, que se muestran en el mapa de T-ADN PHP24597 (Figura 2). Asimismo, las digestiones dobles con BamH UHind III y Bgl WIHind III fueron utilizadas para análisis Southern. Las ubicaciones de los sitios de restricción BamH I y EcoR I se muestran en el mapa del plásmido de PHP24597 (Figura 1 ) y las ubicaciones de pares de bases de los sitios de restricción para enzimas usadas en el análisis se brindan en la Tabla 1. El PHP24597 fue agregado al ADN control de maíz 705, digerido e incluidos en los blots para brindar tanto un control positivo para hibridación de sonda como una referencia de tamaño para fragmentos de ADN que están contenidos completamente en el T-ADN. La Tabla 1 y la Tabla 18 brindan información adicional de las sondas usadas.

El mapa esquemático del plásmido PHP24597 (Figura 1 ) indica los sitios de restricción de enzima para BamH I y EcoR I y las regiones que codifican Ms45, zm-aa1 y DsRed2. El borde izquierdo y borde derecho flanquean el T-ADN (Figura 2) que es espera sea insertado durante la transformación mediada por Agrobacterium. El tamaño del plásmido es de 52869. Las ubicaciones de las enzimas adicionales usadas en este estudio se brindan a continuación: El mapa esquemático de la región de T-ADN del Plásmido PHP24597 (Figura 2) indica sitios de restricción de enzima para BamH I, Bgl II, Bmt\, EcoR I, Hind III y Xho I y las regiones reguladoras y codificadoras de Ms45, zm-aa1 y DsRed2. Las ubicaciones de las enzimas usadas en este estudio se brindan a continuación: Cada digestión de restricción fue hibridada con diez sondas diferentes que cubren los elementos genéticos en el T-ADN de PHP24597: Ms45, zm-bt1, zm-aa1 y DsRed2, y sondas para las regiones reguladoras, promotor 5126, promotor Pg47, terminador In2-1, reforzador 35S, promotor Ltp2 y terminador pm' W. Las descripciones detalladas de todas las sondas se proveen en la Tabla 1 y las ubicaciones de las sondas se ilustran en el mapa del T-ADN (Figura 2). Cada una de estas sondas se híbrida solamente con un elemento en el T-ADN. El número real de bandas de hibridación para cada sonda depende de la ubicación de los sitios de restricción de enzima específicos en relación con el elemento genético y se encuentra entre una a tres bandas para una inserción individual del T-ADN de PHP24597 con las enzimas usadas en este estudio.

Dos tipos de fragmentos serían observados a partir de estas digestiones e hibridaciones: a) fragmentos de borde, en donde un sitio enzimático se ubica en el T-ADN de PHP24597 a un extremo del fragmento de hibridación y un segundo sitio enzimático es esperado en el genoma del maíz y b) fragmentos internos en donde los sitios enzimáticos flanquean la región de la sonda y los fragmentos están contenidos en forma completa en el T-ADN de PHP24597. Los tamaños de los fragmentos de borde son únicos para cada evento y brinda un medio para demostrar el número de copias de un elemento particular basado en el número de bandas observada. Una banda de hibridación producida a partir de una enzima que se diva una vez en la inserción, fuera de la región de la sonda, indica la presencia de una copia del T-ADN insertado en un locus individual en el genoma. Los fragmentos de borde formado a partir de la inserción de un T-ADN de longitud completa son típicamente más largos que el tamaño predicho de la secuencia de T-ADN debido a la inclusión de ADN genómico en el fragmento. El tamaño exacto de los fragmentos de borde no se puede predecir con anticipación debido a la ubicación desconocida del sitio de divaje en el genoma del maíz. Los fragmentos internos brindan un medio para evaluar la integridad del T-ADN insertado y que no ha sido cambiado de la disposición destinada.

Los datos del Southern blot fueron usados para generar un mapa de restricción de la inserción del T-ADN de DP-32138-1 (Figura 3). Los sitios de restricción de enzima BamH I, Bgl II, Bmt I, EcoR I, Hiñó III y Xho I están indicados. Los análisis Southern blot indicaron una copia individual del T-ADN de PHP24597 se había insertado en el genoma del maíz. Las ubicaciones de los sitios enzimáticos fuera de la región del T-ADN no deben escalar. Un asterisco (*) indica que las ubicaciones relativas de estos sitios enzimáticos son inciertos debido al gran tamaño de los fragmentos generados a partir de estos sitios. Las líneas verticales punteadas indican los sitios BamH I y Bgl II ubicados fuera de la unión de borde izquierdo que demostraron digestión bloqueada en los Southern blots.

Las sondas de Ms45, zm-bt1, zm-aa1, promotor 5126, promotor Pg47 y terminador In2-1 usadas en este estudio derivan de secuencias genómicas de ADN de maíz endógeno. Como resultado, los Southern blots con estas sondas también exhibieron un número de bandas que se debieron a la hibridación con las secuencias endógenas además de las bandas debido a la inserción de DP-32138-1. Estas bandas fueron confirmadas por la presencia en una o más de las líneas de plantas de control (705, Hi-ll o H -\\(ms45)). La generación de DP-32138-1 utilizada en este estudio (T1 S1) fue derivada del transformante original del entorno H -\\(ms45) (Hi-ll con un alelo ms45 cruzado en forma retrógrada), cruzado con 705, y luego auto-cruzado. Por ende, las plantas T1S1 exhibieron bandas endógenas derivadas tanto de las líneas de control Hi-ll como 705, que variaron entre individuos T1S1 dependiendo de la digestión y sonda usadas. Asimismo, algunas de las bandas de hibridación mostraron diferencias entre plantas en las líneas de control Hi-ll y Hi-ll(ms45) en sí mismas, de esta manera requiriendo la inclusión de dos plantas a partir de cada una de estas líneas de control en algunos de los Southern blots a fin de representar todas las bandas endógenas observada en las plantas DP-32138-1.

Con excepción del promotor Pg47, cada sonda cubre la mayoría del elemento genético respectivo, con solamente pequeñas regiones que quedan fuera debido a los requerimientos impuestos por el procedimiento de marcación por PCR. En el caso del promotor Pg47, las hibridaciones de evaluación con fragmentos de sondas que comprenden el elemento de aproximadamente 2.7 kb generaron hibridación intensa para todas las corridas que contenían el ADN genómico. La sonda del promotor Pg47 de longitud completa evaluada pero no utilizada en este estudio, como se describe en la presente, se ilustra como línea sólida debajo del elemento promotor Pg47 en el mapa de la Figura 2. La investigación adicional brindó un fragmento de 424 bp ubicado en el extremo 3' del promotor Pg47 que se hibridó con un número reducido de bandas endógenas y, por ende, brindó información utilizable con respecto a este elemento en maíz de DP-32138-1.

Número de copia de ADN insertado en maíz de DP-32138-1 Las enzimas de restricción Bmt I y Xho I fueron seleccionadas para confirmar el número de copias del T-ADN de PHP24597 insertado en el maíz de DP-32138-1.

Bmt I tiene un sitio de restricción individual ubicado en el T-ADN y genera fragmentos de borde en los bordes izquierdos y derechos para cada inserción individual del T-ADN dependiendo de la sonda usada (Figura 2). El sitio para Bmt I está ubicado en el bp 8503 en el T-ADN, y se esperaría que formara fragmentos de más de aproximadamente 8500 bp y más de aproximadamente 1400 bp para un T-ADN insertado individual. El fragmento de más de 8500 bp se híbrida con las sondas del promotor 5126, Ms45, promotor Pg47, zm-bt1, zm-aa1, terminador In2-1, reforzador 35S y promotor Ltp2, mientras que el fragmento de más de 1400 bp se híbrida con las sondas del promotor Ltp2, DsRed2 y terminador pin\\. Como el sitio de Bmt I está ubicado en el elemento promotor Ltp2, la hibridación con esta sonda permitiría que ambos fragmentos fueran visibles de manera simultánea en un Southern blot.

En el análisis Southern de Bmt I, una banda de más de 8600 bp se híbrida en maíz DP-32138-1 con las sondas del promotor 5126, Ms45, zm-bt1, zm-aa1, terminador In2-1, reforzador 35S y promotor Ltp2 (Tabla 3). Asimismo, las bandas endógenas fueron observadas en todas las muestras con las sondas del promotor 5126, Ms45, zm-bt1, zm-aa1 y terminador In2-1. Una banda de más de 8600 bp también fue observada con las sondas del promotor Ltp2, DsRed2 y terminador p/'nll (Tabla 3), que puede ser identificada como la más larga de las dos bandas vistas con la sonda del promotor Ltp2 por comparación con las hibridaciones del terminador pin\\ y promotor 5126. No se puede identificar una banda específica con el promotor Pg47 en el blot Bmt I debido a la intensidad de las bandas endógenas en co-migración. No obstante, la presencia de la banda de más de 8600 bp con las sondas flanqueadoras del elemento promotor Pg47 (Ms45 y zm-bt1) indica que la banda del promotor Pg47 es probablemente ubicada en la región del blot oscurecidas por bandas endógenas por sobre el marcador de 8600 bp. Asimismo, basado en el análisis Xho I discutido a continuación, una copia individual del elemento Pg47 fue determinado para ser insertado en el maíz DP-32138-1.

Xho I tiene dos sitios de restricción ubicados en el T-ADN de PHP24597 (Figura 2), y que se esperaría produzcan un fragmento interno y dos fragmentos de borde en los bordes derecho e izquierdo para cada inserción individual. Los dos sitios de restricción están ubicados en las posiciones de bp 2134 y 5587 (Figura 2). La digestión con esta enzima producen tres fragmentos a partir de una inserción de T-ADN individual: un fragmento de borde de más de aproximadamente 2100 bp que se híbrida con las sondas del promotor 5126 y Ms45, un fragmento interno de 3453 bp que se híbrida con las sondas del Ms45, promotor Pg47 y zm-bt1, y un segundo fragmento de borde de más de aproximadamente 4400 bp que se híbrida con las sondas de zm-bt1, zm-aa1, terminador ¡n2-1, reforzador 35S, promotor Ltp2, DsRed2 y terminador p/nll.

La hibridación de ADN digerido con Xho I a partir de maíz DP-32138-1 con la sonda del promotor 5126 generó una banda individual de aproximadamente 3600 bp a partir de la inserción del T-ADN, además de las dos bandas generadas de las secuencias de maíz endógenas (Tabla 4). La hibridación con la sonda Ms45 generó dos bandas como se esperó: la banda de borde de aproximadamente 3600 bp también vista con la sonda del promotor 5126 y una banda interna que combina con el fragmento del plásmido de 3453 bp (Tabla 4). El mismo fragmento interno de 3453 bp fue observado con la sonda del promotor Pg47 (Tabla 4). La banda del plásmido PHP24597 es débil en muchas de las hibridaciones, pero se puede observar en las películas de los Southern blots. La sonda zm-bt1 mostró dos bandas derivadas de inserción como se espera a partir de las ubicación del sitio Xho I en el elemento: la banda interna 3453 vista con las sondas del promotor Ms45 y Pg47 y una banda de borde de más de 8600 bp (Tabla 4). Las bandas endógenas fueron nuevamente observadas con las sondas del Ms45, promotor Pg47 y zm-bt1. La banda de borde superior a 8600 bp también fue vista en las hibridaciones con las sondas del terminador In2-1 (Tabla 4), reforzador 35S y promotor Ltp2 (Tabla 4), y DsRed2 y terminador pin\\ (Tabla 4). Las bandas endógenas fueron observadas con la sonda del terminador In2-1. No se observaron bandas derivadas de inserción extra con cualquiera de estas sondas. La hibridación del ADN digerido por Xho I con la sonda zm-aa1 no brindó ninguna información sobre la inserción del DP-32138-1 , ya que la región en la cual la banda esperada mayor a 8600 bp está ubicada, como lo muestran las sondas flanqueadora zm-bt1 y In2-1, fue oscurecida por las bandas endógenas intensas. Sin embargo, como las sondas zm-bt1 y In2-1 se hibridaron con la misma banda mayor a 8600 bp que fue oscurecida con las sondas del cásete DsRed2 y, como se describe con antelación en el análisis de Bmt I, una banda individual se híbrido con la sonda zm-aa1, se determinó que una copia individual del gen zm-aa1 se insertó en el maíz DP-32138-1.

Por ende, el análisis Southern de DP-32138-1 con digestión de Bmt I y Xho I demuestra que existe una copia individual de la inserción del T-ADN en el genoma del maíz. Salvo por aquellos elementos en los cuales el sitio de restricción se ubica en el elemento, hay bandas solamente individuales para cada uno de los elementos genéticos, como se espera para los fragmentos de una inserción de copia individual. Los elementos en el T-ADN que contienen los sitios de restricción también muestran el número esperado de bandas, sobre la base de la ubicación de la enzima de restricción, para una inserción de copia individual. La presencia de bandas de borde individuales, y sin bandas derivadas de inserción extra, demuestra que existe solamente una copia individual del T-ADN de PHP24597 en el genoma del maíz DP-32138-1.

Integridad del ADN insertado en el maíz DP-32138-1 La enzima de restricción EcoR I fue usada para confirmar la integridad de la inserción del T-ADN de PHP24597. Esta enzima tiene tres sitios de restricción en el T-ADN de PHP24597: un sitio ubicado entre el borde derecho y el elemento promotor 5126 en la posición de bp 191 , un sitio entre la región terminadora pinll y el borde izquierdo en la posición de bp 9869, y un tercer sitio ubicado entre el terminador In2-1 y el elemento reforzador CaMV 35S en la posición de bp 7407 (Figura 2). La digestión con EcoR I debería producir dos fragmentos internos, de 7216 bp y 2462 bp, tanto del control de plásmido PHP24597 como de las plantas que contienen una inserción de T-ADN intacta. La banda observada dependerá de la sonda usada en un determinado Southern blot. La hibridación con las sondas del promotor 5126, Ms45, promotor Pg47, zm-bt1, zm-aa1 y terminador In2-1 generará la banda de 7216 bp, mientras que las sondas del reforzador 35S, promotor Ltp2, DsRed2 y terminador pin\\ se hibridarán con la banda de 2462 bp. La presencia de la banda apropiada con una sonda determinada y la ausencia de cualquier otra banda derivada de inserción para esa sonda brinda una fuerte indicación de que el T-ADN es completo y no fue truncado ante la inserción.

La hibridación del ADN digerido EcoR I con las sondas del promotor 5126 y Ms45, generó una banda derivada de inserción individual de 7216 bp que combinó la banda del plásmido interna (Tabla 5). La misma banda de 7216 bp fue observada con las sondas del promotor Pg47 y zm-bt1 (Tabla 5) y sondas del terminador zm-aa1 y In2-1 (Tabla 5). La banda de 7216 bp fue algo oscurecida en el blot zm-aa1 por la presencia de bandas de hibridación debido al entorno endógeno del maíz y no podría confirmarse. Se determinó que este elemento fuera insertado intacto sobre la base del análisis discutido a continuación con fíamH I y Bgl II, porque la digestión con estas enzimas liberó un fragmento interno del T-ADN del tamaño apropiado. Asimismo, cada uno de estos análisis mostró solamente el fragmento interno esperado y ninguna otra banda debido a la inserción de DP-32138-1. Asimismo, hubo un número de bandas debido a la hibridación de secuencias de maíz endógenas con las sondas del promotor 5126, Ms45, promotor Pg47, zm-bt1, zm-aa1, y terminador In2-1, que se indican en la Tabla 5 por un asterisco (*) y sombreado gris. La banda de 7216 bp fue observada con un funcionamiento en el gel a un tamaño molecular aparente levemente inferior al tamaño esperado cuando se hibridan con estas sondas tanto en las corridas del plásmido como en las corridas del maíz DP-32138-1. Este tamaño anómalo parece ser específico a este fragmento, ya que el fragmento EcoR I de 2462 bp funcionó al tamaño esperado en comparación con los marcadores de peso molecular. Puede haber un cambio en la movilidad electroforética en el fragmento de 7216 bp debido a la presencia de la muestra de ADN de maíz de control causando que exhiba un tamaño aparente en el gel un tanto menor que el tamaño real. La banda derivada de inserción de 2462 bp fue observado con las sondas del reforzador 35S y promotor Ltp2 (Tabla 5) y las sondas de DsRed2 y terminador pinW (Tabla 5). No se observaron otras bandas específicas para las plantas DP-32138-1 en estos Southern blots. La Tabla 5 resume las bandas esperadas y observadas en los blots de EcoR I.

Los blots de EcoR I demuestran que el T-ADN de PHP24597 en DP-32138-1 está intacto, ya que solamente se observan las dos bandas esperadas de 7216 bp y 2462 bp con sus respectivas sondas. Los dos fragmentos comprenden el T-ADN de PHP24597 entero con excepción de las regiones pequeñas entre los sitios de EcoR I cerca de los extremos del T-ADN y los elementos de borde izquierdo y derecho. La presencia de solamente las dos bandas esperadas y la ausencia de otras bandas específicas a las plantas DP-32138-1 , indican que el T-ADN de PHP24597 se insertó intacto en el genoma del maíz.

Mapa físico del ADN insertado en el maíz DP-32138-1 Tres enzimas de restricción adicionales fueron elegidas para brindar un análisis completo de la inserción de DP-32138-1 : Hind III, SamH I y Bgl II. Las digestiones con cada una de estas enzimas fueron hibridadas con las diez sondas usadas en los blots precedentes y la información derivadas de estas hibridaciones fue combinada con los datos descritos anteriormente para crear un mapa detallado de restricción de la inserción de T-ADN y el ADN genómico de maíz circundante en DP-32138-1 (Figura 3). Las digestiones dobles adicionales fueron llevadas a cabo con SamH UHind III y Bgl WIHind III para aclarar las partes de la inserción como se ven con las digestiones individuales de SamH I y Bgl II.

Existe un sitio de Hind III en el T-ADN de PHP24597, ubicado entre el borde derecho y el promotor 5126 a bp 179 (Figura 2). Todas las sondas usadas en este estudio se hibridarían con un fragmento de borde individual de más de aproximadamente 9800 bp (Tabla 6).

La hibridación de ADN digerido por Hind III de DP-32138-1 con las sondas usadas en este estudio formó una banda derivada de inserción individual de más de 8600 bp, con la excepción de la sonda del promotor Pg47 (Tabla 6). Además de las bandas derivadas de inserción, la hibridación endógena se observó en las digestiones de Hind III con las sondas del promotor 5126, Ms45, promotor Pg47, zm-bt1, zm-aa1, y terminador In2-1, que se indican en la Tabla 6 por un asterisco (*) y sombreado gris. En el caso de la sonda del promotor Pg47, la banda derivada de inserción fue oscurecida por una serie de bandas endógenas muy intensas por sobre el marcador de peso molecular de 8600 bp. Sin embargo, como no hubo otras bandas presentes en las plantas DP-32138-1 que se pudieron determinar desde la inserción, las sondas flanqueadoras Ms45 y zm-bt1 se hibridaron con la misma banda mayor a 8600 bp, es posible que la banda de sonda del promotor Pg47 es de hecho del tamaño esperado a partir de las otras hibridaciones pero es meramente enmascarado por las bandas endógenas. Como se discute con antelación para el análisis Xho I y EcoR I con la sonda Pg47, se determinó que una copia intacta individual de este elemento fue insertada en el maíz DP-32138-1. Como un marcador de peso molecular superior es de 8600 bp, y la banda Hind III se ubica por sobre la banda del marcador, el tamaño exacto de la banda Hind III no se puede determinar, aunque parece lo suficientemente grande para exceder su tamaño mínimo esperado de 9800 bp. Los datos adicionales, como se revelan a continuación en las digestiones dobles de Hind III, muestran que el sitio de Hind III en el genoma está ubicado aproximadamente 1200 a 1400 bp más allá del borde izquierdo de la inserción de DP-32138-1 brindando evidencia que la inserción está intacta a partir de la posición del par de base 179.

Existen cuatro sitios de restricción para BamH I en el T-ADN de PHP24597, ubicado en las posiciones de bp 1456, 4271 , 6773 y 8792 (Figura 2). La digestión con esta enzima generará cinco fragmentos esperados para una inserción de T-ADN individual: un fragmento de borde de más de aproximadamente 1500 bp que se híbrida con las sondas del promotor 5126 y Ms45, un fragmento interno de 2815 bp que se híbrida con la sonda Ms45, un fragmento interno de 2502 bp que se híbrida con las sondas del promotor Pg47, zm-bt1 y zm-aa1, un tercer fragmento interno de 2019 bp que se hibridaría con las sondas de zm-aa1, In2-1, reforzador 35S y promotor Ltp2 y un segundo fragmento de borde de más de aproximadamente 1200 bp que se hibridaría con las sondas de DsRed2 y terminador pin\\ (Tabla 7). Aunque el sitio de BamH I en la ubicación de bp 4271 se ubica en el elemento del promotor Pg47, y por ende la sonda completa del promotor Pg47 se hibridaría tanto con los fragmentos de bp 2815 como con los y 2502, solamente el fragmento de bp 2502 sería visto con la sonda del promotor Pg47 de 424 bp que se usó en este estudio debido a su ubicación en el extremo 3' del elemento (Tabla 7).

Una banda de aproximadamente 3800 bp fue observada ante la hibridación de ADN digerido por BamH I de DP-32138-1 con las sondas del promotor 5126 y Ms45 (Tabla 7). La banda interna esperada de 2815 bp también fue observada con la sonda de Ms45 (Tabla 7). La hibridación con las sondas del promotor Pg47, zm-bt1 y zm-aa1 generó una banda de 2502 bp que combinó con la banda de control del plásmido (Tabla 7). La sonda zm-aa1 también se híbrido con to una banda interna de 2019 bp que se combinó con la banda del plásmido, como lo hizo la sonda del terminador In2-1, reforzador 35S, y promotor Ltp2 (Tabla 7). Las bandas endógenas fueron observadas con todas las sondas en los casetes de Ms45 y zm-aa1. Las dos bandas de borde fueron observadas con las sondas de DsRed2 y terminador pin\\: una banda de firme hibridación de aproximadamente 4600 bp y una banda muy débil de aproximadamente 6100 bp (Tabla 7). La Tabla 7 brinda las bandas esperadas y observadas vistas con esta digestión. A fin de investigar la posibilidad de que la banda débil de 6100 bp generada de la digestión bloqueada del sitio de BamH I genómico que generó la banda de 4600 bp, una digestión doble con BamH \IHind III se realizó como se describe a continuación.

Para demostrar que la segunda banda débil de aproximadamente 6100 bp vista con la digestión de BamH I y las sondas de DsRed2 y terminador pin\\ se debió a la digestión bloqueada en el sitio de BamH I en el genoma de maíz, una digestión doble fue realizada con BamH I y Hind III. Hind III fue seleccionado debido a la ubicación de su sitio de restricción en el genoma de maíz próximo a la unión de borde izquierdo de la inserción de DP-32138-1 como se describe en forma anterior. La digestión con estas dos enzimas debería formar un fragmento de borde de más de 1200 bp del sitio BamH I ubicado a bp 8792 en el T-ADN y sitio de Hind III en el genoma de maíz. Como el sitio de Hind III parece estar ubicado más próximo al borde izquierdo que el sitio de BamH I genómico, la digestión con ambas enzimas debería liberar un fragmento único individual que se híbrida con las sondas de DsRed2 y terminador pin\\ de una inserción individual de T-ADN. La presencia de solamente una banda individual con la digestión doble brindaría evidencia de que la segunda banda débil de aproximadamente 6100 bp en el I Southern blot de BamH se generó a partir del clivaje bloqueado en el sitio de BamH I genómico responsable para la banda de aproximadamente 4600 bp. Sin embargo, si las dos bandas son nuevamente observadas con digestión doble y estas dos sondas, sería evidencia de que existe más de una copia de los elementos.

La hibridación de ADN de maíz digerido por BamH MHinú III con las sondas del DsRed2 y terminador pin\\ generó una banda individual de aproximadamente 2600 bp en las plantas DP-32138-1 y ninguna otra banda (Tabla 8). Este fragmento de 2600 bp es más pequeño que el fragmento de aproximadamente 4600 bp observado en el análisis de BamH I y, por ende, se puede estimar que la ubicación del sitio genómico Hind III es de aproximadamente 1400 bp más allá de la unión de borde izquierdo y se ubica entre el borde izquierdo y el sitio de BamH I genómico. La falta de cualquier otra banda con digestión doble demuestra que existe solamente una copia de esta región del T-ADN de PHP24597 en el genoma de DP-32138-1. Asimismo, esto indica que la banda débil de aproximadamente 6100 bp vista con la digestión de BamH I se debe de hecho al corte bloqueado por esta enzima en el sitio de restricción ubicado más próximo a la unión de borde izquierdo en el genoma de maíz. Una explicación posible del clivaje bloqueado en este sitio de BamH I es la metilación del sitio de restricción o secuencia lindante con ADN que genera eficiencia reducida de digestión by BamH I (Brown, 1998). Las hibridaciones del ADN de maíz digerido por BamH UHind III con las sondas remanentes usadas para caracterizar el maíz de DP-32138-1 mostraron todas las bandas esperadas sobre la base del mapa del T-ADN de PHP24597.

Bgl II tiene tres sitios de restricción en el T-ADN de PHP24597, ubicado en las posiciones de bp 1713, 2519 y 7030 (Figura 2). La digestión del T-ADN insertado con Bgl II formará cuatro fragmentos: un fragmento de borde de más de aproximadamente 1700 bp que se híbrida con las sondas del 5126 promotor y Ms45, un fragmento interno de 806 bp que se híbrida con la sonda de Ms45, otro fragmento interno de 4511 bp que se híbrida con las sondas de Ms45, promotor Pg47, zm-bt1 y zm-aa1 y un tercer fragmento de borde de más de aproximadamente 2900 bp que se híbrida con las sondas del terminador In2-1, reforzador 35S, promotor Ltp2, DsRed2 y terminador pin\\ (Figura 2).

Todas las cuatro bandas esperadas con las varias sondas y el ADN digerido por Bgl II de DP-32138-1 fueron vistos en los Southern blots. Las sondas del promotor 5126 y Ms45 se hibridaron ambas con una banda de borde de aproximadamente 3600 bp (Tabla 9). La sonda de Ms45 también se híbrido con las dos bandas internas de 806 bp y 4511 bp que correspondía a las bandas de control del plásmido (Tabla 9). La banda de 4511 bp es débil debido a la superposición pequeña de aproximadamente 140 bp con la sonda de Ms45, mientras que la banda de 806 bp superpone una banda endógena de aproximadamente 800 bp, pero se puede detectar mediante la intensidad incrementada de la banda comparada con las corridas de la planta de control. La banda interna de 451 1 bp que combinó con la banda del plásmido también fue detectada usando las sondas del promotor Pg47, zm-bt1 y zm-aa1 (Tabla 9). La sonda del terminador In2-1 detectó una banda de borde de hibridación fuerte de aproximadamente 4900 bp (Tabla 9). Como con las otras digestiones, un número de bandas endógenas de varias intensidades fue detectado con todas las sondas de los casetes de Ms45 y zm-aa1. La hibridación con las sondas del reforzador 35S, promotor Ltp2, DsRed2, y terminador pin\\ generó la detección de dos bandas: una banda de borde de hibridación fuerte de aproximadamente 4900 bp y una banda muy débil de aproximadamente 7400 bp (Tabla 9). Es posible que la banda de 7400 bp generada de la digestión bloqueada del ADN genómico de maíz con Bgl II en el sitio que debería generar la banda de borde de 4900 bp, y una digestión doble con Bgl ll/H nd III fue realizada como se describe a continuación para evaluar esta hipótesis. Sobre la base del mapa del T-ADN de PHP24597 (Figura 2), es posible que la banda de 7400 bp también fuera detectada con la sonda del terminador In2-1, pero no se observó debido a la hibridación débil con esta banda y la presencia de bandas endógenas en esa región del blot.

Similar al análisis de BamH \IHind III descrito con anterioridad, se realizó una digestión doble con Bgl II y Hiñó III para demostrar que la segunda banda débil de aproximadamente 7400 bp vista con la digestión de Bgl II y las sondas del reforzador 35S, promotor Ltp2, DsRed2 y terminador p/'nll se debía a la digestión bloqueada en el sitio Bgl II en el genoma de maíz. La digestión con estas dos enzimas y la hibridación con las sondas del reforzador 35S, promotor Ltp2, DsRed2 y terminador pin\\ debería formar un fragmento de borde de más de 2900 bp del sitio Bgl II ubicado a bp 7030 y el sitio de Hind III en el genoma del maíz. Como el sitio de Hind III parece estar ubicado más próximo al borde izquierdo que el sitio de Bgl II genómico, la digestión con ambas enzimas debería liberar un fragmento único, individual, que se híbrida con estas sondas a partir de una inserción de T-ADN individual. La presencia de solamente una banda individual con la digestión doble brindaría evidencia de que la segunda banda débil de aproximadamente 7400 bp en el Southern blot del Bgl II sí se genera del clivaje bloqueado en el sitio de Bgl II genómico responsable de la banda de aproximadamente 4900 bp. Sin embargo, si dos bandas se observan nuevamente con la digestión doble y estas dos sondas, sería evidencia de que hay más de una copia de estos elementos.

La hibridación del ADN de maíz digerido por Bgl MI Hind III con las sondas del reforzador 35S, promotor Ltp2, DsRed2 y terminador pin\\ generó una banda individual de aproximadamente 4100 bp en las plantas de DP-32138-1 (Tabla 10). Este fragmento de 4100 bp es más corto que el fragmento de aproximadamente 4900 bp observado en el análisis de Bgl II y las posiciones en el sitio de Hind III genómico entre la unión de borde izquierdo y el sitio de Bgl II, en aproximadamente 1200 bp del borde. Asimismo, la falta de cualquier otra banda relacionada con la inserción con la digestión doble demuestra que existe solamente una copia de esta región del T-ADN de PHP24597 en el genoma de DP-32138-1 , y que la banda débil de aproximadamente 7400 bp vista con la digestión de Bgl II solamente es posible debido al corte bloqueado por esta enzima en el sitio en el genoma de maíz ubicado más próximo a la unión de borde izquierdo. Una posible explicación para esta digestión bloqueada en este sitio de Bgl II es la metilación del sitio de restricción o secuencia lindante con ADN que genera la eficiencia reducida de digestión por Bgl II (Brown, 1998). Las hibridaciones del ADN de maíz digerido por Bgl WIHind III con las sondas remanentes usados para caracterizar el maíz DP-32138-1 todas mostraron que las bandas esperadas sobre la base del mapa del T-ADN de PHP24597. La diferencia entre la ubicación del sitio de restricción de Hind III genómico determinada con el Southern blot de Bgl WIHinú III (1200 bp del borde izquierdo) y el análisis de BamH UHinú III (1400 bp del borde izquierdo) es posible debido a los cambios en la movilidad electroforética entre Southern blots y la falta de certeza inherente de la aproximación al tamaño de banda basado en los marcadores DIG VII usados en este estudio.

La información obtenida de las digestiones de Hinú III, BamH I, Bgl II, BamH MHinú III, y Bgl WIHinú III se combinó con los datos derivados de los blots de Bmt I, Xho I, y EcoR I para generar un mapa de restricción de la inserción de T-ADN y el genoma de maíz circundante (Figura 3). Las digestiones e hibridaciones son consistentes con la presencia de un T-ADN de PHP24597 individual, intacto en el genoma de maíz DP-32138-1.

Ejemplo 1 Conclusiones El análisis Southern blot fue realizado en el maíz DP-32138-1 para confirmar la integridad y número de copia de inserción y para generar un mapa de enzima de restricción físico de la inserción. Las muestras de ADN genómico a partir de plantas individuales de maíz DP-32138-1 fueron analizadas por digestión con las enzimas de restricción BamH I, Bgl U, Bmt I, EcoR I, Hiñó III, y Xho I y digestiones dobles con BamH MHinú III y Bgl WIHinú III. Estas digestiones fueron hibridadas con sondas con la región genómica Ms45 y los genes zm-aa1 y DsRed2(Alt1, junto con los elementos genéticos remanentes en el T-ADN que incluye el promotor 5126, Pg47 promotor, péptido de tránsito zm-bt1, terminador In2-1, reforzador CaMV 35S, promotor Ltp2, y terminador pin\\. El análisis con Bmt I y Xho I, sitios de examen en el genoma de borde, indicaron que una copia intacta individual del T-ADN de PHP24597 está presente en el maíz DP-32138-1. El análisis de EcoR I indicó que el de T-ADN PHP24597 se había insertado intacto en el genoma, ya que los sitios de restricción de EcoR I interno estaban presentes. El análisis con las enzimas remanentes fue usado junto con estos datos para crear un mapa de restricción físico de la inserción de T-ADN en el maíz DP-32138-1.

Tabla 1: Descripción de sondas de ADN usadas para hibridación Southern 1. La posición de la sonda se basa en el mapa del T-ADN de PHP24597 (Figura 2). 2. La posición de la sonda se basa en el mapa del plásmido de PHP24597 (Figura 1 ). 3. La sonda de Ms45 está comprendida por tres fragmentos marcados que no se superponen que están combinados en la solución de hibridación. 4. La sonda de zm-aa 1 está comprendida por dos fragmentos marcados que no se superponen que están combinados en la solución de hibridación. 5. La sonda zm-bt1-aa 1 está comprendida por dos fragmentos marcados que no se superponen que están combinados en la solución de hibridación. Esta sonda fue utilizada solamente para el análisis Southern blot preliminar.

Tabla 2: Resultados del análisis de reacción en cadena de la polimerasa evento-específica y análisis southern blot preliminare plantas cultivadas a partir de semillas de sustancia de evaluación 1. Un resultado positivo indica la amplificación por sobre un umbral CT de la secuencia blanco de DP-32138-1 en la planta. Un resultado negativo indica que no hubo amplificación por sobre el umbral CT de la secuencia blanco de DP-32138-1 en la planta. Una determinación positiva o negativa indica que la referencia endógena de maíz en la planta fue amplificada. 2. Un resultado positivo indica la presencia de la banda para Ms45, zm-bt1-aa1 , o DsRed2(Alt1) en el Southern blot, mientras un resultado negativo indica la ausencia de la banda apropiada.

Tabla 3: Bandas de hibridación predichas y observadas en Southern Blots; Digestión de Bmt I Nota: Un asterisco (*) y sombreado gris indica que la banda designada se debe a la hibridación con secuencias y plantas de contro . 1. Tamaño predicho para hibridación de sonda con ADN genómico de maíz DP-32138-1 que contiene una inserción de T-ADN completa basada en el mapa del T-ADN de PHP24597 (Figura 2). Los tamaños de fragmentos de borde se redondean al 100 bp más próximo. 2. Tamaño predicho para hibridación de sonda con plásmido PHP24597 basado en el mapa plásmido de PHP24597 (Figura 1 ). 3. Los tamaños de fragmento observados son aproximados a partir de los fragmentos del marcador VII de peso molecular de ADN marcado por DIG. Debido a la incapacidad de determinar tamaños exactos en el blot, todos los valores aproximados son redondeados al 100 bp más próximo. 4. Los fragmentos de borde son aquellos en los cuales un sitio de restricción está en el T-ADN insertado y el otro sitio está ubicado en el ADN genómico flanqueador, que brinda un fragmento de tamaño único para una determinada inserción. 5. La banda endógena de ~2500 bp es vista con solamente una de las DP plantas -32138-1 y las plantas de control Hi II.

Tabla 4: Bandas de hibridación predichas y observadas en Southern Blots; Digestión de Xho / 5. El tamaño observado es el mismo que el tamaño esperado debido a la migración equivalente a la banda del plásmido.

Tabla 5: Bandas de hibridación predichas y observadas en Southern Blots; Digestión de EcoR I s, Tamaño predicho para sonda de hibridación con ADN genómico de maíz DP-32138-1 que contiene una inserción de T-ADN completa sobre la base del mapa del T-ADN de PHP24597 (Figura 2). Los tamaños de los fragmentos de borde se redondean al 100 bp más próximo.

Tamaño predicho para hibridación de sonda con el plásmido PHP24597 sobre la base del mapa plásmido de PHP24597 (Figura 1 ).

Los Tamaños de fragmentos observados son aproximados a partir de los fragmentos del marcador VII de peso molecular de ADN marcado por DIG en los Southern blots. Debido a la incapacidad para determinar tamaños exactos en el blot, todos los valores aproximados se redondean al 100 bp más próximo. 4. El tamaño observado es el mismo que el tamaño esperado debido a la migración equivalente a la banda del plásmido. 5. La banda endógena de -4300 bp es vista solamente en una de las plantas DP-32138-1 y una de las plantas de control Hi-ll.

Tabla 6: Bandas de hibridación predichas y observadas en Southern Blots; Digestión de Hind /// hibridación con las secuencias endógenas, plantas de control. 1. Tamaño predicho para hibridación de sonda con ADN genómico de maíz DP-32138-1 que contiene una inserción de T- ADN completa sobre la base del mapa del T-ADN de PHP24597 (Figura 2). Los tamaños de los fragmentos de borde se redondean al 100 bp más próximo.

Tamaño predicho para hibridación de sonda con plásmido PHP24597 sobre la base del mapa plásmido de PHP24597 (Figura 1).

Los tamaños de fragmentos observados son aproximados a partir de los fragmentos del marcador VII de peso molecular de ADN marcado por DIG en los Southern blots. Debido a la incapacidad para determinar tamaños exactos en el blot, todos los valores aproximados se redondean al 100 bp más próximo.

Los fragmentos de borde son aquellos en los que un sitio de restricción está en el T-ADN insertado y el otro sitio está ubicado en el ADN genómico flanqueador, brindando un fragmento de tamaño único para una determinada inserción. El tamaño esperado de este fragmento es >9800 bp sobre la base del mapa de T-ADN de PHP24597 (Figura 2). Sin embargo, como la banda de marcador de peso molecular más grande en el blot es -8600 bp, y la banda funciona por sobre este marcador, el tamaño observado de la banda se Informa como >8600bp.

Las bandas endógenas de >8600 bp y -3800 bp son vistas en solamente una de las plantas DP-32138-1 y las plantas de control Hi-ll y H\-\\(ms45).

Bandas de hibridación predichas y observadas en Southern Blots; Digestión Nota: Un asterisco (*) y sombreado gris indica que la banda designada se debe a hibridación con las secuencias de con ro . 1. Tamaño predicho para hibridación de sonda con ADN genómico de maíz DP-32138-1 que contiene una inserción de T-ADN completa sobre la base del mapa del T-ADN de PHP24597 (Figura 2). Los tamaños de los fragmentos de borde se redondean al 100 bp más próximo. 2. Tamaño predicho para hibridación de sonda con plásmido PHP24597 sobre la base del mapa plásmido de PHP24597 (Figura 1 ). 3. Los tamaños de fragmentos observados son aproximados a partir de los fragmentos del marcador VII de peso molecular de ADN marcado por DIG en los Southern blots. Debido a la incapacidad para determinar tamaños exactos en el blot, todos los valores aproximados se redondean al 100 bp más próximo. 4. Los fragmentos de borde son aquellos en los que un sitio de restricción está en el T-ADN insertado y el otro sitio está ubicado en el ADN genómico flanqueador, brindando un fragmento de tamaño único para una determinada inserción. 5. Tamaño observado es el mismo que el tamaño esperado debido a la migración equivalente a la banda del plásmido.

Tabla 8: Bandas de hibridación predichas y observadas en Southern Blots; Digestión de BamH l/Hind III 1. Tamaño predicho para hibridación de sonda con ADN genómico de maíz DP-32138-1 que contiene una inserción de T-ADN completa sobre la base del mapa del T-ADN de PHP24597 (Figura 2). Los tamaños de los fragmentos de borde se redondean al 100 bp más próximo. 2. Tamaño predicho para hibridación de sonda con plásmido PHP24597 sobre la base del mapa plásmido de PHP24597 (Figura 1 ). 3. Los tamaños de fragmentos observados son aproximados a partir de los fragmentos del marcador VII de peso molecular de ADN marcado por DIG en los Southern blots. Debido a la incapacidad para determinar los tamaños exactos en el blot, todos los valores aproximados se redondean al 100 bp más próximo. 4. Los fragmentos de borde son aquellos en los que un sitio de restricción está en el T-ADN insertado y el otro sitio está ubicado en el ADN genómico flanqueador, brindando un fragmento de tamaño único para una determinada inserción.

Tabla 9: Bandas de hibridación predichas y observadas en Southern Blots; Digestión de Bgl // Nota: Un asterisco (*) y sombreado gris indica que la banda d 7e7signada se debe a hibridación con las secuencias endógenas, como se puede determinar por la presencia de la misma banda en DP-32138-1 y plantas de control.

ADN completa sobre la base del mapa del T-ADN de PHP24597 (Figura 2). Los tamaños de los fragmentos de borde se redondean al 100 bp más próximo. 2. El tamaño predicho para hibridación de sonda con plásmido PHP24597 sobre la base del mapa plásmido de PHP24597 (Figura 1). 3. Los tamaños de fragmentos observados son aproximados a partir de los fragmentos del marcador VII de peso molecular de ADN marcado por DIG en los Southern blots. Debido a la incapacidad para determinar tamaños exactos en el blot, todos los valores aproximados se redondean al 100 bp más próximo. 4. Los fragmentos de borde son aquellos en los que un sitio de restricción está en el T-ADN insertado y el otro sitio está ubicado en el ADN genómico flanqueador. brindando un fragmento de tamaño único para una determinada inserción. 5. El tamaño observado es el mismo que el tamaño esperado debido a la migración equivalente a la banda del plásmido. 6. La banda superpone una banda endógena pero puede detectarse por intensidad incrementada de hibridación. 7. La banda endógena de -2900 bp es vista solamente en una de las plantas DP-32138-1 y la planta de control 705.

Tabla 10: Bandas de hibridación predichas y observadas en Southern Blots; Digestión de Bgl IIIHmd III 1. Tamaño predicho para hibridación de sonda con ADN genómico de maíz DP-32138-1 que contiene una inserción de T-ADN completa sobre la base del mapa del T-ADN de PHP24597 (Figura 2). Los tamaños de los fragmentos de borde se redondean al 100 bp mas próximo. 2. El tamaño predicho para hibridación de sonda con plásmido PHP24597 sobre la base del mapa plásmido de PHP24597 (Figura 1 ). 3. Los tamaños de fragmentos observados son aproximados a partir de los fragmentos del marcador VII de peso molecular de ADN marcado por DIG en los Southern blots. Debido a la incapacidad para determinar tamaños exactos en el blot, todos los valores aproximados se redondean al 100 bp más próximo. 4. Los fragmentos de borde son aquellos en los que un sitio de restricción está en el T-ADN insertado y el otro sitio está ubicado en el ADN genómico flanqueador, brindando un fragmento de tamaño único para una determinada inserción.

Tabla 11 : Descripción de elementos genéticos en Plásmido PHP24597 genoma Gen de virulencia importante para 37263 a 38066 virG 804 inserción de T-ADN en el genoma Gen de virulencia importante para 38198 a 47633 virB 9436 inserción de T-ADN en el ? genoma Origen bacteriano de región de 49934 a 50303 colE1 orí 370 replicación (£. coli) (Tomizawa y otros, 1977) Sitio eos; extremos cohesivos de 51400 a 51412 eos 13 ADN de bacteriófago lambda (Komari y otros, 1996) Tabla 12: Descripción de elementos genéticos en la región de T-ADN de Plásmido PHP24597 zm-bt1 péptido de tránsito que dirige amiloplasto del gen 5469 a 5693 Péptido de 225 de maíz Brittle-1 (Sullivan y otros, 1991 ) tránsito zm-aa1 5694 a 6956 1263 Gen a-amilasa de maíz Gene Región de Región requerida para clonar elementos 6957 a 7033 77 policlonaje genéticos Terminador Secuencia terminadora del gen In2-1 de maíz 7034 a 7377 344 In2-1 (Hershey y Stoner, 1991 ) Región de Región requerida para clonar elementos 7378 a 7411 34 policlonaje genéticos Región reforzadora del genoma de virus del Reforzador 7412 a 7849 438 mosaico del coliflor (Franck y otros, 1980; Odell y CaMV 35S otros, 1985).

Región de Región requerida para clonar elementos 7850 a 7905 56 policlonaje genéticos Ejemplo 2. Secuenciación de la región de T-ADN de PHP24597 SEQ ID NO: 20 provee la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la traducción de los exones empalmados del gen Ms45 del plásmido PHP24597. La proteína MS45 de longitud completa es de 412 aminoácidos de longitud y pesa aproximadamente 47 kDa.

SEQ ID NO: 21 provee la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la traducción del péptido de tránsito zm-bt1 + región zm-aa1 del plásmido PHP24597. Los aminoácidos en las posiciones 1-75 comprenden el péptido de tránsito. El producto completo de traducción, que incluye el péptido de tránsito es de 495 aminoácidos de longitud y pesa aproximadamente 54 kDa. La proteína ZM-AA1 procesada, con el péptido de tránsito extraído, es de 420 aminoácidos de longitud y pesa aproximadamente 46 kDa.

SEQ ID NO: 33 provee la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la traducción del gen DsRed2(Alt1) del plásmido PHP24597. La proteína DsRed2 es de 225 aminoácidos de longitud y pesa aproximadamente 26 kDa.

SEQ ID NO: 1 provee la secuencia de la inserción de T-ADN más las regiones de borde genómicas en el maíz 32138.

Ejemplo 3. Análisis por reacción en cadena de la polimerasa (PC ) del evento de maíz DP-32138-1 La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de las uniones únicas que empalman los elementos genéticos introducidos puede distinguir las plantas de maíz 32138 de sus contrapartes no modificadas genéticamente y puede ser usada para examinar la presencia del T-ADN insertado. El propósito de este estudio fue verificar la efectividad y confiabilidad de un ensayo por PCR específico de construcción en ADN genómico de un tejido de la hoja de maíz 32138, y evaluar la sensibilidad de este método.

Diseño experimental El ADN genómico del tejido de hoja de la sustancia de evaluación (semilla de maíz 32138: lote# T-F-07-132C) y la sustancia de control (semilla de un maíz no modificado genéticamente con un entorno genético representativo del entorno del evento: lote# C-F-07-131 C) fue aislado y sometido a amplificación por PCR cualitativa usando un par de cebadores específicos de construcción. Los productos de la PCR fueron separados en 2% de gel agarosa para confirmar la presencia de la construcción insertada en el ADN genómico aislado a partir de la sustancia de evaluación y la ausencia de la construcción insertadas en el ADN genómico aislado a partir de la sustancia de control. Un estándar de referencia (Low ADN Mass Ladder; Invitrogen Corporation Catálogo # 10380-012) fue usado para determinar el tamaño del producto de la PCR. La confiabilidad del método de PCR específico de construcción se evaluó al repetir el experimento tres veces. La sensibilidad de la amplificación por PCR se evaluó mediante varias diluciones del ADN genómico del evento DP-32138-1.

Extracción de ADN Las muestras de evaluación y control de la hoja (estadio de la hoja V5-V7) fueron cosechadas a partir de plantas cultivadas en la DuPont Experimental Station (Wilmington, DE) de semillas obtenidas de Pioneer Hi-Bred International, a DuPont Company (Johnston, IA). La extracción de ADN genómico a partir de los tejidos de hoja de evaluación y control fue realizada usando un protocolo de extracción de urea estándar.

El ADN genómico fue cuantificado usando el espectrofotómetro NanoDrop® 1000 que usa el programa ND-1000 V3.6 (ThermoScientific, Wilmington, DE). Las muestras de ADN fueron visualizadas en un gel agarosa para confirmar valores de cuantificación y para determinar la calidad del ADN.

Reacción en cadena de la polimerasa El ADN genómico aislado de una hoja de maíz 32138 y las muestras de control fueron sometidos a amplificación por PCR (AccuPrime Taq ADN Polimerase High Fidelity, Invitrogen Corporation Catálogo # 12346) que utiliza el par de cebadores específicos de construcción 08-0-2544/08-0-2582 (SEQ ID NOS: 2 y 3; Tabla 17) que dirige las secuencias del promotor 5126 y Ms45 genómico de maíz y permite la identificación única de maíz 32138. El tamaño esperado del producto de la PCR que usa el par de cebadores es de 233 bp. Un segundo conjunto de cebadores, 02-O-197/02-O-198 (SEQ ID NOS: 4 y 5; Tabla 17) fue usado para amplificar el gen invertasa de maíz endógeno (número de acceso de GenBank AF171874.1 ) como control positivo para amplificación por PCR. El tamaño esperado del producto de la PCR que usa este par de cebadores es de 225 bp. Los reactivos de PCR y condiciones de reacción se ilustran en la Tabla 13. En este estudio, 50 ng de ADN genómico de hoja fue usado en todas las reacciones PCR.

Tabla 13: Reactivos de PCR y condiciones de reacción Reactivos de PCR condiciones de reacción de PCR Volumen Temp Tiempo # de Reactivo (MU Elemento del ciclo (°C) (seg) ciclos ADN del templado Desnaturalización 1 94 120 1 (50 ng/µ?) inicial Cebador 1 (10 µ?) 2 Desnaturalización 94 15 Cebador 2 (10 µ ) 2 Alineamiento 60 20 35 Mezcla maestra de PCR * 5 Elongación 68 60 ddH20 39,7 Elongación Final 68 420 1 Ciclo de Hasta Polimerasa** 0,3 4 mantenimiento análisis PCR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA DDH20: AGUA DOBLE DESTILADA *10X AccuPrime PCR Tampón II "AccuPrime Taq ADN Polimerase High Fidelity Análisis por PCR específico de construcción para maíz 32138 Un producto de la PCR de aproximadamente 230 bp en tamaño amplificado por el conjunto de cebadores específicos de construcción 08-0-2544/08-0-2582 fue observado en las reacciones PCR que usan plásmido PHP24597 (50 ng) como templado y todas las muestras de ADN de maíz 32138, pero ausente en todas las muestras de control de maíz y el control no templado. Este experimento fue repetido tres veces y se obtuvieron resultados similares. La Figura 7 representa resultados observados para los extractos de ADN a partir de cinco plantas de maíz 32138 y cinco plantas de maíz de control. Estos resultados corresponden de manera estrecha con el tamaño esperado del producto de la PCR (233 bp) para muestras que contienes ADN genómico de maíz 32138. Un producto de la PCR de aproximadamente 220 bp en tamaño fue observado tanto para las muestras de maíz 32138 como para las de maíz de control después de la reacción PCR con el conjunto de cebadores 02-O- 97/02-O-198 para detección del gen invertasa de maíz endógeno (Figura 8). Estos resultados corresponden en forma estrecha con el tamaño del producto de la PCR (225 bp) para muestras de ADN genómico que contiene el gen invertasa de maíz endógeno. La banda blanco endógena no fue observada en el control no templado.

Sensibilidad del análisis por PCR específico de construcción para maíz 32138 A fin de evaluar la sensibilidad de la amplificación por PCR, varias concentraciones de una muestra de ADN individual de la planta de maíz 32138 fueron agregadas a un ADN de control no modificado genéticamente, que genera cantidades de ADN de maíz 32138 que oscilan entre 50 ng y 500 fg (la cantidad total del ADN genómico en todas las muestras de PCR fue de 50 ng). Cada dilución fue sometida a amplificación por PCR como se realizó anteriormente. Sobre la base de este análisis, el límite de detección (LOD) fue determinado como de aproximadamente 50 pg de ADN de maíz 32138 en 50 ng de ADN total, o 0,1 % de ADN de maíz 32138 (Figura 9). Esta sensibilidad es suficiente para muchas aplicaciones de examen.

Ejemplo 3: Conclusiones El análisis por PCR cualitativo que utiliza un conjunto de cebadores específico de construcciones para maíz 32138 confirmaron que las plantas de evaluación contenían el T-ADN insertado de PHP24597, como lo evidenció la presencia de la banda blanco específica de construcción en todas las muestras de planta de evaluación analizadas, y la ausencia en las plantas de control no modificadas genéticamente. Este resultado fue reproducible. Las plantas de control y evaluación contuvieron ambas el gen invertasa de maíz endógeno. La sensibilidad predicha del análisis bajo las condiciones descritas es de 0,1 % de ADN de maíz 32138.

Ejemplo 4. Secuenciamiento del ADN insertado y regiones flanqueadoras del evento 32138 Los análisis Southern blot indicaron que un T-ADN intacto individual del plásmido PHP24597 fue insertado en el genoma de maíz para producir maíz 32138; véase, Ejemplo 1. Este ejemplo brinda la secuencia del T-ADN insertado en el maíz 32138 y además confirma que un T-ADN intacto individual fue insertado en el genoma de maíz con una inserción de T-ADN parcial de 23 bp o 27 bp en la región de borde genómica 5'. Asimismo, este ejemplo describe la clonación y secuenciamiento de las regiones de borde genómicas realizados para obtener una secuencia de ADN que podría ser usada para identificar en forma única el maíz 32138.

Se determinó que la secuencia de las regiones de borde genómicas y de inserción confirman la integridad del ADN insertado y caracterizan la secuencia genómica flanqueadora del sitio de inserción presente en el maíz 32138. En total, fueron confirmados 13998 bp de secuencia genómica de maíz 32138, comprendiendo 21 14 bp de la secuencia de borde genómica 5', 2002 bp de la secuencia de borde genómica 3', y 9882 bp del T-ADN insertado de PHP24597. Se encontró que el T-ADN insertado en maíz 32138 tiene una deleción de 45 bp en el extremo de borde derecho (RB) y una deleción de 23 bp en el extremo de borde izquierdo (LB). Además, una inserción parcial de T-ADN de 23bp está ubicada en las posiciones 2092-21 14 de la secuencia de borde genómica 5' indicada. La secuencia que rodea esta inserción parcial comprende secuencias de unión adicionales únicas para el maíz 32138 y las que se pueden usar para identificar de manera específica el evento 32138. Toda la secuencia transgénica remanente indicada en las posiciones 2115 a 1 1.996 está intacta y es idéntica al T-ADN del plásmido PHP24597.

Se verificó que las regiones de borde genómicas 5' y 3' del maíz 32138 tenían origen en el maíz mediante amplificación por PCR y secuenciación de las regiones de borde genómicas tanto de las plantas de maíz 32138 como de las plantas de control. En general, la caracterización de la secuencia de borde genómica y de inserción en el maíz 32138 confirma que una inserción intacta individual del T-ADN de plásmido PHP24597 está presente en el de genoma maíz con una inserción parcial de T-ADN de 23 bp o 27 bp en la región de borde genómica 5'.

Sustancia de evaluación La sustancia de evaluación se define como semilla de maíz que contiene el evento DP-32138-1 obtenido a partir de una generación T1 S1 de maíz 32138. Solamente los granos rojos fueron seleccionados para uso en el estudio. Otros detalles relacionados con la fuente de la semilla se brindan en el Ejemplo 1.

Todas las semillas fueron obtenidas de Pioneer Hi-Bred International, Inc. (Pioneer, Johnston, IA) y la información de pedigrí se encuentra en archivo con los reproductores empleados. El número de log es T-F-07-132C.

Sustancia de control La sustancia de control se define como una línea de semilla de maíz que no contiene el maíz 32138. La línea de maíz no modificada tiene un entorno genético representativo del entorno del evento; sin embargo, no contiene los casetes de genes Ms45, zm-aa1 y DsRed2 (Alt1). El número de log es C-F-07-131C. Otros detalles se brindan en el Ejemplo 1.

El Low ADN Mass Ladder (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), High ADN Mass Ladder (Invitrogen Corp.), y el GeneRuler 1 kb ADN Ladder (Fermentas, Glen Burnie, MD) fueron usados para electroforesis de gel para estimar el tamaño de ADN de los fragmentos en geles agarosa.

Cultivo de plantas y recolección de muestras La semilla de maíz 32138 y la semilla de control fueron plantadas en las cámaras de cultivo del Regulatory Science en la DuPont Experimental Station (Wilmington, DE) para producir tejidos vegetales para este estudio. Una semilla fue plantada por maceta, y la maceta fue identificada de manera única. Todas las plantas fueron cultivadas con luz, temperatura, y agua reguladas para el cultivo de planta saludable.

Las muestras de hojas fueron recolectadas a partir de cada una de las plantas de control y plantas de maíz 32138. Para cada muestra, suficiente material de hoja con respecto al punto de cultivo fue recolectado y ubicado en una bolsa de muestra pre-rotulada. Las muestras fueron ubicadas en hielo seco y transferidas a un congelador (<-55 °C) después de la recolección. Todas las muestras se mantuvieron congeladas hasta el procesamiento. Todas las muestras de hoja fueron rotuladas en forma única con el identificador de planta y la fecha de cosecha.

Confirmación del genotipo mediante análisis por PCR específico de evento Una muestra de hoja fue tomada a partir de todas las plantas de control y evaluación para análisis por PCR específico de evento. El ADN fue extraído a partir de cada muestra de hoja usando el kit de PCR de Extract-N-Amp™ que usa el procedimiento descrito (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

La PCR en tiempo real fue realizada en cada muestra de ADN utilizando un sistema de detección de secuencia 7500HT ABI PRISM® (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Se diseñaron conjuntos de cebadores y sondas TaqMan® para detectar una secuencia blanco a partir del maíz 32138. Asimismo, una segunda sonda TaqMan® y conjunto de cebadores para un gen endógeno de maíz de referencia fue usado para confirmar la presencia de ADN amplificable en cada reacción. El análisis consistió de determinación por PCR en tiempo real de pruebas cualitativas positivas/negativas. El ADN extraído se evaluó usando concentraciones de cebadores y sondas optimizadas y validadas en TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG (Applied Biosystems, Inc.). La incubación inicial se realizó a 95 °C durante 10 minutos seguido de 40 ciclos de la siguiente manera: 95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 minuto.

La determinación positiva o negativa para el maíz 32138 se basó en la comparación del CT (ciclo de umbral) de la PCR blanco evento-específica con la del blanco de referencia endógena del maíz. Si los blancos del evento y PCR endógenos se amplificaron por sobre el umbral CT, entonces la planta fue puntuada como positiva para ese evento. Si el blanco endógeno se amplificó y el evento no lo hizo, entonces la planta fue puntuada como negativa. Si ningún blanco se amplificó para una muestra particular, entonces se determinó que era una muestra de calidad pobre o no funcionó, y el ensayo fue repetido.

Extracción y cuantificación de ADN Las muestras de hoja congeladas (cantidades de 1-2 gramos) fueron trituradas, y el ADN genómico fue aislado usando un procedimiento de tampón de extracción de urea estándar. Después de la extracción, el ADN fue visualizado en un gel agarosa para determinar la calidad del ADN, y fue cuantificado usando el espectrofotometro NanoDrop 1000 y programa ND-1000 V3.6 (ThermoScientific, Wilmington, DE).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Los cebadores PCR fueron sintetizados por IDT (Coralville, IA) y usados a una concentración de 0,2 - 0,4 µ? con 30 - 250 ng de ADN genómico como templado en una reacción PCR. El ADN aislado de cinco plantas de maíz 32138 fue usado como ADN del templado. Los productos de la PCR fueron clonados y secuenciados a partir de cuatro de las cinco plantas de maíz 32138. Las siguientes regiones fueron amplificadas por PCR a partir del ADN genómico aislado del maíz 32138: el T-ADN de la inserción PHP24597, la inserción 5' y 37uniones de borde genómicas, y las regiones de borde genómicas 5' y 3'. Los sistemas de PCR usados fueron: AccuPrime Taq ADN Polimerase High Fidelity (Invitrogen Corp.), High Fidelity PCR system (Roche, Mannheim, Germany), Expand Long Témplate PCR System (Roche) y Advantage®- GC2 genomic PCR mix (Clontech, Palo Alto, CA). Los productos de la PCR fueron visualizados bajo luz UV después de electroforesis a través de 1 - 2,5% gel de agarosa con 1 X TBE (o 1 X TAE) teñido con bromuro de etidio, o por 1 ,2% de E-Gel agarosa con SYBER® Green (Invitrogen Corp.) bajo una luz azul. Los productos fueron separados y purificados a partir del gel usando un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, Valencia, CA).

Clonación de los productos de la PCR Los productos de la PCR fueron clonados usando el kit TOPO TA Cloning® (vector pCR2.1-TOPO, Invitrogen) o pGem T-Easy Vector System (Promega). Los plásmidos fueron aislados usando QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), examinados por digestiones de enzima de restricción, y secuenciados.

Secuenciación de ADN Los fragmentos de ADN fueron clonados y sometidos a secuenciación en las instalaciones de secuenciación de Pioneer Crop Genetics Research (Wilmington, DE). El programa Sequencher™ de Gene Codes Corporation (Ann Arbor, Michigan) fue usado para ensamblar las secuencias. La anotación de secuencia fue realizada usando Vector NTI 9.1.0 (Invitrogen Corp) al comparar las secuencias de inserción de T-ADN generadas a partir del maíz 32138 con las secuencias de la región de T-ADN del plásmido PHP24597 (plásmido usado para transformación para producir maíz 32138).

Secuenciación del T-ADN de plásmido PHP24597 La región de T-ADN de plásmido PHP24597, usadas para crear maíz 32138, fue secuenciada y comparada con la secuencia insertada generada a partir de maíz 32138.

Secuenciación del T-ADN insertado en maíz 32138 Para verificación de la secuencia de ADN del T-ADN insertado del plásmido PHP24597 en maíz 32138, se diseñaron cebadores basados en la información de secuencia del T-ADN de plásmido PHP24597. Cinco productos de la PCR en superposición fueron generados usando ADN genómico de al menos cuatro plantas de maíz 32138 diferentes como templado en la PCR. Estos productos de la PCR fueron clonados y secuenciados a partir de las plantas de maíz 32138.

Secuenciación de regiones de borde genómicas flanqueadoras 5' y 3' La caracterización de secuencia inicial de la región de borde flanqueadora 5' y 3' se llevó a cabo usando varias rondas de PCR inversa (Silver y Keerikatte, (1989); Ochman, y otros, (1988); Triglia, y otros, (1988)), con cebadores anclados en varias regiones de los extremos 5' y 3' del T-ADN insertado. La información de secuencia obtenida a partir de PCR fue sometida a análisis BLASTn y mostró identidad con secuencia genómica de ADN de maíz (número de acceso de GenBank AC196124) del banco de nucleótidos GenBank de NCBI (National Center for Biotechnology Information). Esta secuencia se usó luego par diseñar cebadores que empalmaron las uniones genómicas/de inserción 5' y 3' del maíz 32138. Los productos de la PCR generados a partir del ADN genómico aislado de cuatro plantas de maíz 32138 fueron clonados y secuenciados para verificar las uniones genómicas/de inserción 5' y 3' y las regiones de borde genómicas. A fin de demostrar que las secuencias de borde genómicas 5' y 3' identificadas tenían origen en el maíz, se realizó PCR en esta región genómica 5' y 3' en ADN genómico de plantas de maíz 32138 y plantas de control. Los productos clonados de la PCR a partir de las cuatro plantas de maíz 32138 y dos plantas de control fueron secuenciados.

Confirmación de genotipo vía análisis por PCR específico de evento Todas las plantas individuales usadas para este estudio fueron evaluadas en cuanto a la presencia de la inserción de 32138 mediante un análisis por PCR específico de evento. Todas las plantas de maíz 32138 fueron positivas para la inserción, mientras que todas las plantas de control fueron negativas para la inserción. Los resultados de los ensayos por PCR evento-especifico para las plantas 32138 y plantas de control se resumen en la Tabla 13.

Caracterización de secuencia de ADN insertados y regiones de borde genómicas La información de secuencia de T-ADN de plásmido PHP24597 fue usada para diseñar cebadores para verificar la secuencia insertada en maíz 32138 (Tablas 14 y 15). Las secuencias preliminares obtenidas por PCR inversa a partir del ADN genómico de maíz 32138 fueron sometidas a análisis BLASTn y mostraron identidad con la secuencia de ADN genómico de maíz (número de acceso AC196124 de GenBank) del banco de nucleótidos de GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information). La información de secuencia de AC196124 se usó luego para diseñar cebadores para extender regiones de borde genómicas adicionales (Tablas 14 y 15).

Para caracterizar el T-ADN insertado en maíz 32138, los cebadores de PCR fueron diseñados para amplificar la inserción de T-ADN en cinco productos de la PCR en superposición separados: Fragmento A (07-0-2286/07-0-2277; SEQ ID NOS: 6 y 7), Fragmento B (08-0-2329/08-0-2398; SEQ ID NOS: 8 y 9), Fragmento C (08-0-2402/07-0-2024; SEQ ID NOS: 10 y 11), Fragmento D (08-0-2505/08-0-2504; SEQ ID NOS: 12 y 13), Fragmento E (08-0-2408/08-0-2526; SEQ ID NOS: 14 y 15) (Figura 10 y Tablas 15 y 16). Como se espera, los productos de la PCR predichos fueron generados solamente a partir de las muestras de ADN genómico de maíz 32138, y no estuvieron presentes en las muestras de control. Los cinco productos de la PCR de las plantas de maíz 32138 fueron clonados y secuenciados a partir de las cuatro plantas de maíz 32138. Al comparar la secuencia del T-ADN insertado en el maíz 32138 con la región del T-ADN de plásmido PHP24597 usado para crear maíz 32138, se determinó que había una deleción de 45 bp en el extremo de borde derecho, y una deleción de 23 bp en el extremo de borde izquierdo. Las deleciones de los términos de borde derecho y borde izquierdo a menudo ocurren en la transformación mediada por Agrobacterium (Kim, y otros, (2007) Plant J. 51 :779-791). Toda la secuencia remanente está intacta y es idéntica a la del plásmido PHP24597. La secuencia de la inserción se presenta en la SEQ ID NO: 1 y Figura 1 1.

Para verificar la secuencia de borde genómica 5' adicional, se realizó PCR con un cebador delantero (07-0-2286; SEQ ID NO: 6) en la región de borde genómica 5' y un cebador reverso (07-0-2277; SEQ ID NO: 7) en el T-ADN insertado. El fragmento A de la PCR de 2198 bp resultante a partir de las muestras de ADN genómico de maíz 32138 fue clonado y secuenciado. La secuencia de región de borde genómica 5' de 21 14 bp se presenta como secuencia subrayada en la Figura 1 1.

Para verificar la secuencia de borde genómica 3' adicional, se realizó PCR con un cebador delantero (08-0-2408; SEQ ID NO: 14) en el T-ADN insertado y un cebador reverso (08-0-2526; SEQ ID NO: 15) en la región de borde genómica 3'. El fragmento E de la PCR de 2683 bp resultante a partir de las muestras de ADN genómico de maíz 32138 fue clonado y secuenciado. La secuencia de región de borde genómica 3' de 2002 bp se presenta como secuencia subrayada en la Figura 1 1.

En total, se confirmaron 13998 bp de la secuencia de ADN genómico de maíz 32138: 21 14 bp de la secuencia de borde genómica 5', 2002 bp de la secuencia de borde genómica 3', y 9882 bp que comprende el T-ADN insertado (Figuras 10 y 1 1).

Para demostrar que las secuencias de borde flanqueadoras 5' y 3' identificadas tengan su origen en el maíz, se realizó PCR en las regiones de borde genómicas 5' y 3' (pares de cebadores 08-0-2528/08-0-2538, SEQ ID NOS: 16 y 17; y 08-0-2539/08-0-2530, SEQ ID NOS: 18 y 19, respectivamente) en muestras de ADN genómico de maíz 32138 y muestras de ADN de control. El fragmento F de la PCR esperado (294 bp para región genómica 5') y fragmento G de la PCR (297 bp para región genómica 3') fueron generados a partir de tanto las muestras de maíz 32138 como las de control. Estos productos de la PCR fueron clonados y secuenciados, y los productos correspondientes del maíz 32138 y el maíz de control fueron idénticos, indicando que las secuencias tenían su origen en maíz genómico (Figuras 12A y 12B).

Tabla 14. Resumen de la confirmación de genotipo mediante análisis por PCR evento-especifico de plantas de maíz 32138 y plantas de control Resumen ensayo de PCR en tiempo real específico evento para maíz 32138.

Positivo indica la presencia del evento de 32138. Negativo (-) indica la ausencia del evento de maíz 32138.

Tabla 15. Cebadores de PCR usados para caracterizar las regiones de borde genómicas y T-ADN insertado en maíz 32138 La Figura 10 indica los fragmentos de PCR generados a partir del ADN genómico maíz 32138 que fueron clonados y secuenciados: Fragmento A (07-0-2286/07-0-2277), Fragmento B (08-0-2329/08-0-2398), Fragmento C (08-0-2402/07-0-2024), Fragmento D (08-0-2505/08-0-2504), y Fragmento E (08-0-2408/08-0-2526). La línea punteada vertical representa la unión de inserción/de borde genómica. El Fragmento F (08-0-2528/08-0-2538) y G (08-0-2539/08-0-2530) representan las regiones de borde genómicas 5' y 3', respectivamente (flechas rojas). La Figura 10 no se dibuja a escala.

En ia Figura 12A, el par de cebadores 08-0-2528/08-0-2538 amplifica un producto de la PCR (294 bp) a partir del ADN genómico flanqueador 5'. En la Figura 12B, el par de cebadores 08-0-2539/08-0-2530 amplifica un producto de la PCR (297 bp) a partir de la región de borde genómica 3'.

Ejemplo 4: Conclusiones Se determinó que la secuencia de la inserción y regiones de borde genómicas confirman la integridad del ADN insertado y caracterizan la secuencia genómica flanqueadora del sitio de inserción en maíz 32138. En total, se confirmaron 13998 bp de secuencia genómica de maíz 32138, que comprenden 21 14 bp de la secuencia de borde genómica 5', 2002 bp de la secuencia de borde genómica 3', y 9882 bp del T-ADN insertado de PHP24597. Se encontró que el T-ADN insertado en el maíz 32138 tiene una deleción de 45 bp en el extremo de borde derecho (RB, Right ??? ß? y una deleción de 23 bp en el extremo de borde izquierdo (LB, Left fíorder). Además, una inserción parcial de T-ADN de 23 bp está ubicado en las posiciones 2092-21 14 de la secuencia de borde genómica 5' indicada. La secuencia que rodea esta inserción parcial comprende secuencias de unión adicionales para maíz 32138 y que se pueden usar para identificar de manera específica el evento 32138. Toda la secuencia transgéníca remanente indicada en las posiciones 21 15 a 11.996 está intacta y es idéntica al T-ADN de plásmido PHP24597.

Se verificó que las regiones de borde genómicas 5' y 3' de maíz 32138 tienen su origen en maíz por amplificación por PCR y secuenciamiento de las regiones de borde genómicas a partir de tanto las plantas de maíz 32138 como las plantas de control. En general, la caracterización de la inserción y secuencia de borde genómica en maíz 32138 confirma que una inserción intacta individual del T-ADN de plásmido PHP24597 está presente en el genoma de maíz con una inserción parcial de T-ADN de 23 bp o 27 bp en la región de borde genómica 5'.

SECUENCIA Y UBICACIÓN DE CEBADORES USADOS PARA REACCIONES PCR. 1 Ubicación en la secuencia de maíz 32138 (véase SEQ ID NO: 1). Bases 1 -2114 = región de 5 borde genómica 5', bases 2115 - 11996 = inserción, bases 11997 - 13998 = región de borde genómica 3'.

Tabla 17. Lista de secuencias cebadoras usadas en las reacciones PCR Los artículos "un" y "una" se usan para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa uno o más de un elemento.

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la memoria indican el nivel de las personas versadas en el arte al cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes se incorporan en la presente a modo de referencia al mismo punto como si se indicara que cada publicación o solicitud de patente individual fuera específica e individualmente incorporada a modo de referencia.

Si bien la presente invención ha sido descrita en detalle a modo de ilustración y ejemplo a los fines de su claridad para entendimiento, es obvio que ciertos cambios y modificaciones se pueden llevar a la práctica dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Tabla 18. Descripción de sondas de ADN usadas para hibridación southern 1. La posición de la sonda se basa en el mapa de T-ADN del PHP24597 (Figura 14). 2. La posición de la sonda se basa en el mapa de plásmido PHP24597 (Figura 13). 3. La sonda Ms45 está comprendida por tres fragmentos marcados que no se superponen que están combinados en la solución de hibridación. 4. La sonda zm-aa1 está comprendida por dos fragmentos marcados que no se superponen que están combinados en la solución de hibridación. 5. La sonda ref está comprendida por dos fragmentos marcados que están combinados en las soluciones de hibridación respectivas. 6. No se aplica ya que este elemento no se ubica en el T-ADN de región PHP24597.

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Claims (18)

1. REIVINDICACIONES Un método para identificar el evento E6611.32.1.38 en una muestra biológica, CARACTERIZADO PORQUE comprende detectar una región específica de E661 1.32.1.38 con una sonda o primer cebador que reconoce en forma específica una secuencia en la inserción de T-ADN de la SEQ ID NO: 1 , y una segunda sonda o cebador que reconoce en forma específica una secuencia en cualquier secuencia flanqueadora de la SEQ ID NO: 1. El método de la reivindicación 1 , CARACTERIZADO PORQUE comprende además amplificar un fragmento de ADN a partir de un ácido nucleico presente en dicha muestra biológica usando reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, en donde dicho primer cebador reconoce una secuencia en la inserción de T-ADN de la SEQ ID NO: 1 , y un segundo cebador reconoce una secuencia en cualquier secuencia flanqueadora de la SEQ ID NO: 1. El método de la reivindicación 2, CARACTERIZADO PORQUE dicho primer cebador se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 7, 9, 10, 1 1 , 12, 13, y 14, y dicho segundo cebador se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 6, 8, 15, 16, 17, 18 y 19. Un método para detectar la presencia del evento E6611.32.1.38 o progenie del mismo en una muestra biológica, CARACTERIZADO PORQUE comprende: (a) extraer una muestra de ADN a partir de dicha muestra biológica; (b) proveer un par de cebadores de ADN, en donde uno de dichos cebadores reconoce una secuencia en cualquier secuencia flanqueadora de SEQ ID NO: 1 , y el segundo de dichos cebadores reconoce una secuencia en la inserción de T-ADN de SEQ ID NO: 1 ; (c) proveer condiciones de reacción de amplificación de ADN; (d) realizar una reacción de amplificación de ADN, produciendo de esta manera una molécula de amplicón de ADN; y (e) detectar dicha molécula de amplicón de ADN, en donde la detección de dicha molécula de amplicón de ADN en dicha reacción de amplificación de ADN indica la presencia del evento E6611.32.1.38. Una molécula de ADN aislada CARACTERIZADA PORQUE comprende cualquiera de los amplicones producidos por el método de la reivindicación 4. Un método para detectar la presencia de ADN correspondiente al evento E661 1.32.1.38 en una muestra, CARACTERIZADO PORQUE comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda de polinucleótido que se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación con ADN del evento E661 1.32.1.38 y no se híbrida bajo dichas condiciones rigurosas de hibridación con un ADN de planta que no es E661 1.32.1.38; (b) someter la muestra y la sonda a condiciones rigurosas de hibridación; y (c) detectar hibridación de la sonda con el ADN, en donde la detección de hibridación indica la presencia del evento E661 1.32.1.38. 7. Una secuencia cebadora de nucleótido de ADN aislado CARACTERIZADO PORQUE comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NOS: 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o su complemento. 8. Una molécula de ADN aislada CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de unión amplificada por el par de cebadores de SEQ ID NO: 6 y 7; o SEQ ID NO: 8 y 9; o SEQ ID NO: 14 y 15. 9. Un método para examinar semillas en cuanto a la presencia de evento E661 1.32.1.38, CARACTERIZADO PORQUE comprende detección de una región específica de E66 1.32.1.38 con una sonda o cebador específicos que reconocer de manera específica una secuencia de unión del evento E661 1.32.1.38. 0. Un par de secuencias de ADN aisladas, CARACTERIZADAS PORQUE cada una comprende al menos diez nucleótidos y que, cuando se usan juntas en un procedimiento de amplificación de ADN, producen un diagnóstico de amplicón para el evento E661 1.32.1.38. 1 1. El par de secuencias de ADN aisladas de la reivindicación 10 CARACTERIZADAS PORQUE el primer miembro del par se elige del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 7, 9, 10, 11 , 12, 13, y 14, y dicho segundo miembro del par se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 6, 8, 15, 16, 17, 18 y 19. 12. El amplicón de la reivindicación 5, CARACTERIZADO PORQUE dicho amplicón tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 25, 28 ó 32. 13. Una planta CARACTERIZADA PORQUE comprende el evento E6611.32.1.38. 14. Semilla CARACTERIZADA PORQUE es producida por una planta de la reivindicación 13. 15. Una planta transgénica, célula, tejido, semilla o parte de la misma que contiene ADN, para las que se han depositado semillas representativas ante la American Type Culture Collection bajo número de acceso PTA-9158. 16. Una planta, o parte de la misma que contiene ADN, CARACTERIZADA PORQUE comprende una inserción de ADN de los nucleótidos 21 15 a 1 1.996 de la SEQ ID NO: 1. 17. Una planta, o parte de la misma que contiene ADN, CARACTERIZADA PORQUE comprende ADN de los nucleótidos 2071 a 2170 de la SEQ ID NO: 1. 18. Una planta, o parte de la misma que contiene ADN, CARACTERIZADA PORQUE comprende ADN de los nucleótidos 11.951 a 12.050 de la SEQ ID NO: 1.