KR102240135B1 - 부위 특이적 뉴클레아제 활성에 대한 dna 검출 방법 - Google Patents

부위 특이적 뉴클레아제 활성에 대한 dna 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 정밀 표적화 게놈 유전자좌를 함유하는 식물 이벤트를 검출하고 확인하는 방법, 및 이러한 표적화 게놈 유전자좌를 포함하는 식물 및 식물 세포를 제공한다. 방법은 표적화 게놈 유전자좌의 무손상 또는 파괴를 스크리닝하고, 임의로 표적화 게놈 유전자좌에서 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 삽입을 검출하기 위해 이용되는 고처리량 과정으로서 전개될 수 있다. 방법은 부위 특이적 뉴클레아제의 사용에 기인하는 표적화 방법을 통해 발생된 식물 이벤트의 확인에 용이하게 적용가능하다.

Description

부위 특이적 뉴클레아제 활성에 대한 DNA 검출 방법 {DNA DETECTION METHODS FOR SITE SPECIFIC NUCLEASE ACTIVITY}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2012년 12월 13일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/736856을 우선권 주장한다. 각각의 상기 특허의 전체 내용은 이로써 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
서열 목록의 공식 복사본은 2012년 11월 26일에 생성된 3,640 바이트의 크기의 파일명 "DNA DETECTION METHOD"로 ASCII 포맷의 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되었고, 본 명세서와 함께 출원된다. 이러한 ASCII-포맷의 문서에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 부분적으로 식물 이벤트의 게놈 유전자좌를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 부분적으로, 표적화 게놈 유전자좌 내에 파괴(disruption)를 함유하는 식물 이벤트를 검출하고 확인하기 위한 고처리량 방법에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 부분적으로, 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 외인성 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물 이벤트를 검출하고 확인하기 위한 고처리량 방법에 관한 것이다. 방법은 부위 특이적 뉴클레아제의 사용이 의해 일어나는 표적화 방법을 통해 발생된 식물 이벤트를 스크리닝하는데 용이하게 적용가능하다.
식물의 표적화 게놈 변형은 응용 연구 및 기초 연구 둘 다의 오래 지속되어 온 달성하기 어려운 목표였다. 부위 특이적 뉴클레아제 (아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, CRISPRS 및 TALENS)에 의해 게놈 DNA를 표적화하고 절단하는 방법 및 조성물이 이러한 목표를 달성하기 위해 개발되고 있다. ZFN에 의한 게놈 유전자좌의 부위 특이적 절단은, 예를 들어 미리 결정된 게놈 유전자좌 내에 표적화 돌연변이유발을 유도하고, 세포 DNA 서열의 표적화 결실을 유도하고, 외인성 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 표적화 재조합을 용이하게 하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 및 20060188987, 및 국제 특허 공개 번호 WO 2007/014275를 참조하며, 이들 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다. 미국 특허 공개 번호 20080182332에는 식물 게놈의 표적화 변형을 위한 비-정규 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)의 용도가 기재되어 있고, 미국 특허 공개 번호 20090205083에는 식물 EPSP 게놈 유전자좌의 ZFN-매개 표적화 변형이 기재되어 있다. 또한 문헌 [Moehle et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(9): 3055-3060]에는 명시된 게놈 유전자좌에서의 표적화 유전자 부가를 위해 설계된 ZFN의 사용이 기재되어 있다. 현재의 표적화 방법은 전형적으로 적어도 하나의 트랜스진을 함유하는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드, 및 특정 게놈 유전자좌에 결합하고 이를 절단하도록 설계된 부위 특이적 뉴클레아제 (예를 들어, ZFN)를 사용한 식물 조직의 공동-형질전환을 포함한다. 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드는 절단된 게놈 유전자좌 내에 안정하게 삽입되어 명시된 게놈 유전자좌에 표적화 유전자 부가를 일으킨다.
불행하게도, 표적화 게놈 변형의 보고 및 관찰된 빈도는 식물 내의 게놈 유전자좌를 표적화하는 것이 상대적으로 비효율적임을 나타낸다. 보고된 비효율은 표적화 게놈 유전자좌를 함유하는 특정 이벤트를 확인하기 위해 수많은 식물 이벤트의 스크리닝을 필요로 한다. 대부분의 현재 보고된 식물 이벤트 분석은 표적화를 확인하기 위한 단일 분석 방법에게 의존하며, 이는 표적화 빈도의 부정확한 판단 및 낮은 신뢰 결과로 이어질 수 있다.
따라서, 관련 기술분야에는 표적화 게놈 유전자좌를 함유하는 식물 이벤트의 신속한 확인을 위한, 임의로 고처리량 방법으로서 적용가능한, 스크리닝 방법에 대한 필요성이 존재한다. 또한, 표적화 유전자 삽입은 무작위 유전자 삽입과 함께 발생하기 때문에, 바람직한 스크리닝 방법은 무작위 삽입의 배경 내에서 표적화의 게놈 유전자좌를 특이적으로 확인할 것이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은, 제1 증폭 반응에서 표적화 게놈 유전자좌를 포함하는 게놈 DNA 샘플을, 혼성화 조건 하에 표적화 게놈 유전자좌 근위에 결합하는 제1의 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜, 표적화 게놈 유전자좌를 포함하는 제1 앰플리콘을 생성하고; 제1 앰플리콘의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 제1 앰플리콘의 부재는 표적화 게놈 유전자좌 내의 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내는 것인, 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 외인성 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 확인하는 방법에 관한 것이다.
추가 실시양태에서, 방법은 제2 증폭 반응에서 게놈 DNA 샘플을, 혼성화 조건 하에 표적화 게놈 유전자좌 근위에 및 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 내에 결합하는 제2의 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜, 표적화 게놈 유전자좌의 적어도 일부 및 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 포함하는 제2 앰플리콘을 생성하고; 제2 앰플리콘의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 증폭된 생성물의 존재는 표적화 게놈 유전자좌 내의 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 방법은, 제1 증폭 반응에서 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 게놈 DNA 샘플을, 혼성화 조건 하에 파괴된 게놈 유전자좌 근위에 결합하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜, 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 제1 앰플리콘을 생성하고; 제1 증폭 반응의 결과를 정량화하고; 제2 증폭 반응에서 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 게놈 DNA 샘플을, 혼성화 조건 하에 파괴된 게놈 유전자좌 근위에 결합하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜, 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 제2 앰플리콘을 생성하고; 제2 증폭 반응의 결과를 정량화하고; 제1 및 제2 증폭 반응의 양을 비교하는 것을 포함하며, 여기서 제1 증폭 반응의 양이 제2 증폭 반응과 비교하여 더 적은 양의 증폭된 생성물을 포함하면, 이로써 이는 제1 앰플리콘 샘플 내의 게놈 유전자좌의 파괴를 나타내는 것인, 다수의 식물 세포로부터의 게놈 유전자좌의 파괴를 확인을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은, 제1 증폭 반응에서 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 게놈 DNA 샘플을, 혼성화 조건 하에 파괴된 게놈 유전자좌 근위에 결합하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜, 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 제1 앰플리콘을 생성하고; 제1 앰플리콘의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 앰플리콘의 부재는 게놈 유전자좌의 파괴를 나타내는 것인, 게놈 유전자좌의 파괴를 확인하는 방법을 기재한다.
방법의 추가 실시양태는 제1 증폭 반응의 결과를 정량화하고; 제2 증폭 반응의 결과를 정량화하고; 제1 및 제2 증폭 반응의 결과를 비교하고; 표적화 게놈 유전자좌 내의 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 제1 앰플리콘이 부재하고 제2 앰플리콘이 존재하는 경우에 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드는 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 것으로 확인된다.
한 실시양태로서, 제1 또는 제2 증폭 반응은 단일 튜브 또는 웰에서 멀티플렉스 포맷으로 진행된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 한 실시양태는 제1 및 제2 증폭 반응 중 하나 또는 둘 다에 대한 서명 프로파일을 생성하는 것을 포함하는, 제1 및 제2 증폭 반응의 결과를 정량화하는 것을 포함한다. 실시양태의 예시적인 측면에서, 서명 프로파일은 용융 온도 곡선 서명 프로파일 및 형광 서명 프로파일로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
추가 실시양태는 삽입 DNA 염료 또는 형광 염료로부터 생성된 서명 프로파일을 포함한다. 여기서, 삽입 염료는 시아닌 염료, 예컨대 SYTO13® 염료를 포함한다. 한 실시양태로서, SYTO13® 염료는 10 μM 미만, 4 μM 미만 또는 2.7 μM 미만의 농도로 증폭 반응에 사용된다. 추가 실시양태에서, 형광 염료는 HEX 형광 염료, FAM 형광 염료, JOE 형광 염료, TET 형광 염료, Cy 3 형광 염료, Cy 3.5 형광 염료, Cy 5 형광 염료, Cy 5.5 형광 염료, Cy 7 형광 염료 및 ROX 형광 염료로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 제1 또는 제2의 다수의 올리고뉴클레오티드 또는 둘 다는 형광 염료를 포함한다.
실시양태에서, 본 개시내용은 표적화 게놈 유전자좌 내의 공여자 삽입의 존재를 확인하고, 표적화 게놈 유전자좌 내에 공여자 삽입을 포함하는 트랜스제닉 이벤트를 선택하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 추가 실시양태는 상기 트랜스제닉 이벤트를 포함하는 식물을 포함한다.
추가 실시양태는 쌍자엽 식물을 포함할 수 있으며, 여기서 쌍자엽 식물은 대두 식물, 카놀라 식물 및 목화 식물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 추가 실시양태는 단자엽 식물을 포함할 수 있으며, 여기서 단자엽 식물은 옥수수 식물, 벼 식물 및 밀 식물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시양태는 부위 특이적 뉴클레아제에 의해 절단된 게놈 유전자좌를 포함한다. 예시적인 부위 특이적 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, CRISPR 또는 TALEN 뉴클레아제 또는 임의의 다른 부위 특이적 뉴클레아제를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 실시양태는 증폭 반응을 포함하고, 여기서 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 완료된다.
본 개시내용의 추가 실시양태는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 및 표적화 게놈 유전자좌의 5' 접합부 및 3' 접합부를 포함하는 앰플리콘을 포함한다. 또한, 본 개시내용의 실시양태는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 및 표적화 게놈 유전자좌의 5' 접합부 또는 3' 접합부를 포함하는 앰플리콘을 포함한다.
실시양태는 또한 적어도 하나의 유전자 발현 카세트를 포함하는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 기재된 예시적인 측면 및 실시양태 이외에도, 추가 측면 및 실시양태가 하기 기재의 연구에 의해 명백해질 것이다.
도 1은 표적화 게놈 유전자좌를 포함하는 식물 이벤트를 확인하기 위한 분석 과정을 예시한다.
도 2는 표적화 유전자좌에서의 ZFN 정량적 PCR (qPCR) 파괴 검정의 결과를 도시한다: 이벤트의 하위세트의 스크리닝 결과. 화살표는 검출가능한 qPCR 신호에서 강하에 의해 입증된, 파괴된 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 이벤트를 나타낸다.
도 3은 인-아웃 PCR 증폭 과정을 이용하여 완료된 스크리닝을 도시한다. 도 3a는 트랜스진 삽입을 갖지 않는 표적화 게놈 유전자좌 ("유전자좌")를 도시한다. 인-아웃 PCR은 증폭된 생성물을 생성하지 않을 것이다. 도 3b는 표적화 트랜스진 삽입을 갖는 유전자좌를 도시한다. 인-아웃 PCR은 유전자좌의 5' 말단으로부터의 2 kb 앰플리콘 및 3' 말단으로부터의 1.5 kb 앰플리콘을 생성할 것이다.
도 4는 인-아웃 PCR 분석을 도시한다. 도 4a는 SYTO13® 염료 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)를 사용한 증폭 반응으로부터 생성된 형광 신호 서명 프로파일을 도시하며, 이는 양성 트랜스진 삽입 이벤트를 확인하는데 이용될 수 있다. 도 4b는 양성 대조군과 비교한 샘플의 증폭 반응으로부터 생성된 용융 온도 서명 프로파일을 도시하며, 이는 양성 형광 신호를 확인하는데 이용될 수 있다.
도 5는 본원에 개시된 대상의 파괴 검정 및 인-아웃 PCR 반응을 이용하여 확인된 표적화 이벤트를 보여준다.
도 6은 ZFN 파괴 검정을 도시한다. 상부 괄호로 나타낸 샘플은 파괴된 게놈 유전자좌를 함유하지 않고, 하부 괄호로 나타낸 샘플은 파괴된 게놈 유전자좌를 함유한다.
도 7은 또 다른 ZFN 파괴 검정을 도시한다. 상부 괄호로 나타낸 샘플은 파괴된 게놈 유전자좌를 함유하지 않고, 하부 괄호로 나타낸 샘플은 파괴된 게놈 유전자좌를 함유한다.
도 8은 ELP 유전자좌 영역에서의 eZFN 파괴 검정을 도시한다. 도 8 (a)는 pDAB105818로부터 T-가닥의 통합에 의해 생산된 ELP를 함유하는 게놈 단편의 예시를 제공한다. 이 개략도에서 파괴 검정에 사용된 프라이머 및 프로브 (MAS621, MAS622 및 프로브 UPL67)의 상대적 위치가 확인된다. 도 8 (b)는 354개의 pat 양성 이벤트의 스크리닝 결과를 제공한다. 파괴된 ELP 유전자좌는 검출가능한 qPCR 신호에서의 강하에 의해 나타난다. 따라서 상부 괄호로 나타낸 샘플은 파괴된 ELP 게놈 유전자좌를 함유하지 않고, 하부 괄호로 나타낸 샘플은 파괴된 ELP 게놈 유전자좌를 함유한다.
도 9는 인-아웃 PCR 분석을 도시한다. 도 9a는 SYTO13® 염료 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)를 사용한 5' 공여자/ELP 유전자좌 접합부의 증폭 반응으로부터 생성된 용융 온도 신호 프로파일을 도시하며, 이는 양성 트랜스진 삽입 이벤트를 확인하는데 이용될 수 있다. 도 9b는 SYTO13® 염료 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)를 사용한 3' 공여자/ELP 유전자좌 접합부의 증폭 반응으로부터 생성된 용융 온도 신호 프로파일을 도시하며, 이는 양성 트랜스진 삽입 이벤트를 확인하는데 이용될 수 있다.
도 10은 ZF 결합 서열과 상응하는 아연 핑거, 및 ELP 유전자좌 파괴 검정에 사용하기 위한 가수분해 프로브의 예시를 제공한다: eZFN8 라인은 결합 부위 서열 SBS15590 및 SBS18473 사이에 스페이서 GTGAGA를 갖는 eZFN8로부터의 활성의 검출을 위한 프로브를 나타내고; eZFN1 라인은 제2 세트의 결합 부위 서열, SBS15590 및 SBS8196 사이에 스페이서 GTGGAT를 갖는 eZFN1로부터의 활성의 검출을 위한 프로브를 나타낸다. 상부 서열은 서열 39로서 제공되고, 도면의 하부에 나타낸 상보적 서열은 서열 40으로서 제공된다.
도 11은 정규화된 aad -1 (○) 및 ELP 카피수 (+)의 오버레이 플롯을 예시한다. 도 11 (a)는 eZFN1 절제자와 교잡된 1125개 샘플의 파괴 검정 결과를 보여준다: 0.05 미만의 ELP 카피수를 갖는 425개 (절단), 0.05 내지 0.4 사이에 95개 (키메라). 도 11 (b)는 eZFN8 절제자와 교잡된 697개 샘플의 파괴 검정 결과를 보여준다: 0.05 미만의 ELP 카피수를 갖는 488개, 0.05 내지 0.4 사이에 1개.
도 12는 eZFN1 (pDAB105825) 및 eZFN8 (pDAB105828)로 절단된 ELP 게놈 유전자좌 샘플에 대한 서열 정렬을 제공한다. ZFN 인식 부위 사이의 폴리뉴클레오티드 스페이서는 적색 박스로 표시된다. 대시 (-)로 나타낸 염기는 서열의 최소 1개의 결손 염기를 나타내는 결실이다.
본 발명에 이르러, 부위 특이적 뉴클레아제 표적화 식물 이벤트의 신속한 스크리닝, 확인 및 특성화를 위한 신규 방법이 발명되었다. 방법은 게놈 표적 유전자좌가 파괴되었는지를 결정하기 위해 제1 증폭 반응을 통해 게놈 표적 유전자좌의 무손상을 분석하는데 이용될 수 있다. 파괴된 게놈 유전자좌를 함유하는 것으로 확인된 이벤트는 후속으로 표적화 게놈 유전자좌 내의 외인성 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 확인하기 위한 제2 증폭 반응을 통해 스크리닝될 수 있다. 이에 따라, 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드를 갖는 특정 이벤트를 확인하고 선택하기 위해 다수의 식물 이벤트를 분석하고 스크리닝할 수 있다. 본원에 개시된 대상은 또한 신규 스크리닝 방법을 이용하여 선택된 뉴클레아제 표적화 식물 이벤트를 포함하는 식물 및 식물 세포를 포함한다.
부위 특이적 뉴클레아제에 의한 게놈 DNA 절단의 결과인 게놈 유전자좌의 파괴에 대해 식물 이벤트를 스크리닝하는 신규 방법이 본원에서 입증된다. 파괴된 게놈 유전자좌는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 포함할 수 있거나, 또는 파괴된 게놈 유전자좌는 삽입 및/또는 결실 (또한 InDel로 기재됨)을 포함할 수 있다. 방법은 스크리닝 검정으로서 2가지의 초기 증폭 반응을 이용한다. 제1 증폭 반응은 증폭 반응에 의해 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 확인하는 파괴 검정이며, 여기서 앰플리콘의 부재는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드가 표적화 게놈 유전자좌 내에 존재한다는 것을 나타낸다. 제2 증폭 반응은 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 표적화 게놈 유전자좌의 3' 및/또는 5' 접합부 서열을 스크리닝하기 위한 "인-아웃" PCR 증폭 반응이다. 3' 및/또는 5' 접합부 서열을 함유하는 증폭된 생성물의 존재는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드가 표적화 게놈 유전자좌 내에 존재한다는 것을 나타낸다.
파괴 증폭 반응 및 인-아웃 증폭 반응의 2가지의 별개의 증폭 반응 스크리닝 검정을 전개함으로써, 다수의 비-표적화 이벤트로부터 양성 표적 이벤트를 확인할 확률이 매우 증가된다. 파괴 증폭 반응은 고처리량 방식으로 다수의 샘플의 신속한 분석이 가능하도록 설계되었다. 또한, 상기 검정은 표적화 게놈 유전자좌 내의 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 삽입 또는 ZFN 절단 둘 다에 대한 이벤트를 확인하고 특성화할 수 있다. 인-아웃 증폭 반응은 대안적 분석 접근법을 제공한다. 상기 검정은 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 확인하기 위해 3' 및 5' 접합부의 존재를 확인하는데 이용된다. 인-아웃 증폭 반응은 파괴 검정에서 확인된 표적화 이벤트가 실제로 게놈 유전자좌 내에 완전한 전장 표적화 삽입을 함유하는지를 확인하는데 이용될 수 있다. 파괴 증폭 반응이 인-아웃 증폭 반응과 함께 진행되는 경우, 수집된 데이터를 분석하여, 게놈 유전자좌 내의 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드를 표적화하는 것에 대한 제한 인자 (예를 들어, 표적화 게놈 유전자좌 내에 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드를 함유하는 이벤트를 발생시키는 것에 대한 제한 인자로서의 ZFN 절단 또는 공여자 삽입)를 결정할 수 있다. 다양한 방법론을 갖는 2가지 상이한 스크리닝 검정을 이용하는 것은 표적화 게놈 유전자좌 내에 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드를 함유하는 표적화 이벤트를 발견할 가능성을 증가시킨다. 더욱이, 개시된 방법은 샘플의 하위세트의 신속하고 효율적인 확인을 가능하게 하는 고처리량 검정으로서 전개될 수 있으며, 이는 이어서 다른 분자 확인 방법에 의해 추가로 검정될 수 있다. 개시된 스크리닝 검정은 표적화 트랜스진 삽입 이벤트를 확인하고 수득하기 위한 고품질, 고처리량 과정을 기재한다. 또한, 방법론은 임의의 식물 종의 분석에 용이하게 적용가능하다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본원이 지배할 것이다. 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 본원에 인용된 모든 공개, 특허 및 다른 참고문헌은, 특허 또는 특허 공개의 단지 특정 섹션만이 참조로 포함되는 것으로 나타내지 않는 한, 각각의 개별 공개 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타낸 경우와 같이, 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다.
본 개시내용을 추가로 명료화하기 위해, 하기 용어, 약어 및 정의가 제공된다.
본원에 사용된 용어 "포함한다", "포함하는", "포함하다", "비롯한", "갖는다", "갖는", "함유한다", 또는 "함유하는", 또는 그의 임의의 다른 변형은 비-배타적이거나 또는 개방형인 것을 의도한다. 예를 들어, 일련의 요소들을 포함하는 조성물, 혼합물, 과정, 방법, 물품, 또는 장치는 반드시 이들 요소에만 제한되는 것은 아니며, 이러한 조성물, 혼합물, 과정, 방법, 물품, 또는 장치에 명백히 열거되지 않거나 내재되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 또한, 달리 명백하게 언급되지 않는 한, "또는"은 포함적 논리합을 지칭하며 배타적 논리합을 지칭하지 않는다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 다음 중 임의의 하나에 의해 충족된다: A가 참이고 (또는 존재하고) B가 거짓인 (또는 존재하지 않는) 것, A가 거짓이고 (또는 존재하지 않고) B가 참인 (또는 존재하는) 것, 및 A 및 B 둘 다가 참인 (또는 존재하는) 것.
또한, 본 개시내용의 한 실시양태의 요소 또는 성분 앞에 오는 부정관사 "a" 및 "an"은 경우의 수, 즉 요소 또는 성분의 발생에 관하여 비제한적인 것으로 의도된다. 따라서, "a" 또는 "an"은 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 해석야 하며, 요소 또는 성분의 단수형 단어 형태는 또한 수치가 단수이도록 명백히 의도하지 않는 한 복수형을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 비제한적 용어이며, 특정한 본 발명의 임의의 단일 실시양태를 지칭하는 것으로 의도되지 않고, 본원에 개시된 모든 가능한 실시양태를 포괄하도록 의도된다.
본원에 사용된 용어 "식물"은 임의의 후손, 세포, 조직 또는 식물의 일부를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 확인하는 방법이 본원에 기재된다. 삽입을 위한 DNA 폴리뉴클레오티드는 또한 "외인성" 폴리뉴클레오티드, "공여자" 폴리뉴클레오티드 또는 "분자" 또는 "트랜스진"으로 지칭될 수 있고, 이를 포함하도록 의도된다.
특정 실시양태에서, 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드는 1 kb 초과의 길이, 예를 들어 2 내지 200 kb, 2 내지 10 kb (또는 그 사이의 임의의 값)의 서열 (예를 들어, 트랜스진으로도 지칭되는 코딩 서열)을 포함한다. 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드는 또한 적어도 하나의 부위 특이적 뉴클레아제 표적 부위, 예를 들어 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있는 적어도 하나의 ZFN, 메가뉴클레아제, CRISPR 또는 TALEN 표적 부위를 포함할 수 있다. 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 ZFN, CRISPR 또는 TALEN의 쌍이 인식하고 결합하고 절단하기 위한 적어도 1개의 표적 부위를 포함할 수 있다. 전형적으로, 바람직한 경우, 뉴클레아제 표적 부위는 개재 트랜스진의 절단 및 제거를 위해 트랜스진 서열의 외부에, 예를 들어 트랜스진 서열에 대해 5' 또는 3'에 존재한다. 뉴클레아제 절단 부위(들)는 임의의 뉴클레아제(들)에 대한 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 이중-가닥 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드에 함유된 뉴클레아제 표적 부위(들)는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드가 삽입된 내인성 게놈 표적을 절단하기 위해 사용되는 동일한 뉴클레아제(들)에 대한 것이다.
본원에 기재된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열 내에 포함된 트랜스진은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 PCR을 이용하여 플라스미드, 세포 또는 다른 공급원으로부터 단리될 수 있다. 사용하기 위한 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 원형 초나선, 원형 이완, 선형 등을 비롯한 다양한 유형의 기하학을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이들은 표준 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 메틸화되거나 메틸화가 결여될 수 있다. 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 박테리아 또는 효모 인공 염색체 (BAC 또는 YAC)의 형태로, 또는 플라스미드 벡터로서 존재할 수 있다. 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 의해 식물 세포 내로 도입된 T-가닥으로부터의 것일 수 있다.
본원에 기재된 이중-가닥 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 비-천연 염기 및/또는 백본을 포함할 수 있다. 특히, 메틸화 시토신을 갖는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입은 관심 영역에서의 전사 정지 상태를 달성하기 위해 본원에 기재된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
공여자 DNA 폴리뉴클레오티드는 관심 대상의 임의의 외인성 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 임의의 폴리펩티드 코딩 서열 (예를 들어, cDNA), 프로모터 서열, 인핸서 서열, 에피토프 태그, 마커 유전자, 절단 효소 인식 부위 및 다양한 유형의 발현 구축물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 마커 유전자는 제초제 저항성 (예를 들어, 다른 공지된 제초제 저항성 단백질 이외에도 HPPD 저항성, 2,4-D 저항성, 글루포시네이트 저항성 또는 글리포세이트 저항성)을 매개하는 단백질을 코딩하는 서열, 유색 또는 형광 또는 발광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질, 증강된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시페라제)을 코딩하는 서열, 및 증강된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질 (예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 에피토프 태그는 예를 들어 하나 이상의 카피의 FLAG, HIS, MYC, TAP, HA 또는 임의의 검출가능한 아미노산 서열을 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 단일 핵산, 뿐만 아니라 복수의 핵산, 핵산 단편, 변이체, 또는 그의 유도체, 또는 구축물, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA) 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 포함하도록 의도된다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 비번역된 5' 및 3' 서열 및 코딩 서열을 포함하는 전장 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 단편을 함유할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥, 또는 보다 전형적으로 이중-가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 이들 용어는 또한 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 화학적으로, 효소적으로, 또는 대사적으로 변형된 형태를 포괄한다.
천연 환경으로부터 제거된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열은 "단리된" 것으로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 벡터 내에 함유된 글리포세이트 내성 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 개시내용의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 추가의 예는 이종 숙주 세포 내에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 정제된 (부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 포함한다. 본 개시내용의 실시양태에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 또한 합성에 의해 생산된 상기 분자를 포함한다. DNA의 중합체 형태인 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 절편으로 구성될 수 있다.
용어 "유전자"는 코딩 서열 앞의 조절 서열 (5' 비-코딩 서열) 및 뒤의 조절 서열 (3' 비-코딩 서열)을 임의로 포함하는, 기능적 생성물 분자, RNA 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "코딩 영역"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 지칭한다. "적합한 조절 서열"은, 코딩 서열의 상류에 (5' 비-코딩 서열), 코딩 서열 내에 또는 코딩 서열의 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치하며 연관된 코딩 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 주는 DNA 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 결합 부위, 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 단일 "폴리펩티드" 뿐만 아니라 복수의 "폴리펩티드들"을 포괄하는 것으로 의도되고, 아미드 결합 (또한 펩티드 결합으로도 공지되어 있음)에 의해 선형으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하고, 특정 길이의 생성물을 지칭하지는 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄", 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 지칭하기 위해 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에, 또는 그와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있으나, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 이는 화학적 합성을 비롯한 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
"단리된" 폴리펩티드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 그의 천연 환경에서는 존재하지 않는 폴리펩티드로 의도된다. 특정한 수준의 정제가 요구되지는 않는다. 따라서, "단리된"의 언급은 본원에 기재된 "인간의 손"의 개입을 의미한다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그의 천연 또는 자연 환경으로부터 분리될수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분획화, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 같이 본 개시내용의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연"은 존재하는 경우에 그 자신의 조절 서열과 함께 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드의 형태를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "내인성"은 유기체 또는 유기체의 게놈 내의 그의 천연 위치에 존재하는 천연 형태의 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. "내인성 폴리뉴클레오티드"는 유기체의 게놈 내의 그의 천연 위치에 존재하는 천연 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈 내의 그의 천연 위치에 존재하는 천연 유전자를 포함한다. "내인성 폴리펩티드"는 유기체 내의 그의 천연 위치에 존재하는 천연 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "이종"은 숙주 유기체에서 자연적으로 발견되지 않고 숙주 유기체 내로 도입된 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. "이종 폴리뉴클레오티드"는 상응하는 천연 폴리뉴클레오티드와 상이한 형태로 공급원 유기체 내로 재도입된 천연 코딩 영역, 또는 그의 일부를 포함한다. "이종 유전자"는 상응하는 천연 유전자와 상이한 형태로 공급원 유기체 내로 재도입된 천연 코딩 영역, 또는 그의 일부를 포함한다. 예를 들어, 이종 유전자는 천연 숙주 내로 재도입된 비-천연 조절 영역을 포함하는 키메라 유전자의 일부인 천연 코딩 영역을 포함할 수 있다. "이종 폴리펩티드"는 상응하는 천연 폴리펩티드와 상이한 형태로 공급원 유기체 내로 재도입된 천연 폴리펩티드를 포함한다. 대상 유전자 및 단백질은 키메라 또는 융합 단백질을 생산하기 위해 다른 유전자 및 단백질에 융합될 수 있다. 본 개시내용의 실시양태에 따라 유용한 유전자 및 단백질은 구체적으로 예시된 전장 서열, 뿐만 아니라 이들 서열의 일부, 절편 및/또는 단편 (전장 분자와 비교하여 인접 단편 및 내부 및/또는 말단 결실을 포함함), 이들의 변이체, 돌연변이체, 키메라, 및 융합을 포함한다.
한 실시양태에서, 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 3' UTR, 제초제 저항성 형질, 곤충 저항성 형질, 변형된 오일 형질, 농경학적 형질 및 상기 임의의 것의 기능적 단편을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 (이에 제한되지는 않음), 세포에서의 발현이 요구되는 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 코딩 서열은 예를 들어 cDNA일 수 있다.
용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3' 쪽에 위치한다. 프로모터는 그 전체가 천연 유전자로부터 유래될 수 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 또는 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 이해한다. 유전자가 대부분의 시기에 대부분의 세포 유형 내에서 발현되도록 하는 프로모터는 통상적으로 "구성적 프로모터"로서 지칭된다. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계가 완전하게 규정되지 않았으므로, 상이한 길이의 DNA 단편들이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 추가로 인정된다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받도록 하는, 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열들의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우에 그 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 것이다 (예를 들어, 상기 코딩 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있음). 코딩 서열은 조절 서열에 센스 또는 안티센스 배향으로 작동가능하게 연결될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 본 개시내용의 실시양태의 핵산 단편으로부터 유래된 센스 (mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 지칭한다. 발현은 또한 폴리펩티드로의 mRNA의 번역을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "과다발현"은 동일한 또는 관련된 유전자의 내인성 발현보다 더 높은 발현을 지칭한다. 이종 유전자는 그의 발현이 대등한 내인성 유전자의 발현보다 더 높은 경우에 과다발현된다.
본원에 사용된 용어 "형질전환"은 유전적으로 안정한 유전을 유도하는, 핵산 또는 단편의 숙주 유기체 내로의 전달 및 통합을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로서 지칭된다. 형질전환의 공지된 방법은 아그로박테리움 투메파시엔스- 또는 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)-매개 형질전환, 인산칼슘 형질전환, 폴리브렌 형질전환, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법 (예를 들어, 초음파천공), 리포솜 형질전환, 미세주사, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 바이오리스틱 (마이크로입자 포격), 탄화규소 휘스커스(WHISKERS)™ 매개 형질전환, 에어로졸 비밍 또는 PEG 형질전환 뿐만 아니라 다른 가능한 방법을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 종종 세포의 중심 대사의 부분이 아닌 유전자를 운반하며 통상적으로 원형 이중-가닥 DNA 분자의 형태인 염색체 외 요소를 지칭한다. 상기 요소는 다수의 뉴클레오티드 서열이, 선택된 유전자 산물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 적절한 3' 비번역된 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 고유한 구축 내로 연결되거나 재조합된, 임의의 공급원으로부터 유래된 선형 또는 원형의 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA의 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "코돈 축퇴성"은 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 주지 않으면서 뉴클레오티드 서열의 변이를 허용하는 유전자 코드의 특성을 지칭한다. 통상의 기술자는 제시된 아미노산을 특정하기 위한 뉴클레오티드 코돈의 사용에 있어서 특정 숙주 세포에 의해 나타나는 "코돈-편향"을 잘 알고 있다. 따라서, 숙주 세포에서의 개선된 발현을 위해 유전자를 합성할 때, 유전자의 코돈 사용 빈도가 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도에 근접하도록 유전자를 설계하는 것이 바람직하다.
용어 "코돈-최적화된"은 다양한 숙주의 형질전환을 위한 유전자 또는 핵산 분자의 코딩 영역을 지칭하는데 사용되기 때문에, DNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 숙주 유기체의 전형적인 코돈 사용을 반영하도록 하는 유전자 또는 핵산 분자의 코딩 영역 내의 코돈의 변경을 지칭한다. 이러한 최적화는 적어도 하나, 하나 초과, 또는 유의한 수의 코돈을 유기체의 유전자에서 보다 빈번하게 사용되는 하나 이상의 코돈으로 교체하는 것을 포함한다.
용어 "퍼센트 동일성" (또는 "% 동일성")은 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이, 서열을 비교함으로써 결정되는, 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 관련 기술분야에서 "동일성"은 또한 경우에 따라 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미하며, 이는 상기 서열 가닥 사이에서의 매칭에 의해 판단된다. "동일성" 및 "유사성"은 다음에 개시된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); 및 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것 및/또는 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 결정하는 것, 및 이들 서열을 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열을 또한 이러한 방식으로 결정하고 비교할 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 일치를 지칭한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)을 이들의 퍼센트 동일성을 결정함으로써 비교할 수 있다. 2개의 서열 (핵산 서열이든 아미노산 서열이든)의 퍼센트 동일성은 정렬된 2개의 서열들 사이의 정확한 매치의 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Russell, R., and Barton, G., "Structural Features can be Unconserved in Proteins with Similar Folds," J. Mol. Biol. 244, 332-350 (1994)]의 337페이지를 참조한다.
또한, 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 편성되어 있다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 예를 들어 벡터(Vector) NTI® 스위트 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)의 얼라인X(AlignX) 프로그램 또는 레이저진(LASERGENE)™ 생물정보학 컴퓨팅 스위트 (디엔에이스타 인크.(DNASTAR Inc.), 위스콘신주 매디슨)의 메갈라인(MegAlign)™ 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 다중 서열 정렬은, 클러스탈(Clustal) V (문헌 [Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)]에 개시됨)로 표지된 정렬 방법에 상응하는 "클러스탈 V 정렬 방법"을 포함하는 몇몇 다양한 알고리즘을 포괄하며 레이저진™ 생물적보학 컴퓨팅 스위트 (디엔에이스타 인크.)의 메갈라인™ 프로그램에서 발견되는 "클러스탈 정렬 방법"을 이용하여 수행한다. 다중 정렬의 경우, 디폴트 값은 갭 페널티=10 및 갭 길이 페널티= 10에 대응한다. 클러스탈 방법을 사용한 단백질 서열의 쌍별 정렬 및 퍼센트 동일성의 계산을 위한 디폴트 파라미터는 KTUPLE=1, 갭 페널티=3, 윈도우=5 및 DIAGONALS SAVED=5이다. 핵산의 경우, 이들 파라미터는 KTUPLE=2, 갭 페널티=5, 윈도우=4 및 DIAGONALS SAVED=4이다. 클러스탈 V 프로그램을 사용한 서열의 정렬 후에, 동일한 프로그램에서 "서열 거리" 표를 살펴봄으로써 "퍼센트 동일성"을 얻을 수 있다. 추가로, "클러스탈 W 정렬 방법"이 이용가능하고, 클러스탈 W (문헌 [Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191 (1992)]에 기재됨)로 표지되며 레이저진 생물정보학 컴퓨팅 스위트 (디엔에이스타 인크.)의 메갈라인™ v6.1 프로그램에서 발견되는 정렬 방법에 대응한다. 다중 정렬을 위한 디폴트 파라미터 (갭 페널티=10, 갭 길이 페널티=0.2, 딜레이 디버전(Delay Divergen) 서열(%)=30, DNA 전이 가중치=0.5, 단백질 가중 매트릭스=고넷(Gonnet) 시리즈, DNA 가중 매트릭스=IUB). 클러스탈 W 프로그램을 이용한 서열의 정렬 후에, 동일한 프로그램에서 "서열 거리" 표를 살펴봄으로써 "퍼센트 동일성"을 얻을 수 있다.
본 개시내용의 실시양태의 핵산 프로브 및 프라이머는 증폭 반응에서 혼성화 조건 하에 표적 DNA 서열에 혼성화될 수 있다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법은 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 확인하는데 이용될 수 있다. 핵산 분자, 올리고뉴클레오티드 또는 그의 단편은 특정 조건 하에 다른 핵산 분자에 특이적으로 혼성화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 분자는 이 두 분자가 역평행의 이중-가닥 핵산 구조를 형성할 수 있는 경우에 서로에 특이적으로 혼성화될 수 있는 것으로 언급된다. 핵산은 2개의 핵산 분자가 완전한 상보성을 나타내는 경우에 또 다른 핵산 분자의 "상보체"인 것으로 언급된다. 본원에 사용된 바와 같이, 분자 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 것의 뉴클레오티드에 상보적인 경우에, 분자는 "완전한 상보성"을 나타내는 것으로 언급된다. 완전한 상보성을 나타내는 분자는 일반적으로 통상의 "고-엄격도" 조건 하에 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 하는 충분한 안정성으로 서로에 혼성화될 것이다. 통상의 고-엄격도 조건은 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기재되어 있다.
2개의 분자는 이들이 적어도 통상의 "저-엄격도" 조건 하에서 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 하는 충분한 안정성으로 서로에 혼성화될 수 있는 경우에 "최소 상보성"을 나타내는 것으로 언급된다. 통상의 저-엄격도 조건은 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기재되어 있다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서 기능하기 위해서는, 사용된 특정 용매 및 염 농도 하에 안정한 이중 가닥 구조를 형성할 수 있도록 서열의 최소 상보성을 나타낼 것만이 요구된다.
혼성화의 엄격도에 영향을 미치는 인자들은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 온도, pH, 이온 강도, 및 유기 용매 예컨대 예를 들어 포름아미드 및 디메틸 술폭시드의 농도를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 혼성화 엄격도는 온도가 높을수록, 이온 강도가 낮을수록, 및 용매 농도가 낮을수록 증가된다.
용어 "엄격한 조건"은 또는 "엄격도 조건"은 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 논의된 특정 혼성화 절차에 의한 표적 핵산 (즉, 특정한 관심 핵산 서열)에 대한 핵산 프로브의 혼성화와 관련하여 기능적으로 정의된다.
전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.5 M Na+ 이온 농도 미만, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na+ 이온 농도 (또는 기타 염)이고, 온도가 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해서는 적어도 약 30℃이고, 긴 프로브 (예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오티드)에 대해서는 적어도 약 60℃인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가로 달성될 수 있다. 예시적인 저 엄격도 조건은 37℃에서의 30% 내지 35% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 0.1% SDS (나트륨 도데실 술페이트)의 완충 용액에 의한 혼성화, 및 50 내지 55℃에서의 1X 내지 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산삼나트륨)으로의 세척을 포함한다. 예시적인 중간 정도의 엄격도 조건은 37℃에서의 40 내지 45% 포름아미드, 1M NaCl, 1% SDS에서의 혼성화, 및 55 내지 60℃에서의 0.5x 내지 1x SSC에서의 세척을 포함한다. 예시적인 고 엄격도 조건은 37℃에서의 50% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 0.1% SDS에서의 혼성화, 및 60 내지 65℃에서의 0.1X SSC에서의 세척을 포함한다.
특이성은 전형적으로 혼성화후 세척의 함수이고, 결정적인 인자는 이온 강도 및 최종 세척 용액의 온도이다. DNA-DNA 하이브리드의 경우, Tm은 식: Tm = 81.5℃ + 16.6 (logM) + 0.41 (%GC) - 0.61 (%form.) - 500/L로부터 근사화될 수 있고; 여기서 M은 1가 양이온의 몰농도이고, %GC는 DNA 내의 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율이고, % form.은 혼성화 용액 중 포름아미드의 백분율이고, L은 염기 쌍 내의 하이브리드의 길이이다 (Meinkoth and Wahl, 1984). Tm은 (규정된 이온 강도 및 pH 하에서의) 상보적 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭되는 프로브에 혼성화되는 온도이다. Tm은 각각 1%의 미스매칭에 대해 약 1℃만큼 감소되며; 따라서, Tm, 혼성화 및/또는 세척 조건을 목적하는 동일성의 서열에 혼성되하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 90%의 동일성을 갖는 서열을 고려하는 경우, Tm은 10℃ 감소될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열 및 그의 보체에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. 그러나, 극도로 엄격한 조건은 열 융점 (Tm)보다 1, 2, 3 또는 4℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 중간 정도로 엄격한 조건은 열 융점 (Tm)보다 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있으며; 저 엄격도 조건은 열 융점 (Tm)보다 11 내지 20℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다. 식, 혼성화 및 세척 조성물, 및 목적하는 Tm을 이용하여, 통상의 기술자는 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격도에서의 변화가 고유하게 기재됨을 이해할 것이다. 원하는 정도의 미스매칭이 45℃ (수용액) 또는 32℃ (포름아미드 용액) 미만의 Tm을 초래하는 경우, 더 높은 온도가 사용될 수 있도록 SSC 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내가 문헌 [(1997) Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, pages 2-40, 3rd Ed. (1997) 및 Sambrook et al. (1989)]에서 발견된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 도입에 관한 것이다. 한 실시양태로서 본원에 사용된 유전자 발현 카세트를 포함하는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 구축을 위한 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); 및 Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)]에 기재되어 있다.
본원에 개시된 방법에서, 식물에서 유전자의 발현을 유도하는 다수의 프로모터가 사용될 수 있다. 상기 프로모터는 구성적, 화학적으로-조절되는, 유도성, 조직-특이적, 및 종자-우선 프로모터로부터 선택될 수 있다. 핵산의 발현을 지시하기 위해 사용되는 프로모터는 특정한 적용에 따라 달라진다. 예를 들어, 숙주 세포에 적합한 강력한 구성적 프로모터가 발현된 단백질의 발현 및 정제에 전형적으로 사용된다.
바람직한 식물 프로모터의 비제한적 예는 에이. 탈리아나(A. thaliana) 유비퀴틴-10 (ubi-10) (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493); 에이. 투메파시엔스 만노핀 신타제 (△mas) (미국 특허 번호 6,730,824 (Petolino et al.)); 및/또는 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 (CsVMV) (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139)로부터 유래된 프로모터 서열을 포함한다. 다른 구성적 프로모터는 예를 들어 코어 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); 벼 액틴 프로모터 (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); 옥수수 유비퀴틴 프로모터 (미국 특허 번호 5,510,474; Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 및 Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU 프로모터 (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); ALS 프로모터 (미국 특허 번호 5,659,026); 옥수수 히스톤 프로모터 (Chaboute et al. Plant Molecular Biology, 8: 179-191 (1987)) 등을 포함한다.
다른 적용가능한 식물 프로모터는 조직 특이적 및 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 유도제에 반응하여 하나 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접 또는 간접적으로 활성화할 수 있는 것이다. 유도제의 부재 하에, DNA 서열 또는 유전자는 전사되지 않을 것이다. 전형적으로, 전사를 활성화하기 위해 유도성 조절 요소에 특이적으로 결합하는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재하고, 이어서 유도제에 의해 활성 형태로 직접 또는 간접적으로 전환된다. 유도제는 화학적 작용제, 예컨대 단백질, 대사물, 성장 조절제, 제초제 또는 페놀계 화합물 또는 열, 저온, 염, 또는 독성 요소에 의해 직접적으로 또는 병원체 또는 질병원, 예컨대 바이러스의 작용을 통해 간접적으로 부가되는 생리학적 스트레스일 수 있다. 전형적으로, 전사를 활성화하기 위해 유도성 조절 요소에 특이적으로 결합하는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재하고, 이어서 유도제에 의해 활성 형태로 직접 또는 간접적으로 전환된다. 유도제는 화학적 작용제, 예컨대 단백질, 대사물, 성장 조절제, 제초제 또는 페놀계 화합물 또는 열, 추위, 염, 또는 독성 요소에 의해 직접적으로 또는 병원체 또는 질병원, 예컨대 바이러스의 작용을 통해 간접적으로 부가되는 생리학적 스트레스일 수 있다. 유도성 조절 요소를 함유하는 식물 세포는 예컨대 분무, 살수, 가열 또는 유사한 방법에 의해 유도제를 세포 또는 식물에 외부에서 적용함으로써 유도제에 노출될 수 있다.
임의의 유도성 프로모터를 본 발명의 실시양태에서 사용할 수 있다. 문헌 [Ward et al., Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993)]을 참조한다. 예시적인 유도성 프로모터는 엑디손 수용체 프로모터 (미국 특허 번호 6,504,082); 구리에 반응하는 ACE1 시스템으로부터의 프로모터 (Mett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 4567-4571 (1993)); 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 반응하는 옥수수로부터의 In2-1 및 In2-2 유전자 (미국 특허 번호 5,364,780; Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991) 및 Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)); Tn10으로부터의 Tet 리프레서 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991)); 또는 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 유도된 전사 활성을 갖는, 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 프로모터 (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421 (1991) 및 McNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257); 발아전 제초제로서 사용되는 소수성 친전자성 화합물에 의해 활성화되는 옥수수 GST 프로모터 (미국 특허 번호 5,965,387 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/001294 참조); 및 살리실산에 의해 활성화되는 담배 PR-1a 프로모터 (문헌 [Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System," Biosci Biotechnol Biochem. 2011 Sep 23;75(9):1796-800] 참조)를 포함한다. 관심 대상의 다른 화학물질-조절 프로모터는 테트라시클린-유도성 및 테트라시클린-억제성 프로모터를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237], 및 미국 특허 번호 5,814,618 및 5,789,156 참조).
관심 대상의 다른 조절가능 프로모터는, 각각 그의 전사가 추위 또는 열에 대한 노출에 반응하여 실시될 수 있는 추위 반응성 조절 요소 또는 열 충격 조절 요소 (Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390, 1992); 혐기성 조건에 의해 유도가능한 알콜 데히드로게나제 유전자의 프로모터 (Gerlach et al., PNAS USA 79:2981-2985 (1982); Walker et al., PNAS 84(19):6624-6628 (1987)); 및 완두콩 rbcS 유전자 또는 완두콩 psaDb 유전자로부터 유래된 광-유도성 프로모터 (Yamamoto et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265); 광-유도성 조절 요소 (Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991; Lam and Chua, Science 248:471, 1990; Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Bio. 23(6):1129-1138); 식물 호르몬 유도성 조절 요소 (Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990) 등을 포함한다. 또한, 유도성 조절 요소는 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 반응하는 옥수수 In2-1 또는 In2-2 유전자의 프로모터 (Hershey et al., Mol. Gen. Gene. 227:229-237, 1991; Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994), 및 트랜스포손 Tn10의 Tet 리프레서 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991)일 수 있다. 스트레스 유도성 프로모터는 염/물 스트레스-유도성 프로모터, 예컨대 P5CS (Zang et al., (1997) Plant Sciences 129:81-89); 추위-유도성 프로모터, 예컨대 cor15a (Hajela et al., (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), cor15b (Wilhelm et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077), wsc1 (Ouellet et al., (1998) FEBS Lett. 423-324-328), ci7 (Kirch et al., (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909), ci21A (Schneider et al., (1997) Plant Physiol. 113:335-45); 가뭄-유도성 프로모터, 예컨대 Trg-31 (Chaudhary et al., (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57), rd29 (Kasuga et al., (1999) Nature Biotechnology 18:287-291); 삼투압 유도성 프로모터, 예컨대 Rab17 (Vilardell et al., (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93) 및 오스모틴 (Raghothama et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1117-28); 열 유도성 프로모터, 예컨대 열 충격 단백질 (Barros et al., (1992) Plant Mol. 19:665-75; Marrs et al., (1993) Dev. Genet. 14:27-41), smHSP (Waters et al., (1996) J. Experimental Botany 47:325-338); 및 파슬리 유비퀴틴 프로모터로부터의 열-충격 유도성 요소 (WO 03/102198)를 포함한다. 다른 스트레스-유도성 프로모터는 rip2 (미국 특허 번호 5,332,808 및 미국 특허 번호 2003/0217393) 및 rd29a (Yamaguchi-Shinozaki et al., (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331-340)를 포함한다. 아그로박테리움 pMAS 프로모터 (Guevara-Garcia et al., (1993) Plant J. 4(3):495-505) 및 아그로박테리움 ORF13 프로모터 (Hansen et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343)를 포함하는 특정 프로모터는 상처에 의해 유도가능하다.
조직-우선 프로모터는 특정한 식물 조직 내의 증강된 전사 및/또는 발현을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 우선적 발현이 언급되는 경우, 이는 다른 식물 조직에서보다 특정한 식물 조직에서 더 높은 수준으로 발현되는 것을 의미한다. 이들 유형의 프로모터의 예는 종자 우선 발현, 예컨대 파세올린 프로모터 (Bustos et al., (1989) The Plant Cell Vol. 1, 839-853), 및 옥수수 글로불린-1 유전자 (Belanger, et al. (1991) Genetics 129:863-972)에 의해 제공되는 것을 포함한다. 쌍자엽 식물의 경우, 종자-우선 프로모터는 콩 β-파세올린, 나핀, β-콘글리시닌, 대두 렉틴, 크루시페린 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 단자엽 식물의 경우, 종자-우선 프로모터는 옥수수 15 kDa 제인, 22 kDa 제인, 27 kDa 제인, γ-제인, 왁시, 슈렁큰 1, 슈렁큰 2, 글로불린 1 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 종자-우선 프로모터는 종자 내의 특정 조직에 우세하게 유전자 발현을 유도하는 프로모터, 예컨대 예를 들어 γ-제인의 내배유-우선 프로모터, 담배로부터의 잠재 프로모터 (Fobert et al., (1994) T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4: 567-577), 옥수수로부터의 P-유전자 프로모터 (Chopra et al., (1996) Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteins with C-terminal replacements. Plant Cell 7:1149-1158, Erratum in Plant Cell.1997, 1:109), 옥수수로부터의 글로불린-1 프로모터 (Belenger and Kriz (1991) Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863-972), 및 종자 외피 또는 옥수수 알맹이의 껍질에 대한 발현을 유도하는 프로모터, 예를 들어 과피-특이적 글루타민 신테타제 프로모터 (Muhitch et al ., (2002) Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase1 -2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163:865-872)를 포함한다.
프로모터 이외에도, 발현 벡터는 전형적으로 숙주 세포 (원핵 또는 진핵)에서의 핵산 발현에 필요한 모든 추가적인 요소들을 함유하는 전사 단위 또는 발현 카세트를 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는 예를 들어 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 신호, 예를 들어 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 부위 또는 번역 종결에 필요한 신호를 함유한다. 카세트의 추가의 요소는 예를 들어 인핸서 및 이종 스플라이싱 신호를 포함할 수 있다.
벡터의 다른 성분이 또한 유전자의 의도되는 용도에 따라 포함될 수 있다. 그 예는 선택 마커, 표적화 또는 조절 서열, 통과 펩티드 서열, 예컨대 최적화된 통과 펩티드 서열 (미국 특허 번호 5,510,471 참조), 안정화 서열, 예컨대 RB7 MAR (문헌 [Thompson and Myatt, (1997) Plant Mol. Biol., 34: 687-692] 및 국제 특허 공개 번호 WO9727207 참조) 또는 리더 서열, 인트론 등을 포함한다. 식물 발현 벡터 및 리포터 유전자에 대한 일반적인 설명 및 예는 문헌 [Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. eds; CRC Press pp. 89-119 (1993)]에서 볼 수 있다. 적절한 발현 벡터의 선택은 숙주, 및 발현 벡터를 숙주 내로 도입시키는 방법에 따라 달라질 것이다. 발현 카세트는 또한 관심 이종 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 식물에서 기능성인 전사 및 번역 종결 영역을 포함할 것이다. 종결 영역은 본 개시내용의 실시양태의 프로모터 뉴클레오티드 서열 그대로일 수 있거나, 관심 DNA 서열 그대로 수 있거나, 또는 또 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다. 편리한 종결 영역은 에이. 투메파시엔스의 Ti-플라스미드, 예컨대 옥토핀 신타제 및 노팔린 신타제 (nos) 종결 영역으로부터 이용가능하며 (Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982) 및 Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, number 20 pp7831-7846(nos)); 또한 문헌 [Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991); Sanfacon et al. Genes Dev. 5:141-149 (1991); Mogen et al. Plant Cell 2:1261-1272 (1990); Munroe et al. Gene 91:151-158 (1990); Ballas et al., Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987)]을 참조한다.
발현 카세트는 5' 리더 서열을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 리더 서열은 번역을 증강시키는 작용을 할 수 있다. 번역 리더는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예로서 피코르나바이러스 리더, EMCV 리더 (뇌심근염 5' 비코딩 영역) (Elroy-Stein et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989)); 포티바이러스 리더, 예를 들어 TEV 리더 (담배 식각 바이러스) (Carrington and Freed Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990)), MDMV 리더 (옥수수 위축 모자이크 바이러스) (Allison et al., Virology 154:9-20 (1986)); 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (BiP) (Macejak et al., Nature 353:90-94 (1991)); 알팔파 모자이크 바이러스의 코트 단백질 mRNA로부터의 비번역된 리더 (AMV RNA 4) (Jobling et al., Nature 325:622-625 (1987)); 담배 모자이크 바이러스 리더 (TMV) (Gallie et al., (1989) Molecular Biology of RNA, pages 237-256); 및 옥수수 백화 얼룩 바이러스 리더 (MCMV) (Lommel et al., Virology 81:382-385 (1991))를 포함한다. 또한, 문헌 [Della-Cioppa et al., Plant Physiology 84:965-968 (1987)]을 참조한다.
또한, 구축물은 번역 및/또는 mRNA 안정성을 증진시키는 서열, 예컨대 인트론을 함유할 수 있다. 한가지 이러한 인트론의 예는 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)의 히스톤 H3.III 변이체의 유전자 II의 제1 인트론이다. Chaubet et al., Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992).
이종 뉴클레오티드 서열의 발현된 생성물이 특정한 소기관, 특히 색소체, 전분체, 또는 세포질 세망으로 향하거나, 또는 세포의 표면 또는 세포외로 분비되는 것이 바람직한 경우에, 발현 카세트는 추가로 통과 펩티드의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 상기 통과 펩티드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 아실 운반 단백질, RUBISCO의 작은 서브유닛, 식물 EPSP 신타제 및 헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)에 대한 통과 펩티드 (미국 특허 번호 5,510,417), 제아 메이스(Zea mays) 브리틀(Brittle)-1 엽록체 통과 펩티드 (Nelson et al., Plant Physiol 117(4):1235-1252 (1998); Sullivan et al., Plant Cell 3(12):1337-48; Sullivan et al., Planta (1995) 196(3):477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(26):18999-9004) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 키메라 엽록체 통과 펩티드, 예컨대 최적화된 통과 펩티드 (미국 특허 번호 5,510,471)가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 추가의 엽록체 통과 펩티드는 미국 특허 번호 5,717,084 및 미국 특허 번호 5,728,925에 이전에 기재된 바 있다. 통상의 기술자는 생성물을 특정한 소기관에서 발현시키는데 이용가능한 많은 옵션을 용이하게 인식할 것이다. 예를 들어, 보리 알파 아밀라제 서열은 종종 세포질 세망에 대한 발현을 유도하기 위해 사용된다 (Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985)).
통상의 기술자는 재조합 DNA 기술의 사용이 예를 들어 숙주 세포 내의 핵산 분자의 카피의 수, 핵산 분자가 전사되는 효율, 생성된 전사체가 번역되는 효율, 및 번역후 변형의 효율을 조작함으로써 형질감염된 핵산 분자의 발현의 제어를 개선할 수 있음을 인식할 것이다. 추가로, 프로모터 서열은 천연 프로모터와 비교하여 발현 수준을 개선하기 위해 유전자 조작될 수 있다. 핵산 분자의 발현을 제어하는데 유용한 재조합 기술은 핵산 분자의 하나 이상의 숙주 세포 염색체 내로의 안정한 통합, 벡터 안정성 서열의 플라스미드에 대한 부가, 전사 제어 신호 (예를 들어, 프로모터, 작동유전자, 인핸서)의 치환 또는 변형, 번역 제어 신호 (예를 들어, 리보솜 결합 부위, 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 또는 코작(Kozak) 서열)의 치환 또는 변형, 숙주 세포의 코돈 사용에 대응하는 핵산 분자의 변형, 및 전사체를 탈안정화시키는 서열의 결실을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
형질전환된 세포 또는 조직 또는 식물 부분 또는 식물의 선택을 위한 리포터 또는 마커 유전자가 형질전환 벡터에 포함될 수 있다. 선택 마커의 예는 항-대사물, 예컨대 제초제 또는 항생제에 대한 저항성을 부여하는 것, 예를 들어 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 디히드로폴레이트 리덕타제 (문헌 [Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994]; 또한 문헌 [Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, (1983); Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16:807-820, (1991)] 참조); 아미노글리코시드 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 대한 저항성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983 및 Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)); 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (문헌 [Marsh, Gene 32:481-485, (1984)]; 또한 문헌 [Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5:103-108, (1985); Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, (1995)] 참조); 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용할 수 있도록 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용할 수 있도록 하는 hisD (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, (1988)); 세포가 만노스를 이용할 수 있도록 하는 만노스-6-포스페이트 이소머라제 (국제 특허 출원 번호 WO 94/20627); 오르니틴 데카르복실라제 억제제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴 (DFMO)에 대한 저항성을 부여하는 오르니틴 데카르복실라제 (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); 및 블라스티시딘 에스 (Blasticidin S)에 대한 저항성을 부여하는 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 데아미나제 (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, (1995))를 포함한다.
추가의 선택 마커는, 예를 들어 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여하는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 (Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, (1988)), 아트라진에 대한 저항성을 부여하는 돌연변이체 psbA (Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, (1993)), 또는 돌연변이체 프로토포르피리노겐 옥시다제 (미국 특허 번호 5,767,373 참조), 또는 제초제 예컨대 글루포시네이트에 대한 저항성을 부여하는 다른 마커를 포함한다. 적합한 선택 마커 유전자의 예는 클로람페니콜 (Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, (1983)); 스트렙토마이신 (Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, (1987)); 스펙티노마이신 (Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, (1996)); 블레오마이신 (Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, (1990)); 술폰아미드 (Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, (1990)); 브로목시닐 (Stalker et al., Science 242:419-423, (1988)); 글리포세이트 (Shaw et al., Science 233:478-481, (1986)); 포스피노트리신 (DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, (1987)) 등에 대한 저항성을 코딩하는 유전자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
선택 유전자의 사용을 위한 하나의 옵션은 글루포시네이트-저항성 코딩 DNA이고, 하나의 실시양태에서 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 프로모터의 제어 하의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (pat), 옥수수 최적화된 pat 유전자 또는 bar 유전자일 수 있다. 이들 유전자는 비알라포스에 대한 저항성을 부여한다. 문헌 [Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya et al., BioTechnology 11:835, 1993; White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062, 1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990; 및 Anzai et al., Mol. Gen. Gen. 219:492, 1989]을 참조한다. pat 유전자의 한 버전은 미국 특허 번호 6,096,947에 기재되어 있는 옥수수 최적화된 pat 유전자이다.
또한, 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물 세포의 확인을 용이하게 하는 마커가 사용될 수 있다. 스코어링가능한 또는 스크리닝가능한 마커가 유용하고, 여기서 서열의 존재는 측정가능한 생성물을 생산하고, 식물 세포를 파괴하지 않으면서 생성물을 생산할 수 있다. 그 예는 β-글루쿠로니다제, 또는 uidA 유전자 (GUS) (다양한 발색 기질이 공지된 효소를 코딩) (예를 들어, 미국 특허 번호 5,268,463 및 5,599,670); 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 number 13 pp. 3901-3907); 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 사용된 마커는 베타-카로틴 또는 프로비타민 A이다 (Ye et al., Science 287:303-305- (2000)). 이 유전자는 쌀의 영양분을 증진시키기 위해 사용되어 왔지만, 이 경우에는 스크리닝가능한 마커로서 대신 사용되고, 관심 유전자에 연결된 유전자의 존재는 제공되는 금색에 의해 검출된다. 유전자가 식물의 영양소에 대한 그의 기여를 위해 사용되는 상황과 달리, 보다 소량의 단백질이 마킹 목적을 위해 충분하다. 다른 스크리닝가능한 마커는, 예를 들어 특히, 식물 조직에서 안토시아닌 색소 (적색)의 생산을 조절하는 생성물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)); 플라보노이드 색소의 생합성을 제어하는 유전자, 예컨대 옥수수 C1 유전자 (Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler et al., Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48) 및 옥수수 C2 (Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207); B 유전자 (Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183), p1 유전자 (Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591; Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553; Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19); 브론즈 유전자좌 유전자 (Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197; Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049)를 포함하는 안토시아닌/플라보노이드 유전자를 전반적으로 포함한다 (문헌 [Taylor and Briggs, The Plant Cell (1990)2:115-127]에서의 논의 참조).
적합한 마커의 추가의 예는 시안 형광 단백질 (CYP) 유전자 (Bolte et al., (2004) J. Cell Science 117: 943-54 및 Kato et al., (2002) Plant Physiol 129: 913-42), 황색 형광 단백질 유전자 (에브로겐(Evrogen)의 PHIYFP™; 문헌 [Bolte et al., (2004) J. Cell Science 117: 943-54] 참조); 예를 들어 X선 필름, 섬광 계수, 형광 분광광도측정법, 저조도 비디오 카메라, 광자 계수 카메라 또는 다중웰 발광측정을 이용하여 그 존재를 검출할 수 있는 루시퍼라제를 코딩하는 lux 유전자 (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343); 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자 (Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5):777-84); 및 마커 유전자로 형질전환된 식물 세포가 적색이고 따라서 시각적으로 선택가능한 DsRed2 (Dietrich et al., (2002) Biotechniques 2(2):286-293)를 포함한다. 추가의 예는, 다양한 발색 기질 (예를 들어, PADAC, 발색 세팔로스포린)이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 β-락타마제 유전자 (Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737); 발색 카테콜을 전환할 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (Zukowsky et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:1101); α-아밀라제 유전자 (Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241); 및 티로신을, 다시 축합되어 용이하게 검출가능한 화합물 멜라닌을 형성하는 DOPA 및 도파퀴논으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703)를 포함한다. 명백하게는, 많은 상기 마커가 이용가능하며 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 임의로 관심 대상의 또 다른 뉴클레오티드 서열과 조합될 수 있다. 용어 "관심 대상의 뉴클레오티드 서열"은 목적 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 전사된 RNA 분자 뿐만 아니라 DNA 분자일 수 있는 핵산 분자 (폴리뉴클레오티드로 지칭될 수도 있음)를 지칭하지만, 또한 전체 유전자를 구성하지 않으며 폴리펩티드 또는 단백질을 반드시 코딩하지는 않는 핵산 분자 (예를 들어, 프로모터)를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 글리포세이트 또는 또 다른 제초제에 대한 추가의 저항성 또는 내성을 제공하는 또 다른 핵산, 및/또는 선택된 곤충 또는 질병에 대한 저항성 및/또는 영양소 증진, 및/또는 개선된 농경학적 특징을 제공하는 또 다른 핵산, 및/또는 사료, 식품, 상업적, 제약적 또는 다른 용도에 유용한 단백질 또는 다른 생성물을 제공하는 또 다른 핵산과 조합되거나 "집적"될 수 있다. 식물 게놈 내의 2개 이상의 관심 핵산 서열의 "집적"은 예를 들어 2개 이상의 이벤트를 사용한 통상적인 식물 육종, 관심 서열을 함유하는 구축물을 사용한 식물의 형질전환, 트랜스제닉 식물의 재-형질전환, 또는 상동 재조합을 통한 표적화 통합에 의한 새로운 형질의 부가를 통해 달성할 수 있다.
관심 대상의 이러한 뉴클레오티드 서열은 하기 제공된 예를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
1. 해충 또는 질병에 대한 저항성을 부여하는 유전자 또는 코딩 서열 (예를 들어 iRNA)
(A) 식물 질병 저항성 유전자. 식물 방어는 종종 식물 내의 질병 저항성 유전자 (R)의 생성물과 병원체 내의 대응하는 비병원성 (Avr) 유전자의 생성물 사이의 특이적 상호작용에 의해 활성화된다. 식물 품종은 특이적 병원체 균주에 저항성인 식물을 조작하기 위해 클로닝된 저항성 유전자로 형질전환될 수 있다. 이러한 유전자의 예는 클라도스포륨 풀붐(Cladosporium fulvum)에 대한 저항성을 위한 토마토 Cf-9 유전자 (Jones et al., 1994 Science 266:789), 슈도모나스 시린가에 (Pseudomonas syringae) pv. 토마토에 대한 저항성을 위한 단백질 키나제를 코딩하는 토마토 Pto 유전자 (Martin et al., 1993 Science 262: 1432), 및 슈도모나스 시린가에에 대한 저항성을 위한 아라비돕시스 RSSP2 유전자 (Mindrinos et al., 1994 Cell 78: 1089)를 포함한다.
(B) 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 단백질, 그의 유도체, 또는 이를 모델로 한 합성 폴리펩티드, 예컨대 Bt δ-내독소 유전자의 뉴클레오티드 서열 (Geiser et al., 1986 Gene 48:109), 및 영양 살곤충 (VIP) 유전자 (예를 들어, 문헌 [Estruch et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94] 참조). 또한, δ-내독소 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection (메릴랜드주 록빌))으로부터, 예를 들어 ATCC 수탁 번호 40098; 67136; 31995; 및 31998 하에 구입할 수 있다.
(C) 렉틴, 예컨대 몇몇 클리비아 미니아타(Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자의 뉴클레오티드 서열 (Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825).
(D) 곤충 해충에 대한 살유충제로서 유용한 비타민 결합 단백질, 예컨대 아비딘 및 아비딘 동족체. 미국 특허 번호 5,659,026 참조.
(E) 효소 억제제, 예를 들어 프로테아제 또는 아밀라제 억제제. 상기 유전자의 예는 벼 시스테인 프로테이나제 억제제 (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793), 담배 프로테이나제 억제제 I (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985), 및 α-아밀라제 억제제 (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243)를 포함한다.
(F) 곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예컨대 엑디스테로이드 및 유충 호르몬, 그의 변이체, 이를 기초로 한 모방체, 또는 그의 길항제 또는 효능제, 예컨대 유충 호르몬의 불활성화제인 클로닝된 유충 호르몬 에스테라제의 바큘로바이러스 발현 (Hammock et al., 1990 Nature 344:458).
(G) 발현시에 침범된 해충의 생리를 파괴하는 곤충-특이적 펩티드 또는 뉴로펩티드 (J. Biol. Chem. 269:9). 상기 유전자의 예는 곤충 이뇨 호르몬 수용체 (Regan, 1994), 디플로프테라 푼크타타(Diploptera punctata)에서 확인된 알로스타틴 (Pratt, 1989), 및 곤충-특이적, 마비성 신경독소 (미국 특허 번호 5,266,361)를 포함한다.
(H) 뱀, 말벌 등에 의해 자연에서 생산되는 곤충-특이적 독, 예컨대 전갈 곤충독성 펩티드 (Pang, (1992) Gene 116:165).
(I) 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 살곤충 활성을 갖는 또 다른 비-단백질 분자의 과축적을 담당하는 효소.
(J) 번역후 변형을 포함하여 생물학적 활성 분자의 변형에 관여하는 효소; 예를 들어, 천연 또는 합성에 관계없이, 당분해 효소, 단백질분해 효소, 지질분해 효소, 뉴클레아제, 시클라제, 트랜스아미나제, 에스테라제, 히드롤라제, 포스파타제, 키나제, 포스포릴라제, 폴리머라제, 엘라스타제, 키티나제 및 글루카나제. 상기 유전자의 예는 callas 유전자 (PCT 공개 출원 WO93/02197), 키티나제-코딩 서열 (ATCC로부터 수탁 번호 3999637 및 67152 하에 얻을 수 있음), 담배 구충 키티나제 (Kramer et al., (1993) Insect Molec. Biol. 23:691), 및 파슬리 유비4-2 폴리유비퀴틴 유전자 (Kawalleck et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673)를 포함한다.
(K) 신호 전달을 자극하는 분자. 상기 분자의 예는 녹두 칼모듈린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 (Botella et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757) 및 옥수수 칼모듈린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 (Griess et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467)을 포함한다.
(L) 소수성 모멘트 펩티드. 미국 특허 번호 5,659,026 및 5,607,914 참조; 후자는 질병 저항성을 부여하는 합성 항미생물 펩티드를 교시한다.
(M) 막 퍼미아제, 채널 형성제, 또는 채널 차단제, 예컨대 트랜스제닉 담배 식물을 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 대해 저항성으로 만들기 위한 세크로핀-β 용해 펩티드 유사체 (Jaynes et al., (1993) Plant Sci. 89:43).
(N) 바이러스-침습성 단백질 또는 그로부터 유래된 복합 독소. 예를 들어, 형질전환된 식물 세포 내의 바이러스 코트 단백질의 축적은 바이러스 감염 및/또는 코트 단백질 유전자가 유래될 수 있는 바이러스에 의한, 뿐만 아니라 관련 바이러스에 의한 질병 발생에 대한 저항성을 부여한다. 코트 단백질-매개 저항성은 알팔파 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 담배 줄무늬 바이러스, 감자 바이러스 X, 감자 바이러스 Y, 담배 식각 바이러스, 담배 얼룩 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스에 대항하여 형질전환된 식물에 부여되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Beachy et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451]을 참조한다.
(O) 곤충-특이적 항체 또는 그로부터 유래된 면역독소. 따라서, 곤충 장에서 중요한 대사 기능에 대해 표적화된 항체는 영향받은 효소를 불활성화시키켜 곤충을 죽인다. 예를 들어, 문헌 [Taylor et al., (1994) Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions]에서는 단일-쇄 항체 단편의 생산을 통한 트랜스제닉 담배에서의 효소 불활성화를 보여준다.
(P) 바이러스-특이적 항체. 예를 들어, 재조합체 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이 바이러스 공격으로부터 보호됨을 보여주는 문헌 [Tavladoraki et al., (1993) Nature 266:469]을 참조한다.
(Q) 병원체 또는 기생충에 의해 자연에서 생산되는 발달-정지 단백질. 따라서, 진균 엔도 α-1,4-D-폴리갈락투로나제는 식물 세포벽 호모-α-1,4-D-갈락투로나제를 가용화함으로써 진균 콜로니화 및 식물 영양분 방출을 용이하게 한다 (Lamb et al., (1992) Bio/Technology 10:1436). 콩 엔도폴리갈락투로나제-억제 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝 및 특성화는 문헌 [Toubart et al., (1992) Plant J. 2:367]에 기재되어 있다.
(R) 식물에 의해 자연에서 생산되는 발달-정지 단백질, 예컨대 진균 질병에 대한 증가된 저항성을 제공하는 보리 리보솜-불활성화 유전자 (Longemann et al., (1992). Bio/Technology 10:3305).
(S) RNA 분자를 코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드가 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해 사용되는 RNA 간섭. 한 예에서 RNA 분자는 부분 또는 완전 이중 가닥이고, 침묵화 반응을 촉발하여 dsRNA의 소형 간섭 RNA로의 절단을 일으키고, 이는 이후에 상동 mRNA를 파괴하는 표적화 복합체 내로 혼입된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,506,559 (Fire et al.); 미국 특허 번호 6,573,099 (Graham et al.)를 참조한다.
2. 제초제에 대한 저항성을 부여하는 유전자
(A) 성장점 또는 분열조직을 억제하는 제초제, 예를 들어 이미다졸리논, 술폰아닐리드 또는 술포닐우레아 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 이 범주 내의 예시적인 유전자는 AHAS 효소 (Miki et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449)로도 공지된 돌연변이체 ALS 효소 (Lee et al., (1988) EMBOJ. 7:1241)를 코딩한다.
(B) 돌연변이체 EPSP 신타제 및 aroA 유전자에 의해, 또는 유전자, 예컨대 GAT (글리포세이트 아세틸트랜스퍼라제) 또는 GOX (글리포세이트 옥시다제) 및 다른 포스포노 화합물, 예컨대 글루포시네이트 (pat 및 bar 유전자; DSM-2), 및 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온 (ACCase 억제제 코딩 유전자)의 대사 불활성화를 통해 부여된 글리포세이트에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 하나 이상의 추가의 유전자. 예를 들어, 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 EPSP의 형태의 뉴클레오티드 서열을 개시하고 있는 미국 특허 번호 4,940,835를 참조한다. 돌연변이체 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 39256 하에 얻을 수 있고, 돌연변이체 유전자의 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 번호 4,769,061에 개시되어 있다. 유럽 특허 출원 번호 0 333 033 및 미국 특허 번호 4,975,374에는 제초제, 예컨대 L-포스피노트리신에 대한 저항성을 부여하는 글루타민 신타제 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. 포스피노트리신 아세틸-트랜스퍼라제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 유럽 특허 출원 번호 0 242 246에 제공되어 있다. 문헌 [De Greef et al., (1989) Bio/Technology 7:61]에는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 키메라 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산이 기재되어 있다. 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온, 예컨대 세톡시딤 및 할록시포프에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 예시는 문헌 [Marshall et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435]에 기재된 Accl-S1, Accl-S2 및 Accl-S3 유전자이다.
(C) 광합성을 억제하는 제초제, 예컨대 트리아진 (psbA 및 gs+ 유전자) 및 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 문헌 [Przibilla et al., (1991) Plant Cell 3:169]에는 돌연변이체 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드를 사용한 클라미도모나스(Chlamydomonas)의 형질전환이 기재되어 있다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 번호 4,810,648에 개시되어 있고, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 53435, 67441 및 67442 하에 이용가능하다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현은 문헌 [Hayes et al., (1992) Biochem. J. 285:173]에 기재되어 있다.
(D) 파라-히드록시페닐피루베이트 (HPP)가 호모겐티세이트로 변환되는 반응을 촉매하는 효소인 히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD)에 결합하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 이는 제초제, 예컨대 이속사졸 (유럽 특허 번호 418175, 유럽 특허 번호 470856, 유럽 특허 번호 487352, 유럽 특허 번호 527036, 유럽 특허 번호 560482, 유럽 특허 번호 682659, 미국 특허 번호 5,424,276), 특히 옥수수에 대한 선택적 제초제인 이속사플루톨, 디케토니트릴 (유럽 특허 번호 496630, 및 유럽 특허 번호 496631), 특히 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-CF3 페닐) 프로판-1,3-디온 및 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2페닐) 프로판-1,3-디온, 트리케톤 (유럽 특허 번호 625505, 유럽 특허 번호 625508, 미국 특허 번호 5,506,195), 특히 술코트리온, 및 피라졸리네이트를 포함한다. 예를 들어 미국 특허 번호 6,268,549 및 6,245,968 및 미국 특허 출원 공개 번호 20030066102에 기재된 유전자를 비롯하여 식물에서 과잉의 HPPD를 생산하는 유전자는 상기 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공할 수 있다.
(E) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하고 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (AOPP) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 또한 부여할 수 있는 유전자. 상기 유전자의 예는 미국 특허 번호 7,838,733에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 (aad-1) 유전자를 포함한다.
(F) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하고 또한 피리딜옥시 옥신 제초제, 예컨대 플루옥시피르 또는 트리클로피르에 대한 저항성 또는 내성을 부여할 수 있는 유전자. 상기 유전자의 예는 WO 2007/053482 A2에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 유전자 (aad-12)를 포함한다.
(G) 디캄바에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20030135879 참조).
(H) 프로토포르피리노겐 옥시다제 (PPO)를 억제하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 (미국 특허 번호 5,767,373 참조).
(I) 광화학계 II 반응 중심 (PS II)의 코어 단백질에 결합하는 트리아진 제초제 (예컨대 아트라진) 및 우레아 유도체 (예컨대 디우론) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 (문헌 [Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245] 참조).
3. 부가가치 형질을 부여하거나 그에 기여하는 유전자
(A) 예를 들어 식물의 스테아르산 함량을 증가시키기 위해 스테아로일-ACP 데새투라제의 안티센스 유전자로 옥수수 또는 브라시카를 형질전환함으로써 변형된 지방산 대사 (Knultzon et al., (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624).
(B) 감소된 피테이트 함량
(1) 피타제-코딩 유전자, 예컨대 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 피타제 유전자의 도입 (Van Hartingsveldt et al., (1993) Gene 127:87)은 피테이트의 파손을 증진시켜, 더 많은 유리 포스페이트를 형질전환된 식물에 부가할 수 있다.
(2) 유전자는 피테이트 함량을 감소시키기 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 옥수수에서, 이것은 낮은 수준의 피트산을 특징으로 하는 옥수수 돌연변이체에 대한 원인이 되는 단일 대립유전자와 연관된 DNA를 클로닝한 후 재도입함으로써 달성할 수 있다 (Raboy et al., (1990) Maydica 35:383).
(C) 예를 들어 식물을 전분의 분지화 패턴을 변경시키는 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환시킴으로써 달성된 변형된 탄수화물 조성. 상기 효소의 예는 스트렙토코쿠스 무코스(Streptococcus mucus) 프룩토실트랜스퍼라제 유전자 (Shiroza et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라제 유전자 (Steinmetz et al., (1985) Mol. Gen. Genel. 200:220), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) α-아밀라제 (Pen et al., (1992) Bio/Technology 10:292), 토마토 인버타제 유전자 (Elliot et al., (1993)), 보리 아밀라제 유전자 (Sogaard et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22480) 및 옥수수 내배유 전분 분지화 효소 II (Fisher et al., (1993) Plant Physiol. 102:10450)를 포함한다.
표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 확인하는 방법이 본원에 기재된다. 추가 실시양태로서, 부위 특이적 뉴클레아제는 비변형된 내인성 식물 게놈 유전자좌, 이전에 표적화된 식물 게놈 유전자좌 또는 이전에 삽입된 외인성 DNA를 절단하는데 사용될 수 있다. 내인성 게놈 유전자좌의 표적화는 본 개시내용의 한 실시양태이다.
실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 조작된 (비-자연 발생) 메가뉴클레아제 (또한 귀소 엔도뉴클레아제로 기재됨)를 포함하는 부위 특이적 뉴클레아제를 사용한다. 귀소 엔도뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열이 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; 문헌 [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs catalogue]를 참조한다. 또한, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-천연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 5 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 번호 20070117128을 참조한다. 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 전체적으로 뉴클레아제의 맥락에서 (즉, 뉴클레아제가 동족 절단 도메인을 포함하도록) 변경될 수 있거나 또는 이종 절단 도메인에 융합될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용되는 하나 이상의 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생) TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 20110301073을 참조한다. 크산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물 식물에서 많은 질병을 야기하는 것으로 공지되어 있다. 크산토모나스의 병원성은 더 많은 상이한 이펙터 단백질을 식물 세포 내로 주입하는 보존된 유형 III 분비 (T3S) 시스템에 의존한다. 이러한 주입된 단백질 중에는 식물 전사 활성화제를 모방하고 식물 트랜스크립톰을 조작하는 전사 활성화제-유사 (TALEN) 이펙터가 있다 (문헌 [Kay et al. (2007) Science 318:648-651] 참조). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 대부분의 잘 특성화된 TAL-이펙터 중의 하나는 크산토모나스 캄페스트그리스 pv. 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다 (문헌 [Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136] 및 WO2010079430 참조). TAL-이펙터는 탠덤 반복부의 집중화 도메인을 함유하고, 각각의 반복부는 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 핵심적인 대략 34개의 아미노산을 함유한다. 또한, 이들은 핵 국재화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다 (검토에 대해서는, 문헌 [Schornack S, et al. (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272] 참조). 또한, 식물병원성 박테리아 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에서, 알. 솔라나세아룸 생물변이형 균주 GMI1000 및 생물변이형 4 균주 RS1000에서 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리에 상동성인 brg11 및 hpx17로 지정된 2개의 유전자가 발견되었다 (문헌 [Heuer et al. (2007) Appl and Enviro Micro 73(13): 4379-4384] 참조). 이들 유전자는 서로 뉴클레오티드 서열이 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복 도메인 내의 1,575 bp의 결실에서 상이하다. 그러나, 두 유전자 생성물은 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 20110301073을 참조한다.
이들 TAL 이펙터의 특이성은 탠덤 반복부에서 발견되는 서열에 따라 달라진다. 반복된 서열은 대략 102 bp를 포함하고, 반복부는 전형적으로 서로에 대해 91-100% 상동성이다 (상기 동일 문헌 [Bonas et al.]). 반복부의 다형성은 대체로 위치 12 및 13에 위치하고, 위치 12 및 13의 초가변 이잔기의 정체와 TAL-이펙터의 표적 서열 내의 인접 뉴클레오티드의 정체 사이에 1:1 대응관계가 존재하는 것으로 보인다 (문헌 [Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501 및 Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512] 참조). 실험에 의해, 이들 TAL-이펙터의 DNA 인식을 위한 천연 코드는 위치 12 및 13의 HD 서열이 시토신 (C)에 결합하고, NG가 T에 결합하고, NI가 A, C, G 또는 T에 결합하고, NN이 A 또는 G에 결합하고, ING가 T에 결합하도록 결정되었다. 이들 DNA 결합 반복부는, 새로운 서열과 상호작용하고 식물 세포 내에서 비-내인성 리포터 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있는 인공 전사 인자를 제조하기 위해 새로운 조합 및 반복부의 수를 갖는 단백질로 조립되었다 (상기 동일 문헌 [Boch et al.]). 조작된 TAL 단백질은 효모 리포터 검정 (플라스미드 기반 표적)에서 활성을 나타내는 TAL 이펙터 도메인 뉴클레아제 융합체 (TALEN)를 수득하기 위해 FokI 절단 절반 도메인에 연결되었다.
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR 연관) 뉴클레아제 시스템은 게놈 조작에 사용될 수 있는 박테리아 시스템에 기반하여 최근에 유전자 조작된 뉴클레아제 시스템이다. 이것은 많은 박테리아 및 고세균의 적응 면역 반응의 일부를 기초로 한다. 바이러스 또는 플라스미드가 박테리아에 침입할 때, 침입자의 DNA의 절편은 '면역' 반응에 의해 CRISPR RNA (crRNA)로 전환된다. 상기 crRNA는 이어서 Cas9 뉴클레아제를 "프로토스페이서"로 불리는 표적 DNA 내의 crRNA에 상동성인 영역으로 가이드하기 위해 tracrRNA로 불리는 또 다른 유형의 RNA와 부분 상보성의 영역을 통해 회합한다. Cas9는 crRNA 전사체 내에 함유된 20-뉴클레오티드 가이드 서열에 의해 특정된 부위에서 DSB에서 평활 말단을 생성하기 위해 DNA를 절단한다. Cas9는 부위 특이적 DNA 인식 및 절단을 위해 crRNA 및 tracrRNA 둘 다를 필요로 한다. 상기 시스템은 본 발명에 이르러 crRNA 및 tracrRNA가 하나의 분자 ("단일 가이드 RNA")로 조합될 수 있도록 조작되었고, 단일 가이드 RNA의 crRNA 동등 부분은 표적 임의의 목적 서열로 Cas9 뉴클레아제를 가이드하도록 조작될 수 있다 (문헌 [Jinek et al. (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al., (2013), eLife 2:e00471, 및 David Segal, (2013) eLife 2:e00563] 참조). 따라서, CRISPR/Cas 시스템은 조작되어 게놈 내의 목적 표적에서 이중-가닥 파손 (DSB)를 생성할 수 있고, DSB의 복구는 오류 유발 복구의 증가를 유발하는 복구 억제자의 사용에 의해 영향받을 수 있다.
특정 실시양태에서, Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질의 "기능적 유도체"일 수 있다. 천연 서열 폴리펩티드의 "기능적 유도체"는 천연 서열 폴리펩티드와 공통적인 정성적 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능적 유도체"는 대응하는 천연 서열 폴리펩티드와 공통적인 생물학적 특성을 갖는다면, 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩티드의 유도체 및 그의 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 고려되는 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해하는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체, 공유 변형 둘 다, 및 그의 융합체를 포괄한다. Cas 폴리펩티드의 적합한 유도체 또는 그의 단편은 Cas 단백질의 돌연변이체, 융합체, 공유 변형 또는 그의 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. Cas 단백질 또는 그의 단편, 뿐만 아니라 Cas 단백질의 유도체 또는 그의 단편을 포함하는 Cas 단백질은 세포로부터 수득가능하거나, 또는 화학적으로 합성되거나 또는 이들 2가지 절차의 조합에 의해 수득가능할 수 있다. 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하는 세포, 또는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하고 내인성 Cas 단백질을 보다 높은 발현 수준으로 생산하도록, 또는 내인성 Cas와 동일하거나 상이한 Cas를 코딩하는 외인성으로 도입된 핵산으로부터 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된 세포일 수 있다. 일부 경우에, 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하지 않고, Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된다. Cas 단백질은 Cas 뉴클레아제와 가이드 RNA를 공동-발현시킴으로써 포유동물 세포 내에 (및 추정상 식물 세포 내에) 배치된다. 가이드 RNA의 2가지 형태는 문헌 [Le Cong, F., et al., (2013) Science 339(6121):819-823]에 개시된 바와 같이 Cas-매개 게놈 절단을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포의 게놈의 생체내 절단 및/또는 표적화 절단을 위해 사용되는 하나 이상의 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 아연 핑거 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아연 핑거 단백질은 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된다는 점에서 비-자연발생적이다. 예를 들어, 문헌 [Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]; 미국 특허 번호 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공개 번호 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061을 참조하며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연 발생 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중 (또는 사중) 뉴클레오티드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 사용을 포함하며, 여기서 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정한 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 회합된다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 6,453,242 및 6,534,261을 참조한다.
표적 부위의 선택; ZFP 및 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구축 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 미국 특허 번호 6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 상기 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거의 아연 핑거 단백질은 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 아연 핑거 사이의 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
따라서, 부위 특이적 뉴클레아제는 그 내로 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 (즉, 적어도 하나의 트랜스진을 포함함)를 삽입하는 것이 요구되는 임의의 유전자 내의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함한다.
임의의 적합한 절단 도메인은 뉴클레아제 융합 단백질을 형성하기 위해 DNA-결합 도메인에 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인은 뉴클레아제 도메인에 융합되어, ZFN - 그의 조작된 (ZFP) DNA 결합 도메인을 통해 그의 의도된 핵산 표적을 인식하고 뉴클레아제 활성을 통해 ZFP 결합 부위 근처에서 DNA를 절단할 수 있는 기능적 개체를 생성하였다. 예를 들어, 문헌 [Kim et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160]을 참조한다. 보다 최근에, ZFN은 다양한 유기체에서 게놈 변형을 위해 사용되었다. 예를 들어, 미국 특허 공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; 및 국제 공개 WO 07/014275를 참조한다. 마찬가지로, TALEN DNA-결합 도메인은 뉴클레아제 도메인에 융합되어 TALEN을 생성하였다. 예를 들어, 미국 공개 번호 20110301073을 참조한다.
상기 제시된 바와 같이, 절단 도메인은 DNA-결합 도메인, 예를 들어 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인 또는 TALEN DNA-결합 도메인 및 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인, 또는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인에 대해 이종일 수 있다. 이종 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단하는 추가의 효소가 공지되어 있다 (예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미크로코쿠스 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한, 문헌 [Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993] 참조). 이들 효소 (또는 그의 기능적 단편) 중 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 절반-도메인의 공급원으로 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 절반-도메인은 상기 제시된 바와 같이, 절단 활성을 위해 이량체화를 필요로 하는 임의의 뉴클레아제 또는 그의 일부로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함한다면 2개의 융합 단백질이 절단에 필요하다. 대안적으로, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반-도메인이 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있거나, 또는 각각의 절단 절반-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질이 각각의 표적 부위에 결합하는 것이, 절단 절반-도메인들이 기능적 절단 도메인을 (예를 들어, 이량체화에 의해) 형성할 수 있게, 절단 절반-도메인들을 서로에 대한 공간 배향으로 위치시키도록, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위들은 바람직하게는 서로 관련되어 배치된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 표적 부위들의 가까운 가장자리들은 5-8개의 뉴클레오티드 또는 15-18개의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 그러나, 임의의 정수 개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 2개의 표적 부위 사이에 개재될 수 있다 (예를 들어, 2 내지 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 쌍). 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 존재한다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 다수의 종 내에 존재하고, DNA에 서열-특이적으로 결합할 수 있고 (인식 부위에서), 결합 부위에서 또는 결합 부위 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소 (예를 들어, 유형 IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하고, 분리가능한 결합 도메인 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 Fok I는 한쪽 가닥 상의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오티드, 및 다른쪽 가닥 상의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오티드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 뿐만 아니라 문헌 [Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982]을 참조한다. 따라서, 한 실시양태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인), 및 조작될 수 있거나 조작되지 않을 수 있는 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 Fok I이다. 이러한 특정 효소는 이량체로서 활성이다. Bitinaite et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. 따라서, 본 개시내용의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에서 사용된 Fok I 효소의 부분은 절단 절반-도메인으로 간주된다. 따라서, 아연 핑거-Fok I 융합체를 사용한 표적화 이중-가닥 절단 및/또는 세포 서열의 표적화 교체를 위해, 각각 FokI 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 촉매적 활성 절단 도메인을 재구성하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 Fok I 절단 절반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자가 또한 사용될 수 있다. 아연 핑거-Fok I 융합체를 사용한 표적화 절단 및 표적화 서열 변경을 위한 파라미터는 본 개시내용의 다른 곳에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 절반-도메인은 절단 활성을 보유하거나 또는 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 다량체화 (예를 들어, 이량체화)하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 유형 IIS 제한 효소는 전문이 본원에 포함되는 국제 특허 출원 공개 WO 07/014275에 기재되어 있다. 추가의 제한 효소는 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하고, 이들은 본 발명에서 구현된다. 예를 들어, 문헌 [Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 절단 도메인은, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 20050064474; 20060188987; 20070305346 및 20080131962 (이들 모두의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 동종이량체화를 최소화하거나 또는 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 절반-도메인 (이량체화 도메인 돌연변이체로도 지칭됨)을 포함한다. Fok I의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538의 아미노산 잔기는 모두 Fok I 절단 절반-도메인의 이량체화에 영향을 주기 위한 표적이다.
절대적 이종이량체를 형성하는 Fok I의 예시적인 조작된 절단 절반-도메인은 제1 절단 절반-도메인이 Fok I의 위치 490 및 538의 아미노산 잔기에서의 돌연변이를 포함하고 제2 절단 절반-도메인이 아미노산 잔기 486 및 499에서의 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 490에서의 돌연변이는 Glu (E)를 Lys (K)로 교체하고; 538에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 교체하고; 486에서의 돌연변이는 Gln (Q)를 Glu (E)로 교체하고; 위치 499에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 교체한다. 구체적으로, 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 "E490K:I538K"로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 생산하기 위해 하나의 절단 절반-도메인에서 위치 490 (E→K) 및 538 (I→K)을 돌연변이시키고, "Q486E:I499L"로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 생산하기 위해 또 다른 절단 절반-도메인에서 위치 486 (Q→E) 및 499 (I→L)를 돌연변이시킴으로써 제조하였다. 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 비정상적 절단이 최소화되거나 또는 제거된 절대적 이종이량체 돌연변이체이다. 예를 들어, 모든 목적을 위해 개시내용 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 2008/0131962를 참조한다. 특정 실시양태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 486, 499 및 496 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에 돌연변이, 예를 들어 위치 486의 야생형 Gln (Q) 잔기를 Glu (E) 잔기로, 위치 499의 야생형 Iso (I) 잔기를 Leu (L) 잔기로, 위치 496의 야생형 Asn (N) 잔기를 Asp (D) 또는 Glu (E) 잔기로 교체한 돌연변이 (각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인으로도 지칭됨)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490, 538 및 537 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에 돌연변이, 예를 들어 위치 490의 야생형 Glu (E) 잔기를 Lys (K) 잔기로, 위치 538의 야생형 Iso (I) 잔기를 Lys (K) 잔기로, 위치 537의 야생형 His (H) 잔기를 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 교체한 돌연변이 (각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인으로도 지칭됨)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조작된 절단 하프-도메인은 위치 490 및 537 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에 돌연변이, 예를 들어 위치 490의 야생형 Glu (E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 위치 537의 야생형 His (H) 잔기를 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 교체한 돌연변이 (각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인으로도 지칭됨)를 포함한다. (미국 특허 공개 번호 20110201055 참조). 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반 도메인은 "Sharkey" 및/또는 "Sharkey" 돌연변이를 포함한다 (문헌 [Guo et al., (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107] 참조).
본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 임의의 적합한 방법을 이용하여, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 20050064474; 20080131962; 및 20110201055에 기재된 바와 같은 야생형 절단 절반-도메인 (Fok I)의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분할-효소" 기술을 이용하여 핵산 표적 부위에서 생체내에서 조립될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20090068164 참조). 이러한 분할 효소의 성분은 별개의 발현 구축물 상에서 발현될 수 있거나, 또는 개별 성분이, 예를 들어 자가-절단성 2A 펩티드 또는 IRES 서열에 의해 분리되는 하나의 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 성분은 개별적인 아연 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
뉴클레아제는 WO 2009/042163 및 20090068164에 기재된 바와 같이 예를 들어 효모-기반 염색체 시스템에서 사용하기 전에 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 뉴클레아제 발현 구축물은 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 용이하게 설계할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; 및 국제 공개 WO 07/014275를 참조한다. 뉴클레아제의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
"표적" 또는 "표적 부위" 또는 "표적화 게놈 유전자좌"는 결합에 충분한 조건이 존재하는 한, 결합 분자 (예를 들어 부위 특이적 뉴클레아제)가 결합할 핵산의 부분을 규정하는 핵산 서열이다.
한 실시양태에서, 게놈 유전자좌 서열은 염색체, 에피솜, 소기관 게놈 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 인공 염색체 및 세포 내에 존재하는 임의의 기타 유형의 핵산, 예컨대 예를 들어 증폭된 서열, 이중 미세 염색체 및 내인성 또는 감염성 박테리아 및 바이러스의 게놈 내에 존재하는 것들을 포함한다. 게놈 유전자좌 서열은 정상 (즉, 야생형) 또는 돌연변이체일 수 있고; 돌연변이체 서열은 예를 들어 삽입 (예를 들어, 이전에 삽입된 외인성 폴리뉴클레오티드), 결실, 전위, 재배열 및/또는 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 게놈 유전자좌 서열은 또한 다수의 상이한 대립유전자들 중 하나를 포함할 수 있다.
게놈 유전자좌 내에 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하는 방법이 또한 본 발명의 한 실시양태로서 본원에 기재된다. 표적화 게놈 변형의 보고 및 관찰된 빈도는 식물 내의 게놈 유전자좌를 표적화하는 것이 상대적으로 비효율적임을 나타낸다. 부분적으로는 불량한 효율의 상동 재조합, 및 표적 부위 이외의 게놈 영역 내로의 공여자 DNA의 높은 빈도의 비-특이적 삽입으로 인해, 이러한 방법은 성공률이 낮다. 본 개시내용은 표적화 게놈 유전자좌 내의 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드를 확인하는 방법을 제공한다
본 개시내용의 방법은 세포 DNA 내에 하나 이상의 표적화 이중-가닥 파손을 일으키기 위해 부위 특이적 뉴클레아제 (예를 들어, 절단 도메인에 융합된 조작된 아연 핑거 결합 도메인)를 제조 및 사용하는 것을 포함한다. 세포 DNA 내의 이중-가닥 파손은 절단 부위 부근에서 세포 복구 메커니즘을 수천배 자극하기 때문에, 이같은 표적화 절단은 게놈 내의 실질적으로 모든 부위에서 서열을 변경 또는 교체시킨다 (상동성-지시 복구를 통해).
본원에 기재된 융합 분자 이외에도, 선택된 게놈 서열의 표적화 교체는 또한 교체 또는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열의 도입을 또한 필요로 한다. 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 융합 단백질(들)의 발현 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 세포 내로 도입될 수 있다. 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드는 게놈 서열에 대한 충분한 상동성을 함유하여, 자신이 상동성인 게놈 서열과 자신 사이의 상동 재조합 (또는 상동성-지시 복구)을 지지한다. 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드와 게놈 유전자좌 사이의 대략 25, 50, 100, 200, 500, 750, 1,000, 1,500, 2,000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 10 내지 2,000개 또는 그 초과의 임의의 정수값의 뉴클레오티드)의 서열 상동성이 이들 사이의 상동 재조합을 지지할 것이다. 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열의 길이는 10 내지 5,000개 뉴클레오티드 (또는 그 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드) 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 전형적으로 자신이 교체하는 게놈 서열과 동일하지 않다는 것이 용이하게 명백할 것이다. 예를 들어, 염색체 서열과의 충분한 상동성이 존재하는 한, 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 서열은 게놈 서열과 관련하여 하나 이상의 단일 염기 교환, 삽입, 결실, 역위 또는 재배열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 2개의 상동성 영역이 플랭킹된 비-상동성 서열을 함유할 수 있다. 추가로, 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열은 세포 염색질 내의 관심 영역에 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 일반적으로, 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 서열의 상동 영역(들)은 재조합을 원하는 게놈 유전자좌에 대해 적어도 50%의 서열 동일성을 가질 것이다. 특정 실시양태에서, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9%의 서열 동일성이 존재한다. 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 길이에 따라, 1% 내지 100% 사이의 임의의 값의 서열 동일성이 존재할 수 있다.
공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 분자는 세포 염색질에 대한 여러 개의 비연속적인 상동성 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 정상적으로는 관심 영역 내에 존재하지 않는 서열의 표적화 삽입을 위해, 상기 서열이 공여자 DNA 핵산 분자 내에 존재할 수 있고, 관심 영역 내의 서열에 대한 상동성 영역이 상기 서열에 플랭킹될 수 있다.
공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 선형 또는 원형 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되면, 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 공여자 서열의 말단들이 보호될 수 있다 (예를 들어, 엑소뉴클레오리틱 분해로부터). 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 부가되고/거나, 자가-상보적 올리고뉴클레오티드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 라이게이션된다. 예를 들어, 문헌 [Chang et al., (1987) Proc. Natl Acad. Sd. USA 84:4959- 4963; Nehls et al., (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오티드를 보호하기 위한 추가적인 방법은 말단 아미노 기(들)의 부가, 및 변형된 뉴클레오티드간 연결부, 예컨대 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기의 사용을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
공여자 DNA 폴리뉴클레오티드는 추가의 서열, 예컨대 예를 들어 복제 기점, 프로모터 및 항생제 저항성을 코딩하는 유전자를 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 또한, 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드는 네이키드 핵산으로서, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체를 이룬 핵산으로서 도입될 수 있거나, 또는 박테리아 또는 바이러스 (예를 들어, 아그로박테리움 종, 리조비움 종(Rhizobium) 종 NGR234, 시노리조비움 멜리오티(Sinorhizoboium meliloti), 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 담배 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 X, 콜리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 엽맥 모자이크 바이러스)에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Chung et al. (2006) Trends Plant Sd. 11(1): 1-4]을 참조한다.
한가지 이론에 얽매이지 않으면서, 세포 서열 내의 이중-가닥 파손의 존재는 파손부에 인접한 또는 파손부 주변의 영역에 대한 상동성을 갖는 외인성 DNA 분자의 존재와 연결되며, 공여자 분자로부터 세포 (예를 들어, 게놈 또는 염색체) 서열 내로의 서열 정보 전달에 의해, 즉, "유전자 전환"으로도 공지된 상동성-지시 복구 프로세스에 의해 파손을 복구하는 세포 메커니즘을 활성화시키는 것으로 보인다. 출원인의 방법은 조작된 ZFP의 강력한 표적화 능력을 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인)과 유리하게 조합하여, 이중-가닥 파손을 외인성 서열의 삽입을 원하는 게놈의 영역으로 특이적으로 표적화한다.
염색체 서열의 변경을 위해, 원하는 서열 변경을 일으키도록 충분한 공여자 서열이 카피되는 한, 공여자의 전체 서열이 염색체 내로 카피될 필요는 없다.
상동 재조합에 의한 공여자 서열 삽입의 효율은 재조합을 원하는 부위와 이중-가닥 파손 간의 거리 (세포 DNA 내에서의 거리)에 반비례한다. 바꾸어 말하면, 이중 가닥 파손이 재조합을 원하는 부위에 가까울수록 더 높은 상동 재조합 효율이 관찰된다. 정확한 재조합 부위가 미리 결정되지 않은 경우 (예를 들어, 원하는 재조합 이벤트가 게놈 서열의 간격에 걸쳐 일어날 수 있음), 공여자 핵산의 길이 및 서열이, 절단 부위(들)와 함께, 원하는 재조합 이벤트가 수득되도록 선택된다. 원하는 이벤트가 게놈 서열 내의 단일 뉴클레오티드 쌍의 서열을 변화시키도록 설계되는 경우, 세포 염색질이 이러한 뉴클레오티드 쌍의 어느 한쪽 측면 상의 10,000개 뉴클레오티드 이내에서 절단된다. 특정 실시양태에서, 절단은 서열이 변화되는 뉴클레오티드 쌍의 어느 한쪽 측면 상의 1,000, 500, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 또는 2개 뉴클레오티드 이내, 또는 2 내지 1,000개 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드 이내에서 일어난다.
상기 상술된 바와 같이, 각각 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질에 대한 결합 부위는 다른 결합 부위에서 가장 가까운 각각의 결합 부위의 가장자리로부터 측정했을 때 5-8개 또는 15-18개의 뉴클레오티드만큼 떨어져 있을 수 있고, 절단은 결합 부위들 사이에서 일어난다. 절단이 결합 부위들 사이의 단일 부위 또는 다중 부위에서 일어나는지 여부는 중요하지 않은데, 절단된 게놈 서열이 공여자 서열로 교체되기 때문이다. 따라서, 표적화 재조합에 의한 단일 뉴클레오티드 쌍의 서열의 효율적인 변경을 위해, 결합 부위들 사이의 영역의 중간점은 이러한 뉴클레오티드 쌍의 10,000개 뉴클레오티드 이내, 바람직하게는 1,000개 뉴클레오티드 이내, 또는 500개 뉴클레오티드 이내, 또는 200개 뉴클레오티드 이내, 또는 100개 뉴클레오티드 이내, 또는 50개 뉴클레오티드 이내, 또는 20개 뉴클레오티드 이내, 또는 10개 뉴클레오티드 이내, 또는 5개 뉴클레오티드 이내, 또는 2개 뉴클레오티드 이내, 또는 1개 뉴클레오티드 이내에, 또는 관심 뉴클레오티드 쌍에 있다.
특정 실시양태에서, 상동 염색체가 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드로서 작용할 수 있다. 따라서, 예를 들어 한 염색체 상의 돌연변이체 서열에 결합하여 이를 절단하지만, 상동 염색체 상의 야생형 서열은 절단하지 않는 융합 단백질을 조작함으로써, 이형접합체에서의 돌연변이를 수정할 수 있다. 돌연변이-보유 염색체 상에서의 이중-가닥 파손은 절단된 염색체 내로 상동 염색체로부터의 야생형 서열이 카피되는 상동성-기반 "유전자 전환" 프로세스를 자극하고, 따라서 야생형 서열의 2개의 카피가 복구된다.
표적화 재조합의 수준을 증진시킬 수 있는 방법 및 조성물이 또한 제공되고, 이는 추가의 ZFP- 기능적 도메인 융합체를 사용하여, 상동 재조합에 관여하는 유전자들, 예컨대 예를 들어 RAD52 우위 군의 구성원 (예를 들어, Rad50, Rad51, Rad51B, RadSIC, RadSID, Rad52, Rad54, Rad54B, Mrell, XRCC2, XRCC3), 유전자의 생성물이 상기 언급된 유전자 생성물들과 상호작용하는 유전자 (예를 들어, BRCA1, BRCA2) 및/또는 NBSl 복합체 내의 유전자의 발현을 활성화시키는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Boyko et al. (2006) Plant Physiology 141: 488-497 및 LaFarge et al. (2003) Nucleic Acids Res 31(4): 1148- 1155]을 참조한다. 유사하게, ZFP-기능적 도메인 융합체가, 본원에 개시된 방법 및 조성물과 조합되어, 비-상동성 말단 연결에 관여하는 유전자 (예를 들어, Ku70/80, XRCC4, 폴리(ADP 리보스) 폴리머라제, DNA 리가제 4)의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Riha et al. (2002) EMBO 21: 2819- 2826; Freisner et al. (2003) Plant J. 34:427-440; Chen et al. (1994) European Journal of Biochemistry 224:135-142]을 참조한다. 아연 핑거 결합 도메인과 기능적 도메인 간의 융합체를 사용하는 유전자 발현의 활성화 및 억제 방법이, 예를 들어 공동-소유의 미국 특허 6,534,261; 6,824,978 및 6,933,113에 개시되어 있다. 추가의 억제 방법은 억제될 유전자의 서열에 대해 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및/또는 소형 간섭 RNA (siRNA 또는 RNAi)를 사용하는 것을 포함한다.
본원에 개시된 재조합 숙주의 유전자 조작은 표준 유전자 기술을 이용하여 유전자 조작에 적합한 임의의 숙주 세포에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 재조합 숙주 세포는 유전자 변형 및 재조합 유전자 발현에 유용한 임의의 유기체 또는 미생물 숙주일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 숙주는 쌍자엽 및 단자엽 식물을 비롯한 임의의 고등 식물, 및 작물 식물 및 그의 오일을 위해 사용되는 식물을 비롯한 소비성 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 임의의 식물 종 또는 식물 세포는 하기에 추가로 기재되는 바와 같이 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 (예를 들어, 식물 숙주 세포)은 쌍자엽 및 단자엽 식물 둘 다를 비롯한 임의의 고등 식물, 및 특히 작물 식물을 비롯한 소비성 식물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 식물은 예를 들어 알팔파, 대두, 목화, 평지씨 (또한 카놀라로 기재됨), 아마인, 옥수수, 벼, 브라키아리아, 밀, 홍화, 소르굼, 사탕무, 해바라기, 담배 및 터프 그래스를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 임의의 식물 종 또는 식물 세포가 선택될 수 있다. 실시양태에서, 본원에 사용된 식물 세포, 및 그로부터 성장 또는 유래된 식물은 평지씨 (브라시카 나푸스(Brassica napus)); 인도 머스타드 (브라시카 준세아(Brassica juncea)); 에티오피아 머스타드 (브라시카 카리나타(Brassica carinata)); 순무 (브라시카 라파(Brassica rapa)); 양배추 (브라시카 올레라세아(Brassica oleracea)); 대두 (글리신 맥스(Glycine max)); 아마인/아마 (리눔 우시타티시뭄(Linum usitatissimum)); 옥수수 (제아 메이스); 홍화 (카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius)); 해바라기 (헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)); 담배 (니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)); 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana); 브라질 넛 (베톨레티아 엑셀사(Betholettia excelsa)); 피마자 (리시누스 콤뮤니스(Ricinus communis)); 코코넛 (코쿠스 누시페라(Cocus nucifera)); 코리안더 (코리안드룸 사티붐(Coriandrum sativum)); 목화 (고시피움(Gossypium) 아종); 땅콩 (아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea)); 호호바 (심몬드시아 키넨시스(Simmondsia chinensis)); 기름 야자 (엘라에이스 구이니이스(Elaeis guineeis)); 올리브 (올레아 에우르파에아(Olea eurpaea)); 벼 (오리자 사티바(Oryza sativa)); 호박 (쿠쿠르비타 막시마(Cucurbita maxima)); 보리 (호르데움 불가레(Hordeum vulgare)); 사탕수수 (사카룸 오피시나룸(Saccharum officinarum)); 벼 (오리자 사티바); 밀 (트리티쿰(Triticum) 아종, 예를 들어 트리티쿰 두룸(Triticum durum) 및 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)); 및 좀개구리밥 (렘나세아에(Lemnaceae) 종)으로부터 수득가능한 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 식물 종 내의 유전적 배경은 상이할 수 있다.
본원에 사용된 "식물 부분"은 종자 (성숙 종자 및 미성숙 종자 포함), 식물 삽목묘, 식물 세포, 식물 세포 배양물, 식물 기관, 화분, 배아, 꽃, 과실, 싹, 잎, 뿌리, 줄기, 체외이식편 등을 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 식물의 임의의 부분을 포함한다. 식물 세포는 원형질체 및 세포벽을 포함하는, 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 식물 세포는 단리된 단일 세포, 또는 세포의 응집체, 예컨대 이쇄성 캘러스 및 배양된 세포의 형태일 수 있거나, 또는 보다 고차원적으로 조직화된 단위, 예를 들어 식물 조직, 식물 기관 또는 식물의 부분일 수 있다. 따라서, 식물 세포는 원형질체, 생식자 생산 세포, 또는 전체 식물로 재생할 수 있는 세포 또는 세포의 집단일 수 있다. 이에 따라, 다수의 식물 세포를 포함하고 전체 식물로 재생할 수 있는 종자는 본 개시내용의 목적을 위해 식물 세포로 간주된다. 식물 조직 또는 식물 기관은 종자, 원형질체, 캘러스, 또는 구조적 또는 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 임의의 다른 군일 수 있다. 식물의 특히 유용한 부분은 수확가능한 부분 및 자손 식물의 번식에 유용한 부분을 포함한다. 식물의 수확가능한 부분은 식물의 임의의 유용한 부분, 예를 들어 꽃, 화분, 묘목, 괴경, 잎, 줄기, 과실, 종자, 뿌리 등일 수 있다. 번식에 유용한 식물의 부분은, 예를 들어 종자, 과실, 삽목묘, 묘목, 괴경, 근경 등을 포함한다. 바람직하게는, 조직 배양물은 상기 근교배 식물의 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 식물을 재생할 수 있을 것이고, 상기 근교배 식물과 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는 식물을 재생할 수 있을 것이다. 한 실시양태에서, 이러한 조직 배양물 내에서 재생가능한 세포는 배아, 원형질체, 분열조직 세포, 캘러스, 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 수염, 꽃, 알맹이, 이삭, 속대, 깍지, 또는 줄기일 것이다. 또한, 본 개시내용의 실시양태는 본 개시내용의 실시양태의 조직 배양물로부터 재생된 식물을 제공한다.
게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물의 생산과 관련하여, 식물의 형질전환 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 쌍자엽 식물 뿐만 아니라 단자엽 식물에 대한 생물학적 및 물리적 형질전환 프로토콜을 비롯한 수많은 식물 형질전환 방법이 개발되었다 (예를 들어, Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)). 또한, 식물 세포 또는 조직 형질전환을 위한 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 시험관내 배양 방법 및 식물의 재생은 예를 들어 문헌 [Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)]에서 이용가능하다.
식물 숙주 세포 내로 유전자 발현 카세트를 포함하는 DNA를 삽입하기 위해 다수의 기술이 이용가능하다. 이들 기술은, 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스를 형질전환 작용제로 사용하는 무력화된 T-DNA로의 형질전환, 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌 형질전환, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법 (예를 들어, 초음파천공), 리포솜 형질전환, 미세주사, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 바이오리스틱 (마이크로입자 포격), 탄화규소 휘스커스™ 매개 형질전환, 에어로졸 비밍, 또는 폴리 에틸렌 글리콜 매개 형질전환 뿐만 아니라 다른 가능한 방법을 포함한다.
예를 들어, 식물 세포 원형질체의 전기천공 및 미세주사와 같은 기술을 이용하여 유전자 발현 카세트를 포함하는 DNA 구축물을 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입할 수 있거나, 또는 바이오리스틱 방법, 예컨대 DNA 입자 포격을 이용하여 DNA 구축물을 식물 조직에 직접 도입할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70-73] 참조). 식물 세포 형질전환을 위한 추가의 방법은 탄화규소 휘스커스™ 매개 DNA 흡수를 통한 미세주사를 포함한다 (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418). 대안적으로, DNA 구축물은 나노입자 형질전환을 통해 식물 세포 내로 도입될 수 있다 (예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 번호 12/245,685 참조).
또 다른 공지된 식물 형질전환 방법은 미세투사체-매개 형질전환이고, 여기서 DNA는 미세투사체의 표면 상에 보유된다. 이 방법에서, 미세투사체를 식물 세포 벽 및 막을 투과하는데 충분한 속도로 가속시키는 바이오리스틱 장치로 발현 벡터가 식물 조직 내로 도입된다. Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992).
대안적으로, 유전자 전달 및 형질전환 방법은 DNA의 염화칼슘 침전, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 전기천공-매개 흡수를 통한 원형질체 형질전환 (문헌 [Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828; 및 Shimamoto (1989) Nature 338:274-276] 참조) 및 식물 조직의 전기천공 (문헌 [D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505] 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터를 식물 내로 도입시키는데 널리 이용되는 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템을 기반으로 한다. Horsch et al., Science 227:1229 (1985). 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스는 식물 세포를 유전적으로 형질전환하는데 유용한 것으로 공지된 식물 병원성 토양 박테리아이다. 각각 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 식물의 유전자 형질전환을 책임지는 유전자를 보유한다. Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991). 아그로박테리움-매개 유전자 전달을 위한 아그로박테리움 벡터 시스템 및 방법에 대한 설명은 또한 예를 들어 상기 문헌 [Gruber et al.], 상기 문헌 [Miki et al.], 문헌 [Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)], 및 미국 특허 번호 4,940,838 및 5,464,763에서 이용가능하다.
아그로박테리움이 형질전환에 사용된 경우에, 삽입될 DNA는 특수 플라스미드에, 즉 중간 벡터 또는 2원 벡터에 클로닝되어야 한다. 중간 벡터는 스스로 아그로박테리움에서 복제할 수 있다. 중간 벡터는 헬퍼 플라스미드 (접합)에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스로 전달될 수 있다. 재팬 토바코(Japan Tobacco) 수퍼바이너리 시스템이 이러한 시스템의 일례이다 (문헌 [Komari et al., (2006) In: Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) number 343: Agrobacterium Protocols (2nd Edition, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, pp.15-41; 및 Komori et al., (2007) Plant Physiol. 145:1155-1160]에서 검토됨). 2원 벡터는 이. 콜라이(E. coli) 내에서 및 아그로박테리움 둘 다 내에서 복제할 수 있다. 이들은 선택 마커 유전자 및 링커 또는 폴리링커를 포함하며, 이들은 우측 및 좌측 T-DNA 경계 영역에 의해 프레이밍된다. 이들은 아그로박테리움 내로 직접 형질전환될 수 있다 (Holsters, 1978). 숙주 세포로 사용되는 아그로박테리움은 vir 영역을 보유하는 플라스미드를 포함한다. Ti 또는 Ri 플라스미드는 또한 T-DNA의 전달에 필요한 vir 영역을 포함한다. vir 영역은 T-DNA를 식물 세포로 전달하는데 필요하다. 추가의 T-DNA가 함유될 수 있다.
아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 병독성 기능은, 세포가 2원 T DNA 벡터를 사용하여 박테리아에 의해 감염되거나 (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) 또는 동시-배양 절차 (Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231)에 의해 감염되는 경우에, 구축물 및 인접 마커를 함유하는 T-가닥이 식물 세포 DNA 내로 삽입되도록 지시할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질전환 시스템을 사용하여 쌍자엽 식물을 조작한다 (Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641). 아그로박테리움 형질전환 시스템은 단자엽 식물 및 식물 세포에 DNA를 형질전환시키는데, 뿐만 아니라 전달하는데 또한 사용될 수 있다. 미국 특허 번호 5,591,616; 문헌 [Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40; 및 Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434]을 참조한다.
식물 세포 내로의 유전자 발현 카세트를 포함하는 유전자 구축물의 도입 후에, 식물 세포는 성장할 수 있고, 분화 조직, 예컨대 싹 및 뿌리의 발아시에, 성숙 식물이 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 식물이 생성될 수 있다. 식물을 재생하기 위한 방법론은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers 및 Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)]에서 찾아볼 수 있다. 본원에 기재된 유전자 변형된 식물은 발효 배지에서 배양되거나 또는 적합한 배지, 예컨대 토양에서 성장할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고등 식물에 대한 적합한 성장 배지는 토양, 모래, 뿌리 성장 (예를 들어, 버미큘라이트, 펄라이트 등) 또는 수경 배양을 지지하는 임의의 다른 미립자 배지, 뿐만 아니라 고등 식물의 성장을 최적화하는 적합한 광, 물 및 영양 보충제를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 식물 성장 배지를 포함할 수 있다.
임의의 상기 형질전환 기술에 의해 생산된 형질전환된 식물 세포를 배양하여, 형질전환된 유전자형을 보유하고, 따라서 원하는 표현형을 보유하는 전체 식물을 재생시킬 수 있다. 이러한 재생 기술은 원하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생물제 및/또는 제초제 마커에 전형적으로 의존하는, 조직 배양 성장 배지 내의 특정 피토호르몬의 조작에 의존한다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생이 문헌 [Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; 및 Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에 기재되어 있다. 재생은 또한 식물 캘러스, 체외이식편, 기관, 화분, 배아 또는 그의 일부로부터 얻어질 수 있다. 이러한 재생 기술은 문헌 [Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486]에 일반적으로 기재되어 있다.
식물 세포 내로 도입된 핵산을 사용하여, 본질적으로 모든 식물에 원하는 형질을 부여할 수 있다. 본 개시내용의 핵산 구축물 및 상기 언급된 다양한 형질전환 방법을 이용하여 본원에 기재된 원하는 생리학적 및 농경학적 특성에 대해 광범위한 식물 및 식물 세포 시스템을 조작할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조작하기 위한 식물 및 식물 세포는 단자엽 및 쌍자엽 식물, 예컨대 작물, 예를 들어 곡실 작물 (예를 들어, 밀, 옥수수, 벼, 기장, 보리), 과일 작물 (예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물 (예를 들어, 알팔파), 뿌리 채소 작물 (예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 잎 채소 작물 (예를 들어, 상추, 시금치); 개화 식물 (예를 들어, 페튜니아, 장미, 국화), 침엽수 및 소나무 (예를 들어, 전나무, 가문비나무); 식물환경복원에 사용되는 식물 (예를 들어, 중금속 축적 식물); 오일 작물 (예를 들어, 해바라기, 평지씨) 및 실험 목적을 위해 사용되는 식물 (예를 들어, 아라비돕시스)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 개시된 방법 및 조성물은 아스파라구스(Asparagus), 아베나(Avena), 브라시카(Brassica), 시트루스(Citrus), 시트룰루스(Citrullus), 캅시쿰(Capsicum), 쿠쿠르비타(Cucurbita), 다우쿠스(Daucus), 에리게론(Erigeron), 글리신(Glycine), 고시피움(Gossypium), 호르데움(Hordeum), 락투카(Lactuca), 롤리움(Lolium), 리코페르시콘(Lycopersicon), 말루스(Malus), 만니호트(Manihot), 니코티아나(Nicotiana), 오리코프라그무스(Orychophragmus), 오리자(Oryza), 페르세아(Persea), 파세올루스(Phaseolus), 피숨(Pisum), 피루스(Pyrus), 프루누스(Prunus), 라파누스(Raphanus), 세칼레(Secale), 솔라눔(Solanum), 소르굼(Sorghum), 트리티쿰(Triticum), 비티스(Vitis), 비그나(Vigna), 및 제아 메이스 속으로부터의 종을 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 광범위한 식물 전반에 걸쳐 유용하다.
조작된 식물 물질을 형질전환 DNA 상에 존재하는 마커 유전자가 코딩하는 형질에 대해 선택 또는 스크리닝함으로써, 형질전환된 식물 세포, 캘러스, 조직 또는 식물을 확인 및 단리할 수 있다. 예를 들어, 선택은 조작된 식물 물질을, 형질전환 유전자 구축물이 저항성을 부여한 항생제 또는 제초제의 억제량을 함유하는 배지 상에서 성장시킴으로써 수행할 수 있다. 또한, 형질전환된 식물 및 식물 세포는 또한 재조합 핵산 구축물 상에 존재할 수 있는 임의의 가시적인 마커 유전자 (예를 들어, β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 또는 gfp 유전자)의 활성을 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 이러한 선택 및 스크리닝 방법론은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
핵산을 세포 내로 삽입하는 것과 관련하여 용어 "도입된"은 세포 내로의 형질전환, 뿐만 아니라 통상적인 식물 육종 기술에서와 같이 제2 식물이 이종 서열을 함유하도록 서열을 갖는 식물을 또 다른 식물과 교잡하는 것을 포함한다. 이러한 육종 기술은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 식물 육종 기술의 논의에 대해서는 문헌 [Poehlman (1995) Breeding Field Crops. AVI Publication Co., Westport Conn, 4th Edit]을 참조한다. 여교잡 방법이 유전자를 식물 내로 도입시키기 위해 이용될 수 있다. 상기 기술은 수십년 동안 형질을 식물 내로 도입하기 위해 사용되어 왔다. 널리 공지된 상기 및 다른 식물 육종 방법론의 설명의 예는 상기 문헌 [Poehlman] 및 문헌 [Plant Breeding Methodology, edit. Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc. (1988)]과 같은 참고문헌에서 찾아볼 수 있다. 전형적인 역교잡 프로토콜에서는, 관심 대상의 원래의 품종 (반복친)을, 전달될 관심 대상의 단일 유전자좌를 보유하는 제2 품종 (비-반복친)과 교잡시킨다. 이어서, 상기 교잡에 의해 생성된 자손을 반복친과 다시 교잡시키고, 비-반복친으로부터 전달된 단일 유전자좌 이외에도 전환된 식물체에서 반복친의 본질적으로 모든 원하는 형태학적 및 생리학적 특성이 회복된 식물이 얻어질 때까지 이 과정을 반복한다.
용어 트랜스제닉 "이벤트"는 이종 DNA, 예를 들어 관심 유전자를 포함하는 발현 카세트를 사용한 단일 식물 세포의 형질전환 및 재생에 의해 생산된 재조합 식물을 지칭한다. 용어 "이벤트"는 이종 DNA를 포함하는 최초 형질전환체 및/또는 형질전환체의 자손을 지칭한다. 용어 "이벤트"는 또한 형질전환체 및 또 다른 식물 간의 유성 이종교잡에 의해 생산된 자손을 지칭한다. 반복친에 대한 반복된 역교잡 후에도, 형질전환된 모체로부터의 삽입된 DNA 및 플랭킹 DNA는 교잡 자손에서 동일한 염색체 위치에 존재한다. 통상적으로, 식물 조직의 형질전환은 다중 이벤트를 생산하며, 이들 각각은 식물 세포의 게놈의 상이한 위치로의 DNA 구축물 삽입을 나타낸다. 트랜스진 또는 다른 바람직한 특성의 발현을 기초로 하여, 특정한 이벤트가 선택된다. 본 개시내용의 실시양태에서, 특정한 이벤트는 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"트랜스진"은 유전자형을 변경하기 위해 유전자 조작에 의해 유기체의 게놈 내로 도입된 유전자를 지칭한다.
"트랜스제닉 식물"은 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 함유하는 하나 이상의 식물 세포를 갖는 식물이다. 용어 "메신저 RNA (mRNA)"는 인트론이 없고 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 지칭한다.
본원에 사용된 "삽입 DNA"는 식물 물질을 형질전환하는데 사용된 유전자 발현 카세트를 포함하는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 내의 이종 DNA를 지칭하는 한편, "플랭킹 DNA" 또는 "접합부 DNA"는 본래의 삽입 DNA 분자, 예를 들어 형질전환 이벤트와 연관된 단편과는 무관한, 유기체, 예컨대 식물에 자연적으로 존재하는 게놈 DNA, 또는 형질전환 과정을 통해 도입된 외래 (이종) DNA를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "접합부" 또는 "플랭킹 영역" 또는 "플랭킹 서열"은 본래의 외래 삽입 DNA 분자의 바로 상류에 인접하여 위치하거나, 또는 바로 하류에 인접하여 위치하는 적어도 20, 50, 100, 200, 300, 400, 1000, 1500, 2000, 2500, 또는 5000개 또는 그 초과의 염기 쌍의 서열을 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 앰플리콘이 생성되는 증폭 반응을 통해 표적화 게놈 내의 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 확인하는 방법에 관한 것이다. 앰플리콘의 부재의 검출은 게놈 유전자좌가 파괴되는지의 지표이다. 추가 실시양태에서, 앰플리콘의 존재는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드가 게놈 유전자좌 내에 삽입되었다는 지표이다.
다양한 검정이 본 개시내용의 특정 실시양태의 증폭 반응과 관련되어 이용될 수 있다. 다음 기술이 다양한 상황에서 유용하고, 한 실시양태에서 식물 세포 내에서 핵산 분자 및/또는 코딩된 폴리펩티드의 존재를 검출하는데 유용하다. 예를 들어, 분자의 존재는 서열의 프라이머 또는 프로브를 사용하는 것을 비롯한 다양한 방법으로 결정될 수 있다. 트랜스진이 식물의 일부 조직에서 또는 일부 발달 단계에서 선택적으로 발현될 수 있거나, 또는 트랜스진이 실질적으로 모든 식물 조직에서, 실질적으로 전체적인 생활 주기에 걸쳐 발현될 수 있다. 그러나, 임의의 조합형 발현 방식이 또한 적용가능하다.
임의의 적합한 수단에 의해 선택된 또는 표적 핵산 서열을 증폭시킬 수 있다. 일반적으로, 문헌 [Kwoh et al., Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25 (1990)]을 참조한다. 적합한 증폭 기법의 예는 폴리머라제 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, 가닥 치환 증폭 (일반적으로 문헌 [G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 (1992); G. Walker et al., Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)] 참조), 전사-기반 증폭 (문헌 [D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)] 참조), 자가-유지 서열 복제 (또는 "3SR") (문헌 [J. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)] 참조), Qβ 레플리카제 시스템 (문헌 [P. Lizardi et al., BioTechnology 6, 1197-1202 (1988)] 참조), 핵산 서열 기반 증폭 (또는 "NASBA") (문헌 [R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)]), 복구 연쇄 반응 (또는 "RCR") (상기 문헌 [R. Lewis] 참조), 및 부메랑 DNA 증폭 (또는 "BDA") (상기 문헌 [R. Lewis] 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 폴리머라제 연쇄 반응이 바람직하다.
"증폭"은 주형 특이성이 관련되는 특수한 경우의 핵산 복제이다. 이는 비-특이적 주형 복제 (즉, 주형-의존성이지만 특정 주형에 의존성은 아닌 복제)와 대조되는 것이다. 여기서 주형 특이성은 복제의 충실도 (즉, 적절한 폴리뉴클레오티드 서열의 합성) 및 뉴클레오티드 (리보- 또는 데옥시리보-) 특이성과는 구별된다. 주형 특이성은 빈번히 "표적" 특이성으로 기재된다. 표적 서열은 이들이 다른 핵산으로부터 선별되도록 탐색된다는 관점에서의 "표적"이다. 증폭 기술은 주로 이러한 선별을 위해 설계되었다.
본원에 사용된 용어 "폴리머라제 연쇄 반응" 및 "PCR"은 일반적으로 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA의 혼합물 중 표적 서열의 절편의 농도를 증가시키는 방법을 지칭한다 (미국 특허 번호 4,683,195; 4,683,202; 및 4,965,188; 본원에 참조로 포함됨). 표적 서열을 증폭하기 위한 이 과정은 목적 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물에 과량의 2종의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 도입시키는 것, 이어서 DNA 폴리머라제의 존재 하에 정확한 순서의 열 사이클링을 포함한다. 2종의 프라이머는 이중 가닥 표적 서열의 그의 각각의 가닥에 대해 상보적이다. 증폭을 일으키기 위해, 혼합물을 변성시키고, 이어서 프라이머를 표적 분자 내의 그의 상보적 서열에 어닐링한다. 어닐링 후, 새로운 쌍의 상보적 가닥이 형성되도록 프라이머는 폴리머라제로 연장된다. 변성, 프라이머 어닐링 및 폴리머라제 연장의 단계는 고농도의 목적 표적 서열의 증폭된 절편을 수득하기 위해 수회 반복될 수 있다 (즉, 변성, 어닐링 및 연장이 한 "사이클"을 구성하며; 다수의 "사이클"이 존재할 수 있다). 목적하는 표적 서열의 증폭된 절편의 길이는 서로에 대한 프라이머의 상대적 위치에 의해 결정되고, 따라서 상기 길이는 제어가능한 파라미터이다. 과정의 반복되는 측면 때문에, 방법을 "폴리머라제 연쇄 반응" (이하 "PCR")으로 지칭한다. 표적 서열의 목적하는 증폭된 절편이 혼합물 내에서 우세한 서열 (농도 면에서)이 되기 때문에, 이들이 "PCR 증폭된" 것으로 언급된다.
용어 "다수"는 2개 이상, 예를 들어 3, 4, 5개 또는 그 초과, 예를 들어 10, 20, 50개 또는 그 초과의 폴리뉴클레오티드, 핵산 프로브 등을 의미하도록 본원에서 사용된다.
용어 "역전사 효소" 또는 "RT-PCR"은 출발 물질이 mRNA인 유형의 PCR를 지칭한다. 출발 mRNA는 역전사효소를 사용하여 상보적 DNA 또는 "cDNA"로 효소에 의해 전환된다. 이어서, cDNA는 "PCR" 반응을 위한 "주형"으로서 사용된다.
한 실시양태에서, 증폭 반응은 정량화된다. 다른 실시양태에서, 증폭 반응은 서명 프로파일을 이용하여 정량화되고, 여기서 서명 프로파일은 용융 온도 또는 형광 서명 프로파일로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 실시양태의 핵산 분자 또는 그의 절편은 PCR 증폭을 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. PCR 증폭을 수행함에 있어서, 프라이머와 주형 간의 어느 정도의 미스매치는 용인될 수 있다. 따라서, 예시된 프라이머의 돌연변이, 결실, 및 삽입 (특히 뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단으로의 부가)는 본 개시내용의 범위에 포함된다. 돌연변이, 삽입 및 결실은 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 소정의 프라이머에서 생산될 수 있다.
서열 검출에 사용하기 위한 분자 비콘이 기재된 바 있다. 간략하게, 플랭킹 게놈 및 삽입 DNA 접합부에 겹쳐지는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된다. FRET 프로브의 특유한 구조는 형광 및 켄칭 모이어티를 매우 근접한 상태로 유지하는 2차 구조를 함유하도록 만든다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입 DNA 서열에 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에 하나의 프라이머)를 열안정성 폴리머라제 및 dNTP의 존재하에 사이클링한다. 성공적인 PCR 증폭 후에, FRET 프로브(들)의 표적 서열에 대한 혼성화는 프로브 2차 구조의 제거 및 형광 및 켄칭 모이어티의 공간 분리를 유발한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 플랭킹 게놈/트랜스진 삽입 서열의 존재를 나타낸다. 증폭 반응으로서의 검출을 위한 이러한 분자 비콘 검정은 본 개시내용의 한 실시양태이다.
택맨(TAQMAN)® (라이프 테크놀로지스(Life Technologies, 캘리포니아주 포스터 시티))으로 달리 공지된 가수분해 프로브 검정은 DNA 서열의 존재를 검출하고 정량화하는 방법이다. 간략하게, FRET 올리고뉴클레오티드 프로브는 트랜스진 내에 하나의 올리고, 및 이벤트-특이적 검출을 위해 플랭킹 게놈 서열에 하나를 갖도록 설계된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입 DNA 서열에 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에 하나)를 열안정성 폴리머라제 및 dNTP의 존재하에 사이클링한다. FRET 프로브의 혼성화의 결과로 FRET 프로브 상의 켄칭 모이어티로부터 형광 모이어티가 절단되고 해제된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 플랭킹/트랜스진 삽입 서열의 존재를 나타낸다. 증폭 반응으로서의 검출을 위한 이러한 가수분해 프로브 검정은 본 개시내용의 한 실시양태이다.
KASPar 검정은 DNA 서열의 존재를 검출 및 정량화하는 방법이다. 간략하게, KASPar® 검정 시스템으로 공지된 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기반 검정을 이용하여 표적화 게놈 유전자좌를 포함하는 게놈 DNA 샘플을 스크리닝한다. 본 개시내용의 실시에 이용된 KASPar® 검정은 다중 프라이머를 함유하는 KASPar® PCR 검정 혼합물을 이용할 수 있다. PCR 검정 혼합물에 사용된 프라이머는 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함할 수 있다. 정방향 프라이머는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 특정 영역에 상응하는 서열을 함유하고, 역방향 프라이머는 게놈 서열의 특정 영역에 상응하는 서열을 함유한다. 또한, PCR 검정 혼합물에 사용된 프라이머는 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, KASPar® PCR 검정 혼합물은 2개의 상이한 대립유전자에 상응하는 2개의 정방향 프라이머 및 1개의 역방향 프라이머를 사용할 수 있다. 정방향 프라이머 중 하나는 내인성 게놈 서열의 특정 영역에 상응하는 서열을 함유한다. 제2 정방향 프라이머는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 특정 영역에 상응하는 서열을 함유한다. 역방향 프라이머는 게놈 서열의 특정 영역에 상응하는 서열을 함유한다. 증폭 반응의 검출을 위한 이러한 KASPar® 검정은 본 개시내용의 한 실시양태이다.
일부 실시양태에서, 형광 신호 또는 형광 염료는 HEX 형광 염료, FAM 형광 염료, JOE 형광 염료, TET 형광 염료, Cy 3 형광 염료, Cy 3.5 형광 염료, Cy 5 형광 염료, Cy 5.5 형광 염료, Cy 7 형광 염료 및 ROX 형광 염료로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 증폭 반응은 유동 세포측정법에 의해 측정가능한 농도 범위에서 세포 DNA를 염색할 수 있는 적합한 제2 형광 DNA 염료를 사용하여 진행되며, 실시간 써모사이클러에 의해 검출가능한 형광 방출 스펙트럼을 갖는다. 통상의 기술자는 다른 핵산 염료가 공지되어 있으며 계속해서 확인되고 있다는 것을 인지해야 한다. 적절한 여기 및 방출 스펙트럼을 갖는 임의의 적합한 핵산 염료, 예컨대 YO-PRO-1®, SYTOX 그린®, SYBR 그린 I®, SYTO11®, SYTO12®, SYTO13®, BOBO®, YOYO® 및 TOTO®가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 제2 형광 DNA 염료는 10 μM 미만, 4 μM 미만, 또는 2.7 μM 미만으로 사용된 SYTO13®이다.
본 발명의 실시양태는 하기 실시예에서 추가로 규정된다. 이들 실시예는 단지 예시의 방식으로 제공된 것임을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 통상의 기술자는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 그의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 용법 및 조건에 적합하도록 본 발명의 실시양태를 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있다. 따라서, 본원에서 나타내고 기재한 것들 이외에도, 본 발명의 실시양태의 다양한 변형이 상기 기재로부터 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 다음은 예시의 방식으로 제공되고, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다.
실시예
실시예 1. 옥수수 캘러스 내의 표적화 유전자좌의 분석
게놈 유전자좌 표적화: 전문이 본원에 포함되는 WO2009100188 (METHODS FOR DETECTION OF CORN EVENT DAS-59132)에 이전에 개시된 옥수수 이벤트 DAS-59132에 대한 게놈 유전자좌를, 상기 이벤트를 형성하는 게놈 DNA에 특이적으로 결합하고 이를 절단하도록 설계된 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하여 표적화하였다. 생성된 형질전환체를, 증폭 반응을 통해 특정 이벤트 내의 게놈 유전자좌의 파괴를 확인하고 특성화하기 위한 분석이 완료될 수 있을 때까지 유지하였다.
DAS-59132에 대한 게놈 유전자좌를 포함하는 DNA 서열에 대해 지시된 아연 핑거 단백질을 상기 기재된 바와 같이 설계하였다. 문헌 [Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651]을 참조한다. DAS-59132 아연 핑거 설계물을, CCHC 구조를 갖는 적어도 하나의 핑거를 갖는 단백질을 코딩하는 벡터 내로 혼입시켰다. 미국 특허 공개 번호 2008/0182332를 참조한다. 특히, 각각의 단백질 내의 마지막 핑거는 인식 나선에 대해 CCHC 백본을 가졌다. 비-정규 아연 핑거-코딩 서열을 4개의 아미노산 링커, 및 제아 메이스로부터 유래된 opaque-2 핵 국재화 신호를 통해 유형 IIS 제한 효소, FokI의 뉴클레아제 도메인 (문헌 [Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569]의 서열의 아미노산 384-579)에 융합시켜, DAS-59132 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 형성하였다. 문헌 [Shukla et al. (2009) Nature 459:437-441]에 기재된 바와 같이, 2A 리보솜 간헐성 신호를 이용하는 비시스트론 발현 구축물에서의 융합 단백질의 발현을 상대적으로 강한, 구성적 및 이소성 프로모터, 예컨대 CsVMV 프로모터에 의해 유도하였다.
최적의 ZFN을 이전에 활성 뉴클레아제를 확인하는 것으로 밝혀진 출아 효모 기반 시스템을 이용하여 절단 활성에 대해 검증하였다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20090111119; 문헌 [Doyon et al. (2008) Nat Biotechnol. 26:702-708; Geurts et al. (2009) Science 325:433]을 참조한다. 추정 DAS-59132 게놈 폴리뉴클레오티드 표적 부위에 결합하도록 설계, 생산 및 시험된 다수의 ZFN 중에서, 높은 수준의 생체내 활성을 갖는 바람직한 ZFN을 확인하고, 추가의 실험을 위해 선택하였다. 이들 ZFN은 식물체내에서 DAS-59132 게놈 폴리뉴클레오티드 표적 부위에 효율적으로 결합하고 이를 절단할 수 있는 것으로 특성화되었다.
효모 검정을 이용하여 확인된, 예시적인 아연 핑거 뉴클레아제의 ZFN 발현 구축물을 함유하는 플라스미드 벡터를 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 기능 및 기술을 이용하여 설계하고 완성하였다. 이어서, opaque-2 핵 국재화 신호::아연 핑거 뉴클레아제 융합 서열과 상보적 opaque-2 핵 국재화 신호::아연 핑거 뉴클레아제 융합 서열의 쌍을 형성하였다. 이에 따라, 각각의 구축물은 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스로부터의 2A 서열에 의해 분리된 2개의 opaque-2 핵 국재화 신호::아연 핑거 뉴클레아제 융합 서열로 구성된 단일 오픈 리딩 프레임으로 이루어졌다 (Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-8127). ZFN 코딩 서열의 발현은 고도로 발현되는 구성적 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 유도되고 (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18(4):675-89) 제아 메이스 Per 5 3' 폴리A 비번역 영역에 플랭킹되었다 (미국 특허 번호 6,699,984).
공여자 구축물을, DAS-59132 게놈 유전자좌의 ZFN 절단된 게놈 DNA 내로 통합되도록 설계하였다. 이러한 단일 유전자 발현 카세트는 벼 액틴1 프로모터 (Os Act1 프로모터) :: 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 코딩 서열 (PAT; 미국 특허 번호 7,838,733) ::에 의해 유도되고, 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역 (ZmLip 3'UTR)에 의해 종결된다. 또한 공여자 플라스미드는 DAS-59132 게놈 유전자좌 내의 ZFN 절단 부위의 어느 한 말단에 대한 서열에 상동성인 표적 PAT 유전자의 어느 한 말단에 대한 1 kB 서열 (상동성 아암)로 설계되었다. 상동성 아암은 상동 재조합 기구가 트랜스진을 게놈 ZFN 절단 부위 내로 삽입하는데 사용한 기질로서 작용하였다. 다양한 유전자 요소가 고카피수 pUC 기반 플라스미드 내에 조립되었다.
표적화 통합: 트랜스제닉 이벤트를 DAS-59132의 내인성 게놈 유전자좌에 표적화하였다. 상기 기재된 바와 같은 구축물은 공여자 서열 (pDAB107855) 및 DAS-59132 ZFN 6 (pDAB105906)을 포함한다. 이들 2개의 플라스미드의 공동-형질전환은 854개의 트랜스제닉 PAT 이벤트를 일으켰고, 본 개시내용의 표적화 게놈 유전자좌 내의 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 확인하는 방법을 이용하여 이를 스크리닝하였다.
사전에 동결-보존된 세포주로부터의 12 mL의 충전 세포 부피 (PCV) + 28 mL의 조건화 배지로 이루어진 옥수수 캘러스 세포를 500 mL 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 GN6 액체 배지 80 mL 내로 계대배양하고, 진탕기 상에 28℃에서 125 rpm으로 두었다. 동일한 세포주를 사용하여 상기 단계를 2회 반복하여, 총 36 mL PCV를 3개의 플라스크에 걸쳐 분배하였다. 24시간 후, GN6 액체 배지를 제거하고, 72 mL GN6 S/M 삼투성 배지로 교체하였다. 적당하게 교반하면서 (125 rpm), 플라스크를 28℃에서 30-35분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 동안, 8.1 mL의 GN6 S/M 액체 배지를 405 mg의 멸균 탄화규소 휘스커스™ (어드밴스드 컴포지트 머티리얼스, 엘엘씨(Advanced Composite Materials, LLC), 사우스캐롤라이나주 그리어)에 첨가함으로써 탄화규소 휘스커스™의 50 mg/mL 현탁액을 제조하였다.
GN6 S/M 삼투성 배지에서의 인큐베이션 후, 각각의 플라스크의 내용물을 250 mL 원심분리 병 내로 모았다. 플라스크 내의 모든 세포가 하부에 침강된 후에, GN6 S/M 액체의 대략 14 mL를 초과하는 내용물 부피를 덜어내어 후속 사용을 위해 멸균 1-L 플라스크 내에 수집하였다. 휘스커스™의 예비-습윤된 현탁액을 60초 동안 볼텍스 상에서 최대 속도로 혼합하고, 이어서 원심분리 병에 첨가하였다.
본 실시예에서, pDAB107855 (공여자 서열) 및 pDAB105906 (ZFN) 플라스미드 DNA를 각각의 병에 첨가하였다. 플라스미드 DNA를 첨가하면, 병을 즉시 변형된 레드 데빌(RED DEVIL) 5400™ 상업용 페인트 혼합기 (레드 데빌 이큅먼트 캄파니(Red Devil Equipment Co.), 미네소타주 플리머스)에 넣고, 10초 동안 교반하였다. 교반 후에, 세포, 배지, 휘스커스™ 및 플라스미드 DNA의 칵테일을 125 mL의 신선한 GN6 액체 배지와 함께 1 L 플라스크의 내용물에 첨가하여 삼투압을 감소시켰다. 125 rpm으로 설정된 진탕기 상에서 2시간 동안 세포들이 회수되도록 하였다. 6 mL의 분산된 현탁액을 병당 60개의 필터가 수득되도록 하우스 진공 라인에 연결된 유리 세포 수집기 유닛을 이용하여 와트만(Whatman) #4 여과지 (5.5 cm) 상에서 여과하였다. 필터를 GN6 고체 배지의 60 x 20 mm 플레이트 상에 놓고, 28℃에서 암실 조건 하에 1주일 동안 배양하였다.
DNA 전달 1주 후, 여과지를 선택적 작용제를 함유하는 GN6 (1H) 선택 배지의 60x20 mm 플레이트로 옮겼다. 이들 선택 플레이트를 28℃에서 1주일 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 암실에서의 선택 1주 후에, 37-38℃에서 유지된 GN6 아가로스 배지 3.0 mL를 함유하는 튜브 내로 각각의 플레이트로부터의 세포 ½을 긁어내어, 조직을 새로운 배지에 포매시켰다.
아가로스/조직 혼합물을 스패튤라로 분쇄한 후, 3 mL의 아가로스/조직 혼합물을 GN6 (1H) 배지를 함유하는 100 x 25 mm 페트리 디쉬의 표면 상에 균등하게 부었다. 이러한 과정을 각각의 플레이트의 양쪽 절반에 대해 반복하였다. 모든 조직이 포매되면, 플레이트를 28℃에서 암실 조건 하에 10주 이하 동안 인큐베이션하였다. 이들 선택 조건 하에 성장한, 추정상 형질전환된 단리물들을 포매된 플레이트로부터 제거하고, 60 x 20 mm 플레이트 내의 신선한 선택 배지로 옮겼다. 지연된 성장이 대략 2주 후에 명백해진 경우에, 이벤트는 적용된 제초제 (선택적 작용제)에 저항성인 것으로 간주하였고, 세포의 분취액을 유전자형 분석을 위해 후속적으로 수확하였다. 본 실시예에서, 수많은 이벤트를 처리된 병으로부터 회수하였다. 이들 이벤트를 분자 분석에 대해 진행하여, 옥수수 이벤트 DAS-59132의 게놈 유전자좌 내의 트랜스진의 통합을 확인하였다.
DNA 추출: 캘러스 조직 샘플을 96-웰 수집 플레이트 (퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아)에 수집하고, 이어서 48시간 동안 동결건조시켰다. 조직 파괴를, 하나의 스테인레스 스틸 비드를 함유하는 바이오스프린트96(BIOSPRINT96) AP1™ 용해 완충제 (퀴아젠) 중에서 클렉코(KLECKO)™ 조직 분쇄기 (가르시아 매뉴팩처링(Garcia Manufacturing), 캘리포니아주 비살리아)를 이용하여 수행하였다. 조직 침연 후에, 게놈 DNA를, 바이오스프린트96™ 추출 로봇 (퀴아젠)을 이용하여 바이오스프린트96™ 식물 키트 (퀴아젠)를 이용하는 고처리량 포맷으로 단리하였다. 이어서, 게놈 DNA의 샘플을 2 ng/μl로 희석한 후, 적절한 Cp (정량화 사이클) 스코어가 달성되도록 qPCR 반응을 세팅하였고, 이로써 서명 프로파일이 생성되었다.
DAS-59132 유전자좌 파괴 검정: DAS-59132-ZFN 및 공여자 플라스미드를 사용한 Hi-II 캘러스 세포의 휘스커스™ 매개 형질전환으로 표적화 및 무작위 트랜스진 삽입을 일으켰다. 표적화 이벤트 집단으로부터 무작위 삽입 이벤트를 구별하기 위해, 생성된 모든 854개의 이벤트를 먼저 유전자좌 파괴 검정을 이용하여 스크리닝하였다. 본 검정은 유전자좌 내의 ZFN 결합 부위가 무손상으로 남아 있는지, ZFN 절단 또는 공여자 삽입을 통해 파괴되었는지의 여부를 결정하였다. 게놈 유전자좌 내의 파괴의 지표는 ZFN이 내인성 DAS-59132 표적 유전자좌를 절단하였다는 초기 증거이며, 공여자 DNA 분자의 표적화 삽입을 나타낸다. 프라이머는 ZFN 인식 부위를 함유하는 내인성 표적 영역을 증폭시키도록 설계하였고, 샘플은 qPCR에 의해 분석하기 위해 세팅하였다. 비표적화 이벤트를 나타내는 무손상 영역의 증폭은 검출가능한 qPCR 신호로서 측정된 140개의 염기 쌍 앰플리콘을 생성하였다. 공여자 분자의 성공적인 표적화 통합은 검출가능한 qPCR 신호의 파괴를 초래하고, 대조군과 비교하여 보다 낮은 전체 신호로서 나타난다.
DAS-59132 유전자좌 파괴 검정을 라이트사이클러(LIGHTCYCLER)®480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 인디애나주 인디애나폴리스)을 이용하는 실시간 PCR에 의해 수행하였다. 검정은 라이트사이클러® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0을 이용하여 DAS-59132 유전자좌 (및 내부 참조 유전자 IVF (진뱅크 Acc 번호 U16123.1|ZMU16123))에서의 DAS-59132 ZFN (25716/25717) 결합 서열을 모니터링하도록 설계되었다. 증폭을 위해, 라이트사이클러®480 프로브스 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스, 인디애나주 인디애나폴리스)를 0.4 μM의 각각의 프라이머 및 0.2 μM의 각각의 프로브를 함유하는 10 μL 부피 멀티플렉스 반응물 중 1X 최종 농도로 제조하였다 (표 1). 2 단계 증폭 반응을 55℃에서 30초 동안 (형광 획득) 연장으로 수행하였다. 파괴 검정에 대한 분석은 표적 대 참조 비를 이용하여 수행하였다.
표 1: DAS-59132 유전자좌 파괴 검정을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브 서열.
Figure 112015066046002-pct00001
정밀 형질전환으로부터 생성된 854개의 이벤트를 파괴 검정으로 스크리닝하고, 표적 대 참조 신호에서의 유의한 강하를 기초로 하여 파괴된 것으로서 스코어링하였다. 검정된 854개의 이벤트 중 63개가 표적화 유전자 삽입을 나타내는, DAS-59132 유전자좌에서의 파괴된 신호를 갖는다는 결과가 나타났다 (도 2). 파괴 검정이 제공하는 파괴된 유전자좌의 정량적 측정에도 불구하고, 본 검정은 오류 유발 파손 복구로부터 생성된 절단 부위에서의 돌연변이로 인한 표적화 삽입을 분리할 수 없었다. 모든 이벤트의 강력하고 정확한 평가를 보장하기 위해 이벤트를 동시에 스크리닝하기 위한 이차 인-아웃 PCR 검정을 개발하였다.
DAS-59132 유전자좌 인-아웃 PCR 검정: 파괴 검정에 의해 스크리닝된 이벤트를 또한 DAS-59132 유전자좌에서의 유전자좌 특이적 종점 PCR 검정에 의해 스크리닝하였다. 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 ZFN 절단 부위 외부의 표적 게놈 DNA의 영역에 어닐링되도록 설계하였고, 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머는 단지 공여자 DNA의 트랜스진 영역에만 어닐링되도록 설계하였다. 프라이머를 설계하여 DAS-59132 유전자좌에서의 표적 부위의 5' 및 3' 삽입 DNA 접합부 영역을 분석하였다. 공여자 서열이 표적 서열 근위에 있지 않았기 때문에, 형질전환으로부터 생성된 다수의 이벤트는 무작위 삽입이었고, 따라서 인-아웃 PCR 동안 증폭되지 않았다 (도 3a). 프라이머가 표적화 영역에 삽입된 공여자 DNA 및 게놈 DNA의 영역을 단지 증폭시키도록 설계되었기 때문에, 증폭은 표적화 트랜스진 이벤트의 결과이다 (도 3b). 프라이머가 표적 서열 및 삽입된 공여자 서열 둘 다를 표적화하도록 설계되었고 5' 및 3' 접합부 둘 다를 분석하였기 때문에, "인-아웃" PCR로 칭해지는 상기 PCR 분석은 표적화 유전자 삽입의 완전한 모습이 얻어지는 것을 보장한다. PCR 후, 증폭된 샘플을 전기영동에 의해 분석하였고, DAS-59132 유전자좌의 표적 부위에서 트랜스진 통합을 갖는 샘플은 2 kb 및 1.5 kb에서 2개의 밴드의 증폭을 일으켰다. 이는 트랜스진의 5' 및 3' 접합부에서 통합된 표적 서열을 나타낸다.
인-아웃 PCR 증폭 반응을 다카라(Takara) Ex Taq HS 키트™ (클론테크 래보러토리즈, 인크.(Clontech Laboratories, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용하여 수행하였다. 각각의 PCR 반응은, 1x Ex Taq 완충제, 200 nM의 정방향 및 역방향 프라이머, 게놈 DNA 주형 10 내지 20 ng 및 최종 농도 0.05 단위/μL의 Ex Taq HS 폴리머라제를 함유하는 15 또는 20 μL 최종 부피로 수행하였다. 실시간 인-아웃 PCR을 위해, 인비트로젠 (뉴욕주 그랜드 아일랜드)으로부터의 SYTO13® 염료를 4 μM 또는 2.67 μM의 최종 농도로 PCR 반응 믹스에 포함시켰다. SYTO13® 녹색 형광 염료는 이전에 전체 검정 감수성을 증가시키고 폴리머라제 활성의 낮은 억제를 나타내는 것으로 밝혀졌기 때문에, 이를 초기에 제조업체 권장 농도에 따라 사용하였다. 이 염료는 보다 강한 신호 및 보다 일관된 결과를 유도하였으나, 고처리량 시스템은 여전히 제한을 가졌다. 프라이머-이량체 형성 또는 (불순한 프라이머로부터의) 비-특이적 프라이머 어닐링이 가양성 신호를 생성하고 있었기 때문에 배경 형광이 계속해서 문제되었다. 이에 따라 검정에 사용된 농도를 10 μM에서 4 μM 또는 2.67 μM로 낮추었다. 염료 농도의 감소는 PCR 검정의 신뢰가능한 검출 및 정량화를 제공하는 서명 프로파일을 유도하였다.
실시간 인-아웃 PCR을 ABI VIIA7 PCR 시스템™ (라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation), 캘리포니아주 칼스배드) 상에서 수행하였다. 초기 변성 후, 용융 온도 분석 프로그램 전의 증폭 프로그램은 10초 동안 98℃, 30초 동안 66℃ 및 2분 동안 68℃ (형광 획득)의 40회 사이클을 포함하였다. 증폭 단계 후에, 반응물을 65℃에서 30초 동안 및 72℃에서 10분 동안 지속시켰고, 최종적으로 4℃에서 유지하였다. 직접 형광 신호 및 용융 온도 프로파일 둘 다를 샘플 분석에 이용하였다. 실시간 시스템 상에서 확인된 양성 샘플을 표준 겔 이동 검정을 이용하여 추가로 확인하였다.
표 2: 인 아웃 검정에서의 DAS-59132 유전자좌에 대한 프라이머 및 프로브 서열.
Figure 112015066046002-pct00002
가양성으로부터 표적화 삽입 PCR 앰플리콘을 구별하기 위한 노력으로, 생성된 모든 PCR 생성물에 서명 프로파일을 배정하기 위한 프로토콜을 설계하였다. PCR 앰플리콘의 용융 온도 프로파일을 양성 대조군과 비교하였고, 매칭 곡선을 양성 인-아웃 PCR 생성물로 확인하였다 (도 4a 및 4b). 3' 및 5' 말단 둘 다의 용융 온도 프로파일을 포함하는 서명 프로파일을 이용하여 인-아웃 PCR 분석의 상관관계를 분석하는 것은 게놈 유전자좌 내의 표적화 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 삽입 이벤트를 확인하는데 있어서 보다 큰 신뢰를 생성하는 신규 분석 방법론이다.
파괴 검정 및 DAS-59132 유전자좌 인-아웃 PCR 검정의 결과를 서던 블롯팅 및 서열분석 (차세대 서열분석의 표준)을 통해 추가로 확인하였다.
상기 신규 검정은 강력한 분석 과정을 유도하여 옥수수의 ZFN 절단 부위에서의 표적화 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 삽입 이벤트를 확인하였다. 내인성 게놈 유전자좌를 성공적으로 표적화하였고, 표적화 이벤트를 신규 검정을 이용하여 효율적으로 확인하였다. 총 854개의 샘플을 개시된 검정을 이용한 분석에 적용하였다. 파괴 검정을 모든 추정 이벤트에 대해 수행하였고, 이벤트 중 63개가 파괴를 나타내었다. 인-아웃 PCR을 모든 이벤트에 대해 수행하였고, 8개의 양성 이벤트가 확인되었다. 결과적으로, 표적화 삽입이 확인된 총 8개의 이벤트가 존재하였다 (도 5).
실시예 2. 옥수수 식물에서의 표적화 유전자좌의 분석
옥수수 트랜스제닉 B104 배아를 생성하였고, 여기서 DAS-59132 유전자좌를 아연 핑거 뉴클레아제 구축물, pDAB105906 및 공여자 구축물, pDAB104179를 통해 표적화하였다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 번호 2011/0191899의 실시예 7에서 기재된 바이오리스틱 형질전환 방법을 이용하여 이들 구축물을 식물 조직 내로 형질전환시켰다. 추정상 형질전환된 배아를 제초제 포스피노트리신의 선택을 통해 확인하엿다.
추정상 확인된 트랜스제닉 배아를, 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 함유하는 이벤트를 확인하기 위해 파괴 검정을 이용하여 분석하였다. ZFN 파괴 검정을 상기 기재된 프로토콜 및 시약을 사용하여 완료하였다. 표적화되거나 파괴되지 않은 이벤트에서, 0.4 내지 0.6 범위의 표적 대 참조 비가 관찰되었고; 파괴되거나 표적화된 샘플의 경우, 0.2 내지 0.35 (플레이트 대 플레이트 변동) 범위가 보고되었다 (도 6). 그래프에 도시된 바와 같이, 앰플리콘을 생산하지 않은 표적화 이벤트는 증폭된 생성물을 더 적은 양으로 생성하였다.
이어서, 유전자좌 특이적 인-아웃 PCR을 상기 기재된 프로토콜 및 시약을 사용하여 완료하였다. 인-아웃 PCR의 결과로 DAS-59132 유전자좌 내에 트랜스진 삽입을 함유하는 특정 이벤트가 확인되었다.
총 1,223개의 샘플 이벤트를 분석하였다. 파괴 검정을 모든 이벤트에 대해 완료하였고, 85개의 이벤트가 파괴를 나타내는 것으로 확인되었다. 인-아웃 PCR을 모든 1,223개의 샘플 이벤트에 대해 완료하였고, 11개의 양성 이벤트 및 2개의 부분 양성 이벤트를 확인하였다. 서던 블롯팅 및 서열분석을 완료하여 확인된 이벤트가 DAS-59132 게놈 유전자좌 내에 완전 트랜스진 삽입을 포함한다는 것을 확인하였다.
실시예 3. 옥수수 식물에서의 표적화 유전자좌의 분석
옥수수 트랜스제닉 B104 배아를 생성하였고, 조작된 랜딩 패드 유전자좌 (미국 특허 출원 번호 2011/0191899, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 아연 핑거 뉴클레아제를 통해 표적화하였고, 공여자 구축물을 바이오리스틱을 이용하여 식물 조직 내로 형질전환시켰다. 조작된 랜딩 패드 유전자좌 내의 공여자 구축물을 표적화하기 위해 다중 형질전환을 완료하였다. 제1 시리즈의 형질전환을 pDAB109714 공여자 구축물 및 pDAB105941 아연 핑거 뉴클레아제 구축물을 사용하여 완료하였다. 제2 시리즈의 형질전환을 pDAB109715 공여자 구축물 및 pDAB105943 아연 핑거 뉴클레아제 구축물을 사용하여 완료하였다. 제3 시리즈의 형질전환을 pDAB109716 공여자 구축물 및 pDAB105942 아연 핑거 뉴클레아제 구축물을 사용하여 완료하였다. 최종 시리즈의 형질전환을 pDAB109717 공여자 구축물 및 pDAB105945 아연 핑거 뉴클레아제 구축물을 사용하여 완료하였다. 추정상 형질전환된 배아를 제초제 포스피노트리신의 선택을 통해 확인하였다.
ELP 유전자좌 파괴 검정: 프라이머는 ZFN 인식 부위를 함유하는 내인성 표적 영역을 증폭시키도록 설계하였고, 샘플은 qPCR에 의해 분석하기 위해 세팅하였다. 비표적화 이벤트를 나타내는 무손상 영역의 증폭은 검출가능한 qPCR 신호로서 측정된 193개의 염기 쌍 앰플리콘을 생성하였다. 공여자 분자의 성공적인 표적화 통합은 검출가능한 qPCR 신호의 파괴를 초래하고, 대조군과 비교하여 보다 낮은 전체 신호로서 나타난다.
ELP 유전자좌 파괴 검정을 라이트사이클러®480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스, 인디애나주 인디애나폴리스)을 이용하는 실시간 PCR에 의해 수행하였다. 검정은 라이트사이클러® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0을 이용하여 ELP 유전자좌 및 내부 참조 유전자 IVF에서의 ELP ZFN 결합 서열을 모니터링하도록 설계되었다. 증폭을 위해, 라이트사이클러®480 프로브스 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스, 인디애나주 인디애나폴리스)를 0.4 μM의 각각의 프라이머 및 0.2 μM의 각각의 프로브를 함유하는 10 μL 부피 멀티플렉스 반응물 중 1X 최종 농도로 제조하였다 (표 3). 2 단계 증폭 반응을 55℃에서 30초 동안 (형광 획득) 연장으로 수행하였다. 파괴 검정에 대한 분석은 표적 대 참조 비를 이용하여 수행하였다.
표 3: ELP 유전자좌 파괴 검정을 위한 프라이머 및 프로브 서열. ELP1 및 ELP2 반응을 IVF 프라이머 및 프로브를 사용하여 멀티플렉스화하였고, 그의 서열은 표 1에 기재되어 있다.
Figure 112015066046002-pct00003
정밀 형질전환으로부터 생성된 1738개의 이벤트를 파괴 검정으로 스크리닝하고, 표적 대 참조 신호에서의 유의한 강하를 기초로 하여 파괴된 것으로서 스코어링하였다. 검정된 1738개의 이벤트 중 158개가 표적화 유전자 삽입을 나타내는, ELP 유전자좌에서의 파괴된 신호를 갖는다는 결과가 나타났다 (도 7). 파괴 검정이 제공하는 파괴된 유전자좌의 정량적 측정에도 불구하고, 본 검정은 오류 유발 파손 복구로부터 생성된 절단 부위에서의 돌연변이로 인한 표적화 삽입을 분리하지 못했다. 따라서, 모든 이벤트의 강력하고 정확한 평가를 보장하기 위해 이벤트를 동시에 스크리닝하기 위한 이차 인-아웃 PCR 검정을 개발하였다.
ELP 유전자좌 인-아웃 PCR 검정: 파괴 검정에 의해 스크리닝된 이벤트를 또한 새로-개발된, ELP 유전자좌에서의 유전자좌 특이적 종점 PCR 검정에 의해 스크리닝하였다. 하나의 프라이머는 ZFN 절단 부위 외부의 표적 게놈 DNA의 영역에 어닐링되도록 설계하였고, 제2 프라이머는 단지 공여자 DNA의 트랜스진 영역에만 어닐링되도록 설계하였다. 프라이머를 설계하여 ELP 유전자좌에서의 표적 부위의 5' 및 3' 영역을 분석하였다. 프라이머가 표적화 영역에 삽입된 공여자 DNA 및 게놈 DNA의 영역을 단지 증폭시키도록 설계되었기 때문에, 증폭은 표적화 트랜스진 이벤트의 결과이며, 5' 및 3' 접합부 둘 다를 분석하였다.
인-아웃 PCR 증폭 반응을 다카라 EX TAQ HS 키트™ (클론테크 래보러토리즈, 인크., 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용하여 수행하였다. 각각의 PCR 반응은, 1X Ex Taq 완충제, 200 nM의 정방향 및 역방향 프라이머, 게놈 DNA 주형 10 내지 20 ng 및 최종 농도 0.05 단위/μL의 Ex Taq HS 폴리머라제를 함유하는 15 또는 20 μL 최종 부피로 수행하였다. 실시간 인-아웃 PCR을 위해, SYTO13® 염료 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)를 4 μM 또는 2.67 μM의 최종 농도로 PCR 반응 믹스에 포함시켰다.
실시간 인-아웃 PCR을 ABI ViiA7 PCR 시스템™ (라이프 테크놀로지스 코포레이션, 캘리포니아주 칼스배드) 상에서 수행하였다. 초기 변성 후, 용융 온도 분석 프로그램 전의 증폭 프로그램은 10초 동안 98℃, 30초 동안 66℃ 및 2분 동안 68℃ (형광 획득)의 40회 사이클을 포함하였다. 그 후에, 반응물을 65℃에서 30초 동안 및 72℃에서 10분 동안 지속시켰고, 최종적으로 4℃에서 유지하였다. 직접 형광 신호 및 용융 온도 프로파일 둘 다를 샘플 분석에 이용하였다. 실시간 시스템 상에서 확인된 양성 샘플을 표준 겔 이동 검정을 이용하여 추가로 확인하였다.
표 4: ELP 유전자좌 인 아웃 검정을 위한 프라이머 및 프로브 서열.
Figure 112015066046002-pct00004
가양성으로부터 PCR 앰플리콘을 확인하기 위한 노력으로, 생성된 모든 PCR 생성물에 서명 프로파일을 배정하기 위한 프로토콜을 설계하였다. PCR 앰플리콘의 용융 온도 프로파일을 양성 대조군과 비교하였고, 매칭 곡선을 양성 인-아웃 PCR 생성물로 확인하였다. 3' 및 5' 말단 둘 다의 용융 온도 프로파일을 포함하는 서명 프로파일을 이용하여 인-아웃 PCR 분석의 상관관계를 분석하는 것은 표적화 트랜스진 삽입 이벤트를 확인하는데 있어서 보다 큰 신뢰를 생성하는 분석 방법론이다.
총 1738개의 PAT 양성 샘플을 상기 프로젝트에 적용하였다. 파괴 검정 및 인-아웃 PCR을 모든 이벤트에 대해 수행하였다. 결과는 158/1738개의 이벤트가 파괴에 대해 양성이고 이들 이벤트 중 46/1738개가 3' 및 5' 인-아웃 PCR 증폭 반응 둘 다에 대해 양성이었음을 나타내었다.
실시예 4. 옥수수 식물에서의 표적화 유전자좌의 분석
제아 메이스 c.v. B104 식물을 이전에 미국 특허 출원 번호 2011/0191899에 기재된 바와 같이 조작된 랜딩 패드 유전자 구축물 (pDAB105817 또는 pDAB105818)을 사용하여 형질전환시켰다. 형질전환된 옥수수 식물을 수득하였고, ELP를 함유하는 것으로 확인되었다. 4개의 ELP 옥수수 식물주; 105817[1]-015.Sx001.Sx011, 105818[1]-269.Sx001.Sx008, 105818[1]-271.Sx001.Sx005, 및 105818[2]-388.Sx001.Sx008을 제아 메이스 c.v. B104와 교잡하여 반접합체로서 생산하였다. 생성된 자손 식물을, eZFN1을 코딩하는 eZFN 플라스미드 pDAB105941 및 상응하는 공여자 플라스미드 pDAB104182, 또는 eZFN8을 코딩하는 eZFN pDAB105948 및 공여자 pDAB104183을 사용하여 공동-형질전환시켰다. 형질전환을 PDS-1000 (바이오-라드(Bio-Rad))을 이용하여 제조업체의 설명서에 따라 1회 발사된, 단리된 배아의 포격을 통해 완료하였다. 총 20,896개의 배아 (각각의 표적 식물주에 대해 약 5000개 배아)에 포격하고, 비알라포스 저항성에 대해 선택하였다: 12,404개는 pDAB105941 및 그의 상응하는 공여자를 사용하여 공동-포격하였고 8,492개의 배아는 pDAB105948 및 그의 상응하는 공여자를 사용하여 공동-포격하였다.
포격 후, 배아를 배지에서 배양하고, 소식물체로 성장시켰다. pat 트랜스진의 존재를 스크리닝하고 검출하기 위해 개발된 qPCR을 통해 트랜스제닉 이벤트를 확인하였다. 카피수를, 미지의 샘플에 대한 표적/참조 (인버타제) 값 (라이트사이클러 480™에 의한 출력)을 기지의 카피수 표준물 (1-카피: 반접합체, 2-카피: 동형접합체)의 표적/참조 값에 비교하여 결정하였다. 총 614개의 재생된 식물이 생존하였고, 354개 (또는 58%)의 식물이 pat 유전자의 존재에 대해 양성인 것으로 확인되었으며, 추가의 분석을 위해 유지하였다.
ELP 유전자좌 파괴 검정: ZFN 파괴 검정을 통합된 ELP의 변화를 모니터링하기 위해 설계하였다. 비-표적화 ELP에서는, PCR 프라이머 MAS621 및 MAS622 (표 5)에 의해 eZFN 결합 부위를 포함하는 214 bp 생성물이 증폭되었다. ELP 유전자좌에서의 eZFN 결합 부위 내로의 통합 (또는 그의 변형)은 낮은 연장 시간의 qPCR에 의한 증폭을 파괴하여, qPCR 반응에서 신호가 생성되지 않거나 유의하게 낮은 신호가 생성될 것이다. 인버타제 유전자의 증폭에 대한 대조 qPCR 반응을 또한 내부 대조 참조로서 포함시켰다.
증폭을 위해, 라이트사이클러®480 프로브스 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스, 인디애나주 인디애나폴리스)를 0.4 μM의 각각의 프라이머 및 0.2 μM의 각각의 프로브를 함유하는 10 μL 부피 멀티플렉스 반응물 중 1X 최종 농도로 제조하였다. 3 단계 증폭 반응을 95℃에서 10초 (변성), 60℃에서 35초 (어닐링) 및 72℃에서 1초 (형광 획득)로 수행하였다. FAM 형광 모이어티를 465/510 nm의 광학 밀도에서, HEX를 533/580 nm에서 여기시켰다. 카피수를, 미지의 샘플에 대한 표적/참조 (인버타제) 값 (라이트사이클러 480™에 의한 출력)을 기지의 단일 카피 반접합체의 표적/참조 값에 비교하여 결정하였다.
ELP-표적화 이벤트로부터 무작위 삽입 이벤트를 구별하기 위해, pat qPCR 스크리닝을 통해 확인된 354개의 샘플을 파괴 검정을 이용하여 추가로 분석하였다. ELP 파괴 검정을 eZFN 절단 부위에서의 대형 삽입/결실을 모니터링하기 위해 설계하였다. 비-표적화 ELP에서는, eZFN 결합 부위를 포함하는 214 bp PCR 생성물이 증폭되고, 강한 형광 신호를 생성한다. eZFN 결합 부위 내로의 통합 (또는 그의 변형)은 증폭을 파괴하고, PCR 반응을 통해 형광 신호가 생성되지 않거나 유의하게 낮은 수준으로 생성될 것이다. 354개의 pat 양성 이벤트 중에서, 약 8% (28개 이벤트)가 파괴된 것으로 보였으며 (도 8b), 이는 잠재적 표적화를 나타낸다.
표 5: 파괴 검정에 사용된 프라이머 및 프로브.
Figure 112015066046002-pct00005
인-아웃 PCR: 파괴 검정으로 ELP 상의 eZFN 결합 영역에서의 변화를 확인하였다. 프라이머 결합 부위에서의 임의의 변이 또는 유전자좌에서의 무작위 삽입은 ZFN 절단에 의해 유발된 유전자좌에 대한 파괴의 가능한 지표이다. 이어서, 인-아웃 PCR을 이용하여 ELP 유전자좌 내의 공여자 삽입의 존재를 확인하였다. 접합부 서열의 양쪽 말단은 표적 유전자좌 및 공여자를 포함한다. 하나의 프라이머는 표적 식물주에만 존재하는 사전-통합된 ELP 영역에 어닐링되도록 설계하였고, 제2 프라이머는 공여자 구축물 내에만 존재하는 공여자 DNA 서열에만 어닐링되도록 설계하였다. PCR을 통한 증폭은 ELP 게놈 유전자좌 내의 공여자의 표적화 결과를 나타내었다. 무작위 삽입으로부터 생성된 임의의 이벤트는 PCR 증폭을 생산하지 않는다.
공여자/ELP 5' 접합부 인-아웃 PCR을 위해, 정방향 프라이머는 공여자 삽입물의 OsAct1 영역 (5OsF3, 서열 23 ATTTCACTTTGGGCCACCTT)에 결합하도록 설계하였고, 역방향 프라이머 (5R3, 서열 24 AGGCTCCGTTTAAACTTGCTG)는 ELP 좌측 아암에서 표적 식물주 특유의 193 bp 서열에 결합하도록 설계하였다. 3' 공여자/ELP 유전자좌 접합부 인-아웃 PCR을 위해, 정방향 프라이머 (3PAF1, 서열 25 ATGGTGGATGGCATGATGTT)는 공여자 삽입물의 PATv6 영역에 결합하도록 설계하였고, 역방향 프라이머 (3R1, 서열 26 TGGAGGTTGACCATGCTAGG)는 ELP 우측 아암에서 표적 식물주 특유의 192 bp 서열에 결합하도록 설계하였다. 정방향 및 역방향 프라이머가 서로 매우 근접하게 서열에 결합한 경우에만 증폭이 일어났다. 공여자 서열의 무작위 통합은 상기 기재된 PCR 프라이머를 사용하여 검출할 수 없었다. 인-아웃 PCR 검출의 처리량을 증가시키기 위해, 용융 곡선 분석을 녹색 형광 핵산 염색제, SYTO13®을 사용하여 완료하였다. PCR 증폭을 0.75 단위의 다카라 Ex TaqTM DNA 폴리머라제 (다카라 바이오 인크.(Takara Bio Inc.), 일본 시가), 200nM의 dNTP, 각각 200nM의 정방향 및 역방향 프라이머, 2.67 μM의 SYTO13® 및 10 ng의 게놈 DNA를 함유하는 15 μl 반응물 중에서 라이트사이클러 480™ 실시간 PCR 시스템 상에서 수행하였다. 95℃에서의 2분 변성 사이클로 증폭을 시작한 다음, 20초 동안 98℃, 30초 동안 60℃ 및 90초 동안 68℃의 30 사이클 후, 97℃에서 0.11℃/s 램프 속도로 용융 곡선 분석이 이어졌다.
PCR 반응의 결과를 5' 및 3' 플랭킹 말단 둘 다의 분석에서 생성하였다. 공여자 표적화 ELP 유전자좌 이벤트는 5' 인-아웃 PCR 반응의 경우 1.1 kb 단편, 및 3' 인-아웃 PCR 반응의 경우 1.4 kb 단편을 생성하였다. PCR 반응의 결과를, 앰플리콘의 길이 및 조성에 따라 상이한 그래프 결과를 생성하는 용융 곡선 분석을 통해 결정하였다 (도 9). 짧은 PCR 앰플리콘은 통상적으로, 그래프로 나타낼 경우에 편평한 선으로 보여지며 낮은-수준의 형광 신호를 생산하는 단일-피크 용융 온도 (Tm) 곡선을 나타낸다. 그러나, 긴 앰플리콘 (즉, 1-2 kb 단편)의 경우, Tm 프로파일은 보다 복잡하게 보여지며, 다중 피크 (앰플리콘의 국부 하위-서열에 따라)를 생성하고, 높은-수준의 형광 신호를 생산한다. 5개의 이벤트가 5' 및 3' PCR 반응 둘 다에 대해 양성인 것으로 확인되었다. 각각의 4개의 표적 식물주는 ELP 게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자를 포함하는 이벤트를 생산하였다. 모든 인-아웃 PCR 양성을 겔 상에 진행시켰고, 여기서 그들은 예상대로 PCR 앰플리콘의 1개의 밴드만을 보여주었다.
분자 확인: 추가의 분자 검출 방법을 파괴 검정 및 인-아웃 PCR 반응의 결과가 가양성이 아니었음을 확인하기 위해 완료하였다. 5' 및 3' 공여자 삽입물/ELP 게놈 유전자좌 접합부의 서던 블롯 분석 및 서열분석을 완료하였다. 결과는, 파괴 검정 및 인-아웃 PCR 분석을 통해 확인된 이벤트가 ELP 게놈 유전자좌 내에 공여자 삽입물을 함유하였음을 확인하였다.
실시예 5. 옥수수 식물에서의 파괴된 유전자좌의 분석
표적 식물주의 게놈 유전자좌로의 ZFN의 전달을 이전에 미국 특허 공개 번호 20110191877에 개시된 바와 같이 식물 교잡 전략을 통해 도입시켰다. 개별 표적 및 절제자 식물 이벤트를 제아 메이스 c.v. B104에서 생성시켰다. 표적 식물의 5개 식물주를 구축물 pDAB105816, pDAB105817, pDAB105818, pDAB105820 및 pDAB105821을 사용한 형질전환으로 생산하였다. 이들 구축물은 다수의 트랜스진, aad-1 선택 마커 유전자, 및 eZF1 및 eZF8 결합 부위를 함유하는 ELP를 함유하였다. 이어서, 절제자 식물의 2개 식물주를 구축물 pDAB105828 및 pDAB105825를 사용한 형질전환으로 생산하였다. pDAB105828 구축물은 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 유도되고 제아 메이스 Per5 3'UTR에 의해 종결되는 ZFN8을 함유하였다. pDAB105825 구축물은 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 유도되고 제아 메이스 Per5 3'UTR에 의해 종결되는 ZFN1을 함유하였다. 절제자 구축물 둘 다는 또한 pat 선택 마커를 함유하였다. 트랜스제닉 식물을 생산하고, 분자 확인 검정을 통해 확인하였다. 식물을 자가수분시켜 동형접합 자손을 생산하였다. 생성된 동형접합 표적 및 절제자 이벤트를 교잡하여 자손을 생산하였다. 자손을 검정하여 모 절제자 이벤트에 의해 제공된 ZFN 트랜스진이 다른 모 표적 이벤트에 의해 제공된 ELP 표적 유전자좌를 절단하였는지의 여부를 결정하였다. 모든 교잡의 대부분은 자성으로서의 표적 식물주 및 웅성으로서의 절제자 식물주로 이루어졌다. 단 1개의 대조 교잡은 자성으로서의 절제자 식물주 및 웅성으로서의 표적 식물주로 이루어졌다. 표적 및 절제자 식물을 교잡시켜 자손을 생산하였고, 발생의 V3 단계에서 어슈어(Assure) II™ (퀴잘로포프) (184 g ae/ha + 1% COC) 및 이그나이트(Ignite)™ 280 SL (글루포시네이트) (480 gae/ha)을 적용함으로써 이를 스크리닝하였다. 임의의 생존 자손을, qPCR 방법을 통한 aad -1 트랜스진의 존재에 대한 스크리닝을 수반하는 추가의 분자 분석을 위해 선택하였다. 총 1902개의 샘플을, 인버타제를 참조 유전자로 사용하는 qPCR 검정을 이용하여 aad -1 유전자좌의 존재에 대해 유전자형 결정하였다. aad -1 표적 대 참조 비를 계산하고, 기지의 표준물에 대해 정규화하였으며, 여기서 2, 1 또는 0의 비는 각각 동형접합성, 반접합성 또는 널(null) 상태를 나타낸다. 1822개의 식물이 aad -1 반접합으로서 확인되었다.
ZFN 파괴 검정: PCR 기반 파괴 검정을 ELP 표적 게놈 유전자좌의 ZFN 절단 활성의 간접 측정을 위해 설계하였다. ZFN 기능의 완전성에 요구되는 스페이서 위에 형광 표지된 프로브가 놓이도록 검정을 설계하였다 (도 10). eZFN1 파괴 검정은 전체 eZFN1 결합 부위 서열을 포함하는 69 bp 단편의 검출을 일으켰다. eZFN8파괴 검정은 eZFN8 결합 부위 서열에 플랭킹된 109 bp 단편의 검출을 일으켰다. 검정은 둘 다 라이프 테크놀로지스 (뉴욕주 그랜드 아일랜드)에 의해 합성된 MGB 프로브를 사용하였다. ZFN이 ELP 게놈 유전자좌를 절단한 경우, 절단은 게놈 서열 내에 InDel의 혼입을 일으키는 NHEJ를 통해 복구되었으며, 이로써 PCR 프라이머의 설계에 사용된 게놈 서열이 변형되었다. 결과적으로, ELP 게놈 유전자좌 내의 ZFN 결합 서열에 대해 앰플리콘을 증폭시키고 검출하도록 설계된 임의의 PCR 증폭 반응은 형광 신호를 생산하지 않을 것이다 (게놈 서열이 결실되거나 재배열되고, 프라이머가 이들 게놈 서열에 결합할 수 없기 때문).
비-플렉스 검정을 라이트사이클러®480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스, 인디애나주 인디애나폴리스)을 이용한 실시간 또는 qPCR로 수행하였다. 대조 반응을 내인성 참조 유전자로서 인버타제를 사용하여 완료하였다. 증폭을 위해, 라이트사이클러®480 프로브스 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스, 인디애나주 인디애나폴리스)를 0.4 μM의 각각의 프라이머 및 0.2 μM의 각각의 프로브를 함유하는 10 μL 부피 멀티플렉스 반응물 중 1X 최종 농도로 제조하였다 (표 6). 3 단계 증폭 반응을 95℃에서 10초 (변성), 60℃에서 35초 (어닐링) 및 72℃에서 1초 (형광 획득)로 시작하였다. 파괴 검정을 위한 분석을 표적 대 참조 비를 사용하여 수행하고, 기지의 동형접합체에 대해 정규화하였다. PCR 검정의 결과를 도 11로서 제공하였다.
표 6: qPCR 검출에 사용된 프라이머.
Figure 112015066046002-pct00006
ELP 게놈 유전자좌의 eZFN 절단율을 결정하기 위해, 식물 교잡으로부터의 F1 잎 샘플을 먼저 접합성에 대해 분석하고, 이어서 무손상 eZFN 결합 부위를 검출하는 qPCR 검정을 이용하여 ELP 파괴에 대해 시험하였다. eZF 결합 부위에 대한 DSB 복구 동안 ELP 게놈 유전자좌에 InDel이 발생한 경우, qPCR 검정에서 검출가능한 신호의 손실 또는 감소가 있었다. 정규화된 ELP 비를 그의 자매 식물주와 비교하였다. 비가 0 내지 0.05인 경우, 이들은 ZFN에 의해 절단된 것으로 간주하였고 (불완전한 복구); 비가 0.05 내지 0.4인 경우, 이들을 키메라로서 표지하였고, 이는 모든 카피의 ELP가 ZFN에 의해 절단된 것은 아니라는 것을 나타내고; 비가 0.4 초과인 경우, 이들을 ZFN에 의해 절단되지 않은 것으로 확인하였다 (또한 절단되었으나 완벽하게 복구된 것일 수 있음). 절단 및 키메라 스코어링을 합하여, 파괴 검정으로 검출된 eZFN1 활성은 46.6% (1125개 식물 이벤트 중 524개)였고, eZFN8의 활성은 70.2% (697개 식물 이벤트 중 489개)였다. (표 7). 터키 크래머 시험은 절단 빈도에 대해 교잡 사이에서 유의차를 나타내었다. L2BG 및 절제자 식물주의 조합이 절단의 성공에 있어서 결정적인 것으로 입증되었다 (p<0.0001).
표 7: 5개의 ELP 표적 식물주 및 절제자 식물주 자손 중에서의 ZFN 절단 활성.
Figure 112015066046002-pct00007
Figure 112015066046002-pct00008
ZFN 절단의 서열 분석: qPCR 기반 ELP 파괴 데이터를 확인하기 위해, 자손 교잡으로부터의 대표적인 샘플, 및 모 표적 식물주에 의해 대표되는 2개의 음성 대조군을 NGS 앰플리콘 심층 서열분석을 위해 선택하였다. 고품질 판독을 ELP 구축물로부터 참조 서열에 대해 정렬하고, 삽입 및/또는 결실 (InDel)을 확인하였다. 예상대로, 2개의 모 식물주는 참조 서열과 비교하였을 때 ZFN 절단 부위에 매우 낮은 백분율 (<0.1%)의 indel을 가졌으며, 아마도 PCR 증폭 및/또는 서열분석 오류에 기인한다 (도 12). qPCR 및 서열분석 데이터 사이에는 상관관계가 있었다. qPCR 데이터를 기초로 하여 100% 절단 효율을 나타내는 4개의 교잡은 서열분석시 91% 이상의 변형된 ELP를 가졌다. 요약하면, NGS 심층 앰플리콘 서열분석 데이터는 qPCR 데이터와 동일하였고, 파괴 검정 방법이 고도로 감수성임을 입증하였다. 또한, ELP 파괴 검정은 식물체내 ZFN (또는 임의의 다른 부위 특이적 뉴클레아제) 절단 활성을 추정하기 위한 효과적인 검정인 것으로 입증되었다.
본 발명의 측면들이 특정 실시양태에서 기재되었지만, 이들은 본 개시내용의 취지 및 범위 내에서 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 본원은 그의 일반적인 원리를 이용하는 본 발명의 실시양태의 임의의 변동, 사용, 또는 적합화를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본원은, 이들 실시양태가 관련되며 첨부된 청구범위의 제한 내에 속하는 관련 기술분야의 공지된 또는 통상의 실시 내에 있는 한, 본 개시내용으로부터의 이러한 이탈을 포함하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Sastry-Dent, Lakshmi Simpson, Matthew Cao, Zehui Chen, Wei Zhou, Ning Webb, Steve <120> DNA DETECTION METHODS FOR SITE SPECIFIC NUCLEASE ACTIVITY <130> 71783 <160> 91 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAS604 Primer Sequence <400> 1 acacggcaca cacggcgaca ttca 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAS606 primer sequence <400> 2 agggcagtgg ccagtgttcc tgtg 24 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVF-Taq Primer Sequence <400> 3 tggcggacga cgacttgt 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVR-Taq Primer Sequence <400> 4 aaagtttgga ggctgccgt 19 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IV-Probe Primer Sequence <400> 5 cgagcagacc gccgtgtact tctacc 26 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E32-5F3 Primer Sequence <400> 6 gaaggcaaaa cgaatataag tgcattcgg 29 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E32-OLP-R1 Primer Sequence <400> 7 tcgtggatag cactttgggc t 21 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E32-OLP-F3 Primer Sequence <400> 8 tctacagtga actttaggac agagcca 27 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E32-3R2 Primer Sequence <400> 9 gcccttacag ttcatgggcg 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAS622 Primer Sequence <400> 10 taggagttct cttttatgcc accc 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAS621 Primer Sequence <400> 11 ccttgggatt tcagttggta ggtt 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAS617 Primer Sequence <400> 12 tgggtaggag gacaccaaag atga 24 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAS618 Primer Sequence <400> 13 ccattggatt attgaaaact ggcag 25 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELP1-PriF1 Primer Sequence <400> 14 agacctacca cccattaggg c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsAct-PriR3 Primer Sequence <400> 15 tcgtggatag cactttgggc t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAD1-PriF1 Primer Sequence <400> 16 cttgactcgc accacagttg g 21 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELP2-PriR1 Primer Sequence <400> 17 gatggtggtt atgacaggct cct 23 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 18 ccttgggatt tcagttggta ggtt 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 19 taggagttct cttttatgcc accc 24 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 20 tggcggacga cgacttgt 18 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> probe sequence <400> 21 cgagcagacc gccgtgtact t 21 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 22 aaagtttgga ggctgccgt 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 23 atttcacttt gggccacctt 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 24 aggctccgtt taaacttgct g 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 25 atggtggatg gcatgatgtt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 26 tggaggttga ccatgctagg 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 27 tagtgagatg ggcgggagtc t 21 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 28 cctagtggat aaactgc 17 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 29 cccacagtga tccgccttt 19 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 30 gcttctctgt gatgataacc ccta 24 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 31 tccgcctttt gcagtttatc 20 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 32 tgtccctagt gagatg 16 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 33 tggcggacga cgacttgt 18 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 34 cgagcagacc gccgtgtact t 21 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 35 aaagtttgga ggctgccgt 19 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 36 tgttcggttc cctctaccaa 20 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 37 cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 38 caacatccat caccttgact ga 22 <210> 39 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zinc Finger Binding Sequence <400> 39 attttacaat cctgtcccta gtgagatggg cgggagtctt caatcctgtc cctagtggat 60 aaactgcaaa aggcggatca 80 <210> 40 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Complementary sequence of Zinc Finger binding sequence <400> 40 taaaatgtta ggacagggat cactctaccc gccctcagaa gttaggacag ggatcaccta 60 tttgacgttt tccgcctagt 80 <210> 41 <211> 248 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reference sequence for ZFN binding <400> 41 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag tggataaact gcaaaaggcg 180 gatcactgtg gggtggcata aaagagaact cctagatgaa tgtctgccag gtaaacaaca 240 gttgactt 248 <210> 42 <211> 236 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 42 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagatgg gcgggagtct tcaatcctgt ccctagtgga taaactgcaa aaggcggatc 180 actgtggggt ggcataaaag agaactccta gatgaatgtc tgccaggtaa acaaca 236 <210> 43 <211> 244 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 43 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtggg cgggagtctt caatcctgtc cctagtggat aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gccaggtaaa caacagttga 240 ctta 244 <210> 44 <211> 243 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 44 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtggg cgggagtctt caatcctgtc cctagtggat aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gccaggtaaa caacagttga 240 ctt 243 <210> 45 <211> 244 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 45 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtatg ggcgggagtc ttcaatcctg tccctagtgg ataaactgca aaaggcggat 180 cactgtgggg tggcataaaa gagaactcct agatgaatgt ctgccaggta aacaacagtt 240 gact 244 <210> 46 <211> 241 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 46 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtggg cgggagtctt caatcctgtc cctagtggat aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gccaggtaaa caacagttga 240 c 241 <210> 47 <211> 244 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 47 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagatgg gcgggagtct tcaatcctgt ccctagtgga taaactgcaa aaggcggatc 180 actgtggggt ggcataaaag agaactccta gatgaatgtc tgccaggtaa acaacagctg 240 actt 244 <210> 48 <211> 243 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 48 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 cgggagtctt caatcctgtc cctagtggat aaactgcaaa aggcggatca ctgtggggtg 180 gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gccaggtaaa caacagttga cttaggactt 240 gat 243 <210> 49 <211> 235 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 49 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagatgg gcgggagtct tcaatcctgt ccctagtgga taaactgcaa aaggcggatc 180 actgtggggt ggcataaaag agaactccta gatgaatgtc tgccaggtaa acaac 235 <210> 50 <211> 242 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 50 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagggcg ggagtcttca atcctgtccc tagtggataa actgcaaaag gcggatcact 180 gtggggtggc ataaaagaga actcctagat gaatgtctgc caggtaaaca acagttgact 240 ta 242 <210> 51 <211> 242 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 51 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctatgggc gggagtcttc aatcctgtcc ctagtggata aactgcaaaa ggcggatcac 180 tgtggggtgg cataaaagag aactcctaga tgaatgtctg ccaggtaaac aacagttgac 240 tt 242 <210> 52 <211> 243 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 52 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagggcg ggagtcttca atcctgtccc tagtggataa actgcaaaag gcggatcact 180 gtggggtggc ataaaagaga actcctagat gaatgtctgc caggtaaaca acagttgact 240 tag 243 <210> 53 <211> 242 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 53 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtggg cgggagtctt caatcctgtc cctagtggat aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gccaggtaaa caacagttga 240 ct 242 <210> 54 <211> 244 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 54 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagatgg gcgggagtct tcaatcctgt ccctagtgga taaactgcaa aaggcggatc 180 actgtggggt ggcataaaag agaactccta gatgaatgtc tgccaggtaa acaacagttg 240 actt 244 <210> 55 <211> 244 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 55 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctaatggg cgggagtctt caatcctgtc cctagtggat aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gccaggtaaa caacagttga 240 ctta 244 <210> 56 <211> 235 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 56 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtggg cgggagtctt caatcctgtc cctagtggat aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gccaggtaaa caaca 235 <210> 57 <211> 234 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 57 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagatgg gcgggagtct tcaatcctgt ccctagtgga taaactgcaa aaggcggatc 180 actgtggggt ggcataaaag agaactccta gatgaatgtc tgccaggtaa acaa 234 <210> 58 <211> 244 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 58 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctgggcgg gagtcttcaa tcctgtccct agtggataaa ctgcaaaagg cggatcactg 180 tggggtggca taaaagagaa ctcctagatg aatgtctgcc aggtaaacaa cagttgactt 240 agga 244 <210> 59 <211> 244 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 59 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgg 120 gcgggagtct tcaatcctgt ccctagtgga taaactgcaa aaggcggatc actgtggggt 180 ggcataaaag agaactccta gatgaatgtc tgccaggtaa acaacagttg acttaggact 240 tgat 244 <210> 60 <211> 234 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 60 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctatgggc gggagtcttc aatcctgtcc ctagtggata aactgcaaaa ggcggatcac 180 tgtggggtgg cataaaagag aactcctaga tgaatgtctg ccaggtaaac aaca 234 <210> 61 <211> 241 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 61 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctaatggg cgggagtctt caatcctgtc cctagtggat aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gccaggtaaa caacagttga 240 c 241 <210> 62 <211> 230 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 62 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagatgg gcgggagtct tcaatcctgt ccctagtgga taaactgcaa aaggcggatc 180 actgtggggt ggcataaaag agaactccta gatgaatgtc tgccaggtaa 230 <210> 63 <211> 243 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 63 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctatgggc gggagtcttc aatcctgtcc ctagtggata aactgcaaaa ggcggatcac 180 tgtggggtgg cataaaagag aactcctaga tgaatgtctg ccaggtaaac aacagttgac 240 tta 243 <210> 64 <211> 244 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 64 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagggcg ggagtcttca atcctgtccc tagtggataa actgcaaaag gcggatcact 180 gtggggtggc ataaaagaga actcctagat gaatgtctgc caggtaaaca acagttgact 240 tagg 244 <210> 65 <211> 239 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 65 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctatgggc gggagtcttc aatcctgtcc ctagtggata aactgcaaaa ggcggatcac 180 tgtggggtgg cataaaagag aactcctaga tgaatgtctg ccaggtaaac aacagttga 239 <210> 66 <211> 237 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 66 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 cccttgggcg ggagtcttca atcctgtccc tagtggataa actgcaaaag gcggatcact 180 gtggggtggc ataaaagaga actcctagat gaatgtctgc caggtaaaca acagttg 237 <210> 67 <211> 243 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 67 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag ataaactgca aaaggcggat 180 cactgtgggg tggcataaaa gagaactcct agatgaatgt ctgccaggta cacaacagtt 240 gac 243 <210> 68 <211> 237 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 68 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag ataaactgca aaaggcggat 180 cactgtgggg tggcataaaa gagaactcct agatgaatgt ctgccaggta aacaaca 237 <210> 69 <211> 241 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 69 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gccaggtaaa caacagctga 240 c 241 <210> 70 <211> 235 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 70 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gccaggtaaa caaca 235 <210> 71 <211> 223 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 71 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gcc 223 <210> 72 <211> 241 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 72 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctgc aaaaggcgga tcactgtggg 180 gtggcataaa agagaactcc tagatgaatg tctgccaggt aaacaacagt tgacttagga 240 c 241 <210> 73 <211> 222 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 73 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag ttaaactgca aaaggcggat 180 cactgtgggg tggcataaaa gagaaatcct agatgaatgt ct 222 <210> 74 <211> 235 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 74 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct tccaggtaaa caaca 235 <210> 75 <211> 243 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 75 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag ataaactgca aaaggcggat 180 cactgtgggg tggcataaaa gagaactcct agatgaatgt ctgccaggta aacaacagtt 240 gac 243 <210> 76 <211> 242 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 76 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgact gccaggtaaa caacagttga 240 ct 242 <210> 77 <211> 244 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 77 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gccaggtaaa caacagttga 240 ctta 244 <210> 78 <211> 243 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 78 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccttatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag ataaactgca aaaggcggat 180 cactgtgggg tggcataaaa gagaactcct agatgaatgt ctgccaggta aacaacagtt 240 gac 243 <210> 79 <211> 243 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 79 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag ataaactgca aaaggcggat 180 cactgtgggg tggcctaaaa gagaactcct agatgaatgt ctgccaggta aacaacagtt 240 gac 243 <210> 80 <211> 236 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 80 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag ataaactgca aaaggcggat 180 cactgtgggg tggcataaaa gagaactcct agatgaatgt ctgccaggta aacaac 236 <210> 81 <211> 238 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 81 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag ataaactgca aaaggcggat 180 cactgtgggg tggcataaaa gagaactcct agatgaatgt ctgccaggta aacaacag 238 <210> 82 <211> 237 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 82 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag 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60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag ttaaactgca aaaggcggat 180 cactgtgggg tggcataaaa gagaaatccc agatgaatgt ctgccaggta aacaaca 237 <210> 86 <211> 225 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 86 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag taaactgcaa aaggcggatc 180 actgtggggt ggcataaaag agaactccta gatgaatgtc tgcca 225 <210> 87 <211> 243 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 87 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag aaactgcaaa aggcggatca 180 ctgtggggtg gcataaaaga gaactcctag atgaatgtct gccaggtaaa caacagttga 240 ctt 243 <210> 88 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atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag ttaaactgca aaaggcggat 180 cactgtgggg tggcataaaa gagaactcct agatgaatgt ctgccaggta aacaacag 238 <210> 91 <211> 226 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Sequenced fragment showing ZFN cleavage <400> 91 ccttgggatt tcagttggta ggttaaaaat gggagtggca tggagaggaa ataacagagg 60 ccctccagca atagcttctc tgtgatgata acccctatac tctatatttt acaatcctgt 120 ccctagtgag atgggcggga gtcttcaatc ctgtccctag ttaaactgca aaaggcggat 180 cactgtgggg tggcataaaa gagaactcct agatgaatgt ctgcca 226

Claims (61)

  1. a. 제1 증폭 반응에서 표적화 게놈 유전자좌를 포함하는 게놈 DNA 샘플을, 혼성화 조건 하에 표적화 게놈 유전자좌 근위에 결합하는 제1의 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜, 표적화 게놈 유전자좌를 포함하는 제1 앰플리콘을 생성하는 단계;
    b. 제1 앰플리콘의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
    c. 제2 증폭 반응에서 게놈 DNA 샘플을, 혼성화 조건 하에 표적화 게놈 유전자좌 근위에 및 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 내에 결합하는 제2의 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜, 표적화 게놈 유전자좌의 적어도 일부 및 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 포함하는 제2 앰플리콘을 생성하는 단계; 및
    d. 제2 앰플리콘의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
    를 포함하고, 여기서 제1 앰플리콘의 부재 및 제2 앰플리콘의 존재는 표적화 게놈 유전자좌 내의 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내는 것인, 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 외인성 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재를 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    a. 제1 증폭 반응의 결과를 정량화하는 단계;
    b. 제2 증폭 반응의 결과를 정량화하는 단계;
    c. 제1 및 제2 증폭 반응의 결과를 비교하는 단계; 및
    d. 표적화 게놈 유전자좌 내의 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 결정하는 단계
    를 추가로 포함하며, 여기서 제1 앰플리콘이 부재하고 제2 앰플리콘이 존재하는 경우에 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드가 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 것으로 확인되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 멀티플렉스 반응을 추가로 포함하며, 여기서 제1 및 제2 증폭 반응은 단일 튜브 또는 웰에서 진행되는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 제1 및 제2 증폭 반응의 결과를 정량화하는 단계가 제1 및 제2 증폭 반응 중 하나 또는 둘 다에 대한 서명 프로파일을 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 서명 프로파일이 용융 온도 곡선 서명 프로파일 및 형광 서명 프로파일로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 서명 프로파일이 삽입 DNA 염료로부터 생성된 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 삽입 DNA 염료가 시아닌 염료를 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 시아닌 염료가 4 μM 미만의 농도로 증폭 반응에 사용되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 시아닌 염료가 2.7 μM 미만의 농도로 증폭 반응에 사용되는 것인 방법.
  10. 제4항에 있어서, 서명 프로파일이 형광 염료로부터 생성된 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    e. 표적화 게놈 유전자좌 내에 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 이벤트를 선택하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제11항의 트랜스제닉 이벤트를 포함하는 식물.
  13. 제12항에 있어서, 쌍자엽 식물인 식물.
  14. 제13항에 있어서, 대두 식물, 카놀라 식물 및 목화 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍자엽 식물.
  15. 제12항에 있어서, 단자엽 식물인 식물.
  16. 제15항에 있어서, 옥수수 식물, 벼 식물 및 밀 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 단자엽 식물.
  17. 제1항에 있어서, 게놈 유전자좌가 부위 특이적 뉴클레아제에 의해 절단된 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 뉴클레아제가 TALEN 또는 CRISPR 뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응으로의 증폭을 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 제2 앰플리콘이 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 및 표적화 게놈 유전자좌의 5' 접합부를 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 제2 앰플리콘이 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 및 표적화 게놈 유전자좌의 3' 접합부를 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드가 적어도 하나의 유전자 발현 카세트를 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 제1 또는 제2의 다수의 올리고뉴클레오티드 또는 둘 다가 형광 염료를 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 형광 염료가 HEX 형광 염료, FAM 형광 염료, JOE 형광 염료, TET 형광 염료, Cy 3 형광 염료, Cy 3.5 형광 염료, Cy 5 형광 염료, Cy 5.5 형광 염료, Cy 7 형광 염료 및 ROX 형광 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  26. a. 제1 증폭 반응에서 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 게놈 DNA 샘플을, 혼성화 조건 하에 파괴된 게놈 유전자좌 근위에 결합하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜, 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 제1 앰플리콘을 생성하는 단계;
    b. 제1 앰플리콘의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
    c. 제2 증폭 반응에서 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 게놈 DNA 샘플을, 혼성화 조건 하에 파괴된 게놈 유전자좌 근위에 결합하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜, 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 제2 앰플리콘을 생성하는 단계; 및
    d. 제2 증폭 반응의 결과를 정량화하는 단계
    를 포함하며, 여기서 제1 앰플리콘의 부재는 게놈 유전자좌의 파괴를 나타내는 것인, 게놈 유전자좌의 파괴를 확인하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    e. 파괴된 게놈 유전자좌 내의 공여자 삽입의 존재를 확인하는 단계; 및
    f. 파괴된 게놈 유전자좌 내에 공여자 삽입을 포함하는 트랜스제닉 이벤트를 선택하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제27항의 트랜스제닉 이벤트를 포함하는 식물.
  29. 제28항에 있어서, 쌍자엽 식물인 식물.
  30. 제29항에 있어서, 대두 식물, 카놀라 식물 및 목화 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍자엽 식물.
  31. 제28항에 있어서, 단자엽 식물인 식물.
  32. 제31항에 있어서, 옥수수 식물, 벼 식물 및 밀 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 단자엽 식물.
  33. 제26항에 있어서, 게놈 유전자좌가 부위 특이적 뉴클레아제에 의해 절단된 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 뉴클레아제가 TALEN 또는 CRISPR 뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
  36. 제26항에 있어서, 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응으로의 증폭을 포함하는 것인 방법.
  37. 제26항에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오티드 또는 둘 다가 형광 염료를 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 형광 염료가 HEX 형광 염료, FAM 형광 염료, JOE 형광 염료, TET 형광 염료, Cy 3 형광 염료, Cy 3.5 형광 염료, Cy 5 형광 염료, Cy 5.5 형광 염료, Cy 7 형광 염료 및 ROX 형광 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  39. a. 제1 증폭 반응에서 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 게놈 DNA 샘플을, 혼성화 조건 하에 파괴된 게놈 유전자좌 근위에 결합하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜, 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 제1 앰플리콘을 생성하는 단계;
    b. 제1 증폭 반응의 결과를 정량화하는 단계;
    c. 제2 증폭 반응에서 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 게놈 DNA 샘플을, 혼성화 조건 하에 파괴된 게놈 유전자좌 근위에 결합하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜, 파괴된 게놈 유전자좌를 포함하는 제2 앰플리콘을 생성하는 단계;
    d. 제2 증폭 반응의 결과를 정량화하는 단계; 및
    e. 제1 및 제2 증폭 반응의 양을 비교하는 단계
    를 포함하며, 여기서 제1 증폭 반응의 양이 제2 증폭 반응과 비교하여 더 적은 양의 증폭된 생성물을 포함하면, 이로써 이는 제1 앰플리콘 샘플 내의 게놈 유전자좌의 파괴를 나타내는 것인, 다수의 식물 세포로부터의 게놈 유전자좌의 파괴를 확인하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 제1 및 제2 증폭 반응의 결과를 정량화하는 단계가 제1 및 제2 증폭 반응 중 하나 또는 둘 다에 대한 서명 프로파일을 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 서명 프로파일이 용융 온도 곡선 서명 프로파일 및 형광 서명 프로파일로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 서명 프로파일이 삽입 DNA 염료로부터 생성된 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 삽입 DNA 염료가 시아닌 염료를 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 시아닌 염료가 4 μM 미만의 농도로 증폭 반응에 사용되는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 시아닌 염료가 2.7 μM 미만의 농도로 증폭 반응에 사용되는 것인 방법.
  46. 제40항에 있어서, 서명 프로파일이 형광 염료로부터 생성된 것인 방법.
  47. 제39항에 있어서,
    f. 표적화 게놈 유전자좌 내의 공여자 삽입의 존재를 확인하는 단계; 및
    g. 표적화 게놈 유전자좌 내에 공여자 삽입을 포함하는 트랜스제닉 이벤트를 선택하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  48. 제47항의 트랜스제닉 이벤트를 포함하는 식물.
  49. 제48항에 있어서, 쌍자엽 식물인 식물.
  50. 제49항에 있어서, 대두 식물, 카놀라 식물 및 목화 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍자엽 식물.
  51. 제48항에 있어서, 단자엽 식물인 식물.
  52. 제51항에 있어서, 옥수수 식물, 벼 식물 및 밀 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 단자엽 식물.
  53. 제39항에 있어서, 게놈 유전자좌가 부위 특이적 뉴클레아제에 의해 절단된 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 뉴클레아제가 TALEN 또는 CRISPR 뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
  56. 제39항에 있어서, 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응으로의 증폭을 포함하는 것인 방법.
  57. 제39항에 있어서, 다수의 올리고뉴클레오티드가 형광 염료를 포함하는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 형광 염료가 HEX 형광 염료, FAM 형광 염료, JOE 형광 염료, TET 형광 염료, Cy 3 형광 염료, Cy 3.5 형광 염료, Cy 5 형광 염료, Cy 5.5 형광 염료, Cy 7 형광 염료 및 ROX 형광 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
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