CN109804066A

CN109804066A - 可编程cas9-重组酶融合蛋白及其用途

Info

Publication number: CN109804066A
Application number: CN201780062152.6A
Authority: CN
Inventors: D.R.刘; B.柴金德; J.L.贝森
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2016-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2019-05-24
Also published as: US20190367891A1; JP7201153B2; WO2018031683A1; AU2017308889B2; AU2017308889A1; JP2019526248A; CA3033327A1; US11661590B2; EP3497214A1; JP2022122919A; EP3497214B1

Abstract

本公开的一些方面提供了融合蛋白，其包含引导核苷酸序列‑可编程DNA结合蛋白域(例如，Cas9的核酸酶无活性变体，例如dCas9)、任选的接头和重组酶催化域(例如，酪氨酸重组酶催化域或丝氨酸重组酶催化域，例如Gin重组酶催化域)。该融合蛋白可以重组含有侧翼为引导RNA指定序列的最小重组酶核心位点的DNA位点。本公开代表朝向不依赖于内源性细胞机制或细胞状态的在未修饰的细胞中的可编程无痕基因组编辑的步骤。

Description

可编程CAS9-重组酶融合蛋白及其用途

相关申请

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2016年8月9日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.62/372,755和2017年2月7日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.62/456,048的优先权，其每一个通过引用并入本文。

政府资助

本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的拨款号R01EB022376和R35GM118062下得到政府支持完成的。政府拥有本发明的某些权利。

发明背景

高效、可编程且位点特异性同源重组仍然是遗传学和基因组编辑的长期目标。将重组导向感兴趣的基因座的早期尝试依赖于用与靶基因座同源的长侧翼序列转染供体DNA。这种策略受到非常低的效率阻碍，并因此需要严格的选择来识别整合体。最近的努力利用了双链DNA断裂(DSB)诱导同源性定向修复(HDR)的能力。归巢内切核酸酶和后来的可编程内切核酸酶如锌指核酸酶、TALE核酸酶、Cas9和fCas9已用于引入靶定的DSB并在供体DNA存在下诱导HDR。然而，在大多数有丝分裂后细胞中，DSB诱导的HDR强烈下调并且通常效率低。此外，通过易错修复途径(例如非同源末端连接(NHEJ)或单链退火(SSA))修复DSB以比HDR更高的频率导致DSB位点处的核苷酸的随机插入或缺失(插入/缺失)。若细胞经受迫使细胞周期同步的条件或者若NHEJ中涉及的酶得以抑制，则可以提高HDR的效率。但是，此类情况可导致许多随机且不可预测的事件，从而限制了潜在的应用。本公开提供了融合蛋白，其可以重组含有侧翼为引导RNA指定序列的最小重组酶核心位点的DNA位点，并且代表朝向不依赖于内源性细胞机制或细胞状态的在未修饰的细胞中的可编程无痕(scarless)基因组编辑的步骤。

发明概述

本公开描述了融合蛋白的开发，所述融合蛋白包含引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域、任选的接头和重组酶催化域(例如，丝氨酸重组酶催化域如Gin重组酶催化域、酪氨酸重组酶催化域，或任何演化的重组酶催化域)。该融合蛋白在侧翼为两个引导RNA指定的DNA序列的最小gix核心重组酶位点(NNNNAAASSWWSSTTTNNNN,SEQ ID NO:19)上起作用。由所述融合蛋白介导的重组依赖于这两个引导RNA，导致不同引导核苷酸:融合蛋白复合物之间的正交性，并且在培养的人细胞中在与人基因组中发现的DNA序列匹配的DNA序列上有效地发挥功能。本公开的融合蛋白还可以直接在人细胞(例如，培养的人细胞)的基因组上起作用，催化位于相隔约14千碱基之间的两个recCas9假位点(psuedosite)之间的缺失、插入、倒位、易位或重组。这项工作提供了工程化的酶，其可以在未修饰的基因组中以用户定义的单碱基对分辨率催化基因插入、缺失、倒位或染色体易位。

在一个方面，本发明提供融合蛋白，其包含：(i)引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域；(ii)任选的接头；和(iii)重组酶催化域，如任何丝氨酸重组酶催化域(包括但不限于Gin、Sin、Tn3、Hin、β、γδ或PhiC31重组酶催化域)、任何酪氨酸重组酶域(包括但不限于Cre或FLP重组酶催化域)，或任何演化的重组酶催化域。

引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域可以选自下组：核酸酶无活性的Cas9(dCas9)域、核酸酶无活性的Cpf1域、核酸酶无活性的Argonaute域，及其变体。在某些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域是核酸酶无活性的Cas9(dCas9)域。在某些实施方案中，dCas9域的氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO:1中的D10A和/或H840A突变的突变。在另一个实施方案中，dCas9域的氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO:1中的D10A突变的突变和对应于SEQ ID NO:1中的H840A突变的突变。在另一个实施方案中，dCas9域的氨基酸序列进一步不包括SEQ ID NO:1中所示的N-末端甲硫氨酸。在某些实施方案中，dCas9域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:712。在一个实施方案中，dCas9域的氨基酸序列与SEQ ID NO:712具有大于95％的序列一致性。在一个实施方案中，dCas9域的氨基酸序列与SEQ ID NO:712具有大于96、97、98、99％或更高的序列一致性。在一些实施方案中，重组酶催化域是丝氨酸重组酶催化域或酪氨酸重组酶催化域。

在一个实施方案中，重组酶催化域的氨基酸序列是Gin重组酶催化域。在一些实施方案中，Gin重组酶催化域包含对应于选自下组的一个或多个突变的突变：SEQ ID NO:713中的H106Y、I127L、I136R和/或G137F突变。在实施方案中，Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含对应于选自下组的两个或更多个突变的突变：SEQ ID NO:713中的I127L、I136R和/或G137F突变。在实施方案中，Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO:713中的I127L、I136R和G137F突变的突变。在另一个实施方案中，Gin重组酶的氨基酸序列已得以进一步突变。在具体的实施方案中，Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:713。

在另一个实施方案中，重组酶催化域的氨基酸序列是Hin重组酶、β重组酶、Sin重组酶、Tn3重组酶、γδ重组酶、Cre重组酶；FLP重组酶；或phiC31重组酶催化域。

在一个实施方案中，Cre重组酶的氨基酸序列是截短的。在另一个实施方案中，酪氨酸重组酶催化域是Cre重组酶的25kDa羧基端域。在另一个实施方案中，Cre重组酶以氨基酸R118、A127、E138或R154开始(每种情况下其之前都是甲硫氨酸)。在一个实施方案中，重组酶的氨基酸序列已得以进一步突变。在某些实施方案中，重组酶催化域是经演化的重组酶催化域。在一些实施方案中，重组酶的氨基酸序列已得以进一步突变。

在一些实施方案中，接头(例如第一、第二或第三接头)可以具有约0埃至约81埃的长度。接头通常具有约33埃至约81埃的长度。接头可以是肽的、非肽的或这两种类型的接头的组合。在某些实施方案中，接头是肽接头。在某些实施方案中，肽接头包含XTEN接头SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:7)、SGSETPGTSESA(SEQ ID NO:8)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS(SEQ ID NO:9)，包含三肽GGS的一个或多个重复的氨基酸序列，或任何以下氨基酸序列：VPFLLEPDNINGKTC(SEQ ID NO:10)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:11)、SIVAQLSRPDPA(SEQ ID NO:12)、MKIIEQLPSA(SEQ ID NO:13)、VRHKLKRVGS(SEQ ID NO:14)、GHGTGSTGSGSS(SEQ ID NO:15)、MSRPDPA(SEQ ID NO:16)或GGSM(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，肽接头包含三肽GGS的一个或多个重复。在一个实施方案中，肽接头包含三肽GGS的一至五个重复。在另一个实施方案中，肽接头包含三肽GGS的六至十个重复。在具体的实施方案中，肽接头包含三肽GGS的八个重复。在另一个实施方案中，肽接头长约18至约27个氨基酸。在某些实施方案中，肽接头长24个氨基酸。在某些实施方案中，肽接头具有氨基酸序列GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:183)。

在某些实施方案中，接头是非肽接头。在某些实施方案中，非肽接头包含聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸、肝素或烷基接头。在某些实施方案中，烷基接头具有式—NH—(CH₂)_s—C(O)—，其中s是1-100之间的任何整数，包括端点。在某些实施方案中，s是1-20的任何整数，包括端点。

在另一个实施方案中，融合蛋白进一步包含核定位信号(NLS)域。在某些实施方案中，NLS域经由一个或多个第二接头与引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域或重组酶催化域结合。

在一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的第二接头序列]-[NLS域]-COOH。在某些实施方案中，融合蛋白与SEQ ID NO:719中所示的氨基酸序列具有大于85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。在具体的实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:719中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，融合蛋白由SEQ ID NO:719中所示的氨基酸序列组成。

在另一个实施方案中，融合蛋白进一步包含一个或多个亲和标签。在一个实施方案中，亲和标签选自下组：FLAG标签、多组氨酸(多His)标签、多精氨酸(多Arg)标签、Myc标签和HA标签。在实施方案中，亲和标签是FLAG标签。在具体的实施方案中，FLAG标签具有序列PKKKRKV(SEQ ID NO:702)。在另一个实施方案中，一个或多个亲和标签经由一个或多个第三接头与引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域、重组酶催化域或NLS域结合。在某些实施方案中，第三接头是肽接头。

本文描述的融合蛋白的元件可以不做限制以任何顺序。在一些实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH、NH₂-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH或NH₂-[二分叉(bifurcated)或环状置换(circularly permuted)的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。

在一些实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-COOH、NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-COOH或NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-COOH。

在某些实施方案中，融合蛋白与SEQ ID NO:185中所示的氨基酸序列具有大于85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。在具体的实施方案中，融合蛋白具有SEQ IDNO:185中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，融合蛋白的重组酶催化域与SEQ ID NO:185的氨基酸1-142中所示的氨基酸序列(其与SEQ ID NO:713中所示的序列相同)具有大于85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。在某些实施方案中，dCas9域与SEQ ID NO:185的氨基酸167-1533中所示的氨基酸序列(其与SEQ ID NO:712中所示的序列相同)具有大于90％、95％或99％的序列一致性。在某些实施方案中，本公开的融合蛋白与SEQ ID NO:185的氨基酸1-1544中所示的氨基酸序列(其与SEQ ID NO:719中所示的序列相同)具有大于90％、95％或99％的序列一致性。在一个实施方案中，融合蛋白与引导RNA(gRNA)结合。

在一个方面，本公开提供了本文所述的融合蛋白的二聚体。在某些实施方案中，二聚体与靶DNA分子结合。在某些实施方案中，二聚体的每个融合蛋白与靶DNA分子的相同链结合。在某些实施方案中，二聚体的每个融合蛋白与靶DNA分子的相对链结合。在某些实施方案中，二聚体的gRNA与靶DNA分子的重组酶位点侧翼的gRNA结合位点杂交。在某些实施方案中，重组酶位点包含res、gix、hix、six、resH、LoxP、FTR或att核心或相关核心序列。在某些实施方案中，重组酶位点包含gix核心或gix相关核心序列。在进一步的实施方案中，gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离为3至7个碱基对。在某些实施方案中，gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离为5至6个碱基对。

在某些实施方案中，第一二聚体与第二二聚体结合，从而形成融合蛋白的四聚体。在一个方面，本公开提供了本文所述的融合蛋白的四聚体。在某些实施方案中，四聚体与靶DNA分子结合。在某些实施方案中，每个二聚体与DNA的相对链结合。在其他实施方案中，每个二聚体与DNA的相同链结合。

在另一个方面，本公开提供了用于两个DNA分子之间的位点特异性重组的方法，其包括：(a)使第一DNA与第一融合蛋白接触，其中引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第一gRNA，所述第一gRNA与第一DNA的第一区域杂交；(b)使第一DNA与第二融合蛋白接触，其中第二融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第二gRNA，所述第二gRNA与第一DNA的第二区域杂交；(c)使第二DNA与第三融合蛋白接触，其中第三融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第三gRNA，所述第三gRNA与第二DNA的第一区域杂交；和(d)使第二DNA与第四融合蛋白接触，其中第四融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第四gRNA，所述第四gRNA与第二DNA的第二区域杂交；其中在使得DNA重组的条件下，步骤(a)-(d)中融合蛋白的结合导致融合蛋白的重组酶催化域的四聚化，并且其中第一、第二、第三和/或第四融合蛋白是本文所述的任何融合蛋白。

在一个实施方案中，第一和第二DNA分子具有不同的序列。在另一个实施方案中，步骤(a)和(b)的gRNA与第一DNA的相对链杂交，并且步骤(c)和(d)的gRNA与第二DNA的相对链杂交。在另一个实施方案中，其中步骤(a)和(b)的gRNA；和/或步骤(c)和(d)的gRNA与它们各自的DNA的区域杂交，所述区域相隔不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过40、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90或不超过100个碱基对。在某些实施方案中，步骤(a)和(b)的gRNA；和/或步骤(c)和(d)的gRNA在重组酶位点侧翼的gRNA结合位点处与它们各自的DNA的区域杂交(参见例如图1D)。在某些实施方案中，重组酶位点包含res、gix、hix、six、resH、LoxP、FTR或att核心或相关核心序列。在某些实施方案中，重组酶位点包含gix核心或gix相关核心序列。在某些实施方案中，gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离为3至7个碱基对。在某些实施方案中，gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离为5至6个碱基对。

本文提供的用于位点特异性重组的方法也可以与单一DNA分子一起使用。在一个方面，本公开提供了用于单一DNA分子的两个区域之间的位点特异性重组的方法，其包括：(a)使DNA与第一融合蛋白接触，其中引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第一gRNA，所述第一gRNA与DNA的第一区域杂交；(b)使DNA与第二融合蛋白接触，其中第二融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第二gRNA，所述第二gRNA与DNA的第二区域杂交；(c)使DNA与第三融合蛋白接触，其中第三融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第三gRNA，所述第三gRNA与DNA的第三区域杂交；和(d)使DNA与第四融合蛋白接触，其中第四融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第四gRNA，所述第四gRNA与DNA的第四区域杂交；其中在使得DNA重组的条件下，步骤(a)-(d)中融合蛋白的结合导致融合蛋白的重组酶催化域的四聚化，并且其中第一、第二、第三和/或第四融合蛋白是所述的任何融合蛋白。

在某些实施方案中，重组的单一DNA分子的两个区域具有不同的序列。在另一个实施方案中，重组导致DNA分子的区域的缺失。在具体的实施方案中，缺失的DNA分子的区域易于在减数分裂中发生交换事件。在一个实施方案中，步骤(a)-(d)的第一和第二gRNA与DNA的相同链杂交，并且步骤(a)-(d)的第三和第四gRNA与DNA的相对链杂交。在另一个实施方案中，步骤(a)和(b)的gRNA与DNA的区域杂交，所述区域相隔不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90或不超过100个碱基对，并且步骤(c)和(d)的gRNA与DNA的区域杂交，所述区域相隔不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过40、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90或不超过100个碱基对。在某些实施方案中，步骤(a)和(b)的gRNA；和/或步骤(c)和(d)的gRNA与重组酶位点侧翼的gRNA结合位点杂交。在某些实施方案中，重组酶位点包含res、gix、hix、six、resH、LoxP、FTR或att核心或相关核心序列。在一个实施方案中，重组酶位点包含gix核心或gix相关核心序列。在某些实施方案中，gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离为3至7个碱基对。在某些实施方案中，gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离为5至6个碱基对。

本文所述的DNA可以在细胞中。在某些实施方案中，细胞是真核细胞。在某些实施方案中，细胞是植物细胞。在某些实施方案中，细胞是原核细胞。在一些实施方案中，细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞可以是人细胞。在某些实施方案中，细胞在受试者中。在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，细胞可以是植物细胞。

在一个方面，本公开提供了编码本文所公开的任何融合蛋白的多核苷酸。在某些实施方案中，本公开提供了包含编码本文所公开的任何融合蛋白的多核苷酸的载体。

在另一个方面，本公开提供了包含用于表达本文所公开的任何融合蛋白的遗传构建体的细胞。

在一个方面，本公开提供了包含本文所公开的任何融合蛋白的试剂盒。在另一个方面，本公开提供了包含编码本文所公开的任何融合蛋白的多核苷酸的试剂盒。在另一个方面，本公开提供了包含用于重组蛋白表达的载体的试剂盒，其中所述载体包含编码本文所公开的任何融合蛋白的多核苷酸。在另一个方面，本公开提供了包含细胞的试剂盒，所述细胞包含用于表达本文所公开的任何融合蛋白的遗传构建体。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含一个或多个gRNA和/或用于表达一个或多个gRNA的载体。

如下所述，在某些实施方案的详细描述中阐述了本发明的某些实施方案的细节。根据定义、实施例、附图和权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。

附图简述

图1A-1D。实验设置的概述。用(图1A)在hU6启动子的控制下的引导RNA表达载体、(图1B)在CMV启动子的控制下的recCas9表达载体和(图1C)recCas9报告质粒转染细胞。这些组分的共转染导致在靶位点处重新组装引导RNA编程的recCas9(图1D)。这将介导polyA终止子的缺失，允许GFP的转录。引导RNA表达载体和引导RNA序列缩写为gRNA。

图2A-2F。融合接头长度和靶位点间隔区变体的优化。在这些实验中使用单一靶引导RNA表达载体pHU6-NT1或非靶载体pHU6-BC74。序列可以在表6-9中找到。(图2A)显示靶位点的一部分，其中引导RNA靶位点为黑色带有虚线下划线并且gix核心序列位点为黑色。假gix位点的任一侧的5'和3'序列是相同的，但是是反向的，并且被pHU6-NT1识别。将gix假位点与5'和3'结合位点分开的碱基对间隔区的数量分别由X和Y表示。该图分别描绘了SEQ IDNO:700和703。(图2B)Z表示将Ginβ与dCas9连接的GGS重复的数量。当X＝Y时，对于连接Gin催化域和dCas9域的接头(图2C)(GGS)₂(SEQ ID NO:182)、(图2D)(GGS)₅(SEQ ID NO:701)和(图2E)(GGS)₈(SEQ ID NO:183)，评估recCas9活性。(图2F)测定recCas9在由不均匀碱基对间隔区(X≠Y)组成的靶位点上的活性；包括X＝Y＝6用于比较。所有实验一式三份进行，并从这些实验中减去背景荧光。eGFP阳性细胞的百分比仅是那些转染的细胞的(即，表达组成型表达的iRFP基因)，并且每个实验记录至少6,000个活事件(live event)。引导RNA表达载体和引导RNA序列缩写为“gRNA”。值和误差条分别代表三个独立生物学重复的平均值和标准偏差。

图3A-3B。正向和反向引导RNA对recCas9活性的依赖性。(图3A)在PCDH15内发现的序列替换了图1A-1D中测试的靶位点。在假gix核心位点的5'和3'侧两者上，引导RNA可以靶向两个偏移序列。该图分别描绘了SEQ ID NO:704-705。(图3B)recCas9活性通过与所有四个引导RNA表达载体对和个别引导RNA载体与脱靶(O.T.)引导RNA载体共转染recCas9表达载体和报告质粒来测量。脱靶正向物和反向物含有分别靶向CLTA和VEGF的引导RNA序列。还显示了用报告质粒转染但未用靶引导RNA转染的对照实验。还显示了与不同引导RNA表达载体共转染但不与recCas9表达载体共转染的报告质粒的结果。所有实验一式四份进行，并且不从这些实验中减去背景荧光。eGFP阳性细胞的百分比仅是那些转染的细胞的(即，表达组成型表达的iRFP基因)，并且每个实验记录至少6,000个活事件。引导RNA表达载体和引导RNA序列缩写为gRNA。值和误差条分别代表四个独立生物学重复的平均值和标准偏差。

图4A-4D。recCas9可以靶向与人基因组中的序列相同的多个序列。(图4A)图1A-1D中所示的靶位点被人基因组内发现的序列替换。有关序列参见表6。将recCas9表达载体与引导RNA载体对和报告质粒的所有组合共转化。脱靶引导RNA载体也与recCas9表达载体和报告质粒共转化，并含有靶向CLTA和VEGF的引导RNA序列(参见例如Guilinger et al.,Fusion of catalytically inactive Cas9to FokI nuclease improves thespecificity of genome modification.Nature biotechnology,(2014)，其全部内容在此通过引用并入)。eGFP阳性细胞的百分比反映了经转染的(iRFP阳性)细胞的百分比。每个实验至少记录6,000个活事件。值和误差条分别代表至少三个独立的生物学重复的平均值和标准偏差。(图4B)再次进行转染实验，用SpecR替换recCas9表达载体和pUC中的抗性标志物。共转染和温育后，提取附加型DNA(episomal DNA)，转化到大肠杆菌中并选择羧苄青霉素抗性。然后对菌落进行测序以确定(图4C)重组质粒与完全完整质粒的比率。(图4D)分离自转染细胞的附加型提取物的测序数据。列和行代表转染条件。每个单元格显示重组的质粒的百分比和比率。显示的值反映了两个独立的生物学重复的平均值和标准偏差。平均值和每个重复之间的平均差值显示为误差。引导RNA表达载体和引导RNA序列缩写为gRNA。

图5A-5D。recCas9介导培养的人细胞中基因组DNA的引导RNA-和recCas9-依赖性缺失。(图5A)示意图显示位于染色体12的FAM19A2基因座的内含子区域内的预测的recCas9靶位点和用于巢式PCR的引物的位置。该图分别从上到下和从左到右描绘了SEQ ID NO:706-709。(图5B)来自用指定表达载体转染的细胞的模板的巢式基因组PCR的代表性结果(n＝3个生物学重复；NTC＝无模板对照)。星号表示1.3-kb预测的初级PCR产物的位置。箭头表示二级PCR后预测的缺失产物。这两个图来自相同的凝胶，但经切割以去除空白泳道。(图5C)对用所有四种gRNA表达载体转染的细胞的巢式基因组PCR产生的PCR产物的Sanger测序，并且recCas9表达载体与预测的重组后产物匹配。该图分别从上到下描绘了SEQ ID NO:710和711。(图5D)通过有限稀释巢式PCR测定的FAM19A2基因座的估计的最小缺失效率。显示的值反映了三次重复的平均值和标准偏差。

图6。报告质粒构建。Golden Gate组装用于构建本工作中描述的报告质粒。所有组装均以共同质粒pCALNL-EGFP-Esp3I开始，该质粒衍生自pCALNL-EGFP并包含Esp3I限制性位点。显示的片段侧翼为Esp3I位点。Esp3I消化产生一系列相容的、独特的4碱基对5'突出端，以便按所示顺序进行组装。为了组装靶位点，将Esp3I(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)和五个片段加入到单个反应管中以允许Esp3I消化和T7连接的迭代循环。然后用Plasmid-Safe-ATP依赖性DNA酶(Epicentre，Madison，WI)消化反应以减少背景。通过菌落PCR分析菌落以鉴定与预期的全长5部分组装产物匹配的PCR产物；然后将来自这些菌落的质粒送去进行sanger测序。对于图4中所示的基因组报告物，将片段1和2以及片段4和5组合成编码整个靶位点的两个gBlock(IDT，Coralville，IA)片段(图中未显示)。然后如上所述完成组装。构建细节可以在支持材料的方法中找到。用于产生片段的寡核苷酸和gBLOCK可以在表2中找到。

图7A和7B。演化以靶向人基因组的Rosa基因座中称为“36C6”的位点的Cre重组酶与dCas9融合。然后将该融合物用于以引导RNA依赖性方式重组含有Rosa靶位点的基于质粒的报告物。图7A证明了使用野生型Cre和36C6的接头优化的结果。显示靶向其关联报告物的GinB构建体用于参考。显示的1x 2x、5x和8x接头是接头中GGS重复的数量。图7B显示了回复分析的结果，其证明了对与dCas9融合的36C6进行突变可以影响嵌合融合物的相对引导依赖性。显示靶向其关联报告物的GinB构建体用于参考。GGS-36C6：1x GGS接头；2GGS-36C6(使用接头SEQ ID NO:181)：2x GGS接头(使用接头SEQ ID NO:181)。

图8。鉴定了人基因组中Rosa26位点侧翼的PAM，其可以支持dCas9结合(参见上图)。设计引导RNA和质粒报告物以测试内源性前间隔区是否可以支持dCas9-36C6活性。显示靶向gix报告物的GinB构建体用于参考。混合：Cas9和36C6之间所有5种接头变体的等份混合物。序列对应于SEQ ID NO:769(核苷酸序列)和770(氨基酸序列)。

图9A-9B。Cre重组酶的各种测试的截短的位置显示在图9A中。与dCas9融合的Cre重组酶的截短的变体显示出可察觉的重组酶活性以及对Lox质粒报告物系统中引导RNA的存在的严格依赖性(图9B)。与dCas9融合的野生型Cre显示为阳性对照。

定义

如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一种”、“一个”和“该/所述”包括单数和复数。因此，例如，提及“试剂”包括单一试剂和多个此类试剂。

非限制性、示例性RNA-可编程DNA结合蛋白包括Cas9核酸酶、Cas9切口酶、核酸酶无活性的Cas9(dCas9)、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2C3和Argonaute。术语“Cas9”或“Cas9域”是指包含Cas9蛋白或其片段的RNA引导的核酸酶(例如，包含Cas9的活性、无活性或部分活性的DNA切割域，和/或Cas9的gRNA结合域的蛋白质)。Cas9具有两个切割域，其切割特定的DNA链(例如有义链和反义链)。可以产生切割任一条链的Cas9切口酶(包括但不限于spCas9的D10A和H840A)。可以不受限制地在本文所述的融合蛋白和方法中使用Cas9域(例如，核酸酶活性Cas9、核酸酶无活性的Cas9或Cas9切口酶)。此外，本文所述的任何引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白可以用作切口酶。

Cas9核酸酶有时也称为casn1核酸酶或CRISPR(聚簇规则间隔短回文重复)相关核酸酶。CRISPR是适应性免疫系统，其提供针对移动遗传元件(病毒、转座元件和接合质粒)的保护。CRISPR簇含有间隔区，与先前的移动元件互补的序列，并靶向侵入核酸。CRISPR簇得以转录并加工成CRISPR RNA(crRNA)。在II型CRISPR系统中，对pre-crRNA的正确加工需要反式编码的小RNA(tracrRNA)、内源性核糖核酸酶3(rnc)和Cas9蛋白。tracrRNA充当用于pre-crRNA的核糖核酸酶3辅助加工的引导。随后，Cas9/crRNA/tracrRNA以内切核水解方式切割与间隔区互补的线性或环状dsDNA靶标。首先以内切核水解方式切割不与crRNA互补的靶链，然后以3'-5'外切核水解方式修剪(trim)。在自然界中，DNA结合和切割通常需要蛋白质和这两种RNA。然而，单一引导RNA(“sgRNA”或简称“gNRA”)可以经工程化以将crRNA和tracrRNA两者的方面并入单一RNA种类中。参见例如Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science337:816-821(2012)，其全部内容通过引用并入本文。Cas9识别CRISPR重复序列中的短基序(PAM或前间隔区相邻基序)，以帮助区分自我与非自我。Cas9核酸酶序列和结构是本领域技术人员熟知的(参见例如“Completegenome sequence of an M1strain of Streptococcus pyogenes.”Ferretti et al.,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,SezateS.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,RenQ.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”Deltcheva E.,Chylinski K.,SharmaC.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011)；和“A programmable dual-RNA-guided DNA endonucleasein adaptive bacterial immunity.”Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)，其各自的全部内容通过引用并入本文)。已经在各种物种中描述了Cas9直系同源物，包括但不限于酿脓链球菌(S.pyogenes)和嗜热链球菌(S.thermophilus)。基于本公开，其他合适的Cas9核酸酶和序列对于本领域技术人员将是显而易见的，并且此类Cas9核酸酶和序列包括来自Chylinski,Rhun,and Charpentier,“The tracrRNA and Cas9families of type II CRISPR-Casimmunity systems”(2013)RNA Biology 10:5,726-737中公开的生物体和基因座的Cas9序列；其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，Cas9核酸酶具有无活性的(例如失活的)DNA切割域，也就是说，Cas9是切口的酶。作为一个实例，Cas9核酸酶(例如Cas9切口酶)可以切割与gRNA结合的DNA链。作为另一个实例，Cas9核酸酶(例如Cas9切口酶)可以切割不与gRNA结合的DNA链。在另一个实施方案中，任何引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白可以具有无活性的(例如失活的)DNA切割域，即，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是切口酶。作为一个实例，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白可以切割与gRNA结合的DNA链。作为另一个实例，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白可以切割不与gRNA结合的DNA链。

另外的示例性Cas9序列可以在2017年4月27日公开的题为“EvolvedCas9Proteins for Gene Editing”的国际公开号WO/2017/070633中找到。

核酸酶失活的Cas9蛋白可以互换地称为“dCas9”蛋白(相当于核酸酶-“死亡的”Cas9)。在一些实施方案中，dCas9对应于，或部分或全部包含如下以SEQ ID NO:1所示的氨基酸。在一些实施方案中，提供了dCas9的变体(例如SEQ ID NO:1的变体)。例如，在一些实施方案中，提供了具有除D10A和H840A之外的突变的dCas9变体，其例如导致核酸酶失活的Cas9(dCas9)。举例来说，此类突变包括D10和H840处的其他氨基酸取代，或Cas9的核酸酶域内的其他取代(例如，HNH核酸酶亚域和/或RuvC1亚域中的取代)。在一些实施方案中，提供了dCas9的变体或同源物(例如SEQ ID NO:1的变体)，其与SEQ ID NO:10至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％。在一些实施方案中，提供了dCas9的变体(例如SEQ IDNO:1的变体)，其具有比SEQ ID NO:1短或长约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸或更多的氨基酸序列。

dCas9(D10A和H840A):

MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:1)

用于生成具有无活性的DNA切割域的Cas9蛋白(或其片段)的方法是已知的(参见例如Jinek et al.,Science.337:816-821(2012)；Qi et al.,“Repurposing CRISPR asan RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression”(2013)Cell.28；152(5):1173-83，其各自的全部内容通过引用并入本文)。例如，已知Cas9的DNA切割域包括两个亚域，即HNH核酸酶亚域和RuvC1亚域。HNH亚域切割与gRNA互补的链，而RuvC1亚域切割非互补链。这些亚域内的突变可以沉默Cas9的核酸酶活性。例如，突变D10A和H840A完全使酿脓链球菌Cas9的核酸酶活性失活(参见例如，Jinek et al.,Science.337:816-821(2012)；Qi et al.,Cell.28；152(5):1173-83(2013))。在一些实施方案中，提供了包含Cas9的片段的蛋白质。例如，在一些实施方案中，蛋白质包含两个Cas9域的一个：(1)Cas9的gRNA结合域；或(2)Cas9的DNA切割域。在一些实施方案中，包含Cas9或其片段的蛋白质称为“Cas9变体”。Cas9变体与Cas9或其片段共享同源性。例如，Cas9变体与野生型Cas9至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％。在一些实施方案中，Cas9变体包含Cas9的片段(例如，gRNA结合域或DNA切割域)，使得该片段与野生型Cas9的相应的片段至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％。在一些实施方案中，野生型Cas9对应与来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(NCBI参考序列：NC_017053.1，SEQ ID NO:2(核苷酸)；SEQ ID NO:3(氨基酸))。在一些实施方案中，Cas9域包含与野生型Cas9至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，与野生型Cas9相比，Cas9域包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，与野生型Cas9相比，Cas9域包含具有至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100或至少1200个相同的连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，Cas9变体包含Cas9的片段(例如，gRNA结合域或DNA切割域)，使得该片段与野生型Cas9的相应的片段至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％相同。在一些实施方案中，片段是相应的野生型Cas9的氨基酸长度的至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％相同、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。

在一些实施方案中，片段的长度为至少100个氨基酸。在一些实施方案中，片段的长度为至少100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250或1300个氨基酸。

ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGATTATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGGCAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGCAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAATCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTAGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAGAAATGGCTTGTTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGATTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAGTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAGCGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAGGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGCGCCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGGGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGATATTCAAAAAGCACAGGTGTCTGGACAAGGCCATAGTTTACATGAACAGATTGCTAACTTAGCTGGCAGTCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAATTGTTGATGAACTGGTCAAAGTAATGGGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTACAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCATTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTACTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA(SEQ ID NO:2)

MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDDYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFGSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLADSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQIYNQLFEENPINASRVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKRNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNSEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGAYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDRGMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGHSLHEQIANLAGSPAIKKGILQTVKIVDELVKVMGHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFIKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:3)

在一些实施方案中，野生型Cas9对应于，或包含SEQ ID NO:4(核苷酸)和/或SEQID NO:5(氨基酸)。

ATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGACATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATCACATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGA(SEQ ID NO:4)

MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:5)

在一些实施方案中，Cas9是指来自以下的Cas9：溃疡棒杆菌(Corynebacteriumulcerans)(NCBI Refs:NC_015683.1,NC_017317.1)；白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)(NCBI Refs:NC_016782.1,NC_016786.1)；Spiroplasma syrphidicola(NCBIRef:NC_021284.1)；间型普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)(NCBI Ref:NC_017861.1)；台湾螺原体(Spiroplasma taiwanense)(NCBI Ref:NC_021846.1)；海豚链球菌(Streptococcus iniae)(NCBI Ref:NC_021314.1)；波罗的海贝尔氏菌(Belliellabaltica)(NCBI Ref:NC_018010.1)；Psychroflexus torquisI(NCBI Ref:NC_018721.1)；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(NCBI Ref:YP_820832.1)、无害李斯特氏菌(Listeria innocua)(NCBI Ref:NP_472073.1)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(NCBI Ref:YP_002344900.1)或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(NCBI Ref:YP_002342100.1)或者是指来自任何其他生物体的Cas9。

Cas9识别靶DNA序列中CRISPR重复序列中的短基序(PAM基序)。如本文所用，“PAM基序”或“前间隔区相邻基序”是指在CRISPR细菌适应性免疫系统中直接在由Cas9核酸酶靶向的DNA序列之后的DNA序列。PAM是入侵病毒或质粒的组分，但不是细菌CRISPR基因座的组分。自然地，若其后没有PAM序列，则Cas9不会成功结合或切割靶DNA序列。PAM是靶向组分(在细菌基因组中未发现)，其区分细菌自我与非自我DNA，从而防止CRISPR基因座被Cas9核酸酶活性靶向和破坏。

野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9识别规范PAM序列(例如来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌或齿垢密螺旋体(Treponema denticolaor)的Cas9)及其Cas9变体已在本领域中描述为具有不同的或更放松的PAM需求。通常，Cas9蛋白，例如来自酿脓链球菌的Cas9(spCas9)，需要规范的NGG PAM序列来结合特定的核酸区域，其中“NGG”中的“N”是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)，并且G是鸟嘌呤。这可以限制在基因组内编辑期望的碱基的能力。在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑融合蛋白需要定位于精确的位置处，例如，其中靶碱基在4碱基区域(例如“脱氨基作用窗口”)内，其在PAM的上游的约15个碱基。参见Komor,A.C.,et al.,“Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”Nature 533,420-424(2016)，其全部内容在此通过引用并入。在一些实施方案中，脱氨基作用窗口在2、3、4、5、6、7、8、9或10碱基区域内。在一些实施方案中，脱氨基作用窗口在PAM的上游的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碱基。因此，在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白可以含有能够结合不含规范的(例如，NGG)PAM序列的核苷酸序列的Cas9域。本领域中已经描述了结合非规范PAM序列的Cas9域，并且其对于熟练技术人员而言将是显而易见的。例如，结合非规范PAM序列的Cas9域已经描述于Kleinstiver,B.P.,et al.,“Engineered CRISPR-Cas9nucleases with altered PAM specificities”Nature 523,481-485(2015)；和Kleinstiver,B.P.,et al.,“Broadening the targeting range of Staphylococcusaureus CRISPR-Cas9by modifying PAM recognition”Nature Biotechnology 33,1293-1298(2015)；每篇的全部内容在此通过引用并入。还参见：Klenstiver et al.,Nature529,490–495,2016；Ran et al.,Nature,Apr 9；520(7546):186–191,2015；Hou et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,110(39):15644-9,2014；Prykhozhij et al.,PLoS One,10(3):e0119372,2015；Zetsche et al.,Cell 163,759–771,2015；Gao et al.,NatureBiotechnology,doi:10.1038/nbt.3547,2016；Want et al.,Nature 461,754–761,2009；Chavez et al.,doi:dx dot doi dot org/10.1101/058974；Fagerlund et al.,GenomeBiol.2015；16:25,2015；Zetsche et al.,Cell,163,759–771,2015；和Swarts et al.,NatStruct Mol Biol,21(9):743-53,2014，其每一个的全部内容通过引用并入本文。

因此，本公开的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白可以识别多种PAM序列，包括但不限于：NGG、NGAN(SEQ ID NO:741)、NGNG(SEQ ID NO:742)、NGAG(SEQ ID NO:743)、NGCG(SEQ ID NO:744)、NNGRRT(SEQ ID NO:745)、NGRRN(SEQ ID NO:746)、NNNRRT(SEQ ID NO:747)、NNNGATT(SEQ ID NO:748)、NNAGAAW(SEQ ID NO:749)、NAAAC(SEQ ID NO:750)、TTN、TTTN(SEQ ID NO:751)和YTN，其中Y是嘧啶，并且N是任何核碱基。

具有不同的PAM特异性的RNA-可编程DNA结合蛋白的一个实例是来自普雷沃氏菌(Prevotella)和弗朗西斯菌(Francisella)1(Cpf1)的聚簇规则间隔短回文重复。与Cas9类似，Cpf1也是2类CRISPR效应物。已经显示，Cpf1介导了强大的DNA干扰，其具有与Cas9不同的特征。Cpf1是缺乏tracrRNA的单一RNA引导的内切核酸酶，并且它利用富含T的前间隔区相邻基序(TTN、TTTN(SEQ ID NO:751)或YTN)。此外，Cpf1经由交错的DNA双链断裂切割DNA。在16种Cpf1家族蛋白中，来自氨基酸球菌(Acidaminococcus)和毛螺菌(Lachnospiraceae)的两种酶显示在人细胞中具有有效的基因组编辑活性。

本文还提供了核酸酶无活性的Cpf1(dCpf1)变体，其可以用作RNA-可编程DNA结合蛋白域。Cpf1蛋白具有RuvC样内切核酸酶域，其类似于Cas9的RuvC域，但不具有HNH内切核酸酶域，并且Cpf1的N端不具有Cas9的alpha螺旋识别叶(lobe)。它在Zetsche et al.,Cell,163,759–771,2015(其全部内容通过引用并入本文)中显示，Cpf1的RuvC样域负责切割两条DNA链并且RuvC样域的失活使Cpf1核酸酶活性失活。例如，对应于新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)Cpf1(SEQ ID NO:714)中的D917A、E1006A或D1255A的突变使Cpf1核酸酶活性失活。在一些实施方案中，本公开的dCpf1包含对应于SEQ ID NO:714中D917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A或D917A/E1006A/D1255A的突变。应当理解，可以根据本公开使用使Cpf1的RuvC域失活的任何突变，例如取代突变、缺失或插入。

在一些实施方案中，本公开的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域对PAM序列没有需求。此类引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白的一个实例可以是来自格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute蛋白(NgAgo)。NgAgo是ssDNA引导的内切核酸酶。NgAgo结合约24个核苷酸的5′磷酸化ssDNA(gDNA)，以将其引导至其靶位点，并将在gDNA位点处产生DNA双链断裂。与Cas9相比，NgAgo-gDNA系统不需要前间隔区相邻基序(PAM)。使用核酸酶无活性的NgAgo(dNgAgo)可以极大地扩展可以靶向的密码子。NgAgo的表征和使用已经描述于Gao et al.,Nat Biotechnol.Epub 2016May 2.PubMed PMID:27136078；Swarts et al.,Nature.507(7491)(2014):258-61；和Swarts et al.,NucleicAcids Res.43(10)(2015):5120-9，其每个的全部内容通过引用并入本文。格氏嗜盐碱杆菌Argonaute的序列提供于SEQ ID NO:718中。

本文还提供了具有放松的PAM需求的Cas9变体(无PAM(PAMless)的Cas9)。与如SEQID NO:1提供的酿脓链球菌Cas9相比，无PAM的Cas9对靶序列表现出增加的活性，所述靶序列在其3'端处不包含规范的PAM(NGG)，例如增加的活性为至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1,000倍、至少5,000倍、至少10,000倍、至少50,000倍、至少100,000倍、至少500,000倍或至少1,000,000倍。因此，本公开的dCas9或Cas9切口酶可以进一步包含放松PAM需求的突变，例如，对应于SEQ ID NO:1中A262T、K294R、S409I、E480K、E543D、M694I或E1219V的突变。

应当理解，另外的Cas9蛋白(例如，核酸酶死亡的Cas9(dCas9)、Cas9切口酶(nCas9)或核酸酶活性Cas9)，包括其变体和同源物，都在本公开的范围内。示例性Cas9蛋白包括但不限于下文提供的那些。在一些实施方案中，Cas9蛋白是核酸酶死亡的Cas9(dCas9)。在一些实施方案中，dCas9包含如下所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，Cas9蛋白是Cas9切口酶(nCas9)。在一些实施方案中，nCas9包含如下所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，Cas9蛋白是核酸酶活性Cas9。在一些实施方案中，核酸酶活性Cas9包含如下所示的氨基酸序列。

示例性的催化无活性的Cas9(dCas9)：DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:752)

示例性的Cas9切口酶(nCas9)：DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:753)

示例性的催化活性Cas9：DKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:754)

在一些实施方案中，Cas9是指来自构成单细胞原核微生物的域和界的古生菌(arehaea)(例如纳古生菌(nanoarchaea))的Cas9。在一些实施方案中，Cas9是指CasX或CasY，其已经描述于例如Burstein et al.,“New CRISPR–Cas systems fromuncultivated microbes.”Cell Res.2017Feb 21.doi:10.1038/cr.2017.21，其全部内容在此通过引用并入。使用基因组分辨的宏基因组学，鉴定了许多CRISPR-Cas系统，包括在生命的古生菌域中首次报告的Cas9。这种趋异的Cas9蛋白在研究很少的纳古生菌中作为活性CRISPR-Cas系统的一部分发现。在细菌中，发现了两个以前未知的系统，CRISPR-CasX和CRISPR-CasY，它们是迄今发现的最紧凑的系统之一。在一些实施方案中，Cas9是指CasX或CasX的变体。在一些实施方案中，Cas9是指CasY或CasY的变体。应当理解，其他RNA引导的DNA结合蛋白可以用作引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白，并且在本公开的范围内。

在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域可以是CasX或CasY蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域是CasX蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域是CasY蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域包含与天然存在的CasX或CasY蛋白至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域是天然存在的CasX或CasY蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域包含与本文所述的示例性CasX或CasY蛋白的任一个至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域包含本文所述的示例性CasX或CasY蛋白的任一个的氨基酸序列。应当理解，根据本公开也可以使用来自其他细菌物种的CasX和CasY。

CasX(uniprot.org/uniprot/F0NN87；uniprot.org/uniprot/F0NH53)

>tr|F0NN87|F0NN87_SULIH CRISPR相关的Casx蛋白OS＝冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)(菌株HVE10/4)GN＝SiH_0402PE＝4SV＝1

MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYEFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIIAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVRIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRYLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTGSKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG(SEQ ID NO:755)

>tr|F0NH53|F0NH53_SULIR CRISPR相关的蛋白质,Casx OS＝冰岛硫化叶菌(菌株REY15A)GN＝SiRe_0771PE＝4SV＝1

MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYKFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIMAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVSIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRDLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTGSKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG(SEQ ID NO:756)

CasY(ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1)

>APG80656.1CRISPR相关的蛋白质CasY[未培养的Parcubacteria组细菌]MSKRHPRISGVKGYRLHAQRLEYTGKSGAMRTIKYPLYSSPSGGRTVPREIVSAINDDYVGLYGLSNFDDLYNAEKRNEEKVYSVLDFWYDCVQYGAVFSYTAPGLLKNVAEVRGGSYELTKTLKGSHLYDELQIDKVIKFLNKKEISRANGSLDKLKKDIIDCFKAEYRERHKDQCNKLADDIKNAKKDAGASLGERQKKLFRDFFGISEQSENDKPSFTNPLNLTCCLLPFDTVNNNRNRGEVLFNKLKEYAQKLDKNEGSLEMWEYIGIGNSGTAFSNFLGEGFLGRLRENKITELKKAMMDITDAWRGQEQEEELEKRLRILAALTIKLREPKFDNHWGGYRSDINGKLSSWLQNYINQTVKIKEDLKGHKKDLKKAKEMINRFGESDTKEEAVVSSLLESIEKIVPDDSADDEKPDIPAIAIYRRFLSDGRLTLNRFVQREDVQEALIKERLEAEKKKKPKKRKKKSDAEDEKETIDFKELFPHLAKPLKLVPNFYGDSKRELYKKYKNAAIYTDALWKAVEKIYKSAFSSSLKNSFFDTDFDKDFFIKRLQKIFSVYRRFNTDKWKPIVKNSFAPYCDIVSLAENEVLYKPKQSRSRKSAAIDKNRVRLPSTENIAKAGIALARELSVAGFDWKDLLKKEEHEEYIDLIELHKTALALLLAVTETQLDISALDFVENGTVKDFMKTRDGNLVLEGRFLEMFSQSIVFSELRGLAGLMSRKEFITRSAIQTMNGKQAELLYIPHEFQSAKITTPKEMSRAFLDLAPAEFATSLEPESLSEKSLLKLKQMRYYPHYFGYELTRTGQGIDGGVAENALRLEKSPVKKREIKCKQYKTLGRGQNKIVLYVRSSYYQTQFLEWFLHRPKNVQTDVAVSGSFLIDEKKVKTRWNYDALTVALEPVSGSERVFVSQPFTIFPEKSAEEEGQRYLGIDIGEYGIAYTALEITGDSAKILDQNFISDPQLKTLREEVKGLKLDQRRGTFAMPSTKIARIRESLVHSLRNRIHHLALKHKAKIVYELEVSRFEEGKQKIKKVYATLKKADVYSEIDADKNLQTTVWGKLAVASEISASYTSQFCGACKKLWRAEMQVDETITTQELIGTVRVIKGGTLIDAIKDFMRPPIFDENDTPFPKYRDFCDKHHISKKMRGNSCLFICPFCRANADADIQASQTIALLRYVKEEKKVEDYFERFRKLKNIKVLGQMKKI(SEQ ID NO:757)

术语“缀合”是指两个实体的缔合，例如两个分子，诸如两个蛋白质、两个域(例如，结合域和切割域)，或蛋白质和试剂，例如蛋白质结合域和小分子的缔合。在一些方面，缔合在蛋白质(例如，RNA-可编程核酸酶)和核酸(例如，引导RNA)之间。缔合可以是例如经由直接或间接的(例如，经由接头)共价连接。在一些实施方案中，缔合是共价的。在一些实施方案中，两个分子经由连接两个分子的接头缀合。例如，在两个蛋白质彼此缀合(例如，经工程化的核酸酶的结合域和切割域)以形成蛋白质融合物的一些实施方案中，这两个蛋白质可以经由多肽接头(例如，将一个蛋白质的C端连接到另一个蛋白质的N端的氨基酸序列)缀合。

如本文在核酸序列的背景下使用的术语“共有序列”是指表示在多个相似序列中的每个位置处发现的最频繁的核苷酸残基的经计算的序列。通常，通过序列比对确定共有序列，其中相似的序列彼此比较并计算相似的序列基序。在重组酶靶位点序列的背景下，在一些实施方案中，重组酶靶位点的共有序列可以是通过给定的重组酶最频繁地结合或以最高亲和力结合的序列。

如本文所用的术语“工程化的”是指已人为设计、生产、制备、合成和/或制造的蛋白质分子、核酸、复合物、物质或实体。因此，工程化的产品是天然不存在的产品。

如本文所用，术语“有效量”是指足以引起期望的生物学反应的生物活性剂的量。在一些实施方案中，重组酶的有效量可以指足以诱导在由重组酶特异性结合并重组的靶位点处的重组的重组酶的量。如熟练技术人员将理解的，试剂，例如核酸酶、重组酶、杂合蛋白、融合蛋白、蛋白质二聚体、蛋白质(或蛋白质二聚体)和多核苷酸的复合物，或多核苷酸的有效量可以随各种因素而变化，诸如例如随期望的生物学反应、特定等位基因、基因组、靶位点、靶定的细胞或组织和使用的试剂而变化。

如本文所用，“引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白”是指能够结合DNA的蛋白质、多肽或域，并且与其靶DNA序列的结合由引导核苷酸序列介导。“引导核苷酸”可以是RNA或DNA分子(例如，单链DNA或ssDNA分子)，其与靶序列互补并且可以将DNA结合蛋白引导至靶序列。因此，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白可以是RNA-可编程DNA结合蛋白，或ssDNA-可编程DNA结合蛋白。“可编程”意指DNA结合蛋白可以被编程以结合引导核苷酸靶标的任何DNA序列。本文提及的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白可以是本领域已知的任何引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白而没有限制，其包括但不限于，二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白。术语“环状置换”是指其中蛋白质中氨基酸的顺序已经改变，导致具有改变的连接性(connectivity)但相似的(整体)三维形状的蛋白质结构的蛋白质。当原始的n和c末端氨基酸经由肽键连接时形成环状置换；然后肽序列在肽序列内的另一个位置中断裂，产生新的n和c端。环状置换可以通过许多过程发生，包括演化事件、翻译后修饰或人工工程化突变。例如，环状置换可以用于改善蛋白质的催化活性或热稳定性。环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白可与本文所述的任何实施方案一起使用。术语“二分叉”通常是指分成两部分的单体蛋白质。通常，两个部分都是单体蛋白质的功能所需要的。二分叉的蛋白质可以或不可以自身二聚化以重建功能性蛋白质。二分叉可以通过许多过程发生，包括演化事件、翻译后修饰或人工工程化突变。当与二分叉域融合时，其他蛋白质域可以用于强制二分叉蛋白质的重新组装。在一些情况下，其相互作用依赖于小分子的蛋白质域可以与每个二分叉域融合，导致二分叉蛋白质的小分子调节的二聚化。

如本文所用，术语“同源的”是本领域理解的术语，其是指在核苷酸和/或氨基酸序列的水平上高度相关的核酸或多肽。彼此同源的核酸或多肽称为“同源物”。两个序列之间的同源性可以通过本领域技术人员已知的序列比对方法确定。根据本发明，若两个序列对于至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120、至少150或至少200个氨基酸的至少一段(stretch)，至少约50-60％相同，例如在一个或另一个序列中包含的所有残基的至少约50-60％中共享相同的残基(例如氨基酸残基)、至少约70％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％相同，则认为它们是同源的。

如本文所用，术语“序列一致性”或“序列一致性百分比”可以分别指给定DNA或蛋白质中与参照序列相同的核酸或氨基酸残基的百分比。参见例如：Christopher M.Holman,Protein Similarity Score:A Simplified Version of the BLAST Score as aSuperior Alternative to Percent Identity for Claiming Genuses of RelatedProtein Sequences,21SANTA CLARA COMPUTER&HIGH TECH.L.J.55,60(2004)，以其全部内容通过引用并入本文。

如本文所用，术语“接头”是指连接两个分子或部分，例如融合蛋白的两个域，诸如例如核酸酶无活性的Cas9域和核酸编辑域(例如腺苷脱氨酶)的键(例如共价键)、化学基团或分子。在一些实施方案中，接头连接RNA-可编程核酸酶的gRNA结合域，包括Cas9核酸酶域和核酸编辑蛋白的催化域。在一些实施方案中，接头连接dCas9和核酸编辑蛋白。通常，接头位于两个基团、分子或其他部分之间或侧翼有两个基团、分子或其他部分，并且经由共价键与每一个连接，从而连接两者。在一些实施方案中，接头是一个氨基酸或多个氨基酸(例如肽或蛋白质)。在一些实施方案中，接头是有机分子、基团、聚合物或化学部分。在一些实施方案中，接头的长度为5-100个氨基酸，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150或150-200个氨基酸。也考虑了更长或更短的接头。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:7)，其也可以称为XTEN接头。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGGS(SEQ ID NO:758)。在一些实施方案中，接头包含(SGGS)_n(SEQ ID NO:758)、(GGGS)_n(SEQ ID NO:759)、(GGGGS)_n(SEQ ID NO:722)、(G)_n、(EAAAK)_n(SEQ ID NO:723)、(GGS)_n或(XP)_n基序，或这些中任何的组合，其中n独立地是1和30之间的整数，并且其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。

如本文所用，术语“突变”是指序列(例如核酸或氨基酸序列)内的残基用另一个残基取代或序列内一个或多个残基的缺失或插入。本文通常通过鉴定初始残基，随后是序列内残基的位置和新取代的残基的身份来描述突变。用于产生本文提供的氨基酸取代(突变)的各种方法在本领域中是熟知的，并且由例如Green and Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(4^th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(2012))提供。

术语“核定位序列”或“NLS”是指促进蛋白质输入细胞核(例如通过核转运)的氨基酸序列。核定位序列是本领域已知的，并且对于熟练技术人员是显而易见的。例如，NLS序列描述于2001年11月23日提交的Plank等人的国际PCT申请PCT/EP2000/011690，2001年5月31日公布为WO/2001/038547，其内容通过引用并入本文，用于其对示例性的核定位序列的公开内容。在一些实施方案中，NLS包含氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO:702)或MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(SEQ ID NO:761)。

如本文所用，术语“核酸酶”是指能够切割连接核酸分子中两个核苷酸残基的磷酸二酯键的试剂，例如蛋白质。在一些实施方案中，“核酸酶”是指具有无活性的DNA切割域，使得核酸酶不能切割磷酸二酯键的蛋白质。在一些实施方案中，核酸酶是蛋白质，例如，可以结合核酸分子并切割连接核酸分子内的核苷酸残基的磷酸二酯键的酶。核酸酶可以是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的内切核酸酶，或切割在多核苷酸链的末端处的磷酸二酯键的外切核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是结合和/或切割特定核苷酸序列(其在本文中也称为“识别序列”、“核酸酶靶位点”或“靶位点”)内的特定磷酸二酯键的位点特异性核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是RNA引导的(即，RNA-可编程)核酸酶，其与具有与靶位点互补的序列的RNA(例如，引导RNA，“gRNA”)缔合(例如，结合)，从而提供核酸酶的序列特异性。在一些实施方案中，核酸酶识别单链靶位点，而在其他实施方案中，核酸酶识别双链靶位点，例如双链DNA靶位点。许多天然存在的核酸酶(例如许多天然存在的DNA限制性核酸酶)的靶位点是本领域技术人员熟知的。核酸酶蛋白质通常包含介导蛋白质与核酸底物相互作用并且在一些情况下，还特异性结合靶位点的“结合域”，以及催化核酸骨架内的磷酸二酯键的切割的“切割域”。在一些实施方案中，核酸酶蛋白质可以以单体形式结合和切割核酸分子，而在其他实施方案中，核酸酶蛋白质必须二聚化或多聚化以切割靶核酸分子。天然存在的核酸酶的结合域和切割域，以及可以融合以产生结合特定靶位点的核酸酶的模块结合域和切割域是本领域技术人员熟知的。例如，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白(诸如RNA-可编程核酸酶(例如Cas9))或具有无活性DNA切割域的Cas9蛋白的结合域可以用作结合域(例如，结合gRNA以直接结合靶位点)以特异性结合所期望的靶位点，并与切割域融合或缀合。

如本文所用，术语“核酸”和“核酸分子”是指包含核碱基和酸性部分(例如核苷、核苷酸或核苷酸的聚合物)的化合物。通常，聚合核酸，例如包含三个或更多个核苷酸的核酸分子是线性分子，其中相邻的核苷酸经由磷酸二酯连接彼此连接。在一些实施方案中，“核酸”是指个别的核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含三个或更多个个别核苷酸残基的寡核苷酸链。如本文所用，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以可互换地使用以指核苷酸的聚合物(例如，至少三个核苷酸的串)。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA。核酸可以是天然存在的，例如在基因组、转录物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、质粒、粘粒、染色体、染色单体或其他天然存在的核酸分子的背景下。另一方面，核酸分子可以是非天然存在的分子，例如重组DNA或RNA、人工染色体、工程化的基因组或其片段，或合成的DNA、RNA、DNA/RNA杂交体，或包括非天然存在的核苷酸或核苷。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或相似术语包括核酸类似物，即具有除磷酸二酯主链之外的类似物。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学合成等。在适当的情况下，例如在化学合成分子的情况下，核酸可以包含核苷类似物，例如具有化学修饰的碱基或糖、和主链修饰的类似物。除非另有说明，核酸序列以5'至3'方向呈现。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)；插入的碱基；修饰的糖(例如2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基团(例如硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺连接)。

术语“正交”是指最低限度相互作用(若有的话)的生物组分。若gRNA引导的recCas9蛋白不与其他潜在的重组酶位点相互作用或最低限度地相互作用，则含有不同gRNA结合位点的重组酶靶位点是正交的。术语“正交性”指的是系统组分可以独立变化而不影响其他组分的效能的构思。复合物的gRNA引导的性质使得与recCas9蛋白复合的该组gRNA分子能够仅在gRNA引导的位点处引导重组酶活性。通过该组gRNA分子对靶定重组酶位点上的酶活性的完全或近完全的依赖性来证明该系统的正交性。

如本文所用，术语“药物组合物”是指可以在治疗和/或预防疾病或病症的背景下施用于受试者的组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含活性成分，例如与Cas9蛋白融合的重组酶，或其片段(或编码此类融合物的核酸)和任选的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含发明的Cas9变体/融合(例如fCas9)蛋白和适于将Cas9变体/融合蛋白靶向到靶核酸的gRNA。在一些实施方案中，靶核酸是基因。在一些实施方案中，靶核酸是与疾病相关的等位基因，其中等位基因通过Cas9变体/融合蛋白的作用而被切割。在一些实施方案中，等位基因是CLTA基因、VEGF基因、PCDH15基因或FAM19A2基因的等位基因。参见例如实施例。

如本文所用，术语“增殖性疾病”是指其中细胞或组织稳态受到干扰，使得细胞或细胞群表现出异常升高的增殖速率的任何疾病。增殖性疾病包括过度增殖性疾病，如新生前期增生性状况和新生性疾病。新生性疾病的特征是细胞的异常增殖，并包括良性和恶性新生物两者。恶性新生物也称为癌症。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法可用于治疗增殖性疾病。例如，在一些实施方案中，药物组合物包含Cas9(例如，fCas9)蛋白和适合于将Cas9蛋白靶向到VEGF等位基因的gRNA，其中等位基因通过Cas9蛋白的作用而失活。参见例如实施例。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指通过肽(酰胺)键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。该术语是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、肽或多肽。通常，蛋白质、肽或多肽将是至少三个氨基酸长。蛋白质、肽或多肽可以指个别的蛋白质或蛋白质的集合。蛋白质、肽或多肽中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如通过添加化学实体如碳水化合物基团、羟基、磷酸基团、法呢基、异法呢基、脂肪酸基团，用于缀合、官能化或其他修饰的接头等。蛋白质、肽或多肽也可以是单个分子或者可以是多分子复合物。蛋白质、肽或多肽可以仅仅是天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质、肽或多肽可以是天然存在的、重组的或合成的，或其任何组合。如本文所用，术语“融合蛋白”是指包含来自至少两种不同蛋白质的蛋白质域的杂合多肽。一种蛋白质可以位于融合蛋白的氨基端(N端)部分或羧基端(C端)蛋白质，从而分别形成“氨基端融合蛋白”或“羧基端融合蛋白”。本文提供的任何蛋白质可以通过本领域已知的任何方法产生。例如，本文提供的蛋白质可以经由重组蛋白质表达和纯化产生，其特别适用于包含肽接头的融合蛋白。用于重组蛋白质表达和纯化的方法是熟知的，并且包括Green and Sambrook,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(4^th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012))描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。本文提及的特定融合蛋白是recCas9，一种通过将催化无活性的dCas9融合至重组酶的催化域创建的RNA编程的小丝氨酸重组酶，其能够在哺乳动物细胞中发挥功能。

如本文所讨论的“假gix”位点或“gix假位点”是类似于Gix重组酶的天然DNA识别序列的特定的假回文核心DNA序列。参见例如N.D.F.Grindley,K.L.Whiteson,P.A.Rice,Mechanisms of site-specific recombination.Annu Rev Biochem 75,567-605(2006)，以其全部内容通过引用并入本文。类似地，“假hix”或“hix假位点”；“假six”或“six假位点”；“假resH”或“resH假位点”；“假res”或“res假位点”；“假LoxP”或“LoxP假位点”；“假att”或“att假位点”；“假FTR”或“FTR假位点”是类似于Hin重组酶、β重组酶、Sin重组酶、Tn3或γδ重组酶、Cre重组酶、λ噬菌体整合酶或FLP重组酶的天然DNA识别序列的特定的假回文核心DNA序列。

术语“RNA-可编程核酸酶”和“RNA引导的核酸酶”在本文中可互换使用，并且是指与一个或多个不是切割靶标的RNA形成复合物(例如，结合或缔合)的核酸酶。在一些实施方案中，当与RNA形成复合物时，RNA-可编程核酸酶可以称为核酸酶:RNA复合物。通常，结合的RNA称为引导RNA(gRNA)。gRNA可以作为两个或更多个RNA的复合物或者作为单个RNA分子存在。作为单个RNA分子存在的gRNA可以称为单引导RNA(sgRNA)，尽管“gRNA”可互换使用以指作为单个分子或作为两个或更多个分子的复合物存在的引导RNA。通常，作为单一RNA种类存在的gRNA包含两个域：(1)与靶核酸共享同源性(例如，并引导Cas9复合物与靶物的结合)的域；和(2)结合Cas9蛋白的域。在一些实施方案中，域(2)对应已知为tracrRNA的序列，并且包含茎-环结构。例如，在一些实施方案中，域(2)与Jinek et al.,Science 337:816-821(2012)的图1E中描绘的tracrRNA同源，其全部内容通过引用并入本文。gRNA的其他实例(例如包括域2的那些)可以在2013年9月6日提交的题为“Switchable Cas9Nucleases andUses Thereof”的美国临时专利申请U.S.S.N.61/874,682；2013年9月6号提交的题为“Delivery System For Functional Nucleases”的美国临时专利申请U.S.S.N.61/874,746；2013年3月15日提交的题为“Methods and Compositions for RNA-Directed TargetDNA Modification and for RNA-Directed Modulation of Transcription”的PCT申请WO2013/176722；和2013年3月20日提交的题为“RNA-Directed DNA Cleavage by the Cas9-crRNA Complex”的PCT申请WO 2013/142578中找到，每篇的全部内容通过引用以其整体并入本文。本文提供了gRNA的其他实例。参见例如实施例。在一些实施方案中，gRNA包含域(1)和(2)中的两个或更多个，并且可以称为“延伸的gRNA”。例如，延伸的gRNA将例如结合两个或更多个Cas9蛋白并在两个或更多个不同区域处结合靶核酸，如本文所述。gRNA包含与靶位点互补的核苷酸序列，其介导核酸酶/RNA复合物与所述靶位点的结合，提供了核酸酶:RNA复合物的序列特异性。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是RNA-可编程核酸酶如(CRISPR相关系统)(CRISPR-associated system)Cas9内切核酸酶，例如来自酿脓链球菌的Cas9(Csn1)(参见例如“Complete genome sequence of an M1strain ofStreptococcus pyogenes.”Ferretti J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,SavicG.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,CliftonS.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,EckertM.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011)；和“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.”Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)，每篇的全部内容通过引用并入本文。

因为RNA-可编程核酸酶(例如Cas9)使用RNA:DNA杂交来确定靶DNA切割位点，所以这些蛋白质原则上能够切割由引导RNA规定的任何序列。使用RNA-可编程核酸酶例如Cas9进行位点特异性切割(例如，以修饰基因组)的方法是本领域已知的(参见例如Cong,L.etal.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science 339,819-823(2013)；Mali,P.et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science 339,823-826(2013)；Hwang,W.Y.et al.Efficient genome editing in zebrafish using aCRISPR-Cas system.Nature biotechnology 31,227-229(2013)；Jinek,M.et al.RNA-programmed genome editing in human cells.eLife 2,e00471(2013)；Dicarlo,J.E.etal.Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cassystems.Nucleic acids research(2013)；Jiang,W.et al.RNA-guided editing ofbacterial genomes using CRISPR-Cas systems.Nature biotechnology 31,233-239(2013)；每篇的全部内容通过引用并入本文)。

如本文所用，术语“重组酶”是指介导重组酶识别序列之间DNA的重组的位点特异性酶，所述重组导致重组酶识别序列之间的DNA片段的切除、整合、倒位或交换(例如，易位)。重组酶可以分为两个不同的家族：丝氨酸重组酶(例如，解离酶和转化酶)和酪氨酸重组酶(例如整合酶)。丝氨酸重组酶的实例包括但不限于，Hin、Gin、Tn3、β-six、CinH、ParA、γδ、Bxb1、φC31、TP901、TG1、R4、MR11、A118、U153和gp29。酪氨酸重组酶的实例包括但不限于，Cre、FLP、R、Lambda、HK101、HK022和pSAM2。本文提及的Gin重组酶可以是本领域已知的任何Gin重组酶，其包括但不限于T.Gaj et al.,Acomprehensive approach to zinc-finger recombinase customization enablesgenomic targeting in human cells.Nucleic Acids Research 41,3937-3946(2013)中提出的Gin重组酶,其通过引用以其整体并入本文。在某些实施方案中，Gin重组酶催化域与SEQ ID NO:713中所示的氨基酸序列具有大于85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。在另一个实施方案中，Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含对应于H106Y，和/或I127L，和/或I136R和/或G137F的突变。在另一个实施方案中，Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含对应于H106Y、I127L、I136R和G137F的突变。在进一步的实施方案中，Gin重组酶的氨基酸序列已得以进一步突变。在具体的实施方案中，Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:713。Gin重组酶与gix靶位点(本文也称为“gix核心”、“最小gix核心”或“gix相关核心”序列)结合。最小gix核心重组酶位点是NNNNAAASSWWSSTTTNNNN(SEQ ID NO:19)，其中N定义为任何氨基酸，W是A或T，并且S是G或C。gix靶位点可以包括本领域已知的任何其他突变。在某些实施方案中，gix靶位点与SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列具有大于90％、95％或99％的序列一致性。gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离可以是1至10个碱基对、3至7个碱基对、5至7个碱基对或5至6个碱基对。gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基对。

丝氨酸和酪氨酸重组酶的名称源自重组酶用来攻击DNA，并在链交换期间与DNA共价连接的保守亲核氨基酸残基。重组酶具有许多应用，包括基因敲除/敲入的创建和基因治疗应用。参见例如Brown et al.,“Serine recombinases as tools for genomeengineering.”Methods.2011；53(4):372-9；Hirano et al.,“Site-specificrecombinases as tools for heterologous gene integration.”Appl.Microbiol.Biotechnol.2011；92(2):227-39；Chavez and Calos,“Therapeuticapplications of theΦC31integrase system.”Curr.Gene Ther.2011；11(5):375-81；Turan and Bode,“Site-specific recombinases:from tag-and-target-to tag-and-exchange-based genomic modifications.”FASEB J.2011；25(12):4088-107；Venken andBellen,“Genome-wide manipulations of Drosophila melanogaster withtransposons,Flp recombinase,andΦC31integrase.”Methods Mol.Biol.2012；859:203-28；Murphy,“Phage recombinases and their applications.”Adv.Virus Res.2012；83:367-414；Zhang et al.,“Conditional gene manipulation:Creating a new biologicalera.”J.Zhejiang Univ.Sci.B.2012；13(7):511-24；Karpenshif and Bernstein,“Fromyeast to mammals:recent advances in genetic control of homologousrecombination.”DNA Repair(Amst).2012；1；11(10):781-8；每篇的全部内容以其整体在此通过引用并入。本文提供的重组酶不意味着是可以用于本发明的实施方案的重组酶的排他性实例。通过挖掘新的正交重组酶的数据库或设计具有限定的DNA特异性的合成重组酶，可以扩展本发明的方法和组合物(参见例如，Groth et al.,“Phage integrases:biologyand applications.”J.Mol.Biol.2004；335,667-678；Gordley et al.,“Synthesis ofprogrammable integrases.”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.2009；106,5053-5058；每篇的全部内容以其整体在此通过引用并入)。

可用于本文所述方法和组合物的重组酶的其他实例是本领域技术人员已知的，并且预期发现或产生的任何新重组酶能够用于本发明的不同实施方案中。在一些实施方案中，重组酶的催化域与核酸酶失活的RNA-可编程核酸酶(例如，dCas9或其片段)融合，使得重组酶域不包含核酸结合域或不能结合随后导致酶促催化的靶核酸(例如，重组酶域经工程化改造以使其不具有特异性DNA结合活性)。缺乏DNA结合活性的部分的重组酶和独立于辅助蛋白起作用的重组酶以及其工程化方法是已知的，并且包括Klippel et al.,“Isolation and characterisation of unusual gin mutants.”EMBO J.1988；7:3983–3989:Burke et al.,“Activating mutations of Tn3resolvase marking interfacesimportant in recombination catalysis and its regulation.Mol Microbiol.2004；51:937–948；Olorunniji et al.,“Synapsis and catalysis by activatedTn3resolvase mutants.”Nucleic Acids Res.2008；36:7181–7191；Rowland et al.,“Regulatory mutations in Sin recombinase support a structure-based model ofthe synaptosome.”Mol Microbiol.2009；74:282–298；Akopian et al.,“Chimericrecombinases with designed DNA sequence recognition.”Proc Natl Acad SciUSA.2003；100:8688–8691；Gordley et al.,“Evolution of programmable zinc finger-recombinases with activity in human cells.J Mol Biol.2007；367:802–813；Gordleyet al.,“Synthesis of programmable integrases.”Proc Natl Acad Sci USA.2009；106:5053–5058；Arnold et al.,“Mutants of Tn3resolvase which do not requireaccessory binding sites for recombination activity.”EMBO J.1999；18:1407–1414；Gaj et al.,“Structure-guided reprogramming of serine recombinase DNA sequencespecificity.”Proc Natl Acad Sci USA.2011；108(2):498-503；和Proudfoot et al.,“Zinc finger recombinases with adaptable DNA sequence specificity.”PLoSOne.2011；6(4):e19537描述的那些；每篇的全部内容在此通过引用并入。例如，解离酶-转化酶组的丝氨酸重组酶(例如Tn3和γδ解离酶以及Hin和Gin转化酶)具有模块化结构，它们具有部分自主的催化和DNA结合域(参见例如，Grindley et al.,“Mechanism of site-specific recombination.”Ann Rev Biochem.2006；75:567–605，其全部内容通过引用并入)。因此，这些重组酶的催化域适合于与如本文所述的核酸酶失活的RNA-可编程核酸酶(例如，dCas9或其片段)重组，例如，在分离不需要任何辅助因素(例如DNA结合活性)的“激活性”重组酶突变体之后(参见例如，Klippel et al.,“Isolation and characterisationof unusual gin mutants.”EMBO J.1988；7:3983–3989:Burke et al.,“Activatingmutations of Tn3resolvase marking interfaces important in recombinationcatalysis and its regulation.Mol Microbiol.2004；51:937–948；Olorunniji et al.,“Synapsis and catalysis by activated Tn3resolvase mutants.”Nucleic AcidsRes.2008；36:7181–7191；Rowland et al.,“Regulatory mutations in Sin recombinasesupport a structure-based model of the synaptosome.”Mol Microbiol.2009；74:282–298；Akopian et al.,“Chimeric recombinases with designed DNA sequencerecognition.”Proc Natl Acad Sci USA.2003；100:8688–8691)。

另外，许多其他具有N端催化域和C端DNA结合域的天然丝氨酸重组酶是已知的(例如，phiC31整合酶、TnpX转座酶、IS607转座酶)，并且它们的催化域可以增选用于工程化如本文所述的可编程位点特异性重组酶(参见例如，Smith et al.,“Diversity in theserine recombinases.”Mol Microbiol.2002；44:299–307，其全部内容通过引用并入)。类似地，酪氨酸重组酶(例如Cre、λ整合酶)的核心催化域是已知的，并且可以类似地增选以工程化如本文所述的可编程位点特异性重组酶(参见例如Guo et al.,“Structure of Crerecombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse.”Nature.1997；389:40–46；Hartung et al.,“Cre mutants with altered DNA bindingproperties.”J Biol Chem 1998；273:22884–22891；Shaikh et al.,“Chimeras of theFlp and Cre recombinases:Tests of the mode of cleavage by Flp and Cre.J MolBiol.2000；302:27–48；Rongrong et al.,“Effect of deletion mutation on therecombination activity of Cre recombinase.”Acta Biochim Pol.2005；52:541–544；Kilbride et al.,“Determinants of product topology in a hybrid Cre-Tn3resolvase site-specific recombination system.”J Mol Biol.2006；355:185–195；Warren et al.,“A chimeric cre recombinase with regulated directionality.”ProcNatl Acad Sci USA.2008 105:18278–18283；Van Duyne,“Teaching Cre to followdirections.”Proc Natl Acad Sci USA.2009Jan 6；106(1):4-5；Numrych et al.,“Acomparison of the effects of single-base and triple-base changes in theintegrase arm-type binding sites on the site-specific recombination ofbacteriophageλ.”Nucleic Acids Res.1990；18:3953–3959；Tirumalai et al.,“Therecognition of core-type DNA sites byλintegrase.”J Mol Biol.1998；279:513–527；Aihara et al.,“A conformational switch controls the DNA cleavage activity ofλintegrase.”Mol Cell.2003；12:187–198；Biswas et al.,“A structural basis forallosteric control of DNA recombination byλintegrase.”Nature.2005；435:1059–1066；和Warren et al.,“Mutations in the amino-terminal domain ofλ-integrasehave differential effects on integrative and excisive recombination.”MolMicrobiol.2005；55:1104–1112；每篇的全部内容通过引用并入)。

在核酸修饰(例如，基因组修饰)的背景下，术语“重组”用于指通过重组酶蛋白质(例如，本文提供的本发明的重组酶融合蛋白)的作用修饰两个或更多个核酸分子或单个核酸分子的两个或更多个区域的过程。重组尤其可以导致核酸的插入、倒位、切除或易位，例如在一个或多个核酸分子之中或之间。

如本文中在蛋白质或核酸的背景中使用，术语“重组体(recombinant)”是指自然界中不存在，但是作为人工程化的产物的蛋白质或核酸。例如，在一些实施方案中，重组蛋白质或核酸分子包含相比于任何天然存在的序列包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个突变的氨基酸或核苷酸序列。

如本文所用，术语“受试者”是指个体生物体，例如个体哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是非人灵长类动物。在一些实施方案中，受试者是啮齿动物。在一些实施方案中，受试者是绵羊、山羊、牛、猫或狗。在一些实施方案中，受试者是脊椎动物、两栖动物、爬行动物、鱼、昆虫、苍蝇或线虫。在一些实施方案中，受试者是研究动物。在一些实施方案中，受试者是经遗传工程化的，例如基因遗传化的非人受试者。受试者可以是任何一个性别和处于任何发展阶段的。在一些实施方案中，受试者是经遗传工程化的，例如基因遗传化的非人受试者。受试者可以是任何一个性别和处于任何发展阶段的。

如本文在核酸酶的背景中使用，术语“靶核酸”和“靶基因组”分别指包含给定核酸酶的至少一个靶位点的核酸分子或基因组。在包含(核酸酶失活的)RNA-可编程核酸酶和重组酶域的融合物的背景中，“靶核酸”和“靶基因组”分别指一个或多个包含至少一个靶位点的核酸分子或基因组。在一些实施方案中，靶核酸包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个靶位点。在一些实施方案中，靶核酸包含四个靶位点。

术语“靶位点”是指由重组酶(例如本文提供的dCas9-重组酶融合蛋白)结合并重组(例如在靶位点处或附近)的核酸分子内的序列。靶位点可以是单链或双链的。例如，在一些实施方案中，四个重组酶单体协调以重组靶核酸，每个单体与由gRNA引导的(核酸酶失活的)Cas9蛋白融合。在此类实例中，每个Cas9域由不同的gRNA引导以结合靶核酸，因此靶核酸包含四个靶位点，每个位点通过分开的dCas9-重组酶融合物靶向(从而协调重组靶核酸的四个重组酶单体)。对于RNA引导的核酸酶失活的Cas9(或其gRNA结合域)和本发明的Cas9的融合物，在一些实施方案中，靶位点可以是17-20个碱基对加上3个碱基对PAM(例如，NNN，其中N独立地代表任何核苷酸)。通常，PAM的第一个核苷酸可以是任何核苷酸，而两个下游核苷酸是根据特定的RNA引导的核酸酶指定的。用于RNA引导的核酸酶(例如Cas9)的示例性靶位点(例如，包含PAM)是本领域技术人员已知的并且包括但不限于NNG、NGN、NAG和NGG，其中每个N独立地是任何核苷酸。另外，来自不同物种(例如嗜热链球菌而不是酿脓链球菌)的Cas9核酸酶识别包含序列NGGNG(SEQ ID NO:763)的PAM。另外的PAM序列是已知的，包括但不限于NNAGAAW(SEQ ID NO:749)和NAAR(SEQ ID NO:771)(参见例如，Esvelt and Wang,Molecular Systems Biology,9:641(2013)，其全部内容通过引用并入本文)。在一些方面，RNA引导的核酸酶(诸如例如Cas9)的靶位点可以包含结构[N_Z]-[PAM]，其中每个N独立地是任何核苷酸，并且z是1和50之间的整数，包括端点。在一些实施方案中，z是至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50。在一些实施方案中，z是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。在一些实施方案中，z是20。在某些实施方案中，可以使用“无PAM的”RNA引导的核酸酶(例如，无PAM的Cas9)或如本文进一步描述的具有放松PAM需求的RNA引导的核酸酶。在一些实施方案中，“靶位点”还可以指核酸分子内被核酸酶结合但未切割的序列。例如，本文描述的某些实施方案提供包含无活性(或失活)Cas9DNA切割域的蛋白质。此类蛋白质(例如，当还包括Cas9RNA结合域时)能够结合由gRNA指定的靶位点；然而，因为DNA切割位点被灭活，所以靶位点不被特定蛋白质切割。在一些实施方案中，此类蛋白质与重组酶(或重组酶的催化域)缀合、融合或结合，所述重组酶介导靶核酸的重组。在一些实施方案中，实际上切割或重组的序列将取决于介导核酸分子的切割或重组的蛋白质(例如，重组酶)或分子，并且在一些情况下，例如可与结合失活的Cas9蛋白的接近性或距离有关。

如本文所用，术语“转录激活物样效应物”(TALE)是指包含DNA结合域的细菌蛋白质，所述DNA结合域含有包含高度可变的双氨基酸基序(重复可变双残基，RVD)的高度保守的33-34个氨基酸的序列。RVD基序决定了对核酸序列的结合特异性，并且可以根据本领域技术人员已知的方法进行工程化以特异性结合所期望的DNA序列(参见例如，Miller,Jeffrey；et.al.(February 2011).“A TALE nuclease architecture for efficientgenome editing”.Nature Biotechnology 29(2):143–8；Zhang,Feng；et.al.(February2011).“Efficient construction of sequence-specific TAL effectors formodulating mammalian transcription”Nature Biotechnology 29(2):149–53；Geiβler,R.；Scholze,H.；Hahn,S.；Streubel,J.；Bonas,U.；Behrens,S.E.；Boch,J.(2011),Shiu,Shin-Han.ed.“Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity”.PLoS ONE 6(5):e19509；Boch,Jens(February 2011).“TALEs of genometargeting”.Nature Biotechnology 29(2):135–6；Boch,Jens；et.al.(December 2009).“Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors”.Science 326(5959):1509–12；和Moscou,Matthew J.；Adam J.Bogdanove(December2009).“A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors”Science 326(5959):1501；其每篇的全部内容通过引用并入本文)。氨基酸序列和DNA识别之间的简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来工程化改造特定的DNA结合域。

如本文所用，术语“转录激活物样元件核酸酶”(TALEN)是指包含转录激活物样效应物DNA结合域至DNA切割域，例如FokI域的人工核酸酶。已经报告了许多用于产生工程化TALE构建体的模块化组装方案(参见例如，Zhang,Feng；et.al.(February 2011).“Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulatingmammalian transcription”.Nature Biotechnology 29(2):149–53；Geiβler,R.；Scholze,H.；Hahn,S.；Streubel,J.；Bonas,U.；Behrens,S.E.；Boch,J.(2011),Shiu,Shin-Han.ed.“Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity”.PLoS ONE 6(5):e19509；Cermak,T.；Doyle,E.L.；Christian,M.；Wang,L.；Zhang,Y.；Schmidt,C.；Baller,J.A.；Somia,N.V.et al.(2011).“Efficient design andassembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNAtargeting”.Nucleic Acids Research；Morbitzer,R.；Elsaesser,J.；Hausner,J.；Lahaye,T.(2011).“Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modularcloning”.Nucleic Acids Research；Li,T.；Huang,S.；Zhao,X.；Wright,D.A.；Carpenter,S.；Spalding,M.H.；Weeks,D.P.；Yang,B.(2011).“Modularly assembled designer TALeffector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement ineukaryotes”.Nucleic Acids Research.；Weber,E.；Gruetzner,R.；Werner,S.；Engler,C.；Marillonnet,S.(2011).Bendahmane,Mohammed.ed.“Assembly of Designer TALEffectors by Golden Gate Cloning”.PLoS ONE 6(5):e19722；其每篇的全部内容通过引用并入本文)。

术语“治疗/处理”是指如本文所述旨在逆转、缓解疾病或病症或其一种或多种症状、延迟疾病或病症或其一种或多种症状的发作或抑制疾病或病症或其一种或多种症状进展的临床干预。如本文所用，术语“治疗/处理”是指如本文所述旨在逆转、缓解疾病或病症或其一种或多种症状、延迟疾病或病症或其一种或多种症状的发作或抑制疾病或病症或其一种或多种症状进展的临床干预。在一些实施方案中，可以在一种或多种症状已经得以形成之后和/或疾病已经得到诊断之后施用治疗。在其他实施方案中，可以在没有症状的情况下施用治疗，例如用于预防或延迟症状的发作或抑制疾病的发作或进展。例如，可以在症状发作之前(例如，鉴于症状的历史和/或鉴于遗传或其他易感性因素)施用治疗于易感个体。治疗也可以在症状消退后继续进行，例如以预防或延迟其复发。

术语“载体”是指包含一种或多种本发明的重组多核苷酸的多核苷酸，例如编码本文提供的Cas9蛋白(或其融合物)和/或gRNA的那些。载体包括但不限于质粒、病毒载体、粘粒、人工染色体和噬菌粒。载体可以能够在宿主细胞中复制，并且可以进一步通过一个或多个内切核酸酶限制性位点来表征，在该位点处可以切割载体并且可以在其中插入所期望的核酸序列。载体可以含有一种或多种适用于鉴定和/或选择已经用或尚未用载体转化或用载体进行基因组修饰的细胞的标志物序列。标志物包括例如编码增加或降低对抗生素(例如，卡那霉素、氨苄青霉素)或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码其活性可通过本领域已知的标准测定法检测的酶(例如，β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或萤光素酶)的基因，以及可见地影响转化或转染细胞、宿主、菌落或噬斑的表型的基因。适用于转化本发明所囊括的宿主细胞(例如大肠杆菌、哺乳动物细胞如CHO细胞、昆虫细胞等)的任何载体，例如属于pUC系列、pGEM系列、pET系列、pBAD系列、pTET系列或pGEX系列的载体。在一些实施方案中，载体适合于转化宿主细胞用于重组蛋白质生产。用于选择和工程化用于表达蛋白质(例如，本文提供的蛋白质)的载体和宿主细胞、转化细胞和表达/纯化重组蛋白质的方法是本领域熟知的，并且由例如Green and Sambrook,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(4^th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012))提供。

如本文所用，术语“锌指”是指以折叠和一个或多个稳定化折叠的锌离子的配位为特征的小核酸结合蛋白结构基序。锌指涵盖极其多种不同的蛋白质结构(参见例如Klug A,Rhodes D(1987).“Zinc fingers:a novel protein fold for nucleic acidrecognition”.Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.52:473–82，其全部内容通过引用并入本文)。可以设计锌指以结合核苷酸的特定序列，并且可以设计包含一系列锌指的融合物的锌指阵列以结合实际上任何所期望的靶序列。此类锌指阵列可以形成蛋白质(例如核酸酶)的结合域，例如，在与核酸切割域缀合的情况下。不同类型的锌指基序是本领域技术人员已知的，包括但不限于Cys₂His₂、Gag knuckle、Treble clef、锌带(Zinc ribbon)、Zn₂/Cys₆和TAZ2域样基序(参见例如Krishna SS,Majumdar I,Grishin NV(January 2003).“Structural classification of zinc fingers:survey and summary”.Nucleic AcidsRes.31(2):532–50)。通常，单一锌指基序结合核酸分子的3或4个核苷酸。因此，包含2个锌指基序的锌指域可以结合6-8个核苷酸，包含3个锌指基序的锌指域可以结合9-12个核苷酸，包含4个锌指基序的锌指域可以结合12-16个核苷酸，等等。可以采用任何合适的蛋白质工程化技术来改变锌指的DNA结合特异性和/或设计新的锌指融合物以结合长度为3至30个核苷酸的实际任何所期望的靶序列(参见例如Pabo CO,Peisach E,Grant RA(2001).“Design and selection of novel cys2His2Zinc finger proteins”.Annual Review ofBiochemistry 70:313–340；Jamieson AC,Miller JC,Pabo CO(2003).“Drug discoverywith engineered zinc-finger proteins”.Nature Reviews Drug Discovery 2(5):361–368；和Liu Q,Segal DJ,Ghiara JB,Barbas CF(May 1997).“Design of polydactylzinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes”.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(11)；其每篇的全部内容通过引用并入本文)。工程化锌指阵列和切割核酸的蛋白域之间的融合可以用于产生“锌指核酸酶”。锌指核酸酶通常包含结合核酸分子内特定靶位点的锌指域和切割由结合域结合的靶位点内或附近的核酸分子的核酸切割域。典型的工程化锌指核酸酶包含具有3和6个之间的个别锌指基序的结合域和长度范围为9个碱基对至18个碱基对的结合靶位点。在期望结合和切割给定基因组中独特的靶位点的情况下，较长的靶位点特别有吸引力。

如本文所用，术语“锌指核酸酶”是指包含与包含锌指阵列的结合域缀合的核酸切割域的核酸酶。在一些实施方案中，切割域是II型限制性内切核酸酶FokI的切割域。可以设计锌指核酸酶以靶向给定核酸分子中的实际任何所期望的序列用于切割，并且设计锌指结合域以在复杂基因组的背景下结合独特位点的可能性允许活细胞中靶向切割单个基因组位点，例如，以实现治疗价值的靶向基因组改变。由于非同源DNA修复途径的易错特性，将双链断裂靶向到期望的基因组基因座可以用于将移码突变引入基因的编码序列中。可以通过本领域技术人员熟知的方法产生锌指核酸酶以靶向感兴趣的位点。例如，可以通过组合已知特异性的个别锌指基序来设计具有所期望的特异性的锌指结合域。与DNA结合的锌指蛋白Zif268的结构已经为该领域的大量工作提供了信息，并且已经描述了为64个可能的碱基对三联体中的每一个获得锌指，然后混合和匹配这些模块化锌指以设计具有任何所期望的序列特异性的蛋白质的构思(Pavletich NP,Pabo CO(May 1991).“Zinc finger-DNArecognition:crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1A”.Science 252(5007):809–17，其全部内容并入本文)。在一些实施方案中，将各自识别3碱基对DNA序列的单独的锌指组合以产生3-、4-、5-或6-指阵列，其识别长度范围为9个碱基对至18个碱基对的靶位点。在一些实施方案中，考虑了更长的阵列。在其他实施方案中，组合识别6-8个核苷酸的2指模块以产生4-、6-或8-锌指阵列。在一些实施方案中，采用细菌或噬菌体展示来开发识别所期望的核酸序列的锌指域，例如，长度为3-30bp的所期望的核酸酶靶位点。在一些实施方案中，锌指核酸酶包含经由接头(例如多肽接头)彼此融合或以其他方式彼此缀合的锌指结合域和切割域。接头的长度决定了切口与由锌指域结合的核酸序列的距离。若使用较短的接头，则切割域将使核酸切割得更接近结合的核酸序列，而较长的接头将导致切口和结合的核酸序列之间更大的距离。在一些实施方案中，锌指核酸酶的切割域必须二聚化以切割结合的核酸。在一些此类实施方案中，二聚体是两个单体的异源二聚体，每个单体包含不同的锌指结合域。例如，在一些实施方案中，二聚体可以包含一个包含与FokI切割域缀合的锌指域A的单体，和一个包含与FokI切割域缀合的锌指域B的单体。在该非限制性实例中，锌指域A结合靶位点的一侧上的核酸序列，锌指域B结合靶位点的另一侧上的核酸序列，并且二聚化FokI域切割锌指域结合位点之间的核酸。

发明详述

从以下实施例将更全面地理解本发明的这些和其他实施方案的功能和优点。以下实施例旨在说明本发明的益处并描述特定实施方案，但并不旨在举例说明本发明的全部范围。因此，应当理解，实施例不意味着限制本发明的范围。

引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白

本文描述的融合蛋白和方法可以使用任何可编程的DNA结合域。

在一些实施方案中，可编程DNA结合蛋白域包含锌指核酸酶(ZFN)或转录激活物样效应域(TALE)的DNA结合域。在一些实施方案中，可编程DNA结合蛋白域可以由引导核苷酸序列编程，并因此称为“引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域”。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是核酸酶无活性的Cas9，或dCas9。如本文所用，dCas9涵盖Cas9，其在其核酸酶活性中完全无活性，或在其核酸酶活性中部分无活性(例如，Cas9切口酶)。因此，在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是Cas9切口酶。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是核酸酶无活性的Cpf1。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是核酸酶无活性的Argonaute。

在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是dCas9域。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是Cas9切口酶。在一些实施方案中，dCas9域包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，dCas9域包含与本文提供的Cas9域的任一个至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列，并且包含对应于SEQ ID NO:1中D10X(X是除D以外的任何氨基酸)和/或H840X(X是除H以外的任何氨基酸)的突变。在一些实施方案中，dCas9域包含与本文提供的Cas9域的任一个至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列，并且包含对应于SEQ IDNO:1中D10A和/或H840A的突变。在一些实施方案中，Cas9切口酶包含与本文提供的Cas9域的任一个至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列，并且包含对应于SEQ ID NO:1中D10X(X是除以外的任何氨基酸D)的突变和对应于SEQ ID NO:1中位置840的位置处的组氨酸。在一些实施方案中，Cas9切口酶包含与本文提供的Cas9域的任一个至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同，并且包含对应于SEQ ID NO:1中D10A的突变和对应于SEQ ID NO:1中位置840的位置处的组氨酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了dCas9或Cas9切口酶的变体或同源物(例如，分别是SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的变体)，其分别与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％相同，并且包含对应于SEQ ID NO:1中D10A和/或H840A的突变。在一些实施方案中，提供了Cas9的变体(例如，SEQ ID NO:2的变体)，其具有比SEQ ID NO:2短或长约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸或更多个的氨基酸序列，条件是dCas9变体包含对应于SEQ ID NO:1中的D10A和/或H840A的突变。在一些实施方案中，提供了Cas9切口酶的变体(例如，SEQ ID NO:3的变体)，其具有比SEQ ID NO:3短或长约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸或更多个的氨基酸序列，条件是dCas9变体包含对应于D10A的突变并且包含对应于SEQ ID NO:1中位置840的位置处的组氨酸。

基于本公开和本领域的知识，另外的合适的核酸酶无活性的dCas9域对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且在本公开的范围内。此类另外的示例性合适的核酸酶无活性的Cas9域包括但不限于SEQ ID NO:1中的D10A/H840A、D10A/D839A/H840A、D10A/D839A/H840A/N863A突变体域(参见例如，Prashant et al.,Nature Biotechnology.2013；31(9):833-838，其通过引用并入本文)，或K603R(参见例如，Chavez et al.,NatureMethods 12,326–328,2015，其通过引用并入本文)。

在一些实施方案中，本文所述的核碱基编辑器包含与野生型Cas9域相比，具有降低的Cas9域与DNA的糖-磷酸主链之间的静电相互作用的Cas9域。在一些实施方案中，Cas9域包含降低Cas9域与DNA的糖-磷酸主链之间的缔合的一个或多个突变。在一些实施方案中，本文所述的核碱基编辑器包含dCas9(例如，具有SEQ ID NO:1中D10A和H840A突变)或Cas9切口酶(例如，具有SEQ ID NO:1中D10A突变)，其中dCas9或Cas9切口酶进一步包含SEQID NO:10中提供的氨基酸序列的N497X、R661X、Q695X和/或Q926X突变，或SEQ ID NO:11-260中提供的任何氨基酸序列中相应的突变的一个或多个，其中X是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的核碱基编辑器包含dCas9(例如，具有SEQ ID NO:1中D10A和H840A突变)或Cas9切口酶(例如，具有SEQ ID NO:1中D10A突变)，其中dCas9或Cas9切口酶进一步包含SEQ ID NO:10中提供的氨基酸序列的N497A、R661A、Q695A和/或Q926A突变，或SEQ IDNO:11-260中提供的任何氨基酸序列中相应的突变的一个或多个。在一些实施方案中，Cas9域(例如本文提供的任何核碱基编辑器的Cas9域)包含如SEQ ID NO:720中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，核碱基编辑器包含如SEQ ID NO:721中所示的氨基酸序列。具有高保真度的Cas9域在本领域中是已知的，并且对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如，具有高保真度的Cas9域已经描述于Kleinstiver,B.P.,et al.“High-fidelity CRISPR-Cas9nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.”Nature 529,490-495(2016)；和Slaymaker,I.M.,et al.“Rationally engineered Cas9nucleaseswith improved specificity.”Science 351,84-88(2015)中；其每一个的全部内容通过引用并入本文。

具有降低的Cas9与DNA主链之间的静电相互作用的Cas9变体DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTAFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGALSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMALIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRAITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:720)

高保真度核碱基编辑器

MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTAFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGALSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMALIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRAITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:721)

Cas9蛋白识别靶DNA序列内的短基序(PAM基序)，其是Cas9-DNA相互作用所需要的，但不是由与引导RNA核苷酸序列的互补性确定的。如本文所用，“PAM基序”或“前间隔区相邻基序”是指直接在与引导RNA寡核苷酸序列互补的DNA序列后5'-或3'-的DNA序列。若其随后没有合适的PAM序列，Cas9将不会成功结合、切割或切口靶DNA序列。不希望受任何特定理论的束缚，Cas9酶中的特定氨基酸残基负责与PAM的碱基相互作用并确定PAM特异性。因此，这些残基或附近残基的变化导致不同或放松的PAM特异性。改变或放松PAM特异性可以转变Cas9可以结合的位置，如基于本公开对于本领域技术人员显而易见的。

野生型酿脓链球菌Cas9识别规范PAM序列(5'-NGG-3')。其他Cas9核酸酶(例如来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)或齿垢密螺旋体(Treponema denticolaor)的Cas9)及其Cas9变体已在本领域中描述为具有不同的或更放松的PAM需求。例如，在Kleinstiver et al.,Nature 523,481–485,2015；Klenstiver et al.,Nature 529,490–495,2016；Ran et al.,Nature,Apr 9；520(7546):186–191,2015；Kleinstiver et al.,Nat Biotechnol,33(12):1293-1298,2015；Hou et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,110(39):15644-9,2014；Prykhozhij et al.,PLoS One,10(3):e0119372,2015；Zetsche et al.,Cell 163,759–771,2015；Gao et al.,Nature Biotechnology,doi:10.1038/nbt.3547,2016；Want etal.,Nature 461,754–761,2009；Chavez et al.,doi:dx.doi dot org/10.1101/058974；Fagerlund et al.,Genome Biol.2015；16:25,2015；Zetsche et al.,Cell,163,759–771,2015；和Swarts et al.,Nat Struct Mol Biol,21(9):743-53,2014中，其每一个通过引用并入本文。

因此，本公开的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白可以识别多种PAM序列，包括但不限于在由引导RNA确定的DNA序列的3'或5'末端上的PAM序列。例如，序列可以是：NGG、NGAN(SEQ ID NO:741)、NGNG(SEQ ID NO:742)、NGAG(SEQ ID NO:743)、NGCG(SEQ ID NO:744)、NNGRRT(SEQ ID NO:745)、NGRRN(SEQ ID NO:746)、NNNRRT(SEQ ID NO:747)、NNNGATT(SEQ ID NO:748)、NNAGAAW(SEQ ID NO:749)、NAAAC(SEQ ID NO:750)、TTN、TTTN(SEQ IDNO:751)和YTN，其中Y是嘧啶，R是嘌呤，并且N是任何核碱基。

本公开的一些方面提供了RNA-可编程DNA结合蛋白，其可以用于将蛋白质(例如碱基编辑器)引导至特定核酸(例如DNA或RNA)序列。核酸可编程DNA结合蛋白包括但不限于Cas9(例如dCas9和nCas9)、CasX、CasY、Cpf1、C2c1、C2c2、C2C3和Argonaute。具有不同的PAM特异性的RNA-可编程DNA结合蛋白的一个实例是来自普雷沃氏菌(Prevotella)和弗朗西斯菌(Francisella)1(Cpf1)的聚簇规则间隔短回文重复。与Cas9类似，Cpf1也是2类CRISPR效应物。已经显示，Cpf1介导了强大的DNA干扰，其具有与Cas9不同的特征。Cpf1是缺乏tracrRNA的单个RNA引导的内切核酸酶，并且它可以利用富含T的前间隔区相邻基序(例如TTN、TTTN(SEQ ID NO:751)或YTN)，其在由引导RNA确定的DNA序列的5’端上。此外，Cpf1经由交错的DNA双链断裂切割DNA。在16种Cpf1家族蛋白中，来自氨基酸球菌(Acidaminococcus)和毛螺菌(Lachnospiraceae)的两种酶显示在人细胞中具有有效的基因组编辑活性。Cpf1蛋白是本领域已知的并且先前已有描述，例如Yamano et al.,“Crystal structure of Cpf1in complex with guide RNA and target DNA.”Cell(165)2016,p.949-962；其全部内容在此通过引用并入。

在本组合物和方法中也有用的是核酸酶无活性的Cpf1(dCpf1)变体，其可以用作引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域。Cpf1蛋白具有RuvC样内切核酸酶域，其类似于Cas9的RuvC域，但不具有HNH内切核酸酶域，并且Cpf1的N端不具有Cas9的alfa螺旋识别叶(lobe)。它在Zetsche et al.,Cell,163,759–771,2015(其通过引用并入本文)中显示，Cpf1的RuvC样域负责切割两条DNA链并且RuvC样域的失活使Cpf1核酸酶活性失活。例如，对应于新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)Cpf1(SEQ ID NO:714)中的D917A、E1006A或D1255A的突变使Cpf1核酸酶活性失活。在一些实施方案中，本公开的dCpf1包含对应于SEQ ID NO:714中D917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A或D917A/E1006A/D1255A的突变。在其他实施方案中，本公开的Cpf1切口酶可以包含对应于SEQ ID NO:714中D917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A或D917A/E1006A/D1255A的突变。有用于本公开的实施方案的Cpf1切口酶可以包含其他突变和/或本领域已知的其他突变。应当理解，可以根据本公开使用使Cpf1的RuvC域完全或部分失活的任何突变，例如取代突变、缺失或插入，以及Cpf1的这些突变可以产生例如dCpf1或Cpf1切口酶。

因此，在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是核酸酶无活性的Cpf1(dCpf1)。在一些实施方案中，dCpf1包含SEQ ID NO:714-717的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，dCpf1包含与SEQ ID NO:714-717的任一个至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列，并且包含对应于SEQ ID NO:714中D917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A或D917A/E1006A/D1255A的突变。根据本公开，来自其他细菌物种的Cpf1也可以用作dCpf1或Cpf1切口酶。

野生型新凶手弗朗西斯菌Cpf1(SEQ ID NO:714)(D917、E1006和D1255是粗体且加下划线的)

新凶手弗朗西斯菌Cpf1 D917A(SEQ ID NO:715)

新凶手弗朗西斯菌Cpf1 E1006A(SEQ ID NO:716)

新凶手弗朗西斯菌Cpf1 D1255A(SEQ ID NO:717)

除了Cas9和Cpf1之外，Shmakov et al.,“Discovery and FunctionalCharacterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems”,Mol.Cell,2015 Nov 5；60(3):385–397已经描述了三种不同的2类CRISPR-Cas系统(C2c1、C2c2和C2c3)，其全部内容在此通过引用并入。两个系统(C2c1和C2c3)的效应物含有与Cpf1相关的RuvC样内切核酸酶域。第三个系统，C2c2含有具有两个预测的HEPN RNA酶域的效应物。与C2c1产生CRISPRRNA不同，成熟CRISPR RNA的产生是不依赖tracrRNA的。C2c1依赖于CRISPR RNA和tracrRNA两者用于DNA切割。已显示细菌性C2c2对于CRISPR RNA成熟具有独特的RNA酶活性，不同于其RNA激活的单链RNA降解活性。这些RNA酶功能彼此不同，并且与Cpf1的CRISPR RNA加工行为不同。参见例如，East-Seletsky,et al.,“Two distinct RNase activities ofCRISPR-C2c2enable guide-RNA processing and RNA detection”,Nature,2016Oct 13；538(7624):270-273，其全部内容在此通过引用并入。Leptotrichia shahii中C2c2的体外生化分析已显示，C2c2由单个CRISPR RNA引导，并且可以编程以切割携带互补前间隔区的ssRNA靶标。两个保守的HEPN域中的催化残基介导切割。催化残基中的突变产生催化无活性的RNA结合蛋白。参见例如Abudayyeh et al.,“C2c2is a single-componentprogrammable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector”,Science,2016Aug5；353(6299)，其全部内容在此通过引用并入。

已经报告了与嵌合单分子引导RNA(sgRNA)复合的酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobaccillus acidoterrastris)C2c1(AacC2c1)的晶体结构。参见例如，Liu etal.,“C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism”,Mol.Cell,2017Jan 19；65(2):310-322，其全部内容在此通过引用并入。还已经报告了在与靶DNA结合的酸土脂环酸芽孢杆菌C2c1中作为三元复合物的晶体结构。参见例如，Yang etal.,“PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1CRISPR-Casendonuclease”,Cell,2016Dec 15；167(7):1814-1828，其全部内容在此通过引用并入。具有靶DNA链和非靶DNA链两者的AacC2c1的催化能力构象已被独立地捕获定位在单个RuvC催化袋内，其中C2c1介导的切割导致靶DNA的交错的七核苷酸断裂。C2c1三元复合物与先前鉴定的Cas9和Cpf1对应物之间的结构比较证明了CRISPR-Cas9系统使用的机制的多样性。

在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白可以是C2c1、C2c2或C2c3蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是C2c1蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是C2c2蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是C2c3蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白包含与天然存在的C2c1、C2c2或C2c3蛋白至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白是天然存在的C2c1、C2c2或C2c3蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白包含本文所述的任何C2c1、C2c2或C2c3蛋白至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白包含本文所述的C2c1、C2c2或C2c3蛋白的任一个的氨基酸序列。应当理解，根据本公开也可以使用来自其他细菌物种的C2c1、C2c2或C2c3。

C2c1(uniprot.org/uniprot/T0D7A2#)

sp|T0D7A2|C2C1_ALIAG CRISPR相关的内切核酸酶C2c1OS＝酸土脂环酸芽孢杆菌(菌株ATCC 49025/DSM 3922/CIP 106132/NCIMB 13137/GD3B)GN＝c2c1PE＝1SV＝1

MAVKSIKVKLRLDDMPEIRAGLWKLHKEVNAGVRYYTEWLSLLRQENLYRRSPNGDGEQECDKTAEECKAELLERLRARQVENGHRGPAGSDDELLQLARQLYELLVPQAIGAKGDAQQIARKFLSPLADKDAVGGLGIAKAGNKPRWVRMREAGEPGWEEEKEKAETRKSADRTADVLRALADFGLKPLMRVYTDSEMSSVEWKPLRKGQAVRTWDRDMFQQAIERMMSWESWNQRVGQEYAKLVEQKNRFEQKNFVGQEHLVHLVNQLQQDMKEASPGLESKEQTAHYVTGRALRGSDKVFEKWGKLAPDAPFDLYDAEIKNVQRRNTRRFGSHDLFAKLAEPEYQALWREDASFLTRYAVYNSILRKLNHAKMFATFTLPDATAHPIWTRFDKLGGNLHQYTFLFNEFGERRHAIRFHKLLKVENGVAREVDDVTVPISMSEQLDNLLPRDPNEPIALYFRDYGAEQHFTGEFGGAKIQCRRDQLAHMHRRRGARDVYLNVSVRVQSQSEARGERRPPYAAVFRLVGDNHRAFVHFDKLSDYLAEHPDDGKLGSEGLLSGLRVMSVDLGLRTSASISVFRVARKDELKPNSKGRVPFFFPIKGNDNLVAVHERSQLLKLPGETESKDLRAIREERQRTLRQLRTQLAYLRLLVRCGSEDVGRRERSWAKLIEQPVDAANHMTPDWREAFENELQKLKSLHGICSDKEWMDAVYESVRRVWRHMGKQVRDWRKDVRSGERPKIRGYAKDVVGGNSIEQIEYLERQYKFLKSWSFFGKVSGQVIRAEKGSRFAITLREHIDHAKEDRLKKLADRIIMEALGYVYALDERGKGKWVAKYPPCQLILLEELSEYQFNNDRPPSENNQLMQWSHRGVFQELINQAQVHDLLVGTMYAAFSSRFDARTGAPGIRCRRVPARCTQEHNPEPFPWWLNKFVVEHTLDACPLRADDLIPTGEGEIFVSPFSAEEGDFHQIHADLNAAQNLQQRLWSDFDISQIRLRCDWGEVDGELVLIPRLTGKRTADSYSNKVFYTNTGVTYYERERGKKRRKVFAQEKLSEEEAELLVEADEAREKSVVLMRDPSGIINRGNWTRQKEFWSMVNQRIEGYLVKQIRSRVPLQDSACENTGDI(SEQID NO:762)

C2c2(uniprot.org/uniprot/P0DOC6)

>sp|P0DOC6|C2C2_LEPSD CRISPR相关的内切核糖核酸酶C2c2OS＝Leptotrichiashahii(菌株DSM 19757/CCUG 47503/CIP 107916/JCM 16776/LB37)GN＝c2c2PE＝1SV＝1

MGNLFGHKRWYEVRDKKDFKIKRKVKVKRNYDGNKYILNINENNNKEKIDNNKFIRKYINYKKNDNILKEFTRKFHAGNILFKLKGKEGIIRIENNDDFLETEEVVLYIEAYGKSEKLKALGITKKKIIDEAIRQGITKDDKKIEIKRQENEEEIEIDIRDEYTNKTLNDCSIILRIIENDELETKKSIYEIFKNINMSLYKIIEKIIENETEKVFENRYYEEHLREKLLKDDKIDVILTNFMEIREKIKSNLEILGFVKFYLNVGGDKKKSKNKKMLVEKILNINVDLTVEDIADFVIKELEFWNITKRIEKVKKVNNEFLEKRRNRTYIKSYVLLDKHEKFKIERENKKDKIVKFFVENIKNNSIKEKIEKILAEFKIDELIKKLEKELKKGNCDTEIFGIFKKHYKVNFDSKKFSKKSDEEKELYKIIYRYLKGRIEKILVNEQKVRLKKMEKIEIEKILNESILSEKILKRVKQYTLEHIMYLGKLRHNDIDMTTVNTDDFSRLHAKEELDLELITFFASTNMELNKIFSRENINNDENIDFFGGDREKNYVLDKKILNSKIKIIRDLDFIDNKNNITNNFIRKFTKIGTNERNRILHAISKERDLQGTQDDYNKVINIIQNLKISDEEVSKALNLDVVFKDKKNIITKINDIKISEENNNDIKYLPSFSKVLPEILNLYRNNPKNEPFDTIETEKIVLNALIYVNKELYKKLILEDDLEENESKNIFLQELKKTLGNIDEIDENIIENYYKNAQISASKGNNKAIKKYQKKVIECYIGYLRKNYEELFDFSDFKMNIQEIKKQIKDINDNKTYERITVKTSDKTIVINDDFEYIISIFALLNSNAVINKIRNRFFATSVWLNTSEYQNIIDILDEIMQLNTLRNECITENWNLNLEEFIQKMKEIEKDFDDFKIQTKKEIFNNYYEDIKNNILTEFKDDINGCDVLEKKLEKIVIFDDETKFEIDKKSNILQDEQRKLSNINKKDLKKKVDQYIKDKDQEIKSKILCRIIFNSDFLKKYKKEIDNLIEDMESENENKFQEIYYPKERKNELYIYKKNLFLNIGNPNFDKIYGLISNDIKMADAKFLFNIDGKNIRKNKISEIDAILKNLNDKLNGYSKEYKEKYIKKLKENDDFFAKNIQNKNYKSFEKDYNRVSEYKKIRDLVEFNYLNKIESYLIDINWKLAIQMARFERDMHYIVNGLRELGIIKLSGYNTGISRAYPKRNGSDGFYTTTAYYKFFDEESYKKFEKICYGFGIDLSENSEINKPENESIRNYISHFYIVRNPFADYSIAEQIDRVSNLLSYSTRYNNSTYASVFEVFKKDVNLDYDELKKKFKLIGNNDILERLMKPKKVSVLELESYNSDYIKNLIIELLTKIENTNDTL(SEQ ID NO:764)

在一些实施方案中，本公开的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白对PAM序列没有需求。此类引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白的一个实例可以是来自格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute蛋白(NgAgo)。NgAgo是ssDNA引导的内切核酸酶。NgAgo结合约24个核苷酸的5′磷酸化ssDNA(gDNA)，以将其引导至其靶位点，并将在gDNA位点处产生DNA双链断裂。与Cas9相比，NgAgo-gDNA系统不需要前间隔区相邻基序(PAM)。使用核酸酶无活性的NgAgo(dNgAgo)可以极大地扩展可以靶向的密码子。NgAgo的表征和使用已经描述于Gao et al.,Nat Biotechnol.,2016Jul；34(7):768-73.PubMed PMID:27136078；Swarts et al.,Nature.507(7491)(2014):258-61；和Swarts et al.,NucleicAcids Res.43(10)(2015):5120-9，其每一个通过引用并入本文。格氏嗜盐碱杆菌Argonaute的序列提供于SEQ ID NO:718中。

野生型格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(SEQ ID NO:718)

MTVIDLDSTTTADELTSGHTYDISVTLTGVYDNTDEQHPRMSLAFEQDNGERRYITLWKNTTPKDVFTYDYATGSTYIFTNIDYEVKDGYENLTATYQTTVENATAQEVGTTDEDETFAGGEPLDHHLDDALNETPDDAETESDSGHVMTSFASRDQLPEWTLHTYTLTATDGAKTDTEYARRTLAYTVRQELYTDHDAAPVATDGLMLLTPEPLGETPLDLDCGVRVEADETRTLDYTTAKDRLLARELVEEGLKRSLWDDYLVRGIDEVLSKEPVLTCDEFDLHERYDLSVEVGHSGRAYLHINFRHRFVPKLTLADIDDDNIYPGLRVKTTYRPRRGHIVWGLRDECATDSLNTLGNQSVVAYHRNNQTPINTDLLDAIEAADRRVVETRRQGHGDDAVSFPQELLAVEPNTHQIKQFASDGFHQQARSKTRLSASRCSEKAQAFAERLDPVRLNGSTVEFSSEFFTGNNEQQLRLLYENGESVLTFRDGARGAHPDETFSKGIVNPPESFEVAVVLPEQQADTCKAQWDTMADLLNQAGAPPTRSETVQYDAFSSPESISLNVAGAIDPSEVDAAFVVLPPDQEGFADLASPTETYDELKKALANMGIYSQMAYFDRFRDAKIFYTRNVALGLLAAAGGVAFTTEHAMPGDADMFIGIDVSRSYPEDGASGQINIAATATAVYKDGTILGHSSTRPQLGEKLQSTDVRDIMKNAILGYQQVTGESPTHIVIHRDGFMNEDLDPATEFLNEQGVEYDIVEIRKQPQTRLLAVSDVQYDTPVKSIAAINQNEPRATVATFGAPEYLATRDGGGLPRPIQIERVAGETDIETLTRQVYLLSQSHIQVHNSTARLPITTAYADQASTHATKGYLVQTGAFESNVGFL

本文还提供了具有放松的PAM需求的Cas9变体(无PAM的Cas9)。与如SEQ ID NO:1提供的酿脓链球菌Cas9相比，无PAM的Cas9对靶序列表现出增加的活性，所述靶序列在其3'端处不包括规范的PAM(例如，NGG)序列，例如活性增加至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1,000倍、至少5,000倍、至少10,000倍、至少50,000倍、至少100,000倍、至少500,000倍或至少1,000,000倍。此类具有放松的PAM需求的Cas9变体描述于2015年10月23日提交的美国临时申请，USSN 62/245,828；2016年1月15日提交的62/279,346；2016年3月22日提交的62/311,763；2016年4月13日提交的62/322,178；和2016年6月30日提交的62/357,332，其每一个通过引用并入本文。在一些实施方案中，可用于本公开的dCas9或Cas9切口酶可以进一步包含放松PAM需求的突变，例如，对应于SEQ ID NO:1中A262T、K294R、S409I、E480K、E543D、M694I或E1219V的突变。

本文讨论的一般结构中使用的“-”可以表示存在任选的接头。如本文所用，术语“接头”是指连接两个分子或部分，例如融合蛋白的两个域，诸如例如引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域和重组酶催化域的化学基团或分子。通常，接头位于两个基团、分子或其他部分之间或侧翼有两个基团、分子或其他部分，并且经由共价键与每一个连接，从而连接两者。在一些实施方案中，接头是一个氨基酸或多个氨基酸(例如肽或蛋白质)。在一些实施方案中，接头是有机分子、基团、聚合物或化学部分。在一些实施方案中，接头的长度为5-100个氨基酸，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150或150-200个氨基酸。也考虑了更长或更短的接头。接头可以是本领域已知的任何形式。例如，街头可以是来自网站诸如www[dot]ibi[dot]vu[dot]nl/programs/linkerdbwww/或来自www[dot]ibi[dot]vu[dot]nl/programs/linkerdbwww/src/database.txt的接头。接头也可以是非结构化的、结构化的、螺旋形的或延伸的。

在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域和重组酶催化域经由接头彼此融合。可以采用引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域和重组酶催化域之间的各种接头长度和柔性度(例如，范围为从形式(GGGS)n(SEQ ID NO:759)、(GGGGS)n(SEQ IDNO:722)、(GGS)n和(G)n的柔性接头至形式(EAAAK)n(SEQ ID NO:723)、SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:724)的更刚性接头(参见例如Guilinger et al.,Nat.Biotechnol.2014；32(6):577-82；其全部内容通过引用并入本文)、(XP)n或任何这些的组合，其中X是任何氨基酸并且n独立地是1至30之间的整数，以便实现对于特定应用的活性的最佳长度。在一些实施方案中，n独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，或者若存在超过一个接头或超过一个接头基序，其任何组合。在一些实施方案中，接头包含(GGS)n基序，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，接头包含(GGS)n基序，其中n是1、3或7。在一些实施方案中，接头包含XTEN接头。XTEN接头可以具有序列SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:7)、SGSETPGTSESA(SEQID NO:8)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，接头包含选自下组的氨基酸序列，其包括但不限于AGVF(SEQ ID NO:772)、GFLG(SEQ ID NO:773)、FK、AL、ALAL(SEQ ID NO:774)和ALALA(SEQ ID NO:775)。在一些实施方案中，合适的接头基序和配置包括描述于Chen et al.,Fusion protein linkers:property,design andfunctionality.Adv Drug Deliv Rev.2013；65(10):1357-69(其通过引用并入本文)中的那些。在一些实施方案中，接头可以包含任何以下氨基酸序列：VPFLLEPDNINGKTC(SEQ IDNO:10)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:11)、SIVAQLSRPDPA(SEQ ID NO:12)、MKIIEQLPSA(SEQID NO:13)、VRHKLKRVGS(SEQ ID NO:14)、GHGTGSTGSGSS(SEQ ID NO:15)、MSRPDPA(SEQ IDNO:16)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:7)、SGSETPGTSESA(SEQ ID NO:8)、SGSETPGTSESATPEGGSGGS(SEQ ID NO:9)和GGSM(SEQ ID NO:17)。

基于本公开，另外的合适的接头序列对于本领域技术人员而言将是显而易见的。在某些实施方案中，接头可以具有约33埃至约81埃的长度。在另一个实施方案中，接头可以具有约54埃至约81埃的长度。在进一步的实施方案中，接头可以具有约63至约81埃的长度。在另一个实施方案中，接头可以具有约65埃至约75埃的长度。在一些实施方案中，接头可以具有约1.20kDa至约1.85kDa的重量。在某些实施方案中，接头可以具有约1.40kDa至约1.85kDa的重量。在某些实施方案中，接头可以具有约1.60kDa至约1.7kDa的重量。在一些实施方案中，接头是一个氨基酸或多个氨基酸(例如肽或蛋白质)。在一些实施方案中，接头是有机分子、基团、聚合物或化学部分。在一些实施方案中，接头是肽接头。在一些实施方案中，肽接头是具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50或更多个氨基酸的任何段的氨基酸。在某些实施方案中，肽接头为18至27个氨基酸长。在具体的实施方案中，肽接头为24个氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含三肽Gly-Gly-Ser的重复，例如包含序列(GGS)_n，其中n表示至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个重复。在一些实施方案中，接头包含序列(GGS)₆(SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，肽接头是16个残基的“XTEN”接头或其变体(参见例如，实施例；和Schellenberger et al.A recombinant polypeptide extends the in vivohalf-life of peptides and proteins in a tunable manner.Nat.Biotechnol.27,1186–1190(2009))。在一些实施方案中，XTEN接头包含序列SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:7)、SGSETPGTSESA(SEQ ID NO:8)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，肽接头选自VPFLLEPDNINGKTC(SEQ ID NO:10)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:11)、SIVAQLSRPDPA(SEQ ID NO:12)、MKIIEQLPSA(SEQ ID NO:13)、VRHKLKRVGS(SEQ ID NO:14)、GHGTGSTGSGSS(SEQ ID NO:15)、MSRPDPA(SEQ ID NO:16)；或GGSM(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，接头是非肽接头。在某些实施方案中，非肽接头包含以下的一个或多个：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸、肝素或烷基接头。在一个实施方案中，烷基接头具有式—NH—(CH₂)_s—C(O)—，其中s可以是任何整数。在进一步的实施方案中，s可以是1-20的任何整数。

重组酶催化域

用于本公开的组合物和方法的重组酶催化域可以来自任何重组酶。用于所公开的方法和组合物的合适的重组酶催化域可以获得自例如但不限于酪氨酸重组酶和丝氨酸重组酶。本文提供的一些示例性合适的重组酶包括，例如但不限于，Gin重组酶(作用于gix位点)、Hin重组酶(作用于hix位点)、β重组酶(作用于6个位点)、Sin重组酶(作用于resH位点)、Tn3重组酶(作用于res位点)、γδ重组酶(作用于res位点)、来自噬菌体P1的Cre重组酶(作用于LoxP位点)；真菌来源的FLP重组酶(作用于FTR位点)；和phiC31整合酶(作用于att位点)。示例性合适的重组酶的非限制性序列可以在下面找到。

Cre重组酶序列

MSNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGD(SEQID NO:725)

FLP重组酶

MPQFGILCKTPPKVLVRQFVERFERPSGEKIALCAAELTYLCWMITHNGTAIKRATFMSYNTIISNSLSFDIVNKSLQFKYKTQKATILEASLKKLIPAWEFTIIPYYGQKHQSDITDIVSSLQLQFESSEEADKGNSHSKKMLKALLSEGESIWEITEKILNSFEYTSRFTKTKTLYQFLFLATFINCGRFSDIKNVDPKSFKLVQNKYLGVIIQCLVTETKTSVSRHIYFFSARGRIDPLVYLDEFLRNSEPVLKRVNRTGNSSSNKQEYQLLKDNLVRSYNKALKKNAPYSIFAIKNGPKSHIGRHLMTSFLSMKGLTELTNVVGNWSDKRASAVARTTYTHQITAIPDHYFALVSRYYAYDPISKEMIALKDETNPIEEWQHIEQLKGSAEGSIRYPAWNGIISQEVLDYLSSYINRRI(SEQ ID NO:726)

γδ重组酶(Gamma Delta解离酶)

MRLFGYARVSTSQQSLDIQVRALKDAGVKANRIFTDKASGSSSDRKGLDLLRMKVEEGDVILVKKLDRLGRDTADMIQLIKEFDAQGVSIRFIDDGISTDGEMGKMVVTILSAVAQAERQRILERTNEGRQEAMAKGVVFGRKR(SEQ ID NO:727)

γδ重组酶(E124Q突变)

MRLFGYARVSTSQQSLDIQVRALKDAGVKANRIFTDKASGSSSDRKGLDLLRMKVEEGDVILVKKLDRLGRDTADMIQLIKEFDAQGVSIRFIDDGISTDGEMGKMVVTILSAVAQAERQRILQRTNEGRQEAMAKGVVFGRKR(SEQ ID NO:728)

γδ重组酶(E102Y/E124Q突变)

MRLFGYARVSTSQQSLDIQVRALKDAGVKANRIFTDKASGSSSDRKGLDLLRMKVEEGDVILVKKLDRLGRDTADMIQLIKEFDAQGVSIRFIDDGISTDGYMGKMVVTILSAVAQAERQRILQRTNEGRQEAMAKGVVFGRKR(SEQ ID NO:729)

β重组酶

MAKIGYARVSSKEQNLDRQLQALQGVSKVFSDKLSGQSVERPQLQAMLNYIREGDIVVVTELDRLGRNNKELTELMNAIQQKGATLEVLDLPSMNGIEDENLRRLINNLVIELYKYQAESERKRIKERQAQGIEIAKSKGKFKGRQH(SEQ ID NO:730)

β重组酶(N95D突变)

MAKIGYARVSSKEQNLDRQLQALQGVSKVFSDKLSGQSVERPQLQAMLNYIREGDIVVVTELDRLGRNNKELTELMNAIQQKGATLEVLDLPSMDGIEDENLRRLINNLVIELYKYQAESERKRIKERQAQGIEIAKSKGKFKGRQH(SEQ ID NO:731)

Sin重组酶

MIIGYARVSSLDQNLERQLENLKTFGAEKIFTEKQSGKSIENRPILQKALNFVRMGDRFIVESIDRLGRNYNEVIHTVNYLKDKEVQLMITSLPMMNEVIGNPLLDKFMKDLIIQILAMVSEQERNESKRRQAQGIQVAKEKGVYKGRPL(SEQ ID NO:732)

Sin重组酶(Q87R/Q115R突变)

MIIGYARVSSLDQNLERQLENLKTFGAEKIFTEKQSGKSIENRPILQKALNFVRMGDRFIVESIDRLGRNYNEVIHTVNYLKDKEVRLMITSLPMMNEVIGNPLLDKFMKDLIIRILAMVSEQERNESKRRQAQGIQVAKEKGVYKGRPL(SEQ ID NO:733)

Tn3重组酶

MRLFGYARVSTSQQSLDLQVRALKDAGVKANRIFTDKASGSSTDREGLDLLRMKVKEGDVILVKKLDRLGRDTADMLQLIKEFDAQGVAVRFIDDGISTDGDMGQMVVTILSAVAQAERRRILERTNEGRQEAKLKGIKFGRRR(SEQ ID NO:734)

Tn3重组酶(G70S/D102Y、E124Q突变)

MRLFGYARVSTSQQSLDLQVRALKDAGVKANRIFTDKASGSSTDREGLDLLRMKVKEGDVILVKKLDRLSRDTADMLQLIKEFDAQGVAVRFIDDGISTDGYMGQMVVTILSAVAQAERRRILQRTNEGRQEAKLKGIKFGRRR(SEQ ID NO:735)

Hin重组酶

MATIGYIRVSTIDQNIDLQRNALTSANCDRIFEDRISGKIANRPGLKRALKYVNKGDTLVVWKLDRLGRSVKNLVALISELHERGAHFHSLTDSIDTSSAMGRFFFHVMSALAEMERELIVERTLAGLAAARAQGRLGGRPV(SEQ ID NO:736)

Hin重组酶(H107Y突变)

MATIGYIRVSTIDQNIDLQRNALTSANCDRIFEDRISGKIANRPGLKRALKYVNKGDTLVVWKLDRLGRSVKNLVALISELHERGAHFHSLTDSIDTSSAMGRFFFYVMSALAEMERELIVERTLAGLAAARAQGRLGGRPV(SEQ ID NO:737)

PhiC31重组酶

MDTYAGAYDRQSRERENSSAASPATQRSANEDKAADLQREVERDGGRFRFVGHFSEAPGTSAFGTAERPEFERILNECRAGRLNMIIVYDVSRFSRLKVMDAIPIVSELLALGVTIVSTQEGVFRQGNVMDLIHLIMRLDASHKESSLKSAKILDTKNLQRELGGYVGGKAPYGFELVSETKEITRNGRMVNVVINKLAHSTTPLTGPFEFEPDVIRWWWREIKTHKHLPFKPGSQAAIHPGSITGLCKRMDADAVPTRGETIGKKTASSAWDPATVMRILRDPRIAGFAAEVIYKKKPDGTPTTKIEGYRIQRDPITLRPVELDCGPIIEPAEWYELQAWLDGRGRGKGLSRGQAILSAMDKLYCECGAVMTSKRGEESIKDSYRCRRRKVVDPSAPGQHEGTCNVSMAALDKFVAERIFNKIRHAEGDEETLALLWEAARRFGKLTEAPEKSGERANLVAERADALNALEELYEDRAAGAYDGPVGRKHFRKQQAALTLRQQGAEERLAELEAAEAPKLPLDQWFPEDADADPTGPKSWWGRASVDDKRVFVGLFVDKIVVTKSTTGRGQGTPIEKRASITWAKPPTDDDEDDAQDGTEDVAATGA(SEQ ID NO:738)

与所公开的组合物和方法一起使用的重组酶还可以包括其他突变。该公开的一些方面提供了包含与本文所讨论的重组酶序列的序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列的重组酶，其中与本文所讨论的重组酶序列的序列相比，重组酶的氨基酸序列包含至少一个突变。在一些实施方案中，与本文所讨论的重组酶序列的序列相比，重组酶的氨基酸序列包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个突变。

例如，γδ重组酶可以包含来自列表的一个或多个突变：R2A、E56K、G101S、E102Y、M103I或E124Q。在一个实施方案中，γδ重组酶可以包含E102Y突变、E124Q突变或E102Y和E124Q突变两者。在另一个实施方案中，β重组酶可以包含一个或多个突变，其包括但不限于N95D。参见例如，Sirk et al.,“Expanding the zinc-finger recombinase repertoire:directed evolution and mutational analysis of serine recombinase specificitydeterminants”Nucl Acids Res(2014)42(7):4755-4766。在另一个实施方案中，Sin重组酶可以具有一个或多个突变，其包括但不限于：Q87R、Q115R或Q87R和Q115R。在另一个实施方案中，Tn3重组酶可以具有一个或多个突变，其包括但不限于：G70S、D102Y、E124Q及其任何组合。在另一个实施方案中，Hin重组酶可以具有一个或多个突变，其包括但不限于：H107Y。在另一个实施方案中，Sin重组酶可以具有一个或多个突变，其包括但不限于：H107Y。与所公开的组合物和方法一起使用的任何重组酶催化域可以与天然(或野生型)氨基酸序列具有大于85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。例如，在某些实施方案中，Gin重组酶催化域与SEQ ID NO:713中所示的氨基酸序列具有大于85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。在另一个实施方案中，Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含对应于H106Y，和/或I127L，和/或I136R和/或G137F的突变。在另一个实施方案中，Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含对应于H106Y、I127L、I136R和G137F的突变。在进一步的实施方案中，Gin重组酶的氨基酸序列已得以进一步突变。在具体的实施方案中，Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:713。

用于本公开的组合物和方法的重组酶催化域可以来自演化的重组酶。如本文所用，术语“演化的重组酶”是指已经改变(例如，通过突变)以识别非天然DNA靶序列的重组酶。

可以演化的合适的重组酶包括例如但不限于酪氨酸重组酶和丝氨酸重组酶(例如，本文讨论的任何重组酶)。可以通过本文提供的方法和策略演化的一些示例性合适的重组酶包括例如但不限于，Gin重组酶(作用于gix位点)、Hin重组酶(作用于hix位点)、β重组酶(作用于6个位点)、Sin重组酶(作用于resH位点)、Tn3重组酶(作用于res位点)、γδ重组酶(作用于res位点)、来自噬菌体P1的Cre重组酶(作用于LoxP位点)；λ噬菌体整合酶(作用于att位点)；真菌来源的FLP重组酶(作用于FTR位点)；phiC31整合酶；Dre重组酶，BxB1；和原核β-重组酶。

例如，可以改变与本公开的组合物和方法一起使用的演化的重组酶以与非规范重组酶靶序列相互作用(例如，结合和重组)。作为非限制性实例，非规范重组酶靶序列可以是天然存在的，诸如例如哺乳动物基因组中“安全港(safe harbor)”基因组基因座内的序列，例如已知对基因修饰耐受而没有任何不期望的影响的基因组基因座。靶向此类序列的重组酶允许例如在特定基因组位置处靶向插入核酸构建体，而不需要常规的时间和劳动密集型基因靶向规程，例如经由同源重组技术。此外，本文提供的定向演化策略可以用于演化具有改变的活性谱的重组酶，例如，有利于核酸序列的整合而不是该序列的切除的重组酶，或反之亦然。

与其野生型对应物相比，演化的重组酶表现出改变的靶序列偏好，可以用于靶向用于重组酶活性的实际任何靶序列。因此，演化的重组酶可以用于修饰例如细胞或受试者的基因组内的任何序列。因为重组酶可以影响异源核酸分子插入到靶核酸分子中、从核酸分子中切除核酸序列、倒位或替换核酸序列，所以本文提供的技术能够以多种方式(例如，整合、缺失、倒位、交换核酸序列)有效修饰基因组靶标。

来自与本公开的方法和组合物一起使用的演化的重组酶的催化域包含与野生型重组酶的序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，其中与野生型重组酶的序列相比，演化的重组酶的氨基酸序列包含至少一个突变，并且其中演化的重组酶识别DNA重组酶靶序列，其与规范重组酶靶序列相差至少一个核苷酸。在一些实施方案中，演化的重组酶识别DNA重组酶靶序列，其与规范重组酶靶序列(例如，res、gix、hix、six、resH、LoxP、FTR或att核心或相关核心序列)相差至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20至少25或至少30个核苷酸。在一些实施方案中，演化的重组酶识别DNA重组酶靶序列，其与规范重组酶靶序列相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。

在一些实施方案中，仅重组酶的一部分用于本文所述的融合蛋白和方法中。作为非限制性实施方案，仅重组酶的C端部分可以用于本文所述的融合蛋白和方法中。在具体的实施方案中，Cre重组酶的25kDa羧基末端域可以用于组合物和方法中。参见例如，Hoess etal,“DNA Specificity of the Cre Recombinase Resides in the 25kDa CarboxylDomain of the Protein,”J.Mol.Bio.1990Dec 20,216(4):873-82，其出于所有目的通过引用并入本文。Cre重组酶的25kDa羧基末端域是从蛋白质的R118延伸至羧基末端的部分。在一些实施方案中，用于本发明融合蛋白和方法的Cre重组酶的25kDa羧基末端域可以与Cre重组酶的规范25kDa羧基末端域相差至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个氨基酸。在一些实施方案中，用于本发明融合蛋白和方法的Cre重组酶的25kDa羧基末端域可以与Cre重组酶的规范25kDa羧基末端域相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些实施方案中，仅Cre重组酶的25kDa羧基末端域的一部分可以用于本文所述的融合蛋白和方法中。例如，使用的Cre重组酶的部分可以是R130至蛋白质的羧基末端、T140至蛋白质的羧基末端、E150至蛋白质的羧基末端、N160至蛋白质的羧基末端、T170至蛋白质的羧基末端、I180至蛋白质的羧基末端、G190至蛋白质的羧基末端、T200至蛋白质的羧基末端、E210至蛋白质的羧基末端、L220至蛋白质的羧基末端、V230至蛋白质的羧基末端、C240至蛋白质的羧基末端、P250至蛋白质的羧基末端、A260至蛋白质的羧基末端、R270至蛋白质的羧基末端、G280至蛋白质的羧基末端、S290至蛋白质的羧基末端、A300至蛋白质的羧基末端或M310至蛋白质的羧基末端。作为另一组非限制性实例，使用的Cre重组酶的部分可以是R118-E340、R118-S330、R118-I320、R118-M310、R118-A300、R118-S290、R118-G280、R118-R270、R118-A260、R118-P250、R118-C240、R118-V230、R118-L220或R118-E210。作为进一步的一组非限制性实例，使用的Cre重组酶的部分可以是R118-E210、G190-R270、E210-S290、P250-M310或R270至蛋白质的羧基末端。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白和方法中使用的Cre重组酶可以在任何位置截短。在具体的实施方案中，本文所述的融合蛋白和方法中使用的Cre重组酶可以截短，使得它以氨基酸R118、A127、E138或R154开始)(每种情况下其之前都是甲硫氨酸)。在另一组非限制性实施方案中，本文所述的融合蛋白和方法中使用的Cre重组酶可以在R118、A127、E138或R154的10个氨基酸、9个氨基酸、8个氨基酸、7个氨基酸、6个氨基酸、5个氨基酸、4个氨基酸、3个氨基酸、2个氨基酸或1个氨基酸内截短。

在一些实施方案中，重组酶靶序列为10-50个核苷酸之间长。在一些实施方案中，重组酶是Cre重组酶、Hin重组酶或FLP重组酶。在一些实施方案中，规范重组酶靶序列是LoxP位点(5′-ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT-3′(SEQ ID NO:739)。在一些实施方案中，规范重组酶靶序列是FRT位点(5'-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAA GTATAGGAACTTC-3′)(SEQ ID NO:740)。在一些实施方案中，与野生型重组酶的序列相比，演化的重组酶的氨基酸序列包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15个突变。在一些实施方案中，演化的重组酶识别包含左半位点、间隔区序列和右半位点的DNA重组酶靶序列，并且其中左半位点不是右半位点的回文序列。

在一些实施方案中，演化的重组酶识别包含天然存在的序列的DNA重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的重组酶识别包含在哺乳动物的基因组中的DNA重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的重组酶识别包含在人的基因组中的DNA重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的重组酶识别在哺乳动物的基因组中仅发生一次的DNA重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的重组酶识别哺乳动物的基因组中的DNA重组酶靶序列，其与基因组中的任何其他位点相差至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15个核苷酸。在一些实施方案中，演化的重组酶识别位于安全港基因组基因座中的DNA重组酶靶序列。在一些实施方案中，安全港基因组基因座是Rosa26基因座。在一些实施方案中，演化的重组酶识别位于与疾病或病症相关的基因组基因座中的DNA重组酶靶序列。

在某些实施方案中，演化的重组酶可以靶向人基因组的Rosa基因座中的位点(例如36C6)。此类重组酶的非限制性组可以在例如，2017年1月26日公开的国际PCT公开WO2017/015545A1,题为“Evolution of Site Specific Recombinases,”中找到，其为此目的通过引用并入本文。在一些实施方案中，与野生型重组酶的序列相比，演化的重组酶的氨基酸序列包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15个突变。编码36C6的核苷酸序列以粗体显示如下；编码GGS接头的那些以斜体显示；编码dCas9接头的那些为黑色；编码FLAG

标签和NLS的那些分别用下划线和小写字母表示。

dCas9-36C6(核苷酸)(SEQ ID NO:765)

dCas9-36C6 (氨基酸) (SEQ ID NO: 766)

本公开的一些方面提供了演化的重组酶(例如Cre重组酶)，其包含与本文讨论的重组酶序列(例如Cre重组酶)的序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，其中与本文讨论的重组酶(例如Cre重组酶)的序列相比，重组酶(例如Cre重组酶)的氨基酸序列包含至少一个突变，并且其中重组酶(例如Cre重组酶)识别与规范LoxP位点5′-ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT-3′(SEQ ID NO:739)相差至少一个核苷酸的DNA重组酶靶序列。

在一些实施方案中，与本文讨论的重组酶(例如Cre重组酶)序列的序列相比，演化的重组酶(例如Cre重组酶)的氨基酸序列包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15个突变，并且识别与规范靶位点(例如LoxP位点)相差至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15个核苷酸的DNA重组酶靶序列。

在一些实施方案中，演化的Cre重组酶识别包含左半位点、间隔区序列和右半位点的DNA重组酶靶序列，并且其中左半位点不是右半位点的回文序列。在一些实施方案中，演化的Cre重组酶识别包含天然存在的序列的DNA重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的Cre重组酶识别包含在哺乳动物的基因组中的DNA重组酶靶序列。

在一些实施方案中，演化的Cre重组酶识别包含在人的基因组中的DNA重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的Cre重组酶识别在哺乳动物的基因组中仅包含一次的DNA重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的Cre重组酶识别哺乳动物的基因组中的DNA重组酶靶序列，其与基因组中的任何其他位点相差至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15个核苷酸。在一些实施方案中，演化的Cre重组酶识别位于安全港基因组基因座中的DNA重组酶靶序列。在一些实施方案中，安全港基因组基因座是Rosa26基因座。在一些实施方案中，演化的Cre重组酶识别位于与疾病或病症相关的基因组基因座中的DNA重组酶靶序列。

与本发明方法和组合物一起使用的另外的演化的重组酶(及其制备方法)可以在例如美国专利申请号15/216,844中找到，其通过引用并入本文。

对于提供重组酶催化域或演化的重组酶催化域两者，另外的合适的重组酶对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且此类合适的重组酶包括但不限于描述于Hiranoet al.,Site-specific recombinases as tools for heterologous geneintegration.Appl Microbiol Biotechnol.2011Oct；92(2):227-39；Fogg et al.,Newapplications for phage integrases.J Mol Biol.2014Jul 29；426(15):2703；Brown etal.,Serine recombinases as tools for genome engineering.Methods.2011Apr；53(4):372-9；Smith et al.,Site-specific recombination by phiC31integrase andother large serine recombinases.Biochem Soc Trans.2010Apr；38(2):388-94；Grindley et al.,Mechanisms of site-specific recombination.Annu RevBiochem.2006；75:567-605；Smith et al.,Diversity in the serine recombinases.MolMicrobiol.2002Apr；44(2):299-307；Grainge et al.,The integrase family ofrecombinase:organization and function of the active site.MolMicrobiol.1999Aug；33(3):449-56；Gopaul et al.,Structure and mechanism in site-specific recombination.Curr Opin Struct Biol.1999Feb；9(1):14-20；Cox et al.,Conditional gene expression in the mouse inner ear using Cre-loxP.J Assoc ResOtolaryngol.2012Jun；13(3):295-322；Birling et al.,Site-specific recombinasesfor manipulation of the mouse genome.Methods Mol Biol.2009；561:245-63；和Mishina M,Sakimura K.Conditional gene targeting on the pure C57BL/6geneticbackground.Neurosci Res.2007Jun；58(2):105-12中的那些；其每一个的全部内容通过引用并入本文。

融合蛋白的结构

本公开的融合蛋白可以是本文所述的元件的任何组合和顺序。示例性融合蛋白包括但不限于任何以下结构：NH₂-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[任选的NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[NLS域]-[接头序列]-[亲和标签]-COOH。

在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-COOH、NH₂-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH、NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH、NH₂-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-COOH、NH₂-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-COOH或NH₂-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-COOH。

在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构：NH₂-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[任选的NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-COOH。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[NLS域]-[接头序列]-[亲和标签]-COOH。

在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[任选的NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[接头序列]-[NLS域]-[接头序列]-[亲和标签]-COOH。

在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[任选的NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[接头序列]-[NLS域]-[接头序列]-[亲和标签]-COOH。

在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[任选的NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[接头序列]-[NLS域]-[接头序列]-[亲和标签]-COOH。

在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[任选的NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[接头序列]-[NLS域]-[接头序列]-[亲和标签]-COOH。

在一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[任选的NLS域]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-COOH。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-COOH。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-COOH。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[亲和标签]-[接头序列]-[NLS域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-COOH。

在一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[任选的NLS域]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-COOH。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-COOH。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-COOH。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[亲和标签]-[接头序列]-[NLS域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-COOH。

在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[任选的NLS域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[亲和标签]-[接头序列]-[NLS域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。

在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[任选的NLS域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[亲和标签]-[接头序列]-[NLS域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH.

在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[任选的NLS域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[亲和标签]-[接头序列]-[NLS域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。

在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[任选的NLS域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构NH₂-[亲和标签]-[接头序列]-[NLS域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-COOH。

融合蛋白可以进一步包含一个或多个亲和标签。本文提供的合适的亲和标签包括但不限于生物素羧化酶载体蛋白(BCCP)标签、myc标签、钙调蛋白标签、FLAG标签、血凝素(HA)标签、多组氨酸标签(也称为组氨酸标签或His标签)、多精氨酸(多Arg)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)-标签、nus标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、绿色荧光蛋白(GFP)标签、硫氧还蛋白标签、S标签、Softag(例如，Softag 1、Softag 3)、strep标签、生物素连接酶标签、FlAsH标签、V5标签和SBP标签。另外的合适的序列对于本领域技术人员而言将是显而易见的。FLAG标签可以具有序列PKKKRKV(SEQ ID NO:702)。一个或多个亲和标签经由一个或多个第三接头与引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域、重组酶催化域或NLS域结合。第三接头可以是本文所述的任何肽接头。例如，第三接头可以是肽接头。

作为非限制性组的实例，第三接头可以包含XTEN接头SGSETPGTSESATPES(SEQ IDNO:7)、SGSETPGTSESA(SEQ ID NO:8)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS(SEQ ID NO:9)，包含三肽GGS的一个或多个重复的氨基酸序列，或任何以下氨基酸序列：VPFLLEPDNINGKTC(SEQ IDNO:10)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:11)、SIVAQLSRPDPA(SEQ ID NO:12)、MKIIEQLPSA(SEQID NO:13)、VRHKLKRVGS(SEQ ID NO:14)、GHGTGSTGSGSS(SEQ ID NO:15)、MSRPDPA(SEQ IDNO:16)或GGSM(SEQ ID NO:17)。在某些实施方案中，第三接头包含三肽GGS的一个或多个重复。在实施方案中，第三接头包含三肽GGS的一个至五个重复。在实施方案中，第三接头包含三肽GGS的一个重复。在具体的实施方案中，第三接头具有序列GGS。

第三接头也可以是非肽接头。在某些实施方案中，非肽接头包含聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸、肝素或烷基接头。在其他实施方案中，烷基接头具有式—NH—(CH₂)_s—C(O)—，其中s可以是1和100之间的任何整数，包括端点。在具体的实施方案中，s是1和20之间的任何整数，包括端点。

本公开的融合蛋白与SEQ ID NO:185的氨基酸1-1544中所示的氨基酸序列(其与SEQ ID NO:719中所示的序列相同)具有大于90％、95％或99％的序列一致性。

MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFYVMGALAEMERELIIERTMAGLAAARNKGRRFGRPPKGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGSDYKDDDDK终止(SEQ ID NO:719)

在二聚化(或多聚化)的蛋白质，诸如例如核酸酶失活的Cas9(或Cas9gRNA结合域)与重组酶(或重组酶的催化域)之间的融合的背景下，靶位点通常包含左半位点(由一种蛋白质结合)、右半位点(由第二种蛋白质结合)，以及在其中进行重组的半位点之间的间隔区序列。在一些实施方案中，重组左半位点或右半位点(而非间隔区序列)。在其他实施方案中，重组间隔区序列。该结构([左半位点]-[间隔区序列]-[右半位点])在本文中称为LSR结构。在一些实施方案中，左半位点和/或右半位点对应于RNA引导的靶位点(例如，Cas9靶位点)。在一些实施方案中，半位点中的任一个或两个比例如Cas9靶向的典型区域更短或更长，例如短于或长于20个核苷酸。在一些实施方案中，左半位点和右半位点包含不同的核酸序列。在一些实施方案中，间隔区序列长度为至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200或至少250bp。在一些实施方案中，间隔区序列为约15bp和约25bp之间长。在一些实施方案中，间隔区序列为约15bp长。在一些实施方案中，间隔区序列为约25bp长。

实施例

实施例1：可编程Cas9-丝氨酸重组酶融合蛋白，其在哺乳动物细胞中的DNA序列上起作用

材料和方法

寡核苷酸和PCR

所有寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies(IDT，Coralville，CA)并列于表1-5中。除非另有说明，否则酶购自New England Biolabs(Ipswich，MA)。Plasmid SafeATP依赖性DNA酶购自Epicenter(Madison，WI)。将所有组装的载体转化到One Shot Mach1-T1噬菌体抗性化学感受态细胞(Fisher Scientific，Waltham，MA)。除非另有说明，否则所有PCR反应均使用Q5热启动高保真(Hot Start High-Fidelity)2X Master Mix进行。Phusion聚合酶用于环状聚合酶延伸克隆(CPEC)组装。

表1：用于gRNA构建的寡核苷酸

表2：用于报告物构建的寡核苷酸和gBlock

表3：用于recCas9构建的寡核苷酸

表4：定制测序寡核苷酸

表5：基因组PCR引物

报告物构建

使用五件式Golden Gate组装构建下述的报告物。片段1-5侧翼为Esp3I位点；Esp3I消化产生互补的5'突出端，指定片段组装的顺序(图6)。通过退火表5中列出的正向和反向互补寡核苷酸产生片段1、2、4和5。通过将20μl的分子级水中的10μl的每种寡核苷酸(100μM)混合，在95℃温育3分钟，并以-0.1℃/秒的速率将温度降至16℃来使片段退火。用引物3-for和3-rev通过PCR扩增含有kanR和PolyA终止密码子的区域产生片段3。这些引物还在该序列的5'和3'末端附加了Esp3I。

将退火的片段1、2、4和5稀释12,000倍并将0.625μl的每个片段添加至含有以下的混合物：

1)40-50ng片段3

2)100ng pCALNL EGFP-Esp3I

3)1μL Tango缓冲液(10X)

4)1μL DTT(10mM)

5)1μL ATP(10mM)

6)0.25uL T7连接酶(3,000U/μL)

7)0.75uL Esp3I(10U/μL)

8)H₂O至10μL

将反应在编程进行20个循环(37℃5分钟，20℃)的热循环仪中温育。

在完成GoldenGate反应后，将7μL的每个反应物与1μL的ATP(10mM)、1μL的10XPlasmid Safe ATP依赖性DNA酶缓冲液(10X)和1μL的Plasmid Safe ATP依赖性DNA酶(10U/μL)(Epicentre,Madison,WI)混合以去除线性DNA并减少背景。将DNA酶消化物在37℃温育30分钟，并在70℃加热杀死30分钟。将每个反应物的一半(5μL)转化到Mach1-T1细胞中。通过菌落PCR分析菌落并测序。

针对图4中使用的报告物修改了方案。使用编码PolyA终止子的5'或3'的靶位点的两个gBlock代替片段1、2、4和5。将这些gBlock(10ng)加入到MMX中，其循环10次(37℃5分钟，20℃)并如上所述继续进行。

质粒

除非另有说明，否则使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)从琼脂糖凝胶分离DNA片段并使用DNA Clean&Concentrator-5(Zymo Research,Irvine,CA)或Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)进一步纯化。使用上面列出的试剂盒之一分离不需要凝胶纯化的PCR片段。

使用pCALNL-GFP亚克隆载体pCALNL-EGFP-Esp3I克隆所有recCas9报告物质粒，并基于先前描述的pCALNL-GFP载体(Matsuda and Cepko,Controlled expression oftransgenes introduced by in vivo electroporation.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 104,1027-1032(2007)，其通过引用并入本文)。为了产生pCALNL-EGFP-Esp3I，用XhoI和MluI消化pCALNL-GFP载体并凝胶纯化以除去loxP位点、卡那霉素抗性标志物和poly-A终止子。退火的寡核苷酸形成EspI插入物，其含有反向的Esp3I位点以及XhoI和MluI相容的突出端；将该插入物连接到XhoI和MluI消化的质粒中并转化。

用退火的寡聚物和含有相容的Esp3I突出端的PCR产物通过Golden Gate组装产生pCALNL-GFP recCas9报告物质粒。如前所述用Esp3I(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)建立并进行Golden Gate反应(Sanjana et al.,A transcription activator-likeeffector toolbox for genome engineering.Nature protocols 7,171-192(2012)，其全部内容在此通过引用并入)。图6概述了用于报告物组装的一般组装方案和相关引物以及所有recCas9靶位点的序列分别列于表2和6中。侧翼为两个recCas9靶位点的含有KanR(粗体和下划线)和PolyA终止子(斜体和下划线)的代表性DNA序列如下所示。显示的靶位点均为PAM_NT1-0bp-gix_核心-0bp-NT1_PAM(见表6)。原相邻间隔区基序(protoadjacent spacermotif)(PAM)以粗体显示。碱基对间隔区是小写的。gix位点或gix相关位点以斜体显示，并且dCas9结合位点以下划线标出。对于图4的测定中使用的基因组报告物质粒，在卡那霉素抗性标志物中观察到G至T颠换，在下面的序列中由G/T表示。这存在于该图中使用的所有报告物中，并且预计不会影响结果，因为它远离PolyA终止子和recCas9靶位点。

表6：用于报告物测定法的靶位点序列的列表

通过用寡核苷酸1GGS-rev-BamHI或2GGS-rev-BamHI(使用接头SEQ ID NO:182)和Gin-for-NotI对编码演化的、过度激活的Gin变体(Ginβ)(Gaj et al.,A comprehensiveapproach to zinc-finger recombinase customization enables genomic targetingin human cells.Nucleic acids research 41,3937-3946(2013)，其全部内容在此通过引用并入)的gBlock进行PCR扩增来构建含有recCas9基因的质粒。用BamHI和NotI消化PCR片段，纯化并连接到先前描述的表达载体(Addgene质粒43861)(参见例如，Fu et al.,High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in humancells.Nature biotechnology 31,822-826(2013)，其全部内容在此通过引用并入)中以产生亚克隆载体pGin-1GGS和pGIN-2GGS(使用接头SEQ ID NO:182)。与Cas9-rev-FLAG-NLS-AgeI一起使用寡核苷酸1GGS-连接-for-BamHI、5GGS-连接-for-BamHI(使用接头SEQ IDNO:701)或8GGS-连接-for-BamHI(使用接头SEQ ID NO:183)构建编码具有1、5或8个GGS接头的Cas9-FLAG-NLS的PCR片段(见表3)。对于编码GGS氨基酸接头的DNA序列，见表7。用BamHI和AgeI消化PCR片段和亚克隆质粒并连接以产生质粒pGinβ-2xGGS-dCas9-FLAG-NLS(使用接头SEQ ID NO:182)、pGinβ-5xGGS-dCas9-FLAG-NLS(使用接头SEQ ID NO:701)和pGinβ-8xGGS-dCas9-FLAG-NLS(使用接头SEQ ID NO:183)。对于pGinβ-8xGGS-dCas9-FLAG-NLS(即recCas9)的DNA和氨基酸序列，参见下文。编码Ginβ的序列以粗体显示；编码GGS接头的序列以斜体显示；编码dCas9接头的序列为黑色；编码FLAG标记和NLS的序列分别用下划线和小写字母表示。

Gin重组酶催化域(其是SEQ ID NO:185的氨基酸1-142)与SEQ ID NO:713的序列相同。dCas9域(其是SEQ ID NO:185的氨基酸167-1533)与SEQ ID NO:712的序列相同。

MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFYVMGALAEMERELIIERTMAGLAAARNKGRRFGRPPK(SEQ ID NO:713)

DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:712)

表7：编码GGS接头的DNA序列

对于质粒测序实验，通过用PCR片段的golden gate克隆，用SpecR替换pGinβ-8xGGS-dCas9-FLAG-NLS(使用接头SEQ ID NO:183)中的AmpR基因。通过用Esp3I-for-质粒和Esp3I-rev-质粒进行PCR，在位于AmpR基因侧翼的位点处将Esp3I位点引入pGinβ-8xGGS-dCas9-FLAG-NLS(使用接头SEQ ID NO:183)质粒中。引物spec-Esp3I-for和spec-Esp3I-rev用于扩增SpecR标志物以及引入Esp3I位点和Esp3I产生的突出端，所述突出端与由Esp3I切割的质粒PCR产物产生的突出端相容。按照用于产生如本文所述的报告物质粒的方案对两个片段进行golden gate组装。

pHU6-NT1引导RNA表达载体基于先前描述的pFYF1328(Fu et al.,High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in humancells.Nature biotechnology 31,822-826(2013)，其全部内容在此通过引用并入)，其被改变以靶向细菌萤光素酶基因LuxAB内的区域。通过用通用引物R.pHU6.TSS(-1).univ和编码独特引导RNA序列的引物(表1)进行整个载体的PCR扩增来产生引导RNA表达载体。表8中给出了引导RNA序列的列表。这些引物用T4多核苷酸激酶磷酸化。将PCR反应产物和线性引导RNA表达载体平端连接并转化。用于初始优化的引导RNA表达载体、脱靶对照引导RNA序列和靶向染色体10基因座的那些包含AmpR。本研究中所述的所有其他质粒含有specR以促进测序实验。最初经由CPEC将壮观霉素抗性引入到引导RNA表达载体中，基本上如所述(Quanet al.,Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries andpathways.PloS one 4,e6441(2009)；和Hillson(2010),vol.2015,pp.CPEC protocol；其每篇通过引用并入本文)，并且然后如上所述通过载体的PCR扩增构建引导RNA质粒。将反应物在37℃与40U的DpnI温育过夜，纯化并转化。通过用寡核苷酸cpec-组装-for-spec2和cpec组装-rev进行引导RNA表达载体的PCR扩增产生CPEC的片段。通过经由寡核苷酸cpec-组装-for-spec和cpec-组装-rev-spec对SpecR基因进行PCR扩增产生specR片段。pUC19(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)进行了类似的修饰。

表8：gRNA序列的列表

细胞培养和转染

HEK293T细胞购自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(ATCC，Manassas，VA)。将细胞在补充有10％胎牛血清(FBS，LifeTechnologies，Carlsbad，CA)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)+GlutaMAX-1(4.5g/LD葡萄糖+110mg/mL丙酮酸钠)中培养。将细胞在37℃，5％CO₂在潮湿的培养箱中培养。

用于转染的质粒从PureYield Plasmid Miniprep System(Promega，Madison，WI)中分离。转染前一晚，在48孔胶原处理的平板(Corning，Corning，NY)中以每孔3×10⁵个细胞的密度接种HEK293T细胞。在25μL的Opti-MEM(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)中制备转染反应。对于每次转染，将45ng的每种引导RNA表达载体、9ng的报告物质粒、9ng的piRFP670-N1(Addgene Plasmid 45457)和160ng的recCas9表达载体混合，与Opti-MEM(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)中的0.8μL liplofectamine 2000组合并加入各孔中。

流式细胞术

转染后60-72小时后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，并用50μL的0.05％胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies，Carlsbad，CA)在37℃收获5-10分钟。将细胞在250μL培养基中稀释，并在BD Fortessa分析仪上运行。使用635nm激光激发iRFP荧光，并使用670/30带通滤光器收集发射。使用488nM激光激发EGFP并用505长通和530/30带通滤光器获得发射荧光。在FlowJo软件上分析数据，门控活的且经转染的事件(表达iRFP)。以从至少6,000个活事件门控的转染细胞的百分比测量阳性GFP表达细胞。对于优化实验，通过测量在用报告物质粒和pUC(没有recCas9或引导RNA表达载体)共转染时产生eGFP的转染细胞的百分比来确定测定背景。然后，当与recCas9和中靶或非靶引导RNA表达载体共转染报告物质粒时从观察到的eGFP阳性细胞的百分比中减去该背景。

基因组靶位点的鉴定

使用Bioconductor(使用R统计程序的开源生物信息学包)进行搜索适当的靶位点(Fu et al.,High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Casnucleases in human cells.Nature biotechnology 31,822-826(2013)，其全部内容在此通过引用并入)。由Genome Reference Consortium发布的人参考基因组的最新版本(GRCh38)用于搜索与Cas9的PAM需求和如文本中描述的演化的gix序列两者相匹配的位点。在将基因组加载到R中的情况下，每个搜索模式都表示为Biostring(允许字符串匹配和操作的R中的容器)。当使用GRCh38参考组装进行搜索时，使用所述参数扫描整个基因组的两条DNA链揭示了人基因组中大约450个潜在靶标(表9)。

表9：计算机中鉴定的recCas9基因组靶标

DNA测序

如上述一式六份进行293T细胞的转染并温育72小时。收获细胞并合并重复。使用涉及碱性裂解和旋转柱纯化的改良HIRT提取来提取附加型DNA，基本上如所述(Quan etal.,Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries andpathways.PloS one 4,e6441(2009)；和Hillson(2010),vol.2015,pp.CPEC protocol；其每篇的全部内容在此通过引用并入)。简而言之，收获后，将HEK293T细胞在500μL的冰冷的PBS中洗涤，重悬于250μL GTE缓冲液(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA并且pH8.0)中，在室温温育5分钟，并用200μL裂解缓冲液(200mM NaOH，1％十二烷基硫酸钠)在冰上裂解5分钟。用150μL的乙酸钾溶液(5M乙酸盐，3M钾，pH 6.7)中和裂解。通过在21,130g离心15分钟沉淀细胞碎片，并将裂解物应用于Econospin旋转柱(Epoch Life Science，MissouriCity，TX)。用750μL洗涤缓冲液(Omega Bio-tek，Norcross，GA)洗涤柱两次，并在45μLTE缓冲液，pH8.0中洗脱。

用RecBCD(10U)按照制造商的说明将分离的附加型DNA在37℃消化2小时，并用MinElute Reaction Cleanup试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化到10μLEB中。用5μL的附加型提取物转化Mach1-T1化学感受态细胞，并在选择羧苄青霉素抗性的琼脂糖平板(含有50μg/mL羧苄青霉素)上铺板。用引物pCALNL-for-1对个别菌落进行测序以确定重组率。测序读段揭示了“左”完整的非重组recCas9位点、预期的重组产物、具有小插入/缺失的“左”非重组位点的罕见实例、或大缺失产物的一个情况。

对recCas9催化基因组缺失的分析

在24孔胶原处理的平板中以每孔6×10⁵个细胞的密度接种HEK293T细胞并生长过夜(Corning，Corning，NY)。在Opti-MEM(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)中使转染反应物达到100μL的终体积。对于每次转染，将90ng的每种引导RNA表达载体、20ng的pmaxGFP(Lonza，Allendale，NJ)和320ng的recCas9表达载体与Opti-MEM(ThermoFisherScientific，Waltham，MA)中2μL Lipofectamine2000组合并加入各孔中。48小时后，收获细胞并在BD FACS AriaIIIu细胞分选仪上分选GFP转染对照。使用100μm喷嘴在纯度模式下分选细胞，并通过与未转染的细胞比较确定背景荧光。在PBS中在冰上收集分选的细胞，沉淀并用冷PBS洗涤两次。使用E.Z.N.A.组织DNA试剂盒(Omega Bio-Tek，Norcross，GA)收获基因组DNA并在100μL Eb中洗脱。使用在Tecan Infinite M1000Pro荧光酶标仪(platereader)上测量的Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)定量基因组DNA。

使用补充有3％DMSO的Q5热启动聚合酶2xMaster Mix进行巢式PCR，并用HyClone水，分子生物学级(GE Life Sciences，Logan，UT)稀释。使用引物对FAM19A2-F1和FAM19A2-R1(表5)用20ng的基因组DNA作为模板以25uL规模进行初级PCR。初级PCR条件如下：98℃1分钟，35个循环(98℃10秒、59℃30秒、72℃30秒)，72℃1分钟。使用引物FAM19A2-F2和FAM19A2-R2，将1:50稀释的初级PCR用作次级PCR的模板。次级PCR条件如下：98℃1分钟，30个循环(98℃10秒、59℃20秒、72℃20秒)，72℃1分钟。通过在TAE中的1％琼脂糖凝胶上与1Kb Plus DNA梯(ladder)(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)一起电泳来分析DNA。在Qiagen Minelute柱(Valencia，CA)上使用制造商的方案纯化待Sanger测序的材料。来自3个生物学重复的模板DNA用于三个独立的基因组巢式PCR。

考虑到一组完整的人染色体重约3.6pg(3.3·10⁹bp×1·10^-1，计算检出限。因此，用20ng的基因组DNA模板接种的PCR反应物含有约5500组染色体。

为了定量基因组缺失，对于3个生物学重复中的每一个，一式三份进使用上述条件行巢式PCR。使用两倍稀释系列的基因组DNA作为模板，从未稀释的储液开始(对于样品1，47.17ng/uL；对于样品2，75.96ng/uL；并且对于样品3，22.83ng/uL)以减少潜在的移液误差来源。假定可以观察到缺失PCR产物的最低DNA浓度含有每个总基因组DNA的单一缺失产物。

可以推断给定量的模板DNA中存在的基因组的数量，并因此可以确定FAM19A2基因座处recCas9的最小缺失效率的估计值。例如，以20ng基因组DNA模板开始，以两倍稀释系列为例。巢式PCR后，只有接种20ng的孔产生正确的PCR产物。每个基因组3.6pg，该PCR含有大约5500个基因组，并且由于必须存在至少一个重组基因组，因此最小缺失效率为5500分之一或0.018％。

使用基因组模板的有限稀释来定量基因组DNA的水平，因为使用定量PCR(qPCR)来确定基因组编辑的绝对水平将需要一组PCR条件，其仅明确地且仅特异性地扩增自重组后基因组DNA。如图5B中所示，使用基因组DNA作为模板的初级PCR导致大约2.5kb脱靶带作为优势种类；需要使用巢式引物进行第二轮的PCR以揭示引导RNA-和recCas9依赖性基因组编辑。

结果

将Gin重组酶融合至dCas9

最近已经证明dCas9的N端可以融合至FokI核酸酶催化域，产生二聚体dCas9-FokI融合物，其切割侧翼为两个引导RNA指定序列的DNA位点(参见例如，Guilinger et al.,Fusion of catalytically inactive Cas9to FokI nuclease improves thespecificity of genome modification.Nature biotechnology,(2014)；Tsai et al.,Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genomeediting.Nature biotechnology,(2014)；其每篇的全部内容在此通过引用并入)。使用相同的融合方向将dCas9与Ginβ(Barbas及其同事先前演化的二聚体Gin转化酶的高活性催化域)连接(Gaj et al.,A comprehensive approach to zinc-finger recombinasecustomization enables genomic targeting in human cells.Nucleic acids research41,3937-3946(2013)，其全部内容在此通过引用并入)。Ginβ混杂地重组与天然核心序列CTGTAAACCGAGGTTTTGGA(SEQ ID NO:700)相关的几个20-bp核心“gix”序列(Gaj et al.,Acomprehensive approach to zinc-finger recombinase customization enablesgenomic targeting in human cells.Nucleic acids research 41,3937-3946(2013)；Klippel et al.,The DNA Invertase Gin of Phage Mu-Formation of a CovalentComplex with DNA Via a Phosphoserine at Amino-Acid Position-9.Embo Journal 7,1229-1237(1988)；Mertens et al.,Site-specific recombination in bacteriophageMu:characterization of binding sites for the DNA invertase Gin.The EMBOjournal 7,1219-1227(1988)；Plasterk et al.,DNA inversions in the chromosome ofEscherichia coli and in bacteriophage Mu:relationship to other site-specificrecombination systems.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 80,5355-5358(1983)；其每篇的全部内容在此通过引用并入)。引导RNA将recCas9二聚体定位于侧翼为两个引导RNA指定的序列的gix位点，使得Ginβ域能够以引导RNA编程的方式催化DNA重组(图1D)。

为了测定所得的dCas9-Ginβ(recCas9)融合物，构建了含有两个recCas9靶位点的报告物质粒，两个recCas9靶位点位于阻断EGFP转录的poly-A终止子的侧翼(图1A-1C)。每个recCas9靶位点由侧翼为与引导RNA前间隔区序列匹配的位点的gix核心假位点组成。重组酶介导的缺失去除了终止子，恢复了EGFP的转录。用该报告物质粒、转录引导RNA的质粒和产生候选dCas9-Ginβ融合蛋白的质粒共转染HEK293T细胞，并使用表现出EGFP荧光的细胞级分评估每种融合构建体的相对活性。

影响recCas9组分的结构的参数，包括核心gix位点和引导RNA结合位点之间的间距(0至7bp)，以及dCas9和Ginβ部分之间的接头长度((GGS)₂(SEQ ID NO:182)、(GGS)₅(SEQID NO:701)或(GGS)₈(SEQ ID NO:183))是变化的(图2A-2F)。大多数融合结构导致无观察到的引导RNA依赖性EGFP表达(图1C-1D)。然而，当存在匹配但不错配的引导RNA时，一个含有8个GGS重复的接头和3-6个碱基对间隔区的融合构建体导致约1％的重组(图2E-2F)。当5-6个碱基对将dCas9结合位点与核心分开时，重组活性始终较高(图2F)。这些结果共同揭示了dCas9和Ginβ之间的特异性融合结构可以在人细胞中与间隔区侧翼的gix相关的核心位点处产生引导RNA依赖性重组活性。8xGGS接头融合构建体称为“recCas9”。

用recCas9靶向人基因组中发现的DNA序列

观察到的活性的低水平可以由次优的引导RNA序列或核心gix序列引起，与表明引导RNA:Cas9结合的效率呈序列依赖性的之前的报告(参见例如，Xu et al.,Sequencedeterminants of improved CRISPR sgRNA design.Genome research 25,1147-1157(2015)，其全部内容在此通过引用并入)一致。此外，尽管目前的优化是用天然gix核心序列进行的(参见例如，Klippel et al.,The DNA Invertase Gin of Phage Mu-Formation ofa Covalent Complex with DNA Via a Phosphoserine at Amino-Acid Position-9.EmboJournal 7,1229-1237(1988)；Mertens et al.,Site-specific recombination inbacteriophage Mu:characterization of binding sites for the DNA invertaseGin.The EMBO journal 7,1219-1227(1988)；Plasterk et al.,DNA inversions in thechromosome of Escherichia coli and in bacteriophage Mu:relationship to othersite-specific recombination systems.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 80,5355-5358(1983)；其每篇的全部内容在此通过引用并入)，但是一些研究已表明锌指-Gin或TALE-Gin融合对略微改变的核心位点是有活性的，并且在某些情况下更具活性。参见例如，Gordley et al.,3rd,Synthesisof programmable integrases.Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 106,5053-5058(2009)；Gersbach et al.,Targetedplasmid integration into the human genome by an engineered zinc-fingerrecombinase.Nucleic acids research 39,7868-7878(2011)；Mercer et al.,ChimericTALE recombinases with programmable DNA sequence specificity.Nucleic acidsresearch 40,11163-11172(2012)；Gaj et al.,A comprehensive approach to zinc-finger recombinase customization enables genomic targeting in humancells.Nucleic acids research 41,3937-3946(2013)；Gordley et al.,3rd,Evolutionof programmable zinc finger-recombinases with activity in human cells.J MolBiol 367,802-813(2007)；Gersbach et al.,3rd,Directed evolution of recombinasespecificity by split gene reassembly.Nucleic acids research 38,4198-4206(2010)；和Gaj et al.,Structure-guided reprogramming of serine recombinase DNAsequence specificity.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 108,498-503(2011)；其每篇的全部内容在此通过引用并入)。因此，靶向在人基因组内发现的序列以测试未修饰的人基因组序列是否能够被recCas9靶向并测试是否改变引导RNA和核心序列将增加recCas9活性。

为了鉴定潜在的靶位点，使用了表征演化的Gin变体的先前发现(参见例如，Gajet al.,A comprehensive approach to zinc-finger recombinase customizationenables genomic targeting in human cells.Nucleic acids research41,3937-3946(2013)，其全部内容在此通过引用并入)以及上述观察结果。使用该信息，在人基因组中搜索含有CCN_(30-31)-AAASSWWSSTTT-N_(30-31)-GG(SEQ ID NO:699)的位点，其中W是A或T，S是G或C，N是任何核苷酸。N_(30-31)包括以下各项的N：NGG前间隔区相邻基序(PAM)、20碱基对Cas9结合位点、Cas9和gix位点之间5-6碱基对间隔以及gix核心位点的四个最外碱基对。预先确定gix核心位点的内部12个碱基对(AAASSWWSSTTT，SEQ ID NO:699)对Ginβ活性是重要的(参见例如，Gaj et al.,Nucleic acids research 41,3937-3946(2013)。

该搜索揭示了人基因组中约450个此类基因座(表9)。产生报告物构建体，其含有与PCDH15中发现的这些基因组基因座之一相同的序列，并且然后构建引导RNA表达载体以将recCas9导向该序列(图3A)。这些载体编码两对引导RNA，其每对含有与PCDH15假gix位点侧翼的5'和3'区域匹配的间隔区序列。报告物质粒、这些侧翼引导RNA表达载体的组合和recCas9表达载体的共转染导致在11％-13％的转染细胞中的EGFP表达(图3B)，表明与图2中所示结果相比，活性提高了10倍以上。这些发现表明，recCas9靶序列的更明智的选择可以导致与人基因组中发现的DNA序列匹配的DNA序列处的重组效率显著提高。

接下来，确定是否需要这两个引导RNA序列引起recCas9介导的缺失。用靶向PCDH15假gix核心位点的5'或3'侧翼序列的引导RNA载体的仅一个、PCDH15报告物质粒和recCas9表达载体共转染HEK293T细胞。这些共转染导致2.5-3％EGFP表达(图3B)。靶向性引导RNA的仅一个和recCas9的表达时观察到的低活性水平可以是由过度激活的gix单体形成二聚体的倾向引起的(参见例如，Gaj et al.,Enhancing the Specificity ofRecombinase-Mediated Genome Engineering through Dimer Interface Redesign.J AmChem Soc 136,5047-5056(2014)，其全部内容在此通过引用并入)；瞬时二聚化可以偶尔允许单一前间隔区序列将二聚体定位于靶位点。当使用脱靶引导RNA载体时或当用pUC替换recCas9载体时，未检测到高于背景的活性(图3B)。

这些发现表明，通过选择不同的靶位点和匹配引导RNA序列，recCas9活性可以比初始实验中观察到的适度活性显著增加。与原始靶序列相比，观察到PCDH15位点上的活性增加大于10倍(比较图3B和图2F)。此外，最大重组活性取决于两个引导RNA和recCas9的存在。

recCas9的正交性

接下来，测试recCas9是否可以以正交方式靶向在人基因组中发现的序列匹配的多个分开的基因座。基于其作为基因组整合的安全港基因座的潜在用途，或者在一种情况下基于其在遗传疾病中涉及的基因内的位置，选择人基因组中recCas9靶位点的子集。

为了鉴定这些位点，搜索ENSEMBL(版本81)以鉴定哪些预测的recCas9靶位点落入注释的基因内(参见例如，Cunningham et al.,Ensembl 2015.Nucleic acids research43,D662-669(2015)，其全部内容在此通过引用并入)。一个此类位点落入FGF14的内含子区域。据信FGF14内的突变会引起脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia)27(SCA27)(参见例如，van Swieten et al.,A mutation in the fibroblast growth factor14gene is associated with autosomal dominant cerebellar ataxia[corrected].AmJ Hum Genet 72,191-199(2003)；Brusse et al.,Spinocerebellar ataxia associatedwith a mutation in the fibroblast growth factor 14gene(SCA27):A newphenotype.Mov Disord 21,396-401(2006)；Choquet et al.,A novel frameshiftmutation in FGF14causes an autosomal dominant episodic ataxia.Neurogenetics16,233-236(2015)；Coebergh et al.,A new variable phenotype in spinocerebellarataxia 27(SCA 27)caused by a deletion in the FGF14gene.Eur J Paediatr Neurol18,413-415(2014)；Shimojima et al.,Spinocerebellar ataxias type 27derived froma disruption of the fibroblast growth factor 14gene with mimicking phenotypeof paroxysmal non-kinesigenic dyskinesia.Brain Dev 34,230-233(2012)；其每篇的全部内容通过引用并入本文)。最后，手动询问未落入基因内的预测的recCas9靶位点的级分，以确定一些序列是否落入安全港基因座内。使用ENSEMBL中的注释鉴定了基因组靶标，该靶标与Bushman及其同事描述的安全港基因座的五个标准的大多数相匹配(Cunninghamet al.,Ensembl 2015.Nucleic acids research 43,D662-669(2015)；和Sadelain etal.,Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome.Nat RevCancer 12,51-58(2012)，其每篇的全部内容通过引用并入本文)。构建了五种报告物和含有与基因组中序列相同的序列的相应的引导RNA载体对。为了评估recCas9在用不同的引导RNA编程时的正交性，测试了五种引导RNA对与五种报告物的所有组合。

报告物、引导RNA质粒和recCas9表达载体的共转染显示，所测试的五种报告物中的三种导致与recCas9介导的重组一致的显著水平的EGFP阳性细胞。该EGFP表达严格依赖于recCas9表达载体和与报告物构建体上的靶位点序列匹配的引导RNA质粒的共转染(图4A)。当与非关联报告物质粒共转染时，与关联报告物质粒和recCas9载体共转染时引起重组的相同的引导RNA对不能介导重组(图4A)。这些结果证明recCas9活性是正交的，并且当用与侧翼序列匹配的一对引导RNA编程时，仅催化gix相关核心位点处的重组。当未用表达recCas9和引导RNA的载体转染报告物质粒时，没有观察到高于测定的背景水平的重组酶活性。

recCas9产物的特性

表征recCas9介导的报告物质粒重组的产物以证实EGFP表达是recCas9介导的poly-A终止子序列除去的结果。在与recCas9表达载体和与产生关联或非关联引导RNA对的质粒共转染后，对报告物质粒进行染色体5位点1、染色体12和染色体13(FGF14基因座)的测序。温育72小时后，提取附加型DNA(如上所述)并转化到大肠杆菌中以分离报告物质粒。对含有报告物质粒的单菌落进行测序(图4B)。

预期个别菌落含有未修饰的或重组的报告物质粒(图4C)。对于每个生物学重复，对用从每个转染条件分离的报告物质粒转化的平均97个菌落进行测序。若报告物质粒先前与关联引导RNA质粒和recCas9表达载体共转染，则仅观察到重组质粒(图4D)。在两个单独的实验中，重组质粒的百分比范围从染色体5中的位点1的12％到染色体13中的FGF14基因座的平均32％。因此，测序数据与图4A中更早的流式细胞术分析一致。重组质粒的绝对水平略高于EGFP阳性细胞的百分比(图4)。这种差异可能是因为流式细胞术测定没有报告当在单一细胞中存在多个拷贝的报告物质粒时可发生的多个重组事件而出现；甚至单一重组事件可以导致EGFP荧光。结果，EGFP阳性细胞的百分比可以对应于重组报告物质粒的实际百分比的下限。或者，差异可以反映质粒大小和转化效率之间的负相关性(参见例如，Hanahan,Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.J MolBiol 166,557-580(1983)，其全部内容在此通过引用并入)；重组质粒约为5,700个碱基对，并且可以转化得略好于完整质粒(其约为6,900个碱基对)。

由于已经报告锌指重组酶在重组酶核心位点连接处引起突变(参见例如，e.g.,Gaj et al.,A comprehensive approach to zinc-finger recombinase customizationenables genomic targeting in human cells.Nucleic acids research 41,3937-3946(2013)，其全部内容在此通过引用并入)，因此测试了此类诱变是否自recCas9处理发生。在报告物构建体中，recCas9应通过首先切割这两个gix核心位点的中心二核苷酸并然后将两个核心彼此再连接来删除kanR和poly-A终止子(图4C)。因此，重组产物应当是由“左”靶位点的第一半和“右”靶位点的第二半组成的单一重组位点。错误或不完整的反应可以导致其他产物。引人注目的是，所检查的所有134个重组序列都含有预期的重组产物。此外，来自两组分开的转染实验的总共2,317个测序读段显示仅三个含有在其他情况下非重组质粒上潜在的缺失产物的测序读段。

在用pUC对照转染并且缺少两个recCas9靶位点以及polyA终止子的染色体12报告物质粒中观察到这些含有缺失的读段之一。该产物归因于在转染、分离或随后操作期间发生的DNA损伤。因为当与报告物和关联引导RNA表达载体共转染时recCas9仅可以定位于序列，所以更相关的度量可以是测量当与关联引导RNA载体和recCas9表达载体共转染报告物质粒时观察到的缺失产物的总数。从与染色体5-位点1报告物和关联引导RNA的共转染测序的总共185个质粒中观察到单一插入/缺失。类似地，在用关联引导RNA和recCas9表达载体转染后，从来自染色体12报告物的204个质粒中观察到一个插入/缺失。值得注意的是，在202个测序读段中，在关联引导RNA和recCas9共转染后，从染色体13报告物中未观察到插入/缺失，尽管导致观察到的最高重组水平。这些观察结果共同表明recCas9主要介导无错重组。

总之，这些结果建立了recCas9可以在最小的交叉反应性或副产物形成的情况下靶向人基因组内发现的多个位点。仅在存在关联引导RNA序列和recCas9的情况下，底物经历有效重组，在人细胞中产生干净的重组产物，并且通常不导致核心位点连接处的突变或产物诸如由细胞DNA修复产生的插入/缺失。

RecCas9介导的基因组缺失

最后，研究了recCas9是否能够直接在培养的人细胞的基因组DNA上操作。使用人基因组中潜在的recCas9识别位点的列表(表9)，搜索在由recCas9靶向的情况下将产生通过PCR可检测的染色体缺失事件的位点对。设计引导RNA表达载体以将recCas9引导至最接近染色体5-位点1或染色体13(FGF14基因座)的那些recCas9位点，即均显示在瞬时转染测定中重组的位点(图4)。新的靶位点范围为染色体5-位点1的上游约3至23Mbp和下游7至10Mbp，以及染色体13-FGF14位点的上游的12至44Mbp。与这些新的引导RNA对之每种和用于染色体5-位点1或染色体13-FGF14的经验证的引导RNA对共转染recCas9表达载体，但通过基因组PCR未观察到染色体缺失的证据。

若recCas9靶位点在基因组上彼此更接近，则认为基因组缺失可能更有效。鉴定了在FAM19A2的内含子区域内以14.2kb分开的两个recCas9位点；这些位点还含有相同的二核苷酸核心，这应当有助于缺失。FAM19A2是五个密切相关的TAFA家族基因之一，其编码认为在免疫和神经细胞中具有调节作用的小的分泌蛋白(参见例如Parker et al.,Admixturemapping identifies a quantitative trait locus associated with FEV1/FVC in theCOPDGene Study.Genet Epidemiol 38,652-659(2014)，其全部内容在此通过引用并入)。位于FAM19A2的内含子序列中的小核苷酸多态性在全基因组关联研究中与系统性红斑狼疮(SLE)和慢性阻塞性肺病(COPD)的风险升高有关(参见例如，Parker et al.,Admixturemapping identifies a quantitative trait locus associated with FEV1/FVC in theCOPDGene Study.Genet Epidemiol 38,652-659(2014)，其全部内容在此通过引用并入)；因此，该基因的内含子区域的缺失可以了解这些疾病的原因。将四个引导RNA序列克隆到表达载体中，所述表达载体设计以介导这两个FAM19A2位点之间的recCas9缺失。与recCas9表达载体共转染表达这些引导RNA的载体(图5A)。RecCas9介导的两个位点之间的重组应当导致14.2kb居间区域的缺失。实际上，使用位于两个FAM19A2recCas9靶标侧翼的基因特异性引物，通过巢式PCR检测到该缺失事件。仅在从用recCas9和所有四种引导RNA表达载体共转染的细胞分离的基因组DNA中观察到与recCas9介导的缺失一致的预期PCR产物(图5B)。在没有单独的引导RNA表达载体的上游或下游对的情况下，在没有recCas9表达质粒的情况下转染的细胞的基因组DNA中，或对于未转染的对照细胞的基因组DNA，未检测到缺失PCR产物(图5B)。这些巢式PCR产物的估计检测限为每5,500个染色体拷贝约1个缺失事件。分离对应于预测的基因组缺失的415-bp PCR产物并测序。测序证实PCR产物与自重组酶介导的基因组缺失预期的预测连接相匹配，并且不含任何提示NHEJ的插入或缺失(图5C)。

在基因组模板的连续稀释液上使用巢式PCR估计最小基因组缺失效率的下限(参见上文或例如Sykes et al.,Quantitation of targets for PCR by use of limitingdilution.Biotechniques 13,444-449(1992)，其全部内容在此通过引用并入，以获得更多细节)。产生recCas9特异性巢式PCR产物的给定量的基因组DNA必须含有至少一个经编辑的染色体。为了建立该recCas9介导的基因组缺失事件的下限，在基因组DNA(从用recCas9和四种FAM19A2引导RNA表达载体转染的细胞中分离)的连续稀释液上进行巢式PCR，以确定导致可检测的缺失产物的基因组模板DNA的最低浓度。这些实验揭示了0.023±0.017％(三个生物学重复的平均值)的缺失效率的下限(图5D)，表明recCas9介导的基因组缺失以至少该效率进行。未转染细胞的基因组DNA的巢式PCR不产生产物，估计检测限为<0.0072％重组。

其他替代重组酶的使用

称为“36C6”的演化为靶向人基因组的Rosa基因座中位点的Cre重组酶与dCas9融合。然后，将该融合物用于以引导RNA依赖性方式重组含有Rosa靶位点的基于质粒的报告物。图7A证明了使用野生型Cre和36C6的接头优化的结果。显示的1x 2x、5x和8x接头是接头中GGS重复的数量。回复分析证明了对与dCas9融合的36C6进行突变可以影响嵌合融合物的相对引导依赖性(图7B)。回复用其未突变的氨基酸标记。例如，已经突变为M的位置306在进行测定之前回复为I。靶向其关联报告物的GinB构建体用作图7A和7B中所示实验数据的对照。中靶引导是chr13-102010574引导(质粒BC165和166)。显示的缩写是GGS-36C6:dCas9-GGS-36C6；2GGS-36C6(使用接头SEQ ID NO:182):sdCas9-GGSGGS-36C6(使用接头SEQ IDNO:182)。

用于36C6和所有变体转染的靶序列如下所示:(引导物-斜体；Rosa位点-粗体)：

CCTAGGGAAGTGATCATAGCTGAGTTTCTATCTCATGGTTTATGCTAAACTATATGTTGACATGTTGAGGAGACTTAAGTCCAAAACCTGG(SEQ ID NO:760)

在图7A、7B、8、9A和9B中，GinB的中靶引导是chr13-102010574引导(质粒BC165和166)。图7A、7B、8、9A和9B中的所有脱靶引导由chr12-62418577引导(BC163和BC164)构成。

鉴定了人基因组中Rosa26位点侧翼的PAM，其可以支持dCas9结合(图8，上图)。然后设计引导RNA和质粒报告物以测试内源性前间隔区是否可以支持dCas9-36C6活性。靶向其关联报告物的GinB构建体用作对照。见图8。混合：Cas9和36C6之间所有5种接头变体的等份混合物。对于hRosa，靶序列(包括引导RNA靶标)如下：(引导-斜体；Rosa位点-粗体)

CCTGAAATAATGCAAGTGTAGAATAACTTTTTAAAATCTCATGGTTTATGCTAAACTATATGTTGACATAAGAGTGGTGATAAGGCAACAGTAGG(SEQ ID NO:767)

用于hRosa的中靶引导质粒与其他gRNA表达质粒相同，只是前间隔区被上文所示的那些替换(图8)。

dCas9-Cre重组酶融合物的几个测试的Cre截短显示在图9A中。与dCas9融合的Cre重组酶的截短的变体显示出可察觉的重组酶活性以及对Lox质粒报告物系统中引导RNA的存在的严格依赖(图9B)。截短的变体用截短的Cre开始的残基标记。图9A和9B中所示的所有融合蛋白的接头是8xGGS。与dCas9融合的野生型Cre用作阳性对照。用于36C6和所有变体转染的靶序列如下所示:(引导-斜体；Rosa位点-粗体)：

CCTAGGGAAGTGATCATAGCTGAGTTTCTATCTCATGGTTTATGCTAAACTATATGTTGACATGTTGAGGAGACTTAAGTCCAAAACCTGG(SEQ ID NO:768)

使用的中靶引导是chr13-102010574引导(质粒BC165和166)，并且脱靶引导是chr12-62418577引导(BC163和BC164)。

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等同实施方案和范围

本领域技术人员将认识到或能够仅仅使用常规的实验确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等同实施方案。本发明的范围不意图限于以上说明书，而是如所附权利要求中所述。

在权利要求中，诸如“一种”、“一个”和“该”的冠词可以表示一个或超出一个，除非相反地指出或者从上下文中显而易见。若一个、超出一个或所有组成员在给定产物或过程中存在、使用或以其他方式相关，则认为在组中的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明书是满足的，除非另有说明或从上下文中显而易见。本发明包括实施方案，其中组的恰好一个成员在给定产物或过程中存在、使用或以其他方式相关。本发明还包括实施方案，其中超出一个或所有组成员在给定产物或过程中存在、使用或以其他方式相关。

此外，应理解，本发明涵盖所有变型、组合和置换，其中来自一个或多个权利要求或来自说明书的相关部分的一个或多个限制、元素、条款、描述性术语等被引入另一个权利要求中。例如，可以修改依赖于另一个权利要求的任何权利要求以包括在依赖于相同基本权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或多个限制。此外，在权利要求叙述组合物的情况下，应当理解包括将组合物用于本文公开的任何目的的方法，并且包括根据本文公开的任何制备方法或本领域中已知的其他方法制备组合物的方法，除非另有说明或者除非本领域普通技术人员明白会出现矛盾或不一致。

在将元素呈现为列表(例如，以马库什群组格式)的情况下，应当理解，还公开了元素的每个子群，并且可以从群组中移除任何元素。还应注意，术语“包含”旨在是开放的并且允许包含另外的元素或步骤。应当理解，通常，在本发明或本发明的方面称为包含特定元素、特征、步骤等的情况下，本发明或本发明的方面的某些实施方案由此类元素、特征、步骤等组成，或基本上由之组成。出于简化的目的，那些实施方案未在本文中用同样的词语具体阐述。因此，对于包含一个或多个元素、特征、步骤等的本发明的每个实施方案，本发明还提供了由这些元素、特征、步骤等组成或基本上由之组成的实施方案。

在给出范围的情况下，端点包括在内。此外，应当理解，除非另有说明或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显看出，否则表示为范围的值可以假定在本发明的不同实施方案中的所述范围内的任何特定值，至该范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。还应当理解，除非另有说明或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显看出，否则表示为范围的值可以假定给定范围内的任何子范围，其中子范围的端点表示为与范围的下限的单位的十分之一相同的精度。

此外，应当理解，本发明的任何具体实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。在给出范围的情况下，该范围内的任何值可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。本发明的组合物和/或方法的任何实施方案、元素、特征、应用或方面可以从任何一个或多个权利要求中排除。出于简洁的目的，本文未明确阐述其中排除一个或多个元素、特征、目的或方面的所有实施方案。

本文提及的所有出版物、专利和序列数据库条目，包括上面列出的那些项，通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。

序列表

<110> 哈佛大学的校长及成员们

<120> 可编程CAS9-重组酶融合蛋白及其用途

<130> H0824.70243WO00

<140> Not Yet Assigned

<141> 2017-08-09

<150> US 62/456,048

<151> 2017-02-07

<150> US 62/372,755

<151> 2016-08-09

<160> 775

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1368

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

1010 1015 1020

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

1025 1030 1035

Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

1040 1045 1050

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

1055 1060 1065

Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

1070 1075 1080

Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

1085 1090 1095

Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys

1100 1105 1110

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

1115 1120 1125

Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

1130 1135 1140

Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

1145 1150 1155

Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1160 1165 1170

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1175 1180 1185

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1190 1195 1200

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly

1205 1210 1215

Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1220 1225 1230

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys

1250 1255 1260

His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

1265 1270 1275

Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala

1280 1285 1290

Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

1295 1300 1305

Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala

1310 1315 1320

Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser

1325 1330 1335

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

1340 1345 1350

Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

<210> 2

<211> 4104

<212> DNA

<213> 酿脓链球菌

<400> 2

atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60

atcactgatg attataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120

cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg gcagtggaga gacagcggaa 180

gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240

tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300

cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360

aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420

aaattggcag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480

atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540

gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa atctacaatc aattatttga agaaaaccct 600

attaacgcaa gtagagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660

cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga gaaatggctt gtttgggaat 720

ctcattgctt tgtcattggg attgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780

gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840

caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900

ttactttcag atatcctaag agtaaatagt gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960

atgattaagc gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020

caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080

ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140

gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200

aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260

gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320

gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380

cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440

gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500

aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560

tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgagggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620

tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680

gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740

tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggcgcct accatgattt gctaaaaatt 1800

attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860

ttaacattga ccttatttga agataggggg atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920

cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980

cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040

gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100

agtttgacat ttaaagaaga tattcaaaaa gcacaggtgt ctggacaagg ccatagttta 2160

catgaacaga ttgctaactt agctggcagt cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220

gtaaaaattg ttgatgaact ggtcaaagta atggggcata agccagaaaa tatcgttatt 2280

gaaatggcac gtgaaaatca gacaactcaa aagggccaga aaaattcgcg agagcgtatg 2340

aaacgaatcg aagaaggtat caaagaatta ggaagtcaga ttcttaaaga gcatcctgtt 2400

gaaaatactc aattgcaaaa tgaaaagctc tatctctatt atctacaaaa tggaagagac 2460

atgtatgtgg accaagaatt agatattaat cgtttaagtg attatgatgt cgatcacatt 2520

gttccacaaa gtttcattaa agacgattca atagacaata aggtactaac gcgttctgat 2580

aaaaatcgtg gtaaatcgga taacgttcca agtgaagaag tagtcaaaaa gatgaaaaac 2640

tattggagac aacttctaaa cgccaagtta atcactcaac gtaagtttga taatttaacg 2700

aaagctgaac gtggaggttt gagtgaactt gataaagctg gttttatcaa acgccaattg 2760

gttgaaactc gccaaatcac taagcatgtg gcacaaattt tggatagtcg catgaatact 2820

aaatacgatg aaaatgataa acttattcga gaggttaaag tgattacctt aaaatctaaa 2880

ttagtttctg acttccgaaa agatttccaa ttctataaag tacgtgagat taacaattac 2940

catcatgccc atgatgcgta tctaaatgcc gtcgttggaa ctgctttgat taagaaatat 3000

ccaaaacttg aatcggagtt tgtctatggt gattataaag tttatgatgt tcgtaaaatg 3060

attgctaagt ctgagcaaga aataggcaaa gcaaccgcaa aatatttctt ttactctaat 3120

atcatgaact tcttcaaaac agaaattaca cttgcaaatg gagagattcg caaacgccct 3180

ctaatcgaaa ctaatgggga aactggagaa attgtctggg ataaagggcg agattttgcc 3240

acagtgcgca aagtattgtc catgccccaa gtcaatattg tcaagaaaac agaagtacag 3300

acaggcggat tctccaagga gtcaatttta ccaaaaagaa attcggacaa gcttattgct 3360

cgtaaaaaag actgggatcc aaaaaaatat ggtggttttg atagtccaac ggtagcttat 3420

tcagtcctag tggttgctaa ggtggaaaaa gggaaatcga agaagttaaa atccgttaaa 3480

gagttactag ggatcacaat tatggaaaga agttcctttg aaaaaaatcc gattgacttt 3540

ttagaagcta aaggatataa ggaagttaaa aaagacttaa tcattaaact acctaaatat 3600

agtctttttg agttagaaaa cggtcgtaaa cggatgctgg ctagtgccgg agaattacaa 3660

aaaggaaatg agctggctct gccaagcaaa tatgtgaatt ttttatattt agctagtcat 3720

tatgaaaagt tgaagggtag tccagaagat aacgaacaaa aacaattgtt tgtggagcag 3780

cataagcatt atttagatga gattattgag caaatcagtg aattttctaa gcgtgttatt 3840

ttagcagatg ccaatttaga taaagttctt agtgcatata acaaacatag agacaaacca 3900

atacgtgaac aagcagaaaa tattattcat ttatttacgt tgacgaatct tggagctccc 3960

gctgctttta aatattttga tacaacaatt gatcgtaaac gatatacgtc tacaaaagaa 4020

gttttagatg ccactcttat ccatcaatcc atcactggtc tttatgaaac acgcattgat 4080

ttgagtcagc taggaggtga ctga 4104

<210> 3

<211> 1367

<212> PRT

<213> 酿脓链球菌

<400> 3

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Asp Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Gly Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Ala Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Ile Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Arg Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Arg Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Ser Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

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530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Ala Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Gly Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

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675 680 685

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His Glu Gln Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

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740 745 750

His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr

755 760 765

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770 775 780

Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val

785 790 795 800

Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln

805 810 815

Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu

820 825 830

Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Ile Lys Asp

835 840 845

Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly

850 855 860

Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn

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885 890 895

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915 920 925

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930 935 940

Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys

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Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu

965 970 975

Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

980 985 990

Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val

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Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn

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1070 1075 1080

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1085 1090 1095

Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg

1100 1105 1110

Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys

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Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser

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Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe

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Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe

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Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu

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Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg

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Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr

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Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile

1295 1300 1305

Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe

1310 1315 1320

Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr

1325 1330 1335

Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly

1340 1345 1350

Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

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<210> 4

<211> 4212

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 4

atggataaaa agtattctat tggtttagac atcggcacta attccgttgg atgggctgtc 60

ataaccgatg aatacaaagt accttcaaag aaatttaagg tgttggggaa cacagaccgt 120

cattcgatta aaaagaatct tatcggtgcc ctcctattcg atagtggcga aacggcagag 180

gcgactcgcc tgaaacgaac cgctcggaga aggtatacac gtcgcaagaa ccgaatatgt 240

tacttacaag aaatttttag caatgagatg gccaaagttg acgattcttt ctttcaccgt 300

ttggaagagt ccttccttgt cgaagaggac aagaaacatg aacggcaccc catctttgga 360

aacatagtag atgaggtggc atatcatgaa aagtacccaa cgatttatca cctcagaaaa 420

aagctagttg actcaactga taaagcggac ctgaggttaa tctacttggc tcttgcccat 480

atgataaagt tccgtgggca ctttctcatt gagggtgatc taaatccgga caactcggat 540

gtcgacaaac tgttcatcca gttagtacaa acctataatc agttgtttga agagaaccct 600

ataaatgcaa gtggcgtgga tgcgaaggct attcttagcg cccgcctctc taaatcccga 660

cggctagaaa acctgatcgc acaattaccc ggagagaaga aaaatgggtt gttcggtaac 720

cttatagcgc tctcactagg cctgacacca aattttaagt cgaacttcga cttagctgaa 780

gatgccaaat tgcagcttag taaggacacg tacgatgacg atctcgacaa tctactggca 840

caaattggag atcagtatgc ggacttattt ttggctgcca aaaaccttag cgatgcaatc 900

ctcctatctg acatactgag agttaatact gagattacca aggcgccgtt atccgcttca 960

atgatcaaaa ggtacgatga acatcaccaa gacttgacac ttctcaaggc cctagtccgt 1020

cagcaactgc ctgagaaata taaggaaata ttctttgatc agtcgaaaaa cgggtacgca 1080

ggttatattg acggcggagc gagtcaagag gaattctaca agtttatcaa acccatatta 1140

gagaagatgg atgggacgga agagttgctt gtaaaactca atcgcgaaga tctactgcga 1200

aagcagcgga ctttcgacaa cggtagcatt ccacatcaaa tccacttagg cgaattgcat 1260

gctatactta gaaggcagga ggatttttat ccgttcctca aagacaatcg tgaaaagatt 1320

gagaaaatcc taacctttcg cataccttac tatgtgggac ccctggcccg agggaactct 1380

cggttcgcat ggatgacaag aaagtccgaa gaaacgatta ctccatggaa ttttgaggaa 1440

gttgtcgata aaggtgcgtc agctcaatcg ttcatcgaga ggatgaccaa ctttgacaag 1500

aatttaccga acgaaaaagt attgcctaag cacagtttac tttacgagta tttcacagtg 1560

tacaatgaac tcacgaaagt taagtatgtc actgagggca tgcgtaaacc cgcctttcta 1620

agcggagaac agaagaaagc aatagtagat ctgttattca agaccaaccg caaagtgaca 1680

gttaagcaat tgaaagagga ctactttaag aaaattgaat gcttcgattc tgtcgagatc 1740

tccggggtag aagatcgatt taatgcgtca cttggtacgt atcatgacct cctaaagata 1800

attaaagata aggacttcct ggataacgaa gagaatgaag atatcttaga agatatagtg 1860

ttgactctta ccctctttga agatcgggaa atgattgagg aaagactaaa aacatacgct 1920

cacctgttcg acgataaggt tatgaaacag ttaaagaggc gtcgctatac gggctgggga 1980

cgattgtcgc ggaaacttat caacgggata agagacaagc aaagtggtaa aactattctc 2040

gattttctaa agagcgacgg cttcgccaat aggaacttta tgcagctgat ccatgatgac 2100

tctttaacct tcaaagagga tatacaaaag gcacaggttt ccggacaagg ggactcattg 2160

cacgaacata ttgcgaatct tgctggttcg ccagccatca aaaagggcat actccagaca 2220

gtcaaagtag tggatgagct agttaaggtc atgggacgtc acaaaccgga aaacattgta 2280

atcgagatgg cacgcgaaaa tcaaacgact cagaaggggc aaaaaaacag tcgagagcgg 2340

atgaagagaa tagaagaggg tattaaagaa ctgggcagcc agatcttaaa ggagcatcct 2400

gtggaaaata cccaattgca gaacgagaaa ctttacctct attacctaca aaatggaagg 2460

gacatgtatg ttgatcagga actggacata aaccgtttat ctgattacga cgtcgatcac 2520

attgtacccc aatccttttt gaaggacgat tcaatcgaca ataaagtgct tacacgctcg 2580

gataagaacc gagggaaaag tgacaatgtt ccaagcgagg aagtcgtaaa gaaaatgaag 2640

aactattggc ggcagctcct aaatgcgaaa ctgataacgc aaagaaagtt cgataactta 2700

actaaagctg agaggggtgg cttgtctgaa cttgacaagg ccggatttat taaacgtcag 2760

ctcgtggaaa cccgccaaat cacaaagcat gttgcacaga tactagattc ccgaatgaat 2820

acgaaatacg acgagaacga taagctgatt cgggaagtca aagtaatcac tttaaagtca 2880

aaattggtgt cggacttcag aaaggatttt caattctata aagttaggga gataaataac 2940

taccaccatg cgcacgacgc ttatcttaat gccgtcgtag ggaccgcact cattaagaaa 3000

tacccgaagc tagaaagtga gtttgtgtat ggtgattaca aagtttatga cgtccgtaag 3060

atgatcgcga aaagcgaaca ggagataggc aaggctacag ccaaatactt cttttattct 3120

aacattatga atttctttaa gacggaaatc actctggcaa acggagagat acgcaaacga 3180

cctttaattg aaaccaatgg ggagacaggt gaaatcgtat gggataaggg ccgggacttc 3240

gcgacggtga gaaaagtttt gtccatgccc caagtcaaca tagtaaagaa aactgaggtg 3300

cagaccggag ggttttcaaa ggaatcgatt cttccaaaaa ggaatagtga taagctcatc 3360

gctcgtaaaa aggactggga cccgaaaaag tacggtggct tcgatagccc tacagttgcc 3420

tattctgtcc tagtagtggc aaaagttgag aagggaaaat ccaagaaact gaagtcagtc 3480

aaagaattat tggggataac gattatggag cgctcgtctt ttgaaaagaa ccccatcgac 3540

ttccttgagg cgaaaggtta caaggaagta aaaaaggatc tcataattaa actaccaaag 3600

tatagtctgt ttgagttaga aaatggccga aaacggatgt tggctagcgc cggagagctt 3660

caaaagggga acgaactcgc actaccgtct aaatacgtga atttcctgta tttagcgtcc 3720

cattacgaga agttgaaagg ttcacctgaa gataacgaac agaagcaact ttttgttgag 3780

cagcacaaac attatctcga cgaaatcata gagcaaattt cggaattcag taagagagtc 3840

atcctagctg atgccaatct ggacaaagta ttaagcgcat acaacaagca cagggataaa 3900

cccatacgtg agcaggcgga aaatattatc catttgttta ctcttaccaa cctcggcgct 3960

ccagccgcat tcaagtattt tgacacaacg atagatcgca aacgatacac ttctaccaag 4020

gaggtgctag acgcgacact gattcaccaa tccatcacgg gattatatga aactcggata 4080

gatttgtcac agcttggggg tgacggatcc cccaagaaga agaggaaagt ctcgagcgac 4140

tacaaagacc atgacggtga ttataaagat catgacatcg attacaagga tgacgatgac 4200

aaggctgcag ga 4212

<210> 5

<211> 1368

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 5

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Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

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Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

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740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

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770 775 780

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805 810 815

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820 825 830

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835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

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865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

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930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

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1010 1015 1020

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1025 1030 1035

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1040 1045 1050

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1070 1075 1080

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1100 1105 1110

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

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Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

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Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

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Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1160 1165 1170

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1175 1180 1185

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1190 1195 1200

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly

1205 1210 1215

Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1220 1225 1230

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1235 1240 1245

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Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

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Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala

1310 1315 1320

Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser

1325 1330 1335

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

1340 1345 1350

Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 6

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 7

Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser

1 5 10 15

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 8

Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 9

Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser

20

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 10

Val Pro Phe Leu Leu Glu Pro Asp Asn Ile Asn Gly Lys Thr Cys

1 5 10 15

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 11

Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe

1 5 10

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 12

Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 13

Met Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro Ser Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 14

Val Arg His Lys Leu Lys Arg Val Gly Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 15

Gly His Gly Thr Gly Ser Thr Gly Ser Gly Ser Ser

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 16

Met Ser Arg Pro Asp Pro Ala

1 5

<210> 17

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 17

Gly Gly Ser Met

1

<210> 18

<400> 18

000

<210> 19

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4)

<223> n是a, c, g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(9)

<223> s是g或c

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> w是a, t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> s是g或c

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(17)

<223> n是a, c, g或u

<400> 19

nnnnaaassw wssnnnn 17

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 20

ggtgtttcgt cctttccaca ag 22

<210> 21

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 21

gcacactagt tagggataac agttttagag ctagaaatag c 41

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 22

gcccatgacc cttctcctct gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 23

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 23

gctcagggcc tgtgatggga ggttttagag ctagaaatag c 41

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ggcccatgac ccttctcctc gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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gcctcagggc ctgtgatggg agttttagag ctagaaatag c 41

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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gacttgaaac actctttttc gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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gagttgaaga cacacaacac agttttagag ctagaaatag c 41

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ggaactcatg tgattaactg gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 29

<211> 41

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<220>

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gtctacctct catgagccgg tgttttagag ctagaaatag c 41

<210> 30

<211> 41

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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gtttcccgca ggatgtggga tgttttagag ctagaaatag c 41

<210> 31

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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gcctggggat ttatgttctt agttttagag ctagaaatag c 41

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<211> 41

<212> DNA

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<220>

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gaaatagcac aatgaatgga agttttagag ctagaaatag c 41

<210> 33

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 33

gactttttgg gggagaggga ggttttagag ctagaaatag c 41

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ggagacttaa gtccaaaacc gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 35

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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gtcagctatg atcacttccc tgttttagag ctagaaatag c 41

<210> 36

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcgtctcggc gtccccaatt ttcccaaaca gaggtctgta aaccgaggtg agacgg 56

<210> 37

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 37

ccgtctcacc tcggtttaca gacctctgtt tgggaaaatt ggggacgccg agacga 56

<210> 38

<211> 57

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 38

tcgtctcggc gtccccaatt ttcccaaaca gaggttctgt aaaccgaggt gagacgg 57

<210> 39

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 39

ccgtctcacc tcggtttaca gaacctctgt ttgggaaaat tggggacgcc gagacga 57

<210> 40

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 40

tcgtctcggc gtccccaatt ttcccaaaca gaggtatctg taaaccgagg tgagacgg 58

<210> 41

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 41

ccgtctcacc tcggtttaca gatacctctg tttgggaaaa ttggggacgc cgagacga 58

<210> 42

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 42

tcgtctcggc gtccccaatt ttcccaaaca gaggtaatct gtaaaccgag gtgagacgg 59

<210> 43

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 43

ccgtctcacc tcggtttaca gattacctct gtttgggaaa attggggacg ccgagacga 59

<210> 44

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 44

tcgtctcggc gtccccaatt ttcccaaaca gaggtaaatc tgtaaaccga ggtgagacgg 60

<210> 45

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 45

ccgtctcacc tcggtttaca gatttacctc tgtttgggaa aattggggac gccgagacga 60

<210> 46

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcgtctcggc gtccccaatt ttcccaaaca gaggtgaaat ctgtaaaccg aggtgagacg 60

g 61

<210> 47

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccgtctcacc tcggtttaca gatttcacct ctgtttggga aaattgggga cgccgagacg 60

a 61

<210> 48

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 48

tcgtctcggc gtccccaatt ttcccaaaca gaggtcgaaa tctgtaaacc gaggtgagac 60

gg 62

<210> 49

<211> 62

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 49

ccgtctcacc tcggtttaca gatttcgacc tctgtttggg aaaattgggg acgccgagac 60

ga 62

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcgtctcggc gtccccaatt ttcccaaaca gaggttcgaa atctgtaaac cgaggtgaga 60

cgg 63

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<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccgtctcacc tcggtttaca gatttcgaac ctctgtttgg gaaaattggg gacgccgaga 60

cga 63

<210> 52

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcgtctcgga ggttttggaa cctctgtttg ggaaaattgg ggagtctgag acgg 54

<210> 53

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccgtctcaga ctccccaatt ttcccaaaca gaggttccaa aacctccgag acga 54

<210> 54

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcgtctcgga ggttttggac acctctgttt gggaaaattg gggagtctga gacgg 55

<210> 55

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccgtctcaga ctccccaatt ttcccaaaca gaggtgtcca aaacctccga gacga 55

<210> 56

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 56

tcgtctcgga ggttttggac tacctctgtt tgggaaaatt ggggagtctg agacgg 56

<210> 57

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 57

ccgtctcaga ctccccaatt ttcccaaaca gaggtagtcc aaaacctccg agacga 56

<210> 58

<211> 57

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 58

tcgtctcgga ggttttggac ttacctctgt ttgggaaaat tggggagtct gagacgg 57

<210> 59

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccgtctcaga ctccccaatt ttcccaaaca gaggtaagtc caaaacctcc gagacga 57

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<211> 58

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcgtctcgga ggttttggac ttaacctctg tttgggaaaa ttggggagtc tgagacgg 58

<210> 61

<211> 58

<212> DNA

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<220>

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ccgtctcaga ctccccaatt ttcccaaaca gaggttaagt ccaaaacctc cgagacga 58

<210> 62

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcgtctcgga ggttttggac ttagacctct gtttgggaaa attggggagt ctgagacgg 59

<210> 63

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 63

ccgtctcaga ctccccaatt ttcccaaaca gaggtctaag tccaaaacct ccgagacga 59

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<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcgtctcgga ggttttggac ttagcacctc tgtttgggaa aattggggag tctgagacgg 60

<210> 65

<211> 60

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 65

ccgtctcaga ctccccaatt ttcccaaaca gaggtgctaa gtccaaaacc tccgagacga 60

<210> 66

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcgtctcgga ggttttggac ttagctacct ctgtttggga aaattgggga gtctgagacg 60

g 61

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccgtctcaga ctccccaatt ttcccaaaca gaggtagcta agtccaaaac ctccgagacg 60

a 61

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<210> 71

<211> 55

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccgtctcatc ggtttacaga acctctgttt gggaaaattg ggggtgcaga gacga 55

<210> 72

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 72

tcgtctctgc acccccaatt ttcccaaaca gaggtatctg taaaccgatg agacgg 56

<210> 73

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 73

ccgtctcatc ggtttacaga tacctctgtt tgggaaaatt gggggtgcag agacga 56

<210> 74

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 74

tcgtctctgc acccccaatt ttcccaaaca gaggtaatct gtaaaccgat gagacgg 57

<210> 75

<211> 57

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccgtctcatc ggtttacaga ttacctctgt ttgggaaaat tgggggtgca gagacga 57

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<212> DNA

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<220>

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tcgtctctgc acccccaatt ttcccaaaca gaggtaaatc tgtaaaccga tgagacgg 58

<210> 77

<211> 58

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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<220>

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tcgtctctgc acccccaatt ttcccaaaca gaggtgaaat ctgtaaaccg atgagacgg 59

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<211> 59

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<220>

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ccgtctcatc ggtttacaga tttcacctct gtttgggaaa attgggggtg cagagacga 59

<210> 80

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcgtctctgc acccccaatt ttcccaaaca gaggtcgaaa tctgtaaacc gatgagacgg 60

<210> 81

<211> 60

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccgtctcatc ggtttacaga tttcgacctc tgtttgggaa aattgggggt gcagagacga 60

<210> 82

<211> 61

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcgtctctgc acccccaatt ttcccaaaca gaggttcgaa atctgtaaac cgatgagacg 60

g 61

<210> 83

<211> 61

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 83

ccgtctcatc ggtttacaga tttcgaacct ctgtttggga aaattggggg tgcagagacg 60

a 61

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 84

tcgtctcgcc gaggttttgg aacctctgtt tgggaaaatt ggggctcgtg agacgg 56

<210> 85

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 85

ccgtctcacg agccccaatt ttcccaaaca gaggttccaa aacctcggcg agacga 56

<210> 86

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 86

tcgtctcgcc gaggttttgg acacctctgt ttgggaaaat tggggctcgt gagacgg 57

<210> 87

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 87

ccgtctcacg agccccaatt ttcccaaaca gaggtgtcca aaacctcggc gagacga 57

<210> 88

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 88

tcgtctcgcc gaggttttgg actacctctg tttgggaaaa ttggggctcg tgagacgg 58

<210> 89

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 89

ccgtctcacg agccccaatt ttcccaaaca gaggtagtcc aaaacctcgg cgagacga 58

<210> 90

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 90

tcgtctcgcc gaggttttgg acttacctct gtttgggaaa attggggctc gtgagacgg 59

<210> 91

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 91

ccgtctcacg agccccaatt ttcccaaaca gaggtaagtc caaaacctcg gcgagacga 59

<210> 92

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 92

tcgtctcgcc gaggttttgg acttaacctc tgtttgggaa aattggggct cgtgagacgg 60

<210> 93

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 93

ccgtctcacg agccccaatt ttcccaaaca gaggttaagt ccaaaacctc ggcgagacga 60

<210> 94

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 94

tcgtctcgcc gaggttttgg acttagacct ctgtttggga aaattggggc tcgtgagacg 60

g 61

<210> 95

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 95

ccgtctcacg agccccaatt ttcccaaaca gaggtctaag tccaaaacct cggcgagacg 60

a 61

<210> 96

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 96

tcgtctcgcc gaggttttgg acttagcacc tctgtttggg aaaattgggg ctcgtgagac 60

gg 62

<210> 97

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccgtctcacg agccccaatt ttcccaaaca gaggtgctaa gtccaaaacc tcggcgagac 60

ga 62

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 98

tcgtctcgcc gaggttttgg acttagctac ctctgtttgg gaaaattggg gctcgtgaga 60

cgg 63

<210> 99

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 99

ccgtctcacg agccccaatt ttcccaaaca gaggtagcta agtccaaaac ctcggcgaga 60

cga 63

<210> 100

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 100

tcgtctcggc gtcccctccc atcacaggcc ctgaggttta agagaaaacc tgagacgg 58

<210> 101

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 101

ccgtctcagg ttttctctta aacctcaggg cctgtgatgg gaggggacgc cgagacga 58

<210> 102

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 102

tcgtctcgaa ccatggtttt gtgggccagg cccatgaccc ttctcctctg ggagtctgag 60

acgg 64

<210> 103

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccgtctcaga ctcccagagg agaagggtca tgggcctggc ccacaaaacc atggttcgag 60

acga 64

<210> 104

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 104

tcgtctctgc accccctccc atcacaggcc ctgaggttta agagaaaacc attgagacgg 60

<210> 105

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<212> DNA

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<220>

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ccgtctcaat ggttttctct taaacctcag ggcctgtgat gggagggggt gcagagacga 60

<210> 106

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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tcgtctcgcc atggttttgt gggccaggcc catgaccctt ctcctctggg ctcgtgagac 60

gg 62

<210> 107

<211> 62

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 107

ccgtctcacg agcccagagg agaagggtca tgggcctggc ccacaaaacc atggcgagac 60

ga 62

<210> 108

<211> 43

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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atccgtctcc agtcgagtcg gatttgatct gatcaagaga cag 43

<210> 109

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<220>

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aaccgtctcg gtgcgttcgg atttgatcca gacatgataa gatac 45

<210> 110

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 110

hscgcgttga gacgctgcca tccgtctcgc 30

<210> 111

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 111

hstcgagcga gacggatggc agcgtctcaa 30

<210> 112

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 112

gttgttcgtc tcggcgtcct tgtgttgtgt gtcttcaact cacagagtta aacgatgctt 60

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<212> DNA

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<220>

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gttggtcgtc tctgcaccct tgtgttgtgt gtcttcaact cacagagtta aacgatgctt 60

tacacagagt agacttgaaa cactcttttt ctggctcgtg agacggttct gttttggtgt 120

gattagttat 130

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<212> DNA

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<220>

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<400> 114

gttgttcgtc tcggcgtccc accggctcat gagaggtaga gctaaggtcc aaacctaggt 60

ttatctgaga ccggaactca tgtgattaac tgtggagtct gagacggttc tgttttggtg 120

tgattagtta t 131

<210> 115

<211> 131

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 115

gttggtcgtc tctgcacccc accggctcat gagaggtaga gctaaggtcc aaacctaggt 60

ttatctgaga ccggaactca tgtgattaac tgtggctcgt gagacggttc tgttttggtg 120

tgattagtta t 131

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<212> DNA

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<220>

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gttgttcgtc tcggcgtcct taagaacata aatccccagg aattcacaga aaccttggtt 60

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gattagttat 130

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<212> DNA

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<220>

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gttggtcgtc tctgcaccct taagaacata aatccccagg aattcacaga aaccttggtt 60

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gattagttat 130

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<220>

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gttgttcgtc tcggcgtcca ctccctctcc cccaaaaagt aaaggtagaa aaccaaggtt 60

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attagttat 129

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<211> 129

<212> DNA

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<220>

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gttggtcgtc tctgcaccca ctccctctcc cccaaaaagt aaaggtagaa aaccaaggtt 60

tacaggcaac aaatagcaca atgaatggaa tggctcgtga gacggttctg ttttggtgtg 120

attagttat 129

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<212> DNA

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<220>

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gttgttcgtc tcggcgtcct agggaagtga tcatagctga gtttctggaa aaacctaggt 60

tttaaagttg aggagactta agtccaaaac ctggagtctg agacggttct gttttggtgt 120

gattagttat 130

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<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 121

gttggtcgtc tctgcaccct agggaagtga tcatagctga gtttctggaa aaacctaggt 60

tttaaagttg aggagactta agtccaaaac ctggctcgtg agacggttct gttttggtgt 120

gattagttat 130

<210> 122

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 122

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<212> DNA

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<220>

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ttcatcggat ccggtggttc aggtggcagc ggag 34

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ttcatcggat ccggagggtc cggaggtagt ggcggcagcg gtggttcagg tggcagcgga 60

g 61

<210> 125

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 125

aataaccggt tcagaccttc cttttcttct ttggggaacc tcccttgtcg tcatcatcct 60

tataatcgga gccaccgtca cccccaagct gtgacaaatc 100

<210> 126

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 126

tgataaggat ccaccctttg gtggtcttcc aaaccgcc 38

<210> 127

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 127

tgataaggat ccaccgctac caccctttgg tggtcttc 38

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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agatccgcgg ccgctaatac 20

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<211> 54

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 129

ttgagtcgtc tctatactct tcctttttca atattattga agcatttatc aggg 54

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ctggaacgtc tcactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg 50

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 131

ggtgtgcgtc tctacagtta tttgccgact accttggtga tctcgc 46

<210> 132

<211> 36

<212> DNA

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<220>

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acaccacgtc tctgtatgag ggaagcggtg atcgcc 36

<210> 133

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag gg 42

<210> 134

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattg 37

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<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagttt gccgactacc ttggtgatct 60

cg 62

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<212> DNA

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<220>

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caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta tttgccgact accttggtga 60

tctcg 65

<210> 137

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 137

ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tg 42

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 138

cgcaaatggg cggtaggcgt g 21

<210> 139

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 139

ccgtgatgga ttggtgaatc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 140

cccatacgat ttcacctgtc 20

<210> 141

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 141

gggtattttc cacaggatgc 20

<210> 142

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 142

cttagaaagg cgggtttacg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 143

cttactaagc tgcaatttgg 20

<210> 144

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 144

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 145

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 146

gttccgcgca catttcc 17

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 147

gcggagccta tggaaaaac 19

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 148

gccttcttct ttttcctaca gc 22

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 149

cgcatcgagc gagcac 16

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 150

tcaagtagca aaagaagtag gagtcag 27

<210> 151

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 151

ttagatgcat tcgtgcttga ag 22

<210> 152

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 152

ttaatttctg ctgctagaac taaatctgg 29

<210> 153

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 153

gggaagaaaa ctggatggag aatg 24

<210> 154

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 154

cataaatgac ctagtggagc tg 22

<210> 155

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 155

tggttatttt gcccattagt tgatgc 26

<210> 156

<211> 1318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 156

acgcgtcccc aattttccca aacagaggtc tgtaaaccga ggttttggaa cctctgtttg 60

ggaaaattgg ggagtcgagt cggatttgat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc 120

gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat 180

tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt 240

cagtcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa 300

ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct 360

gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg 420

caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca 480

atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat 540

cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac 600

gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc 660

gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa 720

aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag 780

gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc 840

ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt 900

cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca 960

acctgccatc acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa 1020

tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct 1080

tcgcccaccc catcgataac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 1140

gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 1200

aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tcaaatccga acgcaccccc aattttccca 1260

aacagaggtc tgtaaaccga ggttttggaa cctctgtttg ggaaaattgg ggctcgag 1318

<210> 157

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 157

ccccaatttt cccaaacaga ggttctgtaa accgaggttt tggaacctct gtttgggaaa 60

attgggg 67

<210> 158

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 158

ccccaatttt cccaaacaga ggttctgtaa accgaggttt tggcaacctc tgtttgggaa 60

aattgggg 68

<210> 159

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 159

ccccaatttt cccaaacaga ggtatctgta aaccgaggtt ttggctaacc tctgtttggg 60

aaaattgggg 70

<210> 160

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 160

ccccaatttt cccaaacaga ggtaatctgt aaaccgaggt tttggcttaa cctctgtttg 60

ggaaaattgg gg 72

<210> 161

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 161

ccccaatttt cccaaacaga ggtaaatctg taaaccgagg ttttggctta aacctctgtt 60

tgggaaaatt gggg 74

<210> 162

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 162

ccccaatttt cccaaacaga ggtgaaatct gtaaaccgag gttttggctt agaacctctg 60

tttgggaaaa ttgggg 76

<210> 163

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 163

ccccaatttt cccaaacaga ggtcgaaatc tgtaaaccga ggttttggct tagcaacctc 60

tgtttgggaa aattgggg 78

<210> 164

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 164

ccccaatttt cccaaacaga ggttcgaaat ctgtaaaccg aggttttggc ttagctaacc 60

tctgtttggg aaaattgggg 80

<210> 165

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 165

ccccaatttt cccaaacaga ggttcgaaat ctgtaaaccg aggttttgga acctctgttt 60

gggaaaattg ggg 73

<210> 166

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 166

ccccaatttt cccaaacaga ggttcgaaat ctgtaaaccg aggttttggc aacctctgtt 60

tgggaaaatt gggg 74

<210> 167

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 167

ccccaatttt cccaaacaga ggtcgaaatc tgtaaaccga ggttttggct aacctctgtt 60

tgggaaaatt gggg 74

<210> 168

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 168

ccccaatttt cccaaacaga ggtcgaaatc tgtaaaccga ggttttggct taaacctctg 60

tttgggaaaa ttgggg 76

<210> 169

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 169

ccccaatttt cccaaacaga ggtcgaaatc tgtaaaccga ggttttggct tagaacctct 60

gtttgggaaa attgggg 77

<210> 170

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 170

ccccaatttt cccaaacaga ggtctgtaaa ccgaggtttt ggcttagcaa cctctgtttg 60

ggaaaattgg gg 72

<210> 171

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 171

ccccaatttt cccaaacaga ggttctgtaa accgaggttt tggcttagca acctctgttt 60

gggaaaattg ggg 73

<210> 172

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 172

ccccaatttt cccaaacaga ggtatctgta aaccgaggtt ttggcttagc aacctctgtt 60

tgggaaaatt gggg 74

<210> 173

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 173

ccccaatttt cccaaacaga ggtaatctgt aaaccgaggt tttggcttag caacctctgt 60

ttgggaaaat tgggg 75

<210> 174

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 174

ccccaatttt cccaaacaga ggtaaatctg taaaccgagg ttttggctta gcaacctctg 60

tttgggaaaa ttgggg 76

<210> 175

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 175

ccccaatttt cccaaacaga ggtgaaatct gtaaaccgag gttttggctt agcaacctct 60

gtttgggaaa attgggg 77

<210> 176

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 176

cccctcccat cacaggccct gaggtttaag agaaaaccat ggttttgtgg gccaggccca 60

tgacccttct cctctggg 78

<210> 177

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 177

ccttgtgttg tgtgtcttca actcacagag ttaaacgatg ctttacacag agtagacttg 60

aaacactctt tttctgg 77

<210> 178

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 178

ccaccggctc atgagaggta gagctaaggt ccaaacctag gtttatctga gaccggaact 60

catgtgatta actgtgg 77

<210> 179

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 179

ccttaagaac ataaatcccc aggaattcac agaaaccttg gtttgagctt tggatttccc 60

gcaggatgtg ggatagg 77

<210> 180

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 180

ccactccctc tcccccaaaa agtaaaggta gaaaaccaag gtttacaggc aacaaatagc 60

acaatgaatg gaatgg 76

<210> 181

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 181

cctagggaag tgatcatagc tgagtttctg gaaaaaccta ggttttaaag ttgaggagac 60

ttaagtccaa aacctgg 77

<210> 182

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 182

Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 183

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 183

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

20

<210> 184

<211> 4665

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 184

atgctcattg gctacgtgcg cgtctcaact aacgaccaga ataccgatct tcagaggaac 60

gcactggttt gtgcaggctg cgaacagatt ttcgaggaca aactcagcgg gacacggacg 120

gacagacctg gcctcaagcg agcactcaag aggctgcaga aaggagacac tctggtggtc 180

tggaaattgg accgcctggg tcgaagcatg aagcatctca tttctctggt tggcgaactg 240

cgagaaaggg ggatcaactt tcgaagtctg acggattcca tagatacaag cagccccatg 300

ggccggttct tcttctacgt gatgggtgca ctggctgaaa tggaaagaga actcattata 360

gagcgaacca tggcagggct tgcggctgcc aggaataaag gcaggcggtt tggaagacca 420

ccaaagggtg gatccggagg gtccggaggt agtggcggca gcggtggttc aggtggcagc 480

ggagggtcag gaggctctga taaaaagtat tctattggtt tagctatcgg cactaattcc 540

gttggatggg ctgtcataac cgatgaatac aaagtacctt caaagaaatt taaggtgttg 600

gggaacacag accgtcattc gattaaaaag aatcttatcg gtgccctcct attcgatagt 660

ggcgaaacgg cagaggcgac tcgcctgaaa cgaaccgctc ggagaaggta tacacgtcgc 720

aagaaccgaa tatgttactt acaagaaatt tttagcaatg agatggccaa agttgacgat 780

tctttctttc accgtttgga agagtccttc cttgtcgaag aggacaagaa acatgaacgg 840

caccccatct ttggaaacat agtagatgag gtggcatatc atgaaaagta cccaacgatt 900

tatcacctca gaaaaaagct agttgactca actgataaag cggacctgag gttaatctac 960

ttggctcttg cccatatgat aaagttccgt gggcactttc tcattgaggg tgatctaaat 1020

ccggacaact cggatgtcga caaactgttc atccagttag tacaaaccta taatcagttg 1080

tttgaagaga accctataaa tgcaagtggc gtggatgcga aggctattct tagcgcccgc 1140

ctctctaaat cccgacggct agaaaacctg atcgcacaat tacccggaga gaagaaaaat 1200

gggttgttcg gtaaccttat agcgctctca ctaggcctga caccaaattt taagtcgaac 1260

ttcgacttag ctgaagatgc caaattgcag cttagtaagg acacgtacga tgacgatctc 1320

gacaatctac tggcacaaat tggagatcag tatgcggact tatttttggc tgccaaaaac 1380

cttagcgatg caatcctcct atctgacata ctgagagtta atactgagat taccaaggcg 1440

ccgttatccg cttcaatgat caaaaggtac gatgaacatc accaagactt gacacttctc 1500

aaggccctag tccgtcagca actgcctgag aaatataagg aaatattctt tgatcagtcg 1560

aaaaacgggt acgcaggtta tattgacggc ggagcgagtc aagaggaatt ctacaagttt 1620

atcaaaccca tattagagaa gatggatggg acggaagagt tgcttgtaaa actcaatcgc 1680

gaagatctac tgcgaaagca gcggactttc gacaacggta gcattccaca tcaaatccac 1740

ttaggcgaat tgcatgctat acttagaagg caggaggatt tttatccgtt cctcaaagac 1800

aatcgtgaaa agattgagaa aatcctaacc tttcgcatac cttactatgt gggacccctg 1860

gcccgaggga actctcggtt cgcatggatg acaagaaagt ccgaagaaac gattactcca 1920

tggaattttg aggaagttgt cgataaaggt gcgtcagctc aatcgttcat cgagaggatg 1980

accaactttg acaagaattt accgaacgaa aaagtattgc ctaagcacag tttactttac 2040

gagtatttca cagtgtacaa tgaactcacg aaagttaagt atgtcactga gggcatgcgt 2100

aaacccgcct ttctaagcgg agaacagaag aaagcaatag tagatctgtt attcaagacc 2160

aaccgcaaag tgacagttaa gcaattgaaa gaggactact ttaagaaaat tgaatgcttc 2220

gattctgtcg agatctccgg ggtagaagat cgatttaatg cgtcacttgg tacgtatcat 2280

gacctcctaa agataattaa agataaggac ttcctggata acgaagagaa tgaagatatc 2340

ttagaagata tagtgttgac tcttaccctc tttgaagatc gggaaatgat tgaggaaaga 2400

ctaaaaacat acgctcacct gttcgacgat aaggttatga aacagttaaa gaggcgtcgc 2460

tatacgggct ggggacgatt gtcgcggaaa cttatcaacg ggataagaga caagcaaagt 2520

ggtaaaacta ttctcgattt tctaaagagc gacggcttcg ccaataggaa ctttatgcag 2580

ctgatccatg atgactcttt aaccttcaaa gaggatatac aaaaggcaca ggtttccgga 2640

caaggggact cattgcacga acatattgcg aatcttgctg gttcgccagc catcaaaaag 2700

ggcatactcc agacagtcaa agtagtggat gagctagtta aggtcatggg acgtcacaaa 2760

ccggaaaaca ttgtaatcga gatggcacgc gaaaatcaaa cgactcagaa ggggcaaaaa 2820

aacagtcgag agcggatgaa gagaatagaa gagggtatta aagaactggg cagccagatc 2880

ttaaaggagc atcctgtgga aaatacccaa ttgcagaacg agaaacttta cctctattac 2940

ctacaaaatg gaagggacat gtatgttgat caggaactgg acataaaccg tttatctgat 3000

tacgacgtcg atgccattgt accccaatcc tttttgaagg acgattcaat cgacaataaa 3060

gtgcttacac gctcggataa gaaccgaggg aaaagtgaca atgttccaag cgaggaagtc 3120

gtaaagaaaa tgaagaacta ttggcggcag ctcctaaatg cgaaactgat aacgcaaaga 3180

aagttcgata acttaactaa agctgagagg ggtggcttgt ctgaacttga caaggccgga 3240

tttattaaac gtcagctcgt ggaaacccgc caaatcacaa agcatgttgc acagatacta 3300

gattcccgaa tgaatacgaa atacgacgag aacgataagc tgattcggga agtcaaagta 3360

atcactttaa agtcaaaatt ggtgtcggac ttcagaaagg attttcaatt ctataaagtt 3420

agggagataa ataactacca ccatgcgcac gacgcttatc ttaatgccgt cgtagggacc 3480

gcactcatta agaaataccc gaagctagaa agtgagtttg tgtatggtga ttacaaagtt 3540

tatgacgtcc gtaagatgat cgcgaaaagc gaacaggaga taggcaaggc tacagccaaa 3600

tacttctttt attctaacat tatgaatttc tttaagacgg aaatcactct ggcaaacgga 3660

gagatacgca aacgaccttt aattgaaacc aatggggaga caggtgaaat cgtatgggat 3720

aagggccggg acttcgcgac ggtgagaaaa gttttgtcca tgccccaagt caacatagta 3780

aagaaaactg aggtgcagac cggagggttt tcaaaggaat cgattcttcc aaaaaggaat 3840

agtgataagc tcatcgctcg taaaaaggac tgggacccga aaaagtacgg tggcttcgat 3900

agccctacag ttgcctattc tgtcctagta gtggcaaaag ttgagaaggg aaaatccaag 3960

aaactgaagt cagtcaaaga attattgggg ataacgatta tggagcgctc gtcttttgaa 4020

aagaacccca tcgacttcct tgaggcgaaa ggttacaagg aagtaaaaaa ggatctcata 4080

attaaactac caaagtatag tctgtttgag ttagaaaatg gccgaaaacg gatgttggct 4140

agcgccggag agcttcaaaa ggggaacgaa ctcgcactac cgtctaaata cgtgaatttc 4200

ctgtatttag cgtcccatta cgagaagttg aaaggttcac ctgaagataa cgaacagaag 4260

caactttttg ttgagcagca caaacattat ctcgacgaaa tcatagagca aatttcggaa 4320

ttcagtaaga gagtcatcct agctgatgcc aatctggaca aagtattaag cgcatacaac 4380

aagcacaggg ataaacccat acgtgagcag gcggaaaata ttatccattt gtttactctt 4440

accaacctcg gcgctccagc cgcattcaag tattttgaca caacgataga tcgcaaacga 4500

tacacttcta ccaaggaggt gctagacgcg acactgattc accaatccat cacgggatta 4560

tatgaaactc ggatagattt gtcacagctt gggggtgacg gtggctccga ttataaggat 4620

gatgacgaca agggaggttc cccaaagaag aaaaggaagg tctga 4665

<210> 185

<211> 1554

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 185

Met Leu Ile Gly Tyr Val Arg Val Ser Thr Asn Asp Gln Asn Thr Asp

1 5 10 15

Leu Gln Arg Asn Ala Leu Val Cys Ala Gly Cys Glu Gln Ile Phe Glu

20 25 30

Asp Lys Leu Ser Gly Thr Arg Thr Asp Arg Pro Gly Leu Lys Arg Ala

35 40 45

Leu Lys Arg Leu Gln Lys Gly Asp Thr Leu Val Val Trp Lys Leu Asp

50 55 60

Arg Leu Gly Arg Ser Met Lys His Leu Ile Ser Leu Val Gly Glu Leu

65 70 75 80

Arg Glu Arg Gly Ile Asn Phe Arg Ser Leu Thr Asp Ser Ile Asp Thr

85 90 95

Ser Ser Pro Met Gly Arg Phe Phe Phe Tyr Val Met Gly Ala Leu Ala

100 105 110

Glu Met Glu Arg Glu Leu Ile Ile Glu Arg Thr Met Ala Gly Leu Ala

115 120 125

Ala Ala Arg Asn Lys Gly Arg Arg Phe Gly Arg Pro Pro Lys Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile

165 170 175

Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val

180 185 190

Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile

195 200 205

Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala

210 215 220

Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg

225 230 235 240

Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala

245 250 255

Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val

260 265 270

Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val

275 280 285

Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg

290 295 300

Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr

305 310 315 320

Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu

325 330 335

Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln

340 345 350

Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala

355 360 365

Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser

370 375 380

Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn

385 390 395 400

Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn

405 410 415

Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser

420 425 430

Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly

435 440 445

Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala

450 455 460

Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala

465 470 475 480

Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp

485 490 495

Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr

500 505 510

Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile

515 520 525

Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile

530 535 540

Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg

545 550 555 560

Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro

565 570 575

His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu

580 585 590

Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile

595 600 605

Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn

610 615 620

Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro

625 630 635 640

Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe

645 650 655

Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val

660 665 670

Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu

675 680 685

Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe

690 695 700

Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr

705 710 715 720

Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys

725 730 735

Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe

740 745 750

Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp

755 760 765

Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile

770 775 780

Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg

785 790 795 800

Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu

805 810 815

Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile

820 825 830

Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu

835 840 845

Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp

850 855 860

Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly

865 870 875 880

Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro

885 890 895

Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu

900 905 910

Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met

915 920 925

Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu

930 935 940

Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile

945 950 955 960

Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu

965 970 975

Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu

980 985 990

Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro

995 1000 1005

Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr

1010 1015 1020

Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu

1025 1030 1035

Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn

1040 1045 1050

Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala

1055 1060 1065

Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys

1070 1075 1080

Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln

1085 1090 1095

Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys

1100 1105 1110

Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val

1115 1120 1125

Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile

1130 1135 1140

Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

1145 1150 1155

Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

1160 1165 1170

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

1175 1180 1185

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

1190 1195 1200

Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

1205 1210 1215

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

1220 1225 1230

Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

1235 1240 1245

Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

1250 1255 1260

Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys

1265 1270 1275

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

1280 1285 1290

Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

1295 1300 1305

Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

1310 1315 1320

Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1325 1330 1335

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1340 1345 1350

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1355 1360 1365

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly

1370 1375 1380

Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1385 1390 1395

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1400 1405 1410

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys

1415 1420 1425

His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

1430 1435 1440

Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala

1445 1450 1455

Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

1460 1465 1470

Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala

1475 1480 1485

Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser

1490 1495 1500

Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

1505 1510 1515

Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1520 1525 1530

Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Ser Pro

1535 1540 1545

Lys Lys Lys Arg Lys Val

1550

<210> 186

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 186

ggtggtagcg gtggatcc 18

<210> 187

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 187

ggtggatccg gtggttcagg tggcagcgga gggtcaggag gctct 45

<210> 188

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 188

ggtggatccg gagggtccgg aggtagtggc ggcagcggtg gttcaggtgg cagcggaggg 60

tcaggaggct ct 72

<210> 189

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 189

acctctgttt gggaaaattg 20

<210> 190

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 190

gcacactagt tagggataac a 21

<210> 191

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 191

gcctcagggc ctgtgatggg a 21

<210> 192

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 192

gctcagggcc tgtgatggga g 21

<210> 193

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 193

ggcccatgac ccttctcctc 20

<210> 194

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 194

gcccatgacc cttctcctct 20

<210> 195

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 195

gacttgaaac actctttttc 20

<210> 196

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 196

gagttgaaga cacacaacac a 21

<210> 197

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 197

ggaactcatg tgattaactg 20

<210> 198

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 198

gtctacctct catgagccgg t 21

<210> 199

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 199

gtttcccgca ggatgtggga t 21

<210> 200

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 200

gcctggggat ttatgttctt a 21

<210> 201

<211> 21

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 201

gaaatagcac aatgaatgga a 21

<210> 202

<211> 21

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 202

gactttttgg gggagaggga g 21

<210> 203

<211> 20

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 203

ggagacttaa gtccaaaacc 20

<210> 204

<211> 21

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 204

gtcagctatg atcacttccc t 21

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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gcagatgtag tgtttccaca 20

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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gggtgggggg agtttgctcc 20

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<211> 21

<212> DNA

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<220>

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<400> 207

gatatccgtt tatcagtgtc a 21

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<211> 21

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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gttcctaagc ttgggctgca g 21

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<212> DNA

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<220>

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gcctaaaagt gactgggaga a 21

<210> 210

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 210

gcacagtccc atatttcttg g 21

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<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 211

cctttagtga aaagtagaca gctctgaata tgaaaggtag gttttcattt ctgggaaaga 60

gacgccaagt gatgtgg 77

<210> 212

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 212

cctccaataa atatgggact atgtggaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacggg aagaatgg 78

<210> 213

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 213

ccattctgcc cgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttagtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 214

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 214

ccattctccc cgtcactttc aggtacaaca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 215

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 215

ccttgtagtg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagacttg 60

aaacactctt gttgtgg 77

<210> 216

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 216

ccttgtagtg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcatacttg 60

aaacactctt tttgtgg 77

<210> 217

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 217

ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagacttg 60

aaacactctt tttgtgg 77

<210> 218

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 218

ccttgtgttg tgtttattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagacttg 60

aaatactctt tttgtgg 77

<210> 219

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 219

ccttgtagtg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcatacttg 60

aaacactctt tttgtgg 77

<210> 220

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 220

ccttgtattg tgagtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagacttg 60

aaacactctt tttgtgg 77

<210> 221

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 221

ccttgtgttg tgtgtcttca actcacagag ttaaacgatg ctttacacag agtagacttg 60

aaacactctt tttctgg 77

<210> 222

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 222

ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagacttg 60

taacactctt tttgtgg 77

<210> 223

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagacgtg 60

aaacactctt tttgtgg 77

<210> 224

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 224

ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagacttg 60

aaacactctt tttgtgg 77

<210> 225

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 225

ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag aggagacttg 60

taacactctt tttgtgg 77

<210> 226

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 226

cctgaggttt tccaggtttt aaaaggaaac ctaaaggtag gtttagcatt aagtgtcttg 60

aagtttattt taaaagg 77

<210> 227

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 227

ccaaaattcc cacaaaaccg aatgcatcag tcaaagcaag gtttgaagaa aagatttacc 60

acttcaggga gcttgg 76

<210> 228

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 228

ccttttctgg atatcgttga tgctctgtat gcaaaaggta ggtttttggg ttatgttgtt 60

aaacagtgat tgaatgg 77

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<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 229

cctccaagaa atatggaact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacaga gagaatgg 78

<210> 230

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 230

cctccaagaa atatgggact atgtgagaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgatggg gagaatgg 78

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<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 231

ccattctccc catcgctttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

ttccatattc tttggagg 78

<210> 232

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 232

ccattctccc catcactttc aggtgtaccg atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 233

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 233

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacggg gagaatgg 78

<210> 234

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 234

ccttcagggc agaaacagct ctactagcag agaaagcaag ctttcaatat tgtgcaatac 60

aaaaacgaga gcaggg 76

<210> 235

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 235

ccattctcct catctccttc tggtactcca atcaaacgta ggtttggtct tttctcatag 60

tctcatattt cttggagg 78

<210> 236

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 236

cctccaagac atataggact atgtgaaaat accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacagg gagtatgg 78

<210> 237

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 237

cctgccagat accagtagtc actgtgaatt acaaagctac gtttcttcca tagggaaagt 60

ttggagtcca gccagg 76

<210> 238

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 238

ccattctccc tgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 239

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 239

ccattctccc caccactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttgtagg 78

<210> 240

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 240

cctaaccaga aactaactaa tagatatggg cagaaagcat cctttcactt ttgttctggg 60

agagggaaga agcaaagg 78

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<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 241

ccattttggg gaggccttga tgggaagctg gaaaaggaag ctttcctccc agtcctgctg 60

aaggccttgc cagctgg 77

<210> 242

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 242

cctccaagaa acacaggact atgtgaaaag atcaaaccta cgtttgattg gtgttcctga 60

aagtgatggg gagaatgg 78

<210> 243

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 243

ccattctctt catgactttc aggtacacca ttgaaacgta ggtttggtct tttcacattg 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 244

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 244

ccattctccc catcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccgtattt cttggtgg 78

<210> 245

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 245

ccattctccc tgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggggg 78

<210> 246

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 246

ccattctccc tgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttgggg 77

<210> 247

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 247

cctccaagaa atatgagatt atatgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacttta 60

aagtgacggg gagaatgg 78

<210> 248

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 248

ccattctccc cgtcattttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccaaattt cttggagg 78

<210> 249

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 249

cccccaagaa atgtgggact atatgaaaag accaaaccta cgtttgactg gtgtacctaa 60

aagtgatggg gagaatgg 78

<210> 250

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 250

ccccaagaaa tgtgggacta tatgaaaaga ccaaacctac gtttgactgg tgtacctaaa 60

agtgatgggg agaatgg 77

<210> 251

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 251

cccattggtg ctgaccagat ggtgaaggag gcaaaggttg ctttgaatga ctgtgctctg 60

gggtgagcca ggcctgg 77

<210> 252

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 252

ccctttacag aggtgagctt tgttattagt aaaaaggtag gtttccctgt ttttctgaag 60

aaaagctgtg agtggg 76

<210> 253

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 253

ccactgccca ttgacagagt ggcgaggtgg gtgaaacctt gctttcctcc tggcccatgg 60

gcagggtggg gctgtggg 78

<210> 254

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 254

ccactgccca ttgacagagt ggcgaggtgg gtgaaacctt gctttcctcc tggcccatgg 60

gcagggtggg gctgtgg 77

<210> 255

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 255

ccattctccc tgtcactttt agatacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatgttt cttggagg 78

<210> 256

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 256

cctccaagaa atatcaactg tgtgaaaaga cgaaacctac gtttgattaa tgtacctgaa 60

agtgacaggg agaatgg 77

<210> 257

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 257

ccattctccc attaactttc aagtacacca atcaaaggta ggtttggtgt tttcccatag 60

tcccgtattt cttggagg 78

<210> 258

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 258

ccttttcatc atgccccttt cactttaagg tgaaaacctt gctttacatg tcagagaaaa 60

gaagagccct cagctggg 78

<210> 259

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 259

ccttttcatc atgccccttt cactttaagg tgaaaacctt gctttacatg tcagagaaaa 60

gaagagccct cagctgg 77

<210> 260

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 260

ccattcaccc cgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 261

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 261

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgatgg tgtacccgaa 60

agtgacaggg agaatgg 77

<210> 262

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 262

ccaccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgatag gtatacctga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

<210> 263

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 263

ccattctccc catcactttc aggtgcacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 264

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 264

ccctcaagaa atatgagact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgactg gtatacctga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

<210> 265

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 265

cctcaagaaa tatgagacta tgtgaaaaga ccaaacctac gtttgactgg tatacctgaa 60

agtgacaggg agaatgg 77

<210> 266

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 266

cctccaacaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacggg gataatgg 78

<210> 267

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 267

ccattctctc cctcactttc aagtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcttatattt cttggcgg 78

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<211> 77

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 268

ccattctccc tgtcactgtc agtacaccaa tcaaacgtag gtttggtctc ttcacatagt 60

cccatatttc ttggagg 77

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<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 269

cctccaagaa atatgggact atgtgaacag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgatggc agaatgg 77

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<211> 77

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<220>

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ccaccatgcc tggccaccac acattttttt ctaaagcttg gttttggcca cagtgagagt 60

ttcttgggct gtcaggg 77

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<211> 76

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<220>

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ccaccatgcc tggccaccac acattttttt ctaaagcttg gttttggcca cagtgagagt 60

ttcttgggct gtcagg 76

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<211> 77

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<220>

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cccactaggt ggcgatatct gagggtccaa tgaaaccatg ctttttactc agatcttcca 60

ctaaccacct cccccgg 77

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<220>

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cctctaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgactg gtgtacctga 60

aagtgacggg gagaatgg 78

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<212> DNA

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<220>

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cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgatta gtgtacctga 60

aagtgacggg gagaatgg 78

<210> 275

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<212> DNA

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<220>

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<400> 275

ccattctccc tgtcactttc aggtacatca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

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<220>

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aagggatggg gagaatgg 78

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<220>

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<400> 277

cccccaagaa atatgagact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

<210> 278

<211> 77

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 278

ccccaagaaa tatgagacta tgtgaaaaga ccaaacctac gtttgattgg tgtacctgaa 60

agtgacaggg agaatgg 77

<210> 279

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 279

cctctaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtaactga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

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<211> 78

<212> DNA

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<220>

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cctccaagaa atatgcgcct atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtatacctga 60

aagtgatgga gagaatgg 78

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<211> 78

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<220>

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tcgcatattt cttggagg 78

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<211> 78

<212> DNA

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<220>

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ccattctccc cgtcactttc aggtacacca accaaacgtt ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

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<220>

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ccattctccc tgtcactttc cagtacacca gtcaaacgta ggtttggtct tttcacatac 60

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 284

cctggcctaa tttttaattc ttagtttgac ttaaaccttg cttttagtgt gatggcgaca 60

aaagctgagc tgaaagg 77

<210> 285

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<400> 287

ccattctccc cgtcactttg aggtgtgcca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcctatattt cttggagg 78

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<211> 78

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<220>

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cctccaaaaa atatgggact acgtaaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aactgacagg gagaatgg 78

<210> 289

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<220>

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aactgacggg gagaatgg 78

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<220>

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aagtgatagg gagaatgg 78

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<220>

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aaatgatggg gagaatgg 78

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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cctccaagaa atatgagact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

<210> 295

<211> 78

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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cctccaagaa atatgggact acgtgaaaag atcaaaccta cgtttgattg ttgtacctga 60

aagtgatggg gagaatgg 78

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<211> 78

<212> DNA

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<220>

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cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg ttgtacctga 60

aagtgatggg gagaatgg 78

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<211> 78

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<220>

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cctcaaaagt gttctggttt tgttttgttt tttaaaccat ggttttacct ctggcttagt 60

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<220>

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cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgactg gtgtacctga 60

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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aactggggag ccagggg 77

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<220>

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actggggagc cagggg 76

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<220>

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<220>

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cccccacctc ccaagctgct ggcttctcga ataaagctac ctttcctttt accaaaactt 60

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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cctcttctag tgaacccatg gggttaccaa gggaaagcaa ccttttgata aatattccca 60

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<220>

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ctccaggctt gtcagtgg 78

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<220>

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<400> 308

cctttctccc catcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttgatct tttcacatag 60

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<220>

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<400> 309

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<220>

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<220>

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<220>

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atgtgacagg gagaatgg 78

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccattctccc tgtcactttt aggtacacca atcaaacgta cgtttggtct tttcacatag 60

acccatattt cttggagg 78

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<211> 78

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 316

ccttcaagaa atatgggact gtgtgaaaag accaaagcta ggtttgattg gtgtacctga 60

aagtgatggg gagaatgg 78

<210> 317

<211> 76

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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cctactattc acagagtaat gcagtttgct gaaaaggttg gtttttgctg acctctgaga 60

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<210> 318

<211> 78

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccattctctc tgtcactttc tggtacacca atcaaacgta ggtttgctct tttcacataa 60

tcccatattt attgaagg 78

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<211> 77

<212> DNA

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<220>

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<211> 78

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccattctccc catcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tctcacacag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 321

<211> 78

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<220>

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ccattcttcc cattactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccacattt cttggagg 78

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<211> 78

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 322

ccattctccc cctcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacattg 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 323

<211> 78

<212> DNA

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<220>

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccattctccc tgtcactttc aggtacagca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatgg 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 325

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 325

cctccaagaa atatgagact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacggg gaagatgg 78

<210> 326

<211> 78

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<220>

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cctccaagaa atatgagact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

<210> 327

<211> 78

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<220>

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aagtgacagg aagaatgg 78

<210> 328

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 328

ccattctccc catcactttc aggtacacca accaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tctcatattt cttggagg 78

<210> 329

<211> 76

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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cctccattga ctactcctta tcattggcta gaaaacctac ctttcaacca gtttctaagg 60

ccaagaaact tggagg 76

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<211> 78

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 330

ccaccaagaa atatgggact acgtgaaaag accaaaccta cgtttgatgg gtgtgcctga 60

aagtgacggg aagaatgg 78

<210> 331

<211> 78

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 331

cctccaagaa ataagggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aggtgacagg gagaatgg 78

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<211> 77

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccaaagggcc tttgtgattc tactttgtaa tataaaggat ggtttcttac tacggttggt 60

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<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 333

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgatggg gagaatgg 78

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<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 334

ccattctccc cgttactttc aggtacacca ataaaaccta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 335

cccatatctc tggcaagggc agctctctgg ctaaaccaag ctttcctgta gagcttgagt 60

tccaaggcag cgttgg 76

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<220>

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ccttgtagtg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagacttg 60

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<220>

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ccttgtagtg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcatacttg 60

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<220>

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aaacactctt tttgtgg 77

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aaacactctt tttgtgg 77

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<220>

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cctccaagaa atatgggact ctgtaaagag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgaaggg gagaatgg 78

<210> 351

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<220>

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aagtgatggg gaaaatgg 78

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aagtgatggg aagaatgg 78

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<211> 77

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tcgaatattt cttcaagg 78

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cgaatatttc ttcaagg 77

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 403

ccattctccc catcatttcc aggtaaacca atcaaaggta ggtttggtca tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 404

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 404

ccattctccc cgtcactttc aggtacacca gtcaaacgta ggtttggtct tttcacacag 60

tcccatattt cctggagg 78

<210> 405

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 405

ccattctccc catcactttc aggtacagca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 406

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 406

ccactacaga ttcttgggtc aagatgtgtg caaaaggatg ctttagggtg atggatatga 60

gtgggatgaa atgagg 76

<210> 407

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 407

cctgaaaaaa aaccctgcca gccagcaact ctgaaaggat gctttgtgtg agtgagcagt 60

gtctgagatg gacaggg 77

<210> 408

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 408

ccattctccc catcactttc aggtacgcca atcaaacgta ggtttggtct tttgacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 409

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 409

ccgttctccc catcactttt aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tctcatattt cttggagg 78

<210> 410

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 410

ccattctcct ggtcactttc aggtatacca atcaaacgta ggtttggtct tttcatgtag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 411

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 411

cctccaagaa atatgggact acatgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtatacctga 60

aagtgaccag gagaatgg 78

<210> 412

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 412

cctccaagaa ctatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacggg gagaatgg 78

<210> 413

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 413

ccattctccc cgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatagtt cttggagg 78

<210> 414

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 414

ccattctccc cgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacagag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 415

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 415

ccattctccc cgtcactttc atgtacacca agcaaacgta ggtttgatct ttccacatag 60

tcccgtgttt cttggagg 78

<210> 416

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 416

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacttga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

<210> 417

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 417

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag acaaaaccta cgtttcactg gtgtacctga 60

aagtgacagg gaggatgg 78

<210> 418

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 418

cccccacctt ttaaaaacat gcatacatac ggaaacgttg ctttctgcac gatttcattt 60

taatggaaca gaacagg 77

<210> 419

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 419

ccatttcccc tgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tatcatattt cttggagg 78

<210> 420

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 420

ccattctccc cgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt ctggagg 77

<210> 421

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 421

ccttttgtta aagtaataga attctgcttc ttaaaggaac ctttcaggca agatggtggt 60

tagagcacct aaatggg 77

<210> 422

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 422

ccttttgtta aagtaataga attctgcttc ttaaaggaac ctttcaggca agatggtggt 60

tagagcacct aaatgg 76

<210> 423

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 423

cctccaagaa ctatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacggg gagaatgg 78

<210> 424

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 424

ccattctccc cgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggcct tttcacatag 60

tcccatagtt cttggagg 78

<210> 425

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 425

cctccaagaa atatgggact ggtgaaaaga ccaaacctac gtttgactgg tgtacctgaa 60

agtgacgggg agactgg 77

<210> 426

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 426

cctccaagaa acatgggaat gtgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gcgtacctga 60

aagtgacggg gagtatgg 78

<210> 427

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 427

cctccaagaa atatgggact gtgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtatacctga 60

aagtgacaga gagaatgg 78

<210> 428

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 428

ccattctccc cttcactatc aggtacacca atcaaacgta ggtttagtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 429

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 429

ccattctccc cgtcactttc agatacacca gtcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 430

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 430

ccatcttact ttgtactaca ctgttcttta gagaaagctt ccttttggag accaaccagg 60

actccttaga agcagagg 78

<210> 431

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 431

ccatcttact ttgtactaca ctgttcttta gagaaagctt ccttttggag accaaccagg 60

actccttaga agcagagg 78

<210> 432

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 432

cctctgcttc taaggagtcc tggttggtct ccaaaaggaa gctttctcta aagaacagtg 60

tagtacaaag taagatgg 78

<210> 433

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 433

cctctgcttc taaggagtcc tggttggtct ccaaaaggaa gctttctcta aagaacagtg 60

tagtacaaag taagatgg 78

<210> 434

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 434

cctctgcttc taaggagtcc tggttggtct ccaaaaggaa gctttctcta aagaacagtg 60

tagtacaaag taagatgg 78

<210> 435

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 435

ccaccactgt gcctggccat tttcactatt cttaaaggaa gctttggttt acaaaggttt 60

gctactgtac ttccagg 77

<210> 436

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 436

ccattctccc tgtcactttc aggtacacca ttcaaacgta ggtttggtct tttctcatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 437

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 437

cctccaagaa attcgggact atgtgaaaag acaaaaccta cgtttaattg gtgtgtggtg 60

tacctgaaag tgacaagg 78

<210> 438

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 438

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgaccag aagaatgg 78

<210> 439

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 439

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag cccaaaccta cgtttgactg atgtacctaa 60

agtgacgggg agaatgg 77

<210> 440

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 440

cccgcactgt gagcttggcc gagtgctgtc tgaaagcatc ctttcccttc acctggagac 60

tggagcgcca tagagg 76

<210> 441

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 441

cctgtctccc ccattccatg caaaataaaa cacaaaccaa gctttgcttt aagtgctccc 60

tgatgcagtt cagcgtgg 78

<210> 442

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 442

ccattcttcc cgtcacattc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcccatag 60

tcccatattt cttagagg 78

<210> 443

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 443

ccccctgctc agcttgggga agaaaaatac aaaaacgatg cttttaggca ttttaaacaa 60

cttcactaca ttgaggg 77

<210> 444

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 444

ccccctgctc agcttgggga agaaaaatac aaaaacgatg cttttaggca ttttaaacaa 60

cttcactaca ttgagg 76

<210> 445

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 445

cctttgtgtt gtgtgtattc aactcacaga gtgaaacctt cctttattca gagcagtttt 60

gaaacactct ttttgtgg 78

<210> 446

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 446

cctttgtgtt gtgtgtattc aactcacaga gtgaaacctt cctttattca gagcagtttt 60

gaaaaacact ttttgtgg 78

<210> 447

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 447

cctttgtgtt gtgtgtattc aactcacaga gtgaaacctt cctttattca gagcagtttt 60

gaaaaactct ttttgtgg 78

<210> 448

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 448

cctttgtgtt gtgtgtattc aactcacaga gtgaaacctt cctttattca gagcagtttt 60

gaaacactct ttttgtgg 78

<210> 449

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 449

cctttgtgtt gtgtgtattc aactcacaga gtgaaacctt cctttattca gagcagtttt 60

gaaatactct ttttgtgg 78

<210> 450

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 450

cctttgtgtt gtgtgtattc aactcacaga gtgaaacctt cctttattca gagcagtttt 60

gaaacactct ttttgtgg 78

<210> 451

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 451

ccattctccc tgtcactttc aagtacacca atcaaaccta ggtttggtct tttcacatag 60

ttccatattt cttggagg 78

<210> 452

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 452

cccctcccat cacaggccct gaggtttaag agaaaaccat ggttttgtgg gccaggccca 60

tgacccttct cctctggg 78

<210> 453

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 453

cccctcccat cacaggccct gaggtttaag agaaaaccat ggttttgtgg gccaggccca 60

tgacccttct cctctgg 77

<210> 454

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 454

ccctcccatc acaggccctg aggtttaaga gaaaaccatg gttttgtggg ccaggcccat 60

gacccttctc ctctggg 77

<210> 455

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 455

ccctcccatc acaggccctg aggtttaaga gaaaaccatg gttttgtggg ccaggcccat 60

gacccttctc ctctgg 76

<210> 456

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 456

ccattctccc catcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttcatct tttcacatag 60

tcccacggtt tttggagg 78

<210> 457

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 457

cctccaagat atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aattgatggg gagaatgg 78

<210> 458

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 458

cctccaagaa atatgggact gtgtgaaaag aacaaaccta cgtttgattg gtgtacgtga 60

aagtgatggg gagaatgg 78

<210> 459

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 459

ccattcctcc cgtcactttc agatacacca aaaaaacgta ggtttggtct cttcacatag 60

tcccacattt cttggagg 78

<210> 460

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 460

cctccaagaa atgtgggact atgtgaagag accaaaccta cgtttttttg gtgtatctga 60

aagtgacggg aggaatgg 78

<210> 461

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 461

cctccaaggg gaatctgagt tctctgaaga caaaaagcat ggtttctttt cttctgtatt 60

tcttattgtt tcctagg 77

<210> 462

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 462

ccattctccc tatcactttc cagtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 463

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 463

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtatacttga 60

aattgacaag gagaatgg 78

<210> 464

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 464

cctccaagaa atatgggact atgtggaaag accaaaccta cgtttgactg gtgtacctga 60

aagtgatggg gagaatgg 78

<210> 465

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 465

cctctaagaa atatgggact atgtgaagag atgaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacgag gagaatgg 78

<210> 466

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 466

ccctcgtata ctacatgcta tagtcaaagc agtaaacctt cctttcctta agcagaccac 60

actctttcat gcctggg 77

<210> 467

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 467

cctcgtatac tacatgctat agtcaaagca gtaaaccttc ctttccttaa gcagaccaca 60

ctctttcatg cctggg 76

<210> 468

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 468

ccattctccc catcactttc aggtatacta atcaaaggta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt catggagg 78

<210> 469

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 469

ccattccccc gtcactttca ggtacaccaa tcaaacgtag gtttggtctt ttcacatagt 60

cccatatttc ttggagg 77

<210> 470

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 470

ccattctccc cgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggttttgtct tttcttatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 471

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 471

ccactgcacc tgaccaagat ccttaatttt tctaaaccta cgtttatcat ctataaaatg 60

agccatcttt tcacatgg 78

<210> 472

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 472

cctccgagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg ttgtacctga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

<210> 473

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 473

ccattctccc catcactttt aggtacacca atcaaacgta ggtttggtcc ttttgcatag 60

acccatattt cttggagg 78

<210> 474

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 474

ccattttccc cgtcagtttc atatacacct atcaaacgta ggtttactgt tttcacatag 60

tcccttattt cttggagg 78

<210> 475

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 475

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cctttgattg gtgtacctga 60

aagtgacggg caggatgg 78

<210> 476

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 476

ccattcttct cgtcattttc aagtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcgcatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 477

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 477

ccattcttct cgtcactttc aagtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 478

cctccaagaa atataggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacttga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 479

cctccaagaa atgtggaact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 480

ccctgacact gataaacgga tatgaagaga aaaaagctag gttttcgctg gaattcctaa 60

gcttgggctg cagtgg 76

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 481

cccttctccc agtcactttt aggtacacca atgaaacgta ggtttggtct tttcacacag 60

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 482

ccttctccca gtcactttta ggtacaccaa tgaaacgtag gtttggtctt ttcacacagt 60

cccatatttc ttggagg 77

<210> 483

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 483

ccactccctc tcccccaaaa agtaaaggta gaaaaccaag gtttacaggc aacaaatagc 60

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<220>

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ccaaacccgc atcgcacacc ctgtgagggg gacaaaggaa cctttccgtt ccaacatcaa 60

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<220>

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<400> 485

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<220>

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ccattctccc catcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

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<220>

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<210> 488

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<212> DNA

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<220>

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<400> 488

ccaccaagaa acatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttggttg gtgtacctgg 60

aagtgacggg gagagtgg 78

<210> 489

<211> 78

<212> DNA

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<220>

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<400> 489

cctccaagaa atatgggacc atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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cctactctga acctaccttg ataaagccta gaaaaccaag ctttgacaag atttgacaag 60

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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ccattctccc ttcactttca gttacaccaa tcaaacgtag gtttggtctt ttcacatagt 60

cccatatttc ttggagg 77

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<212> DNA

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<220>

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aagtgacagg gagaatgg 78

<210> 505

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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<220>

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aagtgacgag gagaatgg 78

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattt gtgtacctga 60

aagtgatggg gagaatgg 78

<210> 508

<211> 78

<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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tactctaaga aatgggg 77

<210> 510

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<212> DNA

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<220>

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tactctaaga aatggg 76

<210> 511

<211> 78

<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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cctataaagc ttagagaaac acagggctct ttaaacgatc ctttttctct tttctgtttt 60

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccattctccc catcactttc aggtacacta atcaaaggta ggtttggtct tttcacatgg 60

tcctatattt cttggagg 78

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<220>

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 517

cccatagcac gatcacatgg gacattcagg ggaaagcaac cttttccagg aaggaaaacc 60

caatgctggg acccagg 77

<210> 518

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 518

ccctttcagc gctcacaggc tatggtttta taaaaggaac ctttgatttt gttcatgtga 60

aactacaaaa tgccagg 77

<210> 519

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 519

ccccatagca cgatcacatg ggacattcag gggaaagcaa ccttttccag gaaggaaaac 60

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<220>

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caatgctggg acccagg 77

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<223> 合成多核苷酸

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ccattctccc cgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

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<220>

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ccattctccc cgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 524

ccattctccc catcactttc aggtacacca gtcaaacgaa ggtttggtct tatcacatac 60

tccaatattt cttggagg 78

<210> 525

<211> 78

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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cctccaagat atatgggact atgtgaaaag gccaaaccta cctttgattg atacacctga 60

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<220>

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<220>

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cctccaagaa atatgggact atgtggaaag accaaaccta cgtttgtttg gtgtacctga 60

aagtgagggg agaatgg 77

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccattctcct catcactttc aagtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcttatattt cttggagg 78

<210> 529

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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ccattctccc cgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccattctccc catcactttc aggtacacca gtcaaacgaa ggtttggtct tatcacatac 60

tccaatattt cttggagg 78

<210> 531

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 531

ccattctccc cgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 532

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 532

ccagcagaag aatctggggc acagtctgtg aaaaaaggta cctttcttaa gcagggttct 60

tatccttcat gggtctgg 78

<210> 533

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 533

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg ttgtacctga 60

aagtgagggg gagaatgg 78

<210> 534

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 534

ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagatttg 60

aaacactgtt tttctgg 77

<210> 535

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagatttg 60

aaacactgtt tttctgg 77

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagatttg 60

aaacactgtt tttctgg 77

<210> 537

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 537

ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacac agcagatttg 60

aaacactgtt tttctgg 77

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<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 538

ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagatttg 60

aaacactgtt tttctgg 77

<210> 539

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 539

ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagatttg 60

aaacactgtt tttctgg 77

<210> 540

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagatttg 60

aaacactgtt tttctgg 77

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 541

ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagatttg 60

aaacactgtt tttctgg 77

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagatttg 60

aaacactgtt tttctgg 77

<210> 543

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 543

ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagatttg 60

aaacactgtt tttctgg 77

<210> 544

<211> 77

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 544

ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagatttg 60

aaacactgtt tttctgg 77

<210> 545

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 545

ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagatttg 60

aaacactgtt tttctgg 77

<210> 546

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aaattgagaa aatatgg 77

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<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 616

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaaa accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

<210> 617

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 617

ccctgtgttc ttttatacta aaacaagcca gcaaaccaac ctttgagatg tgttgcctta 60

aacattactg aatgggg 77

<210> 618

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 618

ccctgtgttc ttttatacta aaacaagcca gcaaaccaac ctttgagatg tgttgcctta 60

aacattactg aatggg 76

<210> 619

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 619

ccgagaaacg gctttagcaa caaataaata tcaaaaggat gctttctctt cagaataatc 60

taaagtaagt tgggagg 77

<210> 620

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 620

ccatgttact ccggataagg acagcaaagg aggaaaggaa ccttttctgg gccaccagaa 60

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<210> 621

<211> 78

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 621

cccagggata tgctggccac ggggaggagc cggaaaccaa cctttgtgtc actgtgtagt 60

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<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccagggatat gctggccacg gggaggagcc ggaaaccaac ctttgtgtca ctgtgtagtg 60

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<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccttagggac ccataatggc cacaaccagg agaaaagcaa gctttgatgc ttaaacacta 60

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<210> 624

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 624

cctgcctctg ttcctccttc ctgatggtgg cggaaaggat gcttttgcca gatcaacagt 60

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<210> 625

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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cctgactcca gccctccttg acaaggtctc cgtaaagcat gctttctctt agggaccctc 60

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 626

cctgactcca gccctccttg acaaggtctc cgtaaagcat gctttctctt agggaccctc 60

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<220>

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<220>

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ccattctccc tgtcactttc aggtacacta atcaaacgta ggtttgctgt ttttacatag 60

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<220>

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<211> 76

<212> DNA

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<220>

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cctgtttgtt attttagcta atgtcaaaaa gaaaaccttg ctttttctga accctttcag 60

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<211> 77

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<220>

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ccattttccc caccactttc acgtacagca atcaaacgta ggtttggtct tttcactagt 60

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<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<220>

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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aaacactctt tttgtgg 77

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag agcagacttg 60

aaacactctt tttgtgg 77

<210> 642

<211> 77

<212> DNA

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<220>

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ccttgtgttg tgtgtattca actcacagag ttaaacgatc ctttacacag aggagacttg 60

taacactctt tttgtgg 77

<210> 643

<211> 78

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ataacatact tagagtgg 78

<210> 644

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<212> DNA

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<220>

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<210> 645

<211> 78

<212> DNA

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<220>

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<400> 645

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<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccctcttgaa gttagggaag tagcatttaa gggaaacgta gctttactat taagaatttc 60

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<211> 77

<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 648

cctcttgaag ttagggaagt agcatttaag ggaaacgtag ctttactatt aagaatttca 60

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<212> DNA

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<220>

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<211> 77

<212> DNA

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<220>

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ccattctccc ttcactttca ggtacaccaa tcaaacgtag gtttggtctt ttcacatagt 60

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<213> 人工序列

<220>

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<210> 652

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 652

cctatagtct cagttacttg ggaggctgag gtaaaaggat cgtttgagcc caggaggtgg 60

aggttgcagt gagccgg 77

<210> 653

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 653

cctttcccaa ctctgctatt gcccccacat cctaaaggaa cctttctttt tttatatatt 60

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<210> 654

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 654

cctccaagaa atatggaact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg acgtacctga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

<210> 655

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 655

cctcttctga aagcattgat aatcaacatt ttaaacgtag cttttcccca tattgctagg 60

aaggctcatt cccggg 76

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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ccattctccc catcattttc aggtacacca atcaaacgta ggtttgatct tttcacatag 60

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<220>

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ccaccagcac ttctgttaga agttgcagca gagaaaggat cctttaggca catctcccag 60

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<210> 662

<211> 78

<212> DNA

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<220>

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cctgtgccag ggtccttcca ctgggactgg cagaaacgta ggtttgcatg gagtgagaag 60

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<220>

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<220>

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<220>

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<210> 666

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<220>

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<400> 666

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<220>

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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cctccaagaa atatggggct atgtgaaaag accaaaccta cctttgattg gtgtatctga 60

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 669

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattt gtgtacctga 60

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<210> 670

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<220>

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<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 671

cccatcaaga gcggttgtgc atggcaacag taaaaggatg gtttgttaca ctagtacaaa 60

aagaggtggc cagagg 76

<210> 672

<211> 78

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccattctctc tgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

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<211> 78

<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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aagtgatagg gagaatgg 78

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<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgactgg gagaatgg 78

<210> 675

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 675

ccattctccc tgtcactttc aggtacacga atcaaacgta ggtttcatct tttcacatag 60

tcccatattt cttagagg 78

<210> 676

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccattctctc tgtcactttc tggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

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<210> 677

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacaag gaaaatgg 78

<210> 678

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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cctgaaaaac attgtttcca acctggtaaa tcaaaaggaa ggtttaactt tgttagataa 60

gtccacatat caccaagg 78

<210> 679

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 679

cctccaagaa atgtgggact atgggaaaag accaaaccta cctttgtttg gtgtacctga 60

aagtgacggg gagaaagg 78

<210> 680

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 680

cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttcattg gtgtacctga 60

aagtgatggg tagaatgg 78

<210> 681

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 681

cctacaagaa atatgggact atgggaaaag accaaaccta cgtttgattg gtacactgga 60

aagtgacagg gataatgg 78

<210> 682

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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ccattctccc tgtcactttc tggtacacca atcaaaggta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 683

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgatggg gagaatgg 78

<210> 684

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 684

ccattctctt tgtcactttc aggtatacca atcaaacgtt ggtttggtct ttttgcatag 60

tcccatattt tgtggagg 78

<210> 685

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 685

cctccaagaa atatgagact atgtgaaaag accaaaccta cgtttgatta gtgtacctga 60

aaatgatggg gagaatgg 78

<210> 686

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 686

ccattctttc tgtcactttc aggtacacca atcaaacgta ggtttggtct tttcacatag 60

tcccatattt cttggagg 78

<210> 687

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcccatattt cttggagg 78

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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ttcaatattt ctttgagg 78

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<212> DNA

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<223> 合成多核苷酸

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cctccaagaa atatgggact atctgaaaag atcaaaccta cgtttgattg gtgtacctga 60

aagtgacagg gagaatgg 78

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成多核苷酸

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tcccatattt cttggagg 78

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<223> 合成多核苷酸

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aagtgatggg gagaatgg 78

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<223> 合成多核苷酸

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<223> 合成多核苷酸

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aaatgacagg gataatgg 78

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<223> 合成多核苷酸

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<223> 合成多核苷酸

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<223> 合成多核苷酸

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aagtgacagg gagaatgg 78

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<223> 合成多核苷酸

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<223> 合成多核苷酸

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<223> 合成多核苷酸

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<223> 合成多核苷酸

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<213> 新凶手弗朗西斯菌

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ctggcccgag ggaactctcg gttcgcatgg atgacaagaa agtccgaaga aacgattact 2520

ccatggaatt ttgaggaagt tgtcgataaa ggtgcgtcag ctcaatcgtt catcgagagg 2580

atgaccaact ttgacaagaa tttaccgaac gaaaaagtat tgcctaagca cagtttactt 2640

tacgagtatt tcacagtgta caatgaactc acgaaagtta agtatgtcac tgagggcatg 2700

cgtaaacccg cctttctaag cggagaacag aagaaagcaa tagtagatct gttattcaag 2760

accaaccgca aagtgacagt taagcaattg aaagaggact actttaagaa aattgaatgc 2820

ttcgattctg tcgagatctc cggggtagaa gatcgattta atgcgtcact tggtacgtat 2880

catgacctcc taaagataat taaagataag gacttcctgg ataacgaaga gaatgaagat 2940

atcttagaag atatagtgtt gactcttacc ctctttgaag atcgggaaat gattgaggaa 3000

agactaaaaa catacgctca cctgttcgac gataaggtta tgaaacagtt aaagaggcgt 3060

cgctatacgg gctggggacg attgtcgcgg aaacttatca acgggataag agacaagcaa 3120

agtggtaaaa ctattctcga ttttctaaag agcgacggct tcgccaatag gaactttatg 3180

cagctgatcc atgatgactc tttaaccttc aaagaggata tacaaaaggc acaggtttcc 3240

ggacaagggg actcattgca cgaacatatt gcgaatcttg ctggttcgcc agccatcaaa 3300

aagggcatac tccagacagt caaagtagtg gatgagctag ttaaggtcat gggacgtcac 3360

aaaccggaaa acattgtaat cgagatggca cgcgaaaatc aaacgactca gaaggggcaa 3420

aaaaacagtc gagagcggat gaagagaata gaagagggta ttaaagaact gggcagccag 3480

atcttaaagg agcatcctgt ggaaaatacc caattgcaga acgagaaact ttacctctat 3540

tacctacaaa atggaaggga catgtatgtt gatcaggaac tggacataaa ccgtttatct 3600

gattacgacg tcgatgccat tgtaccccaa tcctttttga aggacgattc aatcgacaat 3660

aaagtgctta cacgctcgga taagaaccga gggaaaagtg acaatgttcc aagcgaggaa 3720

gtcgtaaaga aaatgaagaa ctattggcgg cagctcctaa atgcgaaact gataacgcaa 3780

agaaagttcg ataacttaac taaagctgag aggggtggct tgtctgaact tgacaaggcc 3840

ggatttatta aacgtcagct cgtggaaacc cgccaaatca caaagcatgt tgcacagata 3900

ctagattccc gaatgaatac gaaatacgac gagaacgata agctgattcg ggaagtcaaa 3960

gtaatcactt taaagtcaaa attggtgtcg gacttcagaa aggattttca attctataaa 4020

gttagggaga taaataacta ccaccatgcg cacgacgctt atcttaatgc cgtcgtaggg 4080

accgcactca ttaagaaata cccgaagcta gaaagtgagt ttgtgtatgg tgattacaaa 4140

gtttatgacg tccgtaagat gatcgcgaaa agcgaacagg agataggcaa ggctacagcc 4200

aaatacttct tttattctaa cattatgaat ttctttaaga cggaaatcac tctggcaaac 4260

ggagagatac gcaaacgacc tttaattgaa accaatgggg agacaggtga aatcgtatgg 4320

gataagggcc gggacttcgc gacggtgaga aaagttttgt ccatgcccca agtcaacata 4380

gtaaagaaaa ctgaggtgca gaccggaggg ttttcaaagg aatcgattct tccaaaaagg 4440

aatagtgata agctcatcgc tcgtaaaaag gactgggacc cgaaaaagta cggtggcttc 4500

gatagcccta cagttgccta ttctgtccta gtagtggcaa aagttgagaa gggaaaatcc 4560

aagaaactga agtcagtcaa agaattattg gggataacga ttatggagcg ctcgtctttt 4620

gaaaagaacc ccatcgactt ccttgaggcg aaaggttaca aggaagtaaa aaaggatctc 4680

ataattaaac taccaaagta tagtctgttt gagttagaaa atggccgaaa acggatgttg 4740

gctagcgccg gagagcttca aaaggggaac gaactcgcac taccgtctaa atacgtgaat 4800

ttcctgtatt tagcgtccca ttacgagaag ttgaaaggtt cacctgaaga taacgaacag 4860

aagcaacttt ttgttgagca gcacaaacat tatctcgacg aaatcataga gcaaatttcg 4920

gaattcagta agagagtcat cctagctgat gccaatctgg acaaagtatt aagcgcatac 4980

aacaagcaca gggataaacc catacgtgag caggcggaaa atattatcca tttgtttact 5040

cttaccaacc tcggcgctcc agccgcattc aagtattttg acacaacgat agatcgcaaa 5100

cgatacactt ctaccaagga ggtgctagac gcgacactga ttcaccaatc catcacggga 5160

ttatatgaaa ctcggataga tttgtcacag cttgggggtg acggtggctc cgattataag 5220

gatgatgacg acaagggagg ttccccaaag aagaaaagga aggtctga 5268

<210> 766

<211> 1755

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 766

Met Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val

1 5 10 15

Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg

20 25 30

Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val

35 40 45

Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe

50 55 60

Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala

65 70 75 80

Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn

85 90 95

Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala

100 105 110

Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly

115 120 125

Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln

130 135 140

Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp Ile Arg Asn

145 150 155 160

Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Ile Ala Glu

165 170 175

Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg

180 185 190

Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly

195 200 205

Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp

210 215 220

Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys

225 230 235 240

Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu

245 250 255

Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr His Arg Leu Ile

260 265 270

Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly

275 280 285

His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val

290 295 300

Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn Ile

305 310 315 320

Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val

325 330 335

Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

340 345 350

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp

355 360 365

Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp

370 375 380

Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val

385 390 395 400

Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala

405 410 415

Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg

420 425 430

Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu

435 440 445

Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe

450 455 460

His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu

465 470 475 480

Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu

485 490 495

Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr

500 505 510

Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile

515 520 525

Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn

530 535 540

Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln

545 550 555 560

Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala

565 570 575

Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile

580 585 590

Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile

595 600 605

Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu

610 615 620

Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp

625 630 635 640

Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe

645 650 655

Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu

660 665 670

Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile

675 680 685

Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu

690 695 700

Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln

705 710 715 720

Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu

725 730 735

Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr

740 745 750

Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln

755 760 765

Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu

770 775 780

Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys

785 790 795 800

Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr

805 810 815

Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr

820 825 830

Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val

835 840 845

Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe

850 855 860

Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu

865 870 875 880

Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val

885 890 895

Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys

900 905 910

Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys

915 920 925

Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val

930 935 940

Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr

945 950 955 960

His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu

965 970 975

Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe

980 985 990

Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu

995 1000 1005

Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr

1010 1015 1020

Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

1025 1030 1035

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly

1040 1045 1050

Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu

1055 1060 1065

Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly

1070 1075 1080

Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala

1085 1090 1095

Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu

1100 1105 1110

Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu

1115 1120 1125

Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser

1130 1135 1140

Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly

1145 1150 1155

Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln

1160 1165 1170

Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met

1175 1180 1185

Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp

1190 1195 1200

Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile

1205 1210 1215

Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser

1220 1225 1230

Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr

1235 1240 1245

Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe

1250 1255 1260

Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

1265 1270 1275

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile

1280 1285 1290

Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys

1295 1300 1305

Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr

1310 1315 1320

Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe

1325 1330 1335

Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala

1340 1345 1350

Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro

1355 1360 1365

Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp

1370 1375 1380

Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala

1385 1390 1395

Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys

1400 1405 1410

Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu

1415 1420 1425

Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly

1430 1435 1440

Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val

1445 1450 1455

Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys

1460 1465 1470

Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg

1475 1480 1485

Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro

1490 1495 1500

Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

1505 1510 1515

Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr

1520 1525 1530

Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu

1535 1540 1545

Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys

1550 1555 1560

Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg

1565 1570 1575

Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala

1580 1585 1590

Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr

1595 1600 1605

Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu

1610 1615 1620

Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln

1625 1630 1635

Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu

1640 1645 1650

Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile

1655 1660 1665

Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn

1670 1675 1680

Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp

1685 1690 1695

Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu

1700 1705 1710

Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu

1715 1720 1725

Ser Gln Leu Gly Gly Asp Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

1730 1735 1740

Asp Lys Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1745 1750 1755

<210> 767

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 767

cctgaaataa tgcaagtgta gaataacttt ttaaaatctc atggtttatg ctaaactata 60

tgttgacata agagtggtga taaggcaaca gtagg 95

<210> 768

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 768

cctagggaag tgatcatagc tgagtttcta tctcatggtt tatgctaaac tatatgttga 60

catgttgagg agacttaagt ccaaaacctg g 91

<210> 769

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 769

atgtcctgaa ataatgcaag tgtagaataa ctttttaaaa tctcatggtt tatgctaaac 60

tatatgttga cataagagtg gtgataaggc aacagtaggt aaaag 105

<210> 770

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是终止密码子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是终止密码子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (25)..(25)

<223> Xaa是终止密码子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (28)..(29)

<223> Xaa是终止密码子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (34)..(34)

<223> Xaa是终止密码子

<400> 770

Met Ser Xaa Asn Asn Ala Ser Val Glu Xaa Leu Phe Lys Ile Ser Trp

1 5 10 15

Phe Met Leu Asn Tyr Met Leu Thr Xaa Glu Trp Xaa Xaa Gly Asn Ser

20 25 30

Arg Xaa Lys

35

<210> 771

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 771

Asn Ala Ala Arg

1

<210> 772

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 772

Ala Gly Val Phe

1

<210> 773

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 773

Gly Phe Leu Gly

1

<210> 774

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 774

Ala Leu Ala Leu

1

<210> 775

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 775

Ala Leu Ala Leu Ala

1 5

Claims

1.融合蛋白，其包含：

(i)引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域；

(ii)接头；和

(iii)重组酶催化域。

2.权利要求1的融合蛋白，其中所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域选自下组：核酸酶无活性的Cas9(dCas9)域、核酸酶无活性的Cpf1域、核酸酶无活性的Argonaute域，及其变体。

3.权利要求1的融合蛋白，其中所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域是核酸酶无活性的Cas9(dCas9)域。

4.权利要求2或3的融合蛋白，其中所述dCas9域的氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO:1中D10A或H840A突变的突变。

5.权利要求2-4中任一项的融合蛋白，其中所述dCas9域的氨基酸序列包含对应于SEQID NO:1中D10A突变的突变和对应于SEQ ID NO:1中H840A突变的突变。

6.权利要求2-5中任一项的融合蛋白，其中所述dCas9域的氨基酸序列进一步包含对应于SEQ ID NO:1中缺少的N-末端甲硫氨酸的突变。

7.权利要求2或3的融合蛋白，其中所述dCas9域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:712。

8.权利要求2或3的融合蛋白，其中所述dCas9域的氨基酸序列与SEQ ID NO:712具有95％或更高的序列一致性。

9.权利要求2或3的融合蛋白，其中所述dCas9域的氨基酸序列与SEQ ID NO:712具有96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。

10.前述权利要求中任一项的融合蛋白，其中所述重组酶催化域是丝氨酸重组酶催化域或酪氨酸重组酶催化域。

11.权利要求10的融合蛋白，其中所述丝氨酸重组酶催化域或酪氨酸重组酶催化域选自Gin、Sin、Tn3、Hin、β、γδ、PhiC31、Cre或FLP重组酶催化域。

12.权利要求10或权利要求11的融合蛋白，其中所述Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含选自下组的一个或多个突变：SEQ ID NO:713中的H106Y、I127L、I136R或G137F突变。

13.权利要求11或权利要求12的融合蛋白，其中所述Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:713。

14.权利要求10或权利要求11的融合蛋白，其中所述Cre重组酶的氨基酸序列是截短的。

15.权利要求11或权利要求14的融合蛋白，其中所述酪氨酸重组酶催化域是所述Cre重组酶的25kDa羧基-末端域。

16.权利要求14的融合蛋白，其中所述Cre重组酶以氨基酸R118、A127、E138或R154开始。

17.权利要求1-16中任一项的融合蛋白，其中所述重组酶的氨基酸序列已得以进一步突变。

18.前述权利要求中任一项的融合蛋白，其中所述重组酶催化域是经演化的重组酶催化域。

19.权利要求1-18中任一项的融合蛋白，其中所述接头具有约33埃至约81埃的长度。

20.权利要求1-19中任一项的融合蛋白，其中所述接头是肽接头。

21.权利要求20的融合蛋白，其中所述肽接头包含XTEN接头(SGSETPGTSESATPES(SEQID NO:7)、SGSETPGTSESA(SEQ ID NO:8)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS(SEQ ID NO:9))、包含三肽GGS的一个或多个重复的氨基酸序列，或任何以下氨基酸序列：VPFLLEPDNINGKTC(SEQID NO:10)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:11)、SIVAQLSRPDPA(SEQ ID NO:12)、MKIIEQLPSA(SEQ ID NO:13)、VRHKLKRVGS(SEQ ID NO:14)、GHGTGSTGSGSS(SEQ ID NO:15)、MSRPDPA(SEQ ID NO:16)或GGSM(SEQ ID NO:17)。

22.权利要求20或权利要求21的融合蛋白，其中所述肽接头包含所述三肽GGS的一个或多个重复。

23.权利要求20-22中任一项的融合蛋白，其中所述肽接头包含所述三肽GGS的六至十个重复。

24.权利要求20-23中任一项的融合蛋白，其中所述肽接头包含所述三肽GGS的八个重复。

25.权利要求20-24中任一项的融合蛋白，其中所述肽接头长约18至约27个氨基酸。

26.权利要求20-25中任一项的融合蛋白，其中所述肽接头长24个氨基酸。

27.权利要求20-26中任一项的融合蛋白，其中所述肽接头具有氨基酸序列GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:183)。

28.权利要求1-19中任一项的融合蛋白，其中所述接头是非肽接头。

29.权利要求28的融合蛋白，其中所述非肽接头包含聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸、肝素或烷基接头。

30.权利要求29的融合蛋白，其中所述烷基接头具有式—NH—(CH2)s—C(O)—，其中s可以是1-100的任何整数，包括端点。

31.权利要求30的融合蛋白，其中s是1-20的整数，包括端点。

32.权利要求1-31中任一项的融合蛋白，其进一步包含核定位信号(NLS)域。

33.权利要求32的融合蛋白，其中所述NLS域经由一个或多个第二接头与所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域或所述Gin重组酶催化域结合。

34.权利要求33的融合蛋白，其中所述第二接头是肽接头。

35.权利要求33或权利要求34的融合蛋白，其中所述第二接头包含XTEN接头(SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:7)、SGSETPGTSESA(SEQ ID NO:8)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS(SEQ ID NO:9))、包含一个或多个三肽GGS的重复的氨基酸序列，或任何以下氨基酸序列：VPFLLEPDNINGKTC(SEQ ID NO:10)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:11)、SIVAQLSRPDPA(SEQ ID NO:12)、MKIIEQLPSA(SEQ ID NO:13)、VRHKLKRVGS(SEQ ID NO:14)、GHGTGSTGSGSS(SEQ ID NO:15)、MSRPDPA(SEQ ID NO:16)或GGSM(SEQ ID NO:17)。

36.权利要求33-35中任一项的融合蛋白，其中所述第二接头包含所述三肽GGS的一个或多个重复。

37.权利要求33-36中任一项的融合蛋白，其中所述第二接头包含所述三肽GGS的一至五个重复。

38.权利要求33-37中任一项的融合蛋白，其中所述第二接头包含所述三肽GGS的一个重复。

39.权利要求33-38中任一项的融合蛋白，其中所述第二接头具有序列GGS。

40.权利要求33的融合蛋白，其中所述第二接头是非肽接头。

41.权利要求40的融合蛋白，其中所述非肽接头包含聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸、肝素或烷基接头。

42.权利要求41的融合蛋白，其中所述烷基接头具有式—NH—(CH2)s—C(O)—，其中s可以是1-100的任何整数，包括端点。

43.权利要求42的融合蛋白，其中s是1-20的任何整数，包括端点。

44.权利要求32-43中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含结构NH₂-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-COOH。

45.权利要求32-44中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含结构NH₂-[Gin重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-COOH。

46.权利要求32-39、44或45中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:719中所示的氨基酸序列。

47.前述权利要求中任一项的融合蛋白，其进一步包含一个或多个亲和标签。

48.权利要求47的融合蛋白，其中所述亲和标签选自下组：FLAG标签、多组氨酸(多His)标签、多精氨酸(多Arg)标签、Myc标签和HA标签。

49.权利要求47或权利要求48的融合蛋白，其中所述亲和标签是FLAG标签。

50.权利要求47-49中任一项的融合蛋白，其中所述FLAG标签具有序列PKKKRKV(SEQ IDNO:702)。

51.权利要求47-50中任一项的融合蛋白，其中所述一个或多个亲和标签经由一个或多个第三接头与所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域、所述重组酶催化域或所述NLS域结合。

52.权利要求51的融合蛋白，其中所述第三接头是肽接头。

53.权利要求51或权利要求52的融合蛋白，其中所述第三接头包含XTEN接头，(SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:7)、SGSETPGTSESA(SEQ ID NO:8)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS(SEQ ID NO:9))、包含三肽GGS的一个或多个重复的氨基酸序列，或任何以下氨基酸序列：VPFLLEPDNINGKTC(SEQ ID NO:10)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:11)、SIVAQLSRPDPA(SEQ ID NO:12)、MKIIEQLPSA(SEQ ID NO:13)、VRHKLKRVGS(SEQ ID NO:14)、GHGTGSTGSGSS(SEQ ID NO:15)、MSRPDPA(SEQ ID NO:16)或GGSM(SEQ ID NO:17)。

54.权利要求51-53中任一项的融合蛋白，其中所述第三接头包含所述三肽GGS的一个或多个重复。

55.权利要求51-54中任一项的融合蛋白，其中所述第三接头包含所述三肽GGS的一至五个重复。

56.权利要求51-55中任一项的融合蛋白，其中所述第三接头包含所述三肽GGS的一个重复。

57.权利要求51-56中任一项的融合蛋白，其中所述第三接头具有序列GGS。

58.权利要求51的融合蛋白，其中所述第三接头是非肽接头。

59.权利要求58的融合蛋白，其中所述非肽接头包含聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(POE)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸、肝素或烷基接头。

60.权利要求59的融合蛋白，其中所述烷基接头具有式—NH—(CH2)s—C(O)—，其中s可以是1-100的任何整数，包括端点。

61.权利要求60的融合蛋白，其中s可以是1-20的任何整数。

62.权利要求47-61中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含结构NH₂-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-COOH、NH₂-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH、NH₂-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-COOH、NH₂-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-COOH、NH₂-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[NLS域]-COOH或NH₂-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的N端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域的C端部分]-[任选的接头序列]-[NLS域]-COOH。

63.权利要求47-57中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白与SEQ ID NO:185中所示的氨基酸序列具有大于99％的序列一致性。

64.权利要求47-57中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白与SEQ ID NO:185中所示的氨基酸序列具有大于90％或95％的序列一致性。

65.权利要求47-57、63或64中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:185中所示的氨基酸序列。

66.前述权利要求中任一项的融合蛋白，其中所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域与引导RNA(gRNA)结合。

67.权利要求66的融合蛋白的二聚体。

68.权利要求67的融合蛋白的二聚体，其中所述二聚体与DNA分子结合。

69.权利要求68的融合蛋白的二聚体，其中所述二聚体的每个融合蛋白与所述DNA分子的相同链结合。

70.权利要求68的融合蛋白的二聚体，其中所述二聚体的每个融合蛋白与所述DNA分子的相对链结合。

71.权利要求67-70中任一项的融合蛋白的二聚体，其中所述二聚体的gRNA与重组酶位点旁侧的gRNA结合位点杂交。

72.权利要求71的方法，其中所述重组酶位点包含res、gix、hix、six、resH、LoxP、FTR或att核心或相关核心序列。

73.权利要求71或权利要求72的融合蛋白的二聚体，其中所述重组酶位点包含gix核心或gix相关核心序列。

74.权利要求72或权利要求73的二聚体，其中所述gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离为3至7个碱基对。

75.权利要求72-74中任一项的二聚体，其中所述gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离为5至6个碱基对。

76.权利要求67-75中任一项的融合蛋白的二聚体，其中第一二聚体与第二二聚体结合，从而形成所述融合蛋白的四聚体。

77.权利要求66的融合蛋白的四聚体。

78.权利要求77的融合蛋白的四聚体，其中所述四聚体与DNA分子结合。

79.权利要求68的融合物的四聚体，其中每个二聚体与DNA的相对链结合。

80.权利要求68的融合蛋白的四聚体，其中每个二聚体与DNA的相同链结合。

81.用于两个DNA分子之间的位点特异性重组的方法，其包括：

(a)使第一DNA与第一融合蛋白接触，其中所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第一gRNA，所述第一gRNA与所述第一DNA的第一区域杂交；

(b)使所述第一DNA与第二融合蛋白接触，其中所述第二融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第二gRNA，所述第二gRNA与所述第一DNA的第二区域杂交；

(c)使第二DNA与第三融合蛋白接触，其中所述第三融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第三gRNA，所述第三gRNA与所述第二DNA的第一区域杂交；和

(d)使所述第二DNA与第四融合蛋白接触，其中所述第四融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第四gRNA，所述第四gRNA与所述第二DNA的第二区域杂交；

其中在使得所述DNA重组的条件下，步骤(a)-(d)中所述融合蛋白的结合导致所述融合蛋白的重组酶催化域的四聚化，并且其中所述第一、第二、第三和/或第四融合蛋白是权利要求1-63中任一项的融合蛋白。

82.权利要求81的方法，其中所述第一和第二DNA分子具有不同的序列。

83.权利要求81的方法，其中步骤(a)和(b)的所述gRNA与所述第一DNA的相对链杂交，并且步骤(c)和(d)的所述gRNA与所述第二DNA的相对链杂交。

84.权利要求81-83中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)的所述gRNA；和/或步骤(c)和(d)的所述gRNA与它们各自的DNA的区域杂交，所述区域相隔不超过100个碱基对。

85.权利要求84的方法，其中步骤(a)和(b)的所述gRNA；和/或步骤(c)和(d)的所述gRNA与它们各自的DNA的区域杂交，所述区域相隔不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过40、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80或不超过90个碱基对。

86.权利要求81-85中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)的所述gRNA；和/或步骤(c)和(d)的所述gRNA在重组酶位点旁侧的gRNA结合位点处与它们各自的DNA的区域杂交。

87.权利要求86的方法，其中所述重组酶位点包含res、gix、hix、six、resH、LoxP、FTR或att核心或相关核心序列。

88.权利要求86或权利要求87的方法，其中所述重组酶位点包含gix核心或gix相关核心序列。

89.权利要求87或权利要求88的方法，其中所述gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离为3至7个碱基对。

90.权利要求87-89中任一项的方法，其中所述gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离为5至6个碱基对。

91.用于单一DNA分子的两个区域之间的位点特异性重组的方法，其包括：

(a)使所述DNA与第一融合蛋白接触，其中所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第一gRNA，所述第一gRNA与所述DNA的第一区域杂交；

(b)使所述DNA与第二融合蛋白接触，其中所述第二融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第二gRNA，所述第二gRNA与所述DNA的第二区域杂交；

(c)使所述DNA与第三融合蛋白接触，其中所述第三融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第三gRNA，所述第三gRNA与所述DNA的第三区域杂交；和

(d)使所述DNA与第四融合蛋白接触，其中所述第四融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域结合第四gRNA，所述第四gRNA与所述DNA的第四区域杂交；

92.权利要求91的方法，其中重组的所述单一DNA分子的两个区域具有不同的序列。

93.权利要求91或权利要求92的方法，其中所述重组导致所述DNA分子的区域的缺失。

94.权利要求93的方法，其中缺失的所述DNA分子的区域易于在减数分裂中发生交换事件。

95.权利要求91-94中任一项的方法，其中步骤(a)-(d)的所述第一和第二gRNA与所述DNA的相同链杂交，并且步骤(a)-(d)的所述第三和第四gRNA与所述DNA的相对链杂交。

96.权利要求91-95中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)的所述gRNA与所述DNA的区域杂交，所述区域相隔不超过100个碱基对，并且步骤(c)和(d)的所述gRNA与所述DNA的区域杂交，所述区域相隔不超过100个碱基对。

97.权利要求96的方法，其中步骤(a)和(b)的所述gRNA与所述DNA的区域杂交，所述区域相隔不超过50、不超过60、不超过70、不超过80或不超过90个碱基对，并且步骤(c)和(d)的所述gRNA与所述DNA的区域杂交，所述区域相隔不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过40、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80或不超过90个碱基对。

98.权利要求91-97中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)的所述gRNA；和/或步骤(c)和(d)的所述gRNA与重组酶位点旁侧的gRNA结合位点杂交。

99.权利要求98的方法，其中所述重组酶位点包含res、gix、hix、six、resH、LoxP、FTR或att核心或相关核心序列。

100.权利要求98或权利要求99的方法，其中所述重组酶位点包含gix核心或gix相关核心序列。

101.权利要求99或权利要求100的方法，其中所述gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离为3至7个碱基对。

102.权利要求99-101中任一项的方法，其中所述gix核心或gix相关核心序列与至少一个gRNA结合位点之间的距离为5至6个碱基对。

103.权利要求81-102中任一项的方法，其中所述DNA在细胞中。

104.权利要求103的方法，其中所述细胞是真核细胞。

105.权利要求103的方法，其中所述细胞是原核细胞。

106.权利要求104或权利要求105的方法，其中所述细胞在受试者中。

107.权利要求106的方法，其中所述受试者是人。

108.多核苷酸，其编码权利要求1-63中任一项的融合蛋白。

109.载体，其包含权利要求108的多核苷酸。

110.用于重组蛋白表达的载体，其包含编码权利要求1-63中任一项的融合蛋白的多核苷酸。

111.细胞，其包含用于表达权利要求1-63中任一项的融合蛋白的遗传构建体。

112.试剂盒，其包含权利要求1-63中任一项的融合蛋白。

113.试剂盒，其包含编码权利要求1-63中任一项的融合蛋白的多核苷酸。

114.试剂盒，其包含用于重组蛋白表达的载体，其中所述载体包含编码权利要求1-63中任一项的融合蛋白的多核苷酸。

115.试剂盒，其包含含有用于表达权利要求1-63中任一项的融合蛋白的遗传构建体的细胞。

116.权利要求112-115中任一项的试剂盒，其进一步包含一个或多个gRNA和/或用于表达一个或多个gRNA的载体。