CN104805078A - 用于高效基因组编辑的rna分子的设计、合成及其应用 - Google Patents

Abstract

在原核生物中，CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeals and CRISPR associated)系统中的cas9蛋白被证实与两种小RNA(crRNA、tracrRNA)结合对外源核酸进行识别直接剪切已达到保护自身的目的。科学家们充分利用这一特性，用cas9和gRNA(将crRNA和tracrRNA融合成一条相对较长的RNA，gRNA)对目的DNA序列进行剪切，从而实现基因定点修饰。然而现有的Cas9/gRNA对靶基因的切割效率较低，一般在5％～30％之间，应用会受到一定的限制。本发明中利用高效筛选体系，筛选出一系列可以提高Cas9活性的gRNA。

Description

用于高效基因组编辑的RNA分子的设计、合成及其应用

技术领域：

本发明涉及基因工程及核酸检测领域。具体地说，本发明涉及可用病毒、微生物、动植物等生物核酸序列的基因组编辑方法及用途。

背景技术：

基因定点修饰一直是研究基因功能的重要手段之一，它也被用于人类遗传性疾病的治疗中，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到限制。

锌指核酸酶(ZFN的)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)的出现让科学家们可以高效地进行基因定点修饰，被应用于斑马鱼、小鼠、大鼠、猪等动物模型中，实验证明它们可以高效准确地对基因进行定点修饰。但是这两种技术所需的核酸序列，合成方法麻烦，成本昂贵，无法进行大规模基因筛选。

2013年初，在原核生物中，CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeals and CRISPR associated)最新进展为基因定点修饰提供了一种制作简单、成本低廉、作用高效的方法。该系统在细菌和古细菌中用于降解入侵的病毒和质粒，防止本体收到外来遗传物质的损害。CRISPR/Cas系统一共分为三种类型，Cas9属于研究相对清楚的II型系统，研究证实在原核生物中，Cas9需要同两种小RNA(crRNA、tracrRNA)结合对外源核酸进行识别，直接剪切以达到保护自身的目的。科学家们为了能够便于操作、简化实验体系，将crRNA和tracrRNA融合成一条相对较长的gRNA，实验证明，在哺乳动物细胞内，Cas9由gRNA引导，可以对靶DNA进行剪切。

现有技术存在的问题：现有的Cas9/gRNA对靶基因的切割效率较低，一般在5％～30％之间，应用会受到一定的限制。因此，开发新的gRNA，就成为本领域迫切需要解决的一个技术问题。

发明内容：

本发明的目的正是为了解决上述问题，希望通过对gRNA的结构进行一些改进，提高Cas9/gRNA系统对靶向基因的切割效率。

本发明所称的“靶序列”是指gRNA5’端的20～24碱基的序列，这段序列与目的DNA序列相同，gRNA需这段序列与目的DNA结合，cas9/gRNA复合体对目的DNA进行剪切。

本发明所称的“RNA二级结构”是指通过使用核酸二级结构预测软件RNAfold(Mathews等人(2004)，网址http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)预测得到的RNA二级结构。

本发明所称的“基因组编辑”是指对生物的基因组DNA进行删除、插入或者替换，从而达到对目的序列修改的目的。

本发明采用的技术方案如下：

本发明中设计针对HHB基因序列设计合成gRNA，采用的实验方法是国际上比较常用的荧光素酶单链重组退火实验(luciferase single-strand annealing recombination assay，SSA)，和用来检测内源基因非同源重组检测效率的方法-SURVEYOR实验。实验原理如附图1、2所示。

gRNA是一个含有96碱基的RNA，如果用随机合成的方法进行筛选，将会有4⁹⁶种可能，筛选工作量过于庞大，无法进行。所以本发明中着眼于gRNA的第一个发卡结果进行筛选，利用质粒不相容这一性质进行筛选。具体步骤如图1所示。该方法首先建立筛选体系，然后从第一个发卡结构中按顺序选取4个碱基合成NNNN的随机序列建立gRNA库，将cas9表达质粒和gRNA表达质粒与报告质粒一起共转化进大肠杆菌，在其中挑选阳性克隆扩增，最后与报告质粒再次共转化进行验证。我们设计的上述新方法使得筛选实验的实验量大大减小，从而使得从大量可能的组合中挑选出有效的新型gRNA变得可行。

使用上述方法，我们从上千种gRNA中挑选出了10种最优选的增强cas9/gRNA效果的gRNA，并且根据实验结果合理概括出效果较好的gRNA结构。同时我们对现有的gRNA的结构进行修改测试。

附图说明

图1筛选实验流程示意图。我们将cas9和gRNA构建到同一个载体上，再通过共转化的方法，将其和报告基因的载体共转化到同一个大肠杆菌内，有效果的gRNA会和cas9形成复合体将含有报告基因载体上的靶序列剪切，此时会发生荧光素酶单链重组退火反应，报告基因会表达。我们经过挑选报告基因表达的克隆来选取有效果的gRNA。为了进行大规模筛选，我们将gRNA库构建到载体上进行筛选，从中挑取阳性克隆，提取gRNA质粒，再进行下游重新验证。

图2荧光素酶单链重组退火实验(luciferase single-strand annealing recombinationassay，SSA)原理图：首先，把荧光素酶基因进行改造。在荧光素酶基因中间加入终止密码子和靶基因序列；随后通过分子生物学手段再紧接上另外一段荧光素酶基因序列，图中浅灰色区域的序列(约800bp)相同。当gRNA有效果时，Cas9/gRNA复合体会在靶序列位置把双链DNA剪切形成一个双链的DNA断裂，由于两个浅灰色区域序列(即图1中“终止密码子”左侧的一段基因和“靶序列”右侧的一段基因)相同，此时会发生同源重组，就形成了一个有活性的荧光素酶报告基因，实验中可以测量荧光素酶的表达来检测TALEN的效果的强弱。

图3SURVEYOR原理图：首先用PCR的方法把目的基因片段从基因组上扩增出来。其中包括发生缺失和没有产生变化的序列。然后把扩增出来的片段在体外进行重新退火，此时发生缺失的片段和没有产生变化的序列会退火形成有部分不配对的双链结构。接下来用SURVEYOR酶进行酶切实验，这种酶可以识别不配对的区域进行酶切。我们可以通过跑胶检测图中a、b、c的含量来检测发生缺失的效率，从而得出TALEN的作用效果。

图4gRNA修改1序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第1个碱基由G变为U，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9剪切效果相对原始gRNA略有下降。

图5gRNA修改2序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第1个碱基由G的配对序列由U突变为C，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9剪切效果相对原始gRNA基本不变。

图6gRNA修改3序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第1个碱基由G的配对序列由U突变为A，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没有剪切活性。

图7gRNA修改4序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第1个碱基由G突变为A，它的配对序列由U突变为A，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没有剪切活性。

图8gRNA修改5序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第1个碱基由G突变为U，它的配对序列由U突变为G，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没有剪切活性。

图9gRNA修改6序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第3、4、5个碱基由UUU突变为GCG，它们的配对序列由AAA突变为CGC，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没有剪切活性。

图10gRNA修改7序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第3个碱基U配对序列由A突变为C，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没有剪切活性。

图11gRNA修改8序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第3、4、5个碱基由UUU变为UU，它们的配对序列AAA变为AA，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没有剪切活性。

图12gRNA修改9序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第7、8、9个碱基由GAG变为ACU，他们的互补序列变为CUC，将泡补齐，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没有剪切活性。

图13gRNA修改10序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第8个碱基由A变为AAG，第21、22、23个碱基由AAG变为A，将泡方向改变，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9没有剪切活性。

图14gRNA修改11序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第21个碱基A去掉，减少泡3’端的大小，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9剪切效果相对原始gRNA有下降。

图15gRNA修改12序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第21、22个碱基AA去掉，减少泡3’端的大小，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9剪切效果相对原始gRNA有下降。

图16gRNA修改13序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第8个碱基A去掉，减少泡5’端的大小，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9剪切效果相对原始gRNA下降很明显。

图17gRNA修改14序列及SSA和SURVEYOR实验结果。将gRNA序列中第8个碱基由A突变为G，SSA结果和SURVEYOR结果显示，cas9剪切效果相对原始gRNA有所升高。

图18gRNA1序列及SSA和SURVEYOR实验结果

图19gRNA2序列及SSA和SURVEYOR实验结果

图20gRNA3序列及SSA和SURVEYOR实验结果

图21gRNA4序列及SSA和SURVEYOR实验结果

图22gRNA5序列及SSA和SURVEYOR实验结果

图23gRNA6序列及SSA和SURVEYOR实验结果

图24gRNA7序列及SSA和SURVEYOR实验结果

图25gRNA8序列及SSA和SURVEYOR实验结果

图26gRNA9序列及SSA和SURVEYOR实验结果

图27gRNA1O序列及SSA和SURVEYOR实验结果

具体实施方式

以下将通过具体的实施例说明本发明，但是这些具体的实施例不应当理解为对本发明的限制，对某些细节进行修改将仍然落入本发明的保护范围之内。实施例中使用的gRNA碱基序列、被上述gRNA识别的目标DNA中的片段的序列、以及cas9的氨基酸序列如附录所示。附录中列出了3组gRNA碱基序列和能被上述gRNA识别的DNA序列，实验中使用的gRNA碱基序列和对应的被gRNA识别的DNA序列是同一组的，但是并不限于某一个特定的组。在实际应用的时候，一般是知道目标DNA序列后，选取目标DNA序列中的一段作为gRNA的识别位点，然后根据该目标DNA片段合成出能识别该片段的gRNA。

实施例1原理如图2和图3所示，实验结果如图18所示。首先，我们将gRNA识别序列构建到SSA载体中，然后在真核表达载体上构建gRNA表达载体；其次，我们将gRNA表达载体、cas9表达载体、SSA表达载体共转染到HEK293T细胞中，24小时之后检查荧光素酶基因的表达水平。同时，我们将gRNA表达载体和cas9表达载体共转染到HEK293T细胞中，48小时之后，提取基因组DNA，做SURVEYOR实验，反应gRNA/cas9活性。从图18中可以看出，gRNA1的活性相对gRNA活性提高50％左右。

实施例2实验过程与实施例1类似，只是将gRNA1序列换成了gRNA2。实验结果见图19。由图19可以看出，gRNA2的活性相对gRNA活性提高了30％左右。

实施例3实验过程与实施例1类似，只是将gRNA1序列换成了gRNA3。实验结果见图20。由图20可以看出，gRNA3的活性相对gRNA活性提高了30％左右。

实施例4实验过程与实施例1类似，只是将gRNA1序列换成了gRNA4。实验结果见图21。由图21可以看出，gRNA4的活性相对gRNA活性提高了60％左右。

实施例5实验过程与实施例1类似，只是将gRNA1序列换成了gRNA5。实验结果见图22。由图22可以看出，gRNA5的活性相对gRNA活性提高了60％左右。

实施例6实验过程与实施例1类似，只是将gRNA1序列换成了gRNA6。实验结果见图23。由图23可以看出，gRNA6的活性相对gRNA活性提高了30％左右。

实施例7实验过程与实施例1类似，只是将gRNA1序列换成了gRNA7。实验结果见图24。由图24可以看出，gRNA7的活性相对gRNA活性提高了40％左右。

实施例8实验过程与实施例1类似，只是将gRNA1序列换成了gRNA8。实验结果见图25。由图25可以看出，gRNA8的活性相对gRNA活性提高了100％左右。

实施例9实验过程与实施例1类似，只是将gRNA1序列换成了gRNA9。实验结果见图26。由图26可以看出，gRNA9的活性相对gRNA活性提高了110％左右。

实施例10实验过程与实施例1类似，只是将gRNA1序列换成了gRNA10。实验结果见图27。由图27可以看出，gRNA1O的活性相对gRNA活性提高了45％左右。

由上述实施例的结果可以看出，gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4、gRNA5、gRNA6、gRNA7、gRNA8、gRNA9和gRNA10在SSA实验中还是在SURVEYOR实验中都可以有效的对目标DNA序列进行剪切，体现出相对gRNA较高的活性。

附录

(1)

gRNA识别序列(AATAACAGTGATAATTTCT)

gRNA碱基序列：

AAUAACAGUGAUAAUUUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU

(2)

gRNA识别序列(CAGTGATAATTTCTGGGTTA)

gRNA碱基序列：

CAGUGAUAAUUUCUGGGUUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU

(3)

gRNA识别序列(AGGGCGAGGAGCTGTTCACC)

gRNA碱基序列：

AGGGCGAGGAGCUGUUCACCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU

(4)

Cas9氨基酸序列：

MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

(5)

SSA质粒核心碱基序列：

ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCTCTAGAGGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGAACATCACGTACGCGGAATACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGAACATTTCGCAGCCTACCGTAGTGTTTGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAATTACCAATAATCCAGAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTACCAGAGTCCTTTGATCGTGACAAAACAATTGCACTGATAATGAATTCCTCTGGATCTACTGGGTTACCTAAGGGTGTGGCCCTTCCGCATAGAACTGCCTGCGTCAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTTTACGATCCCTTCAGGATTACAAAATTCAAAGTGCGTTGCTAGTACCAACCCTATTTTCATTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGGGGCGCACCTCTTTCGAAAGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCAAAACGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAGAGAGGCGAATTATGTGTCAGAGGACCTATGTGAAGATCTGTTATTTTCTCCCCTAAGGATCCTGCGGGCATTTTTGAGCTGGTGGACTCGAGCGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGAACATTTCGCAGCCTACCGTAGTGTTTGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAATTACCAATAATCCAGAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTACCAGAGTCCTTTGATCGTGACAAAACAATTGCACTGATAATGAATTCCTCTGGATCTACTGGGTTACCTAAGGGTGTGGCCCTTCCGCATAGAACTGCCTGCGTCAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTTTACGATCCCTTCAGGATTACAAAATTCAAAGTGCGTTGCTAGTACCAACCCTATTTTCATTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGGGGCGCACCTCTTTCGAAAGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCAAAACGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAGAGAGGCGAATTATGTGTCAGAGGACCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATAGTTGACCGCTTGAAGTCTTTAATTAAATACAAAGGATATCAGGTGGCCCCCGCTGAATTGGAATCGATATTGTTACAACACCCCAACATCTTCGACGCGGGCGTGGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGTCCAAATTGTAA

Claims (25)

1.一种RNA，其特征在于序列为5’-靶序列-X-AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3'，其中X表示一段RNA片段，所述X片段具有下图所示的RNA二级结构：

其中区域I中所有碱基完全配对，碱基个数为12-16，A和U的数目之和占总碱基数的50％以上，5’端端点碱基为G或者A，当5’端端点碱基为G时，3’端端点碱基为C或者U，当5’端端点碱基为A时，3’端端点碱基为U；

区域II中所有碱基都不配对，靠近5’端的RNA链具有1个以上的碱基，靠近3’端的RNA链具有3个以上的碱基，且靠近3’端的RNA链碱基数大于靠近5’端的RNA链碱基数；

区域III中一半以上的碱基配对，碱基数为4-32个；

区域IV中碱基可配对也可不配对。

2.根据权利要求1所述的RNA，其特征在于区域I中碱基个数为14；区域II中靠近5’端的RNA链具有1个碱基，靠近3’端的RNA链具有3个碱基。

3.根据权利要求2所述的RNA，其特征在于区域II中靠近5’端的RNA链具有1个碱基，该碱基为A或者G。

4.根据权利要求1-3的任一项所述的RNA，其特征在于区域III中碱基个数为14或16，当碱基个数为14时，只有两个碱基不配对；当碱基个数为16时，所有碱基均配对。

5.根据权利要求1-4的任一项所述的RNA，其特征在于区域I的2、3、4、5位置必须为A或U，且与3端RNA链形成的配对必须为A-U配对。

6.根据权利要求1所述的RNA，其特征在于所述X的序列具有下图所示的RNA二级结构：其中，区域I中的碱基数为14个，且所有碱基完全配对；区域II中碱基数为4个，且所有碱基都不配对，靠近5’端的RNA链具有1个碱基，靠近3’端的RNA链具有3个碱基；区域III中的碱基数为4个，且所有碱基完全配对；区域IV中的碱基数为8个，且所有碱基都不配对。

7.根据权利要求1或6所述的RNA，其特征在于所述X的序列为5'-GUAUUAGAGCCUGAAAAUGCAAGUUAAUAU-3'。

8.根据权利要求1或6所述的RNA，其特征在于所述X的序列为5'-GUAUUAGAGCGGGAAAAAGCAAGUUAAUAU-3'。

9.根据权利要求1所述的RNA，其特征在于所述X的序列具有下图所示的RNA二级结构：其中，区域I中的碱基数为14个，且所有碱基完全配对；区域II中碱基数为4个，且所有碱基都不配对，靠近5’端的RNA链具有1个碱基，靠近3’端的RNA链具有3个碱基；区域III中的碱基数为32个，靠近区域II的10个碱基完全配对，靠近区域IV的16个碱基完全配对，其余的6个碱基完全不配对；区域IV中的碱基数为4个，且所有碱基都不配对。

10.根据权利要求1或9所述的RNA，其特征在于所述X的序列为5'-GUAUUAGAGCUAGUCAGUCAGUCAGAAAUGACUGACAUCCUAGCAAGUUAAUAU-3'。

11.根据权利要求1所述的RNA，其特征在于所述X的序列具有下图所示的RNA二级结构：其中，区域I中的碱基数为14个，且所有碱基完全配对；区域II中碱基数为4个，且所有碱基都不配对，靠近5’端的RNA链具有1个碱基，靠近3’端的RNA链具有3个碱基；区域III中的碱基数为8个，且所有碱基完全配对；区域IV中的碱基数为8个，且所有碱基都不配对。

12.根据权利要求1或11所述的RNA，其特征在于所述X的序列为5'-GUAUUAGAGCUAAAGAAAAGUAGCAAGUUAAUAU-3'。

13.根据权利要求1所述的RNA，其特征在于所述X的序列具有下图所示的RNA二级结构：其中，区域I中的碱基数为14个，且所有碱基完全配对；区域II中碱基数为4个，且所有碱基都不配对，靠近5’端的RNA链具有1个碱基，靠近3’端的RNA链具有3个碱基；区域III中的碱基数为27个，靠近5’端的第10个碱基不配对，其余的碱基完全配对；区域IV中的碱基数为8个，且所有碱基都不配对。

14.根据权利要求1或13所述的RNA，其特征在于所述X的序列为5'-GUAUUAGAGCUAGUCAGUCAGUCAGAAAUUAUUGCUGACUAGCAAGUUAAUAU-3’。

15.根据权利要求1所述的RNA，其特征在于所述X的序列具有下图所示的RNA二级结构：其中，区域I中的碱基数为14个，且所有碱基完全配对；区域II中碱基数为4个，且所有碱基都不配对，靠近5’端的RNA链具有1个碱基，靠近3’端的RNA链具有3个碱基；区域III中的碱基数为16个，且所有碱基完全配对；区域IV中的碱基数为4个，且所有碱基都不配对。

16.根据权利要求1或15所述的RNA，其特征在于所述X的序列为5'-GUAUUAGAGCUAGUCAGAAAUGACUAGCAAGUUAAUAU-3'。

17.根据权利要求1所述的RNA，其特征在于所述X的序列具有下图所示的RNA二级结构：其中，区域I中的碱基数为14个，且所有碱基完全配对；区域II中碱基数为4个，且所有碱基都不配对，靠近5’端的RNA链具有1个碱基，靠近3’端的RNA链具有3个碱基；区域III中的碱基数为8个，且所有碱基完全配对；区域IV中的碱基数为4个，且所有碱基都不配对。

18.根据权利要求1或17所述的RNA，其特征在于所述X的序列为5'-GUAUUAGGCUAGGAAACUAGAAGUUAAUAU-3'。

19.根据权利要求1所述的RNA，其特征在于所述X的序列具有下图所示的RNA二级结构：其中，区域I中的碱基数为12个，且所有碱基完全配对；区域II中碱基数为6个，且所有碱基都不配对，靠近5’端的RNA链具有2个碱基，靠近3’端的RNA链具有4个碱基；区域III中的碱基数为8个，且所有碱基完全配对；区域IV中的碱基数为4个，且所有碱基都不配对。

20.根据权利要求1或19所述的RNA，其特征在于所述X的序列为5'-GUAUUAUAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAUAU-3'。

21.根据权利要求1所述的RNA，其特征在于所述X的序列具有下图所示的RNA二级结构：其中，区域I中的碱基数为14个，且所有碱基完全配对；区域II中碱基数为4个，且所有碱基都不配对，靠近5’端的RNA链具有1个碱基，靠近3’端的RNA链具有3个碱基；区域III中的碱基数为14个，靠近区域II的4个碱基完全配对，靠近区域IV的8个碱基完全配对，其余的2个碱基完全不配对；区域IV中的碱基数为4个，且所有碱基都不配对。

22.根据权利要求1或21所述的RNA，其特征在于所述X的序列为5'-GUAUUAGAGUCAUGUGAAAACAUAGCAAGUUAAUAU-3'。

23.根据权利要求1所述的RNA，其特征在于所述X的序列具有下图所示的RNA二级结构：其中，区域I中的碱基数为14个，且所有碱基完全配对；区域II中碱基数为6个，且所有碱基都不配对。

24.根据权利要求1或23所述的RNA，其特征在于所述X的序列为5’-GUAUUAGAGCAAGUUAAUAU-3'。

25.一种CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPRassociated)系统，其特征在于该系统包括权利要求1-24的任意一项所述的RNA。