CN105543281A - 一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，包括以下步骤：莱茵衣藻在TAP液体培养基，23±0.5°C，连续光照，8000Lx光强下进行通气培养，经过转接后培养、处理，将抗性DNA片段经过方波电击转化，抗性DNA随机整合进入莱茵衣藻染色体中，经过过夜弱光恢复，涂布于抗性筛选平板，经过7天光周期培养，获得引起随机插入突变的突变体文库。此方法的优点是可以高效的获得大量随机插入的转化子，构建莱茵衣藻突变体文库。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用方波电击使得外源DNA整合进入莱茵衣藻染色体DNA的方法，特别是一种利用方波电击使得抗性DNA随机插入莱茵衣藻染色体DNA，构建随机插入的莱茵衣藻突变体文库的方法。
背景技术
莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是一种真核单细胞绿藻，因其生长快、易培养，基因组小而且已被注释，生物技术手段相对成熟，细胞内生理过程的分子机制与高等动植物高度相似，因此是目前植物与动物共同的模式生物之一。采用正向遗传学插入突变手段研究表型与基因的关联性，并进一步揭示该基因的生物学功能，是目前较为直接与有效的研究手段。然而该手段的关键在于获得大量可以稳定遗传的DNA片段随机插入的突变体文库，一方面要求单克隆转化子的突变尽可能是单一插入引起，另外一方面要求DNA片段的转化尽可能获得较多的转化子，二者是相互矛盾体，前者要求在做随机插入突变的时候尽可能降低DNA的量，而提高转化子数目除了提高转化效率因素之外，增加DNA的量也可以提高转化子的数目，从而获得数目可观的突变体文库。因此，从提高DNA转化效率入手是目前构建莱茵衣藻突变体文库，或者是开展衣藻转基因技术的根本。
目前的衣藻DNA转化技术中，常用的有玻璃珠转化，电击转化等。Kindle等研究者报道了莱茵衣藻的玻璃珠转化法，该方法将去壁处理的衣藻细胞、DNA、聚乙二醇和玻璃珠震荡混匀，可以获得103个转化子/微克DNA（Kindle,1990,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences）。因而，早期的玻璃珠转化技术效率较低，操作较复杂，逐渐被摒弃。
电击转化技术被认为是一种最有效的DNA转化技术，最成功的案例是应用在细菌上，可达106-10个转化子/微克DNA。另外，RNA、DNA、蛋白质和小分子都可以使用该方法转入酵母，植物细胞与动物细胞，具有重复性好、效率高和细胞的存活率高等优点。Shimogawara等研究者报道了莱茵衣藻的电击转化方法，该方法对于细胞壁缺陷细胞CC3395的转化效率高达1.9×105个，然而没有检测野生型衣藻的转化效率（Shimogawara,1998,Genetics）。同样的，Ladygin研究发现使用细胞壁缺陷CW-15衣藻电击转化获得103个/5ugDNA（Ladygin,2003,Microbiology）。而方波电击转化技术比指数衰减波更具有良好的重复性，对细胞损伤小等特点，然而目前使用该系统电击转化莱茵衣藻的报道还很少，效率还不够高。Takashi等研究者使用方波电击仪NEPA21，采用衰减型，高低压与正反极组合变化的方式对野生型C-9莱茵衣藻细胞进行电击转化，具体参数为①高压250V，8ms，50ms间隔，衰减40%为150V，8ms；②低压20V，衰减40%，50ms间隔，10次（后五次电极方向相反），将2k抗性片段经过转化可以获得3380个转化子/ugDNA，C-9去细胞壁后使得其转化效率翻倍；利用相同的电击参数电击转化其他野生型莱茵衣藻CC-124，CC-125，CC-1690（21gr），分别获得转化子的数目是2930个转化子/ugDNA，404个转化子/ugDNA，3400个转化子/ugDNA。如果将长片段7.8kb片段DNA进行转化，则效率下降至500个转化子/ugDNA（Takashi,2012,JournalofBioscienceandBioengineering）。
因此寻求一种适用于有壁野生型衣藻细胞，并且操作设置简单、转化效率高的电击转化方法是迫切的，必要的，尤其是衣藻基因前期的建库研究当中。
发明内容
本发明的目的是要提供一种利用方波电击使得外源DNA整合进入莱茵衣藻染色体DNA的方法，特别是利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，从而解决衣藻DNA的转化效率问题。
本发明的目的是这样实现的：莱茵衣藻在TAP液体培养基，23±0.5°C，连续光照，8000Lx光强下进行通气培养，经过转接后培养、处理，将抗性DNA片段经过方波电击转化，使得抗性DNA随机整合进入莱茵衣藻染色体中，经过过夜弱光恢复，涂布于抗性筛选平板，经过7天光周期培养，获得引起随机插入突变的突变体文库。
所述的莱茵衣藻即实验藻种：21gr（CC1690），属于莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）的一个品系。该实验品系可以从衣藻实验室馈赠或从美国衣藻资源中心（ChlamydomonasResourceCenter）购买。
所述TAP液体培养基为：TAP盐溶液25ml/L，磷酸盐溶液0.375ml/L，Hutner微量元素1ml/L，乙酸1ml/L，Tris2.42g/L，121°C高压蒸汽灭菌20min；所述的TAP盐溶液为：NH4Cl15g/L,MgSO4·7H2O4g/L,CaCl2·2H2O2g/L。
所述的磷酸盐溶液为：K2HPO4288g/L,KH2PO4144g/L；Hutner微量元素为：EDTA二钠盐50g/L,ZnSO4·7H2O22g/L,H3BO311.4g/L,MnCl2·4H2O5.06g/L,CoCl·6H2O1.61g/L,CuSO4·5H2O1.57g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O1.1g/L,FeSO4·7H2O4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0。
所述的抗性DNA片段为从pJMG-aphVIII质粒（6.6kb大小）中，经过内切酶EcoRI酶切、回收获得抗巴龙霉素片段（aphVIII片段，2.1kb大小），检测后定量为每个转化加入100ng。
所述的方波电击条件为使用BTXECM830电击仪，设置参数电压500V，电击时间4ms，电击波段6-7次，每次电击时间间隔100ms，电击完毕冰浴放置10min。
所述的抗性筛选平板为上述TAP液体培养基的配方中加入琼脂粉15g/L，进行121°C高压蒸汽灭菌20min，冷却至约55°C后添加巴龙霉素（Paro，即Paromomycin），使其终浓度为10ug/ml，倒平板备用。
所述的涂布抗性筛选平板为衣藻细胞沉淀悬液与制备好的20%淀粉溶液混匀，1ml/平板涂布均匀，并保持无菌。
所述的20%淀粉溶液为依次经过70%乙醇洗涤、（TAP+60mM山梨醇）溶液洗涤，并用该溶液重悬后，加入终浓度为0.4%PEG6000的淀粉溶液。
本发明的有益效果：利用方波电击可以获得大量的转化子，即约5600个转化子/ugDNA，从而进行莱茵衣藻21gr的高效建库。本方法与传统的玻璃珠转化法，或者指数衰减波电击转化法相比，获得转化子的数目多，效果好，适合对衣藻细胞突变体文库的构建，应用价值高。能够有效导入外源DNA片段，整合进入衣藻染色体DNA（如图所示），获得大量具有稳定遗传的突变体藻株，达到了本发明的目的。
优点：利用方波电击转化法降低细胞损伤，提高转化效率，可以用于外源DNA整合进入衣藻染色体DNA或者高效建立突变体文库，具有良好的应用前景。
1、该藻株种质资源丰富，基因组小，功能保守，遗传分析与生化分析简单，是进行正向遗传学基因分析常用模式生物，应用范围广。
2、本发明获得的转化子数目多，可以在要建库或者其他方案不能达到理想结果的时候采用本方案。
3、本发明能有效解决莱茵衣藻外源DNA转化问题，甚至可为其他藻系的高效建库方案提供相应的参考，具有很好的推广应用价值。
附图说明
图1是本发明经过方波电击转化，涂布抗Paro的抗性平板，培养后获得大量突变体转化子。
图2是本发明使用藻落PCR方法检测转化子是否含有导入的抗性DNA片段视图。PCR引物为pSI103_F1（GATTCCCGTACCTCGTGTTG）和pSI103_R1（TCGTCCAGATCCTCCAAGTC），扩增目的片段大小为263bp；
图中，M为已知分子量的DNA片段，transformants为随机检测的转化子；+为使用的aphVIII片段为模板，作为阳性对照，-为使用水为模板，作为阴性对照。
具体实施方式
如图1和图2所示，本发明包括如下步骤：1、准备细胞、平板与制备DNA：提前超净工作台紫外灭菌15min，接种新鲜衣藻21gr细胞至无菌的TAP液体吹气瓶中，在23±0.5°C，8000Lx光强下连续光照通气培养，3-4天，至细胞溶度为1-2×107个细胞/ml，再次转移细胞至新鲜无菌TAP液体吹气瓶中，稀释至初始浓度为1×106个细胞/ml，继续连续光照培养20h，使其终浓度达4×106个细胞/ml，即可用来电击转化。所述的TAP液体培养基平板包括：TAP盐溶液25ml/L，磷酸盐溶液0.375ml/L，Hutner微量元素1ml/L，乙酸1ml/L，Tris2.42g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min；所述TAP盐溶液为：NH4Cl15g/L,MgSO4·7H2O4g/L,CaCl2·2H2O2g/L；所述的磷酸盐溶液为：K2HPO4288g/L,KH2PO4144g/L；Hutner微量元素为：EDTA二钠盐50g/L,ZnSO4·7H2O22g/L,H3BO311.4g/L,MnCl2·4H2O5.06g/L,CoCl·6H2O1.61g/L,CuSO4·5H2O1.57g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O1.1g/L,FeSO4·7H2O4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0。
抗性筛选平板的配制为上述TAP液体培养基的配方中加入琼脂粉15g/L，进行121°C高压蒸汽灭菌20min，冷却至约55°C后添加巴龙霉素（Paro，即Paromomycin），使其终浓度为10ug/ml，倒平板备用。
抗性DNA片段为从pJMG-aphVIII质粒（6.6kb大小）中，经过内切酶EcoRI酶切、回收获得抗巴龙霉素片段（aphVIII片段，2.1kb大小），检测定量后备用。
2、收集处理衣藻细胞：将经过20h培养的衣藻细胞进行细胞计数；每个转化需要250ul终浓度为1×108个/ml来计算离心所需细胞体积，按照所需要的体积进行离心收集细胞，2500rpm/min，3min；去上清，用预冷的（TAP+60mM山梨醇）溶液重悬并离心，2500rpm/min，3min；去上清，用预冷的（TAP+60mM山梨醇）重悬至总体积（250ul×所要做的转化数），冰上放置10min；同时对电击杯进行处理、预冷。所述的（TAP+60mM山梨醇）溶液配制方法为：在TAP液体中加入终浓度为60mM山梨醇的山梨醇，并经过0.22um的滤膜进行过滤除菌，4°C冰箱保存备用。所述的对电击杯进行处理、预冷的方法为：在超净工作台中，无水乙醇1ml洗0.4cm的电击杯，晾干，再用（TAP+60mM山梨醇）溶液漂洗，晾干，-20°C预冷
3、电击衣藻细胞：在超净工作台中，每个预冷的电击杯中加入250ul处理好的衣藻细胞和100ng抗Paro的抗性DNA片段，迅速转移至冰上，使用BTXECM830电击仪，设置参数如下：电压500V，电击时间4ms，电击波段6-7次，每次电击时间间隔100ms，电击完毕冰浴放置10min。
4、过夜恢复：将上述电击杯中的细胞分别转移至含有10ml（TAP+60mM山梨醇）溶液的50ml灭菌管中，做好标记、封口膜封口，在摇床上23±0.5°C、慢速、弱光过夜恢复
5、衣藻细胞涂布平板：将上述过夜恢复后的细胞离心，2500rpm/min，3min，在超净工作台中去上清，按照每个离心管加入2ml制备好的20%淀粉溶液，将细胞沉淀与淀粉溶液吹匀，并均匀涂布在抗Paro的筛选平板上，1ml/平板，2平板/转化。所述的20%淀粉溶液为依次经过70%乙醇洗涤、（TAP+60mM山梨醇）溶液洗涤，并用该溶液重悬后，加入终浓度为0.4%PEG6000的淀粉溶液。
6、倒置光周期培养：将上述涂布完毕，晾干后的筛选平板，用封口膜封口，倒置于23±0.5°C，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养7天，可获得大量的转化子。
经过上述实验步骤，可以获得大量的随机插入突变体文库，该方法是一种高效率的外源基因整合进入衣藻细胞染色体DNA的方法。上述实施方案中需要注意的问题是：从收集细胞到电击转化之间的时间间隔最好不要超过1h；过夜恢复时间也不能超过20h，以免引起细胞分裂而造成的大量转化子的假象；电击杯加入的抗性DNA片段的量要控制在100ng以下，放止引起DNA片段多插入，造成突变体文库后期鉴定基因的困难；所有与细胞接触的实验用具，实验试剂必须是无菌的。
Claims (9)
1.一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，其特征在于，莱茵衣藻在TAP液体培养基，23±0.5°C，连续光照，8000Lx光强下进行通气培养，经过转接后培养、处理，将抗性DNA片段经过方波电击转化，抗性DNA随机整合进入莱茵衣藻染色体中，经过过夜弱光恢复，涂布于抗性筛选平板，经过7天光周期培养，获得引起随机插入突变的突变体文库。
2.根据权利要求1所述的一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，其特征在于，所述的莱茵衣藻即实验藻种：21gr（CC1690），属于莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）的一个品系。
3.根据权利要求1所述的利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，其特征在于，所述TAP液体培养基为：TAP盐溶液25ml/L，磷酸盐溶液0.375ml/L，Hutner微量元素1ml/L，乙酸1ml/L，Tris2.42g/L，121°C高压蒸汽灭菌20min。
4.根据权利要求3所述的一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，其特征在于，所述的TAP盐溶液为：NH4Cl15g/L,MgSO4·7H2O4g/L,CaCl2·2H2O2g/L；所述的磷酸盐溶液为：K2HPO4288g/L,KH2PO4144g/L；Hutner微量元素为：EDTA二钠盐50g/L,ZnSO4·7H2O22g/L,H3BO311.4g/L,MnCl2·4H2O5.06g/L,CoCl·6H2O1.61g/L,CuSO4·5H2O1.57g/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O1.1g/L,FeSO4·7H2O4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0。
5.根据权利要求1所述的一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，其特征在于，所述的抗性DNA片段为从pJMG-aphVIII质粒（6.6kb大小）中，经过内切酶EcoRI酶切、回收获得抗巴龙霉素片段（aphVIII片段，2.1kb大小），检测后定量为每个转化加入100ng。
6.根据权利要求1所述的一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，其特征在于，所述的方波电击条件为使用BTXECM830电击仪，设置参数电压500V，电击时间4ms，电击波段6-7次，每次电击时间间隔100ms，电击完毕冰浴放置10min。
7.根据权利要求1所述的一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，其特征在于，所述的抗性筛选平板为上述TAP液体培养基的配方中加入琼脂粉15g/L，进行121°C高压蒸汽灭菌20min，冷却至约55°C后添加巴龙霉素（Paro，即Paromomycin），使其终浓度为10ug/ml，倒平板备用。
8.根据权利要求1所述的一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，其特征是在于，所述的涂布抗性筛选平板为衣藻细胞沉淀悬液与制备好的20%淀粉溶液混匀，1ml/平板涂布均匀，并保持无菌。
9.根据权利要求8所述的一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，其特征在于，所述的20%淀粉溶液为依次经过70%乙醇洗涤、（TAP+60mM山梨醇）溶液洗涤，并用该溶液重悬后，加入终浓度为0.4%PEG6000的淀粉溶液。
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