CN110408564A - 一种提高阿维拉霉素效价及有效组份的菌种改造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高阿维拉霉素效价及有效组份的菌种改造方法，本发明经过ARTP诱变，特别是微波诱变，不仅获得了高产菌株，而且提高了最具活性的A组份含量，通过诱导物质的添加，进一步提高了有效组份的含量和效价的提升，诱变后的菌株，经过自然筛选和稳定性考察，确定可供量产使用，突破了阿维拉霉素由于生产能力较低不能量产的现实问题。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，尤其是涉及一种提高阿维拉霉素效价及有效组份的菌种改造方法。。
背景技术
阿维拉霉素(Avilamycin)又名卑霉素、阿维霉素，属寡糖类抗生素，是一种使用效果卓越的动物专用抗生素。阿维拉霉素约有A、A′、B、C、D、E、F、G、 H等十多种组分，其中最具活性的是阿维拉霉素A组分。阿维拉霉素具有较高的安全性，在肠道中不吸收，在畜产品中无残留，排泄后(包括分解物)对环境安全；在畜禽饲料中添加使用时无需停药期。因使用效果卓越，阿维拉霉素已在世界上40多个国家和地区广泛使用。
目前阿维拉霉素正处于国外技术垄断阶段，国内企业还处于技术探索阶段，对于阿维拉霉素未实现产业化的瓶颈在于菌种产素能力低，对于阿维拉高产菌种的研究处于初级阶段，尚未实现工业化生产。目前阿维拉霉素的菌种选育主要采用手段是自然选育和推理选育两种，推理设计主要使用了耐自身或者其它抗生素的添加和一些压力因子的使用，同时结合使用微波诱变，氮离子注入技术，NTG诱变，紫外线诱变效价也得到了不少提高，因为基础效价较低，所以还是很难达到量产的程度，为了工业生产的使用，还是要进一步提高效价，增加产能，改造阿维拉菌种特性还是当今的主要技术公关工作。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种阿维拉霉素菌种改造的方法，采用菌种诱变，诱导因子添加，诱导激活某些关键酶使其发挥作用，使用恒化器组，富集高活性的诱变菌株，通过对诱变菌株的验证，得到了效价明显提高，特别是有效组份明显提高的菌株，经过自然分离得到了稳定的生产菌株，为企业的量产提供了可能。该方法机理明确，简单高效，效果显著。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：
本发明所用的方法为：以产绿链霉菌为出发菌株，采用组合诱变方法，即ARTP诱变，微波诱变，选取诱变获得的高产菌株，添加不同种类的诱导因子，诱导某些酶的活性，使用恒化器组对比筛选，得到明显改变性状的菌株，富集高活性的诱变菌株，进行菌株能力的验证，得到了效价明显提高，特别是有效组份明显改善和提高的菌株，纯化后通过Ⅴ代稳定性验证，确定供量产使用的稳定菌株。本发明具体实施步骤如下：
本发明过程分为四步：第一步和第二步为菌株诱变，第三步添加诱导因子诱导激活酶系，进一步提高效价，改变有效组份的含量，第四步，对诱变获得的菌株进行纯化，经过Ⅴ代稳定性验证，得到稳定的供量产使用的菌株。
以企业自有产绿链霉菌为出发菌株，斜面培养得到成熟的孢子，首先进行 ARTP诱变，挑选高出对照最多的菌株，进行微波诱变，挑选高产菌株，选取5 种诱导因子，添加到发酵瓶培养基中，使用恒化器组进行培养大于72h，无菌取样，分离单菌落，进行发酵水平能力测定，得到高产且有效组份提高的菌株，进行自然分离，得到稳定，可供量产使用的菌株。
具体操作过程为：
第一步：
1)将产绿链霉菌SD00601接到斜面上进行培养
所用斜面培养基成分为(g/L)：玉米淀粉20.0，KNO31.0，K2HPO40.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0；培养基pH7.0-7.2，
培养条件：培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期7天。
2)在1)中斜面加入10mL生理盐水，制备成孢子悬液，使孢子浓度达到107-108。进行ARTP诱变，80秒致死率为92.8％；分离到固体平板上，(固体平板培养基同斜面培养基)得到单菌落。
3)将2)中单菌落接斜面，斜面培养同1)
4)将3)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，
所用种子瓶培养基成分及配比为(g/L)：黄豆饼粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖5.0，糊精20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH 7.0-7.2。
培养条件：摇床振幅5cm，转速为220-250rpm，温度27.0-29.0℃，周期培养24-28h。
5)将4)中培养好的种子液接种到发酵瓶中，接种量为10％(V/V)。
发酵培养基成分及配比为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉 10.0，CaCl22.0，CaCO34.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm转速200-220h，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期96h。
6)使用液相色谱法检测效价，得到高产菌株，制备成砂土进行保存。
第二步：
7)将产绿链霉菌6)的菌株接到斜面上进行培养
斜面培养基成分为(g/L)：玉米淀粉20.0，KNO31.0，K2HPO40.5，CaCl22.0，琼脂30.0；培养基pH7.0-7.2，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期7天。
8)在7)中斜面加入10mL生理盐水，制备成孢子悬液，使孢子浓度达到107-108。进行微波诱变，50秒致死率为97.6％；分离到固体平板上，(固体平板培养基同斜面培养基)得到单菌落。
9)将8)中单菌落接斜面，斜面培养同7)
10)将9)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，
所用种子瓶培养基配比为(g/L)：黄豆饼粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖5.0，糊精20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH 7.0-7.2。
培养条件：摇床振幅5cm，转速为220-250rpm，温度27.0-29.0℃，周期培养24-28h。
11)将培养好的10)中的种子液接种到发酵瓶中，接种量为10％(V/V)。
发酵培养基的成分为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0，CaCl22.0，CaCO34.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm转速200-220h，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期96h。
12)使用液相色谱法检测效价，得到高产并且A组份明显提升的菌株，制备成砂土进行保存。
第三步：
13)将产绿链霉菌12)的菌株接到斜面上进行培养
斜面培养基成分为(g/L)：玉米淀粉20.0，KNO31.0，K2HPO40.5，CaCl22.0，琼脂30.0；培养基pH7.0-7.2，
培养条件：培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期7天。
14)将13)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，
所用种子瓶培养基配比为(g/L)：黄豆饼粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖5.0，糊精20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH 7.0-7.2。
培养条件：摇床振幅5cm，转速为220-250rpm，温度27.0-29.0℃，周期培养24-28h。
15)将14)中长好的种子液接种到恒化器200/1000mL玻璃罐培养基中，接种量为10％(V/V)
所用恒化器培养基配比为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉 10.0，CaCl22.0，CaCO34.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；在不用的恒化器玻璃培养罐里分别添加诱导活化因子，并且进行编号
培养条件：空气流量为1.2L/分，培养温度27.0-29.0℃，通气比1:1vvm，罐压0.02-0.04MPa，转速300rpm，发酵培养pH值为6.8-7.2。培养＞40h开始补入料液，培养基的流加速度为20mL/h。
16)在36h后，每8h无菌取样进行涂平板分离，(平板培养基和培养条件同斜面)平板培养7天。
17)选取对应不同诱导因子的单菌落接种斜面，斜面培养基和培养条件同 13)
18)将17)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，种瓶培养基及培养条件同14)
19)将培养好的18)中的种子液接种到发酵瓶中，接种量为10％(V/V)。
发酵培养基的成分为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0，CaCl22.0，CaCO34.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm转速200-220h，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期96h。
20)使用液相色谱法检测效价，得到高产且A组份含量进一步提高的菌株，制备成砂土进行保存。
第四步：
21)将产绿链霉菌20)的菌株接到斜面上进行培养
所用斜面培养基成分为(g/L)：玉米淀粉20.0，KNO31.0，K2HPO40.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0；培养基pH7.0-7.2，
培养条件：培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期7天。
22)在21)中斜面加入10mL生理盐水，制备成孢子悬液，分离到固体平板上，(固体平板培养基同斜面培养基)得到单菌落。
23)将22)中单菌落接斜面，斜面培养同1)
24)将23)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，
所用种子瓶培养基成分及配比为(g/L)：黄豆饼粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖5.0，糊精20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH 7.0-7.2。
培养条件：摇床振幅5cm，转速为220-250rpm，温度27.0-29.0℃，周期培养24-28h。
25)将24)中培养好的种子液接种到发酵瓶中，接种量为10％(V/V)。
发酵培养基成分及配比为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉 10.0，CaCl22.0，CaCO34.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm转速200-220h，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期96h。
26)使用液相色谱法检测效价，得到纯化后的菌株，制备成砂土进行保存，并进行五代稳定性验证。
采用上述技术方案本发明取得的技术进步是：
ARTP是常压室温等离子体的简称，能够在大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流。在育种技术中，等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。与传统诱变方法相比，采用ARTP能够有效造成DNA多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变株；与分子操作手段相比，ARTP进行微生物诱变育种具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程等优点。清华大学开发了ARTP常温诱变育种系统，制造了一种简单易用、安全高效的微生物诱变育种机。ARTP 对微生物诱变的机理为，采用氦气为工作气体的常压室温等离子体源中含有多种化学活性粒子成分，如OH、氮分子二正系统、氮分子一负系统、激发态氦原子、氢原子和氧原子等。ARTP富含的活性能量粒子对菌株/植株/细胞等的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制。SOS修复过程为一种高容错率修复，因此修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株。SOS修复强度，和DNA受损伤的程度有很大关联。ARTP对生物的遗传物质损伤效果明显、损伤机制丰富、尤其是对于染色体等真核生物的遗传物质均有很强的损伤效果；因而ARTP较其他诱变方法显示出更高效的突变性能、更广谱的适用范围。本发明经过ARTP诱变，特别是微波诱变，不仅获得了高产菌株，而且提高了最具活性的A组份含量，通过诱导物质的添加，进一步提高了有效组份的含量和效价的提升，诱变后的菌株，经过自然筛选和稳定性考察，确定可供量产使用，突破了阿维拉霉素由于生产能力较低不能量产的现实问题。
附图说明
图1是本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
实施例1：
ARTP诱变
1)将产绿链霉菌SD00601接到斜面上，接种3支斜面，培养在恒温室中，培养条件：培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期7天
所用斜面培养基成分为(g/L)：玉米淀粉20.0，KNO31.0，K2HPO40.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0；培养基pH7.0-7.2，
2)选取1)中均匀饱满的斜面，加入10mL生理盐水，使用接种针刮下孢子，制备成孢子悬液，使孢子浓度达到107-108。在无菌条件下，滴加到诱变使用用的无菌铁片上，进行ARTP诱变，诱变时间设为，40″、60″、80″和100″，分离到固体平板上，(固体平板培养基及培养条件同斜面)得到单菌，不同诱变时间的致死率分别为42.3％、64.3％、92.8％和99.7％；最合适的诱变时间是80″。
3)将2)中单菌落接斜面，每个诱变条件接30个斜面，包括对照共接150 个斜面，培养基和培养条件同1)
4)将3)中生长良好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，共接种84个种瓶；
所用种子瓶培养基成分及配比为(g/L)：黄豆饼粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖5.0，糊精20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH 7.0-7.2。
培养条件：摇床振幅5cm，转速为220-250rpm，温度27.0-29.0℃，周期培养24-28h。
5)将4)中培养好的种子液接种到发酵瓶中，每一个种瓶接种一个发酵瓶，接种量为10％(V/V)。
发酵培养基成分及配比为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉 10.0，CaCl22.0，CaCO34.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm转速200-220h，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期96h。
6)使用液相色谱法，每一个发酵瓶检测一个效价
表1 ARTP诱变获得菌株效价及组份数据
得到SD00602菌株，效价高出对照27.77％，制备成砂土进行保存。
实施例2：
微波诱变
1)将产绿链霉菌SD00602接到斜面上进行培养，接种3支斜面，培养在恒温室中，培养条件：培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期7天
斜面培养基成分为(g/L)：玉米淀粉20.0，KNO31.0，K2HPO40.5，CaCl22.0，琼脂30.0；
2)在1)中斜面加入10mL生理盐水，制备成孢子悬液，使孢子浓度达到107-108。进行微波诱变，诱变时间采取30″、50″、70″和100″，诱变后分离到固体平板上，(固体平板培养基同斜面培养基)得到单菌落，诱变致死率为82.4％、97.6％、99.2和99.9％最合适的是50″。
3)将2)中单菌落接斜面，前3个诱变时间各接斜面30个，最后1个时间接斜面12个，对照接斜面20个，共接斜面122个，斜面培养基和培养条件同同 1)
4)将3)中生长良好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，共接种64个种瓶；
所用种子瓶培养基配比为(g/L)：黄豆饼粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖5.0，糊精20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH 7.0-7.2。
培养条件：摇床振幅5cm，转速为220-250rpm，温度27.0-29.0℃，周期培养24-28h。
5)将培养好的4)中的种子液接种到发酵瓶中，每个种瓶接种一个发酵瓶，接种量为10％(V/V)。
发酵培养基的成分为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0，CaCl22.0，CaCO34.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm转速200-220h，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期96h。
6)发酵结束后，使用液相色谱法，每个发酵瓶检测一个效价
表2微波诱变获得菌株效价及组份数据
得到SD00603菌株，效价高出对照28.47％，A组份高出对照32.87％，制备成砂土进行保存。
实施例3：
第三步：恒化器中添加诱导因子
1)将产绿链霉菌SD00603接到斜面上进行培养
斜面培养基成分为(g/L)：玉米淀粉20.0，KNO31.0，K2HPO40.5，CaCl22.0，琼脂30.0；培养基pH7.0-7.2，
培养条件：培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期7天。
2)将1)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，
所用种子瓶培养基配比为(g/L)：黄豆饼粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖5.0，糊精20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH 7.0-7.2。
培养条件：摇床振幅5cm，转速为220-250rpm，温度27.0-29.0℃，周期培养24-28h。
3)将2)中长好的种子液接种到恒化器3000mL玻璃罐培养基中，接种量为10％ (V/V)
所用恒化器培养基配比为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉 10.0，CaCl22.0，CaCO34.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
活化因子的添加，使用以下6种因子和不添加因子的培养发酵液进行对照，添加方式均为灭前添加，和培养基同时灭菌。
表3添加诱导因子的种类和比例
| 添加离子 | CuSO4 | ZnSO<sub>4</sub> | MnSO4 | MgSO<sub>4</sub> | CoCl<sub>2</sub> |
| 添加量(g/L) | 0.01 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.01 |
培养条件：空气流量为1.2L/分，培养温度27.0-29.0℃，通气比1:1vvm，罐压0.02-0.04MPa，转速300rpm，发酵培养pH值为6.8-7.2。培养＞40h开始补入料液，培养基的流加速度为20mL/h。
4)在36h后，每8h无菌取样进行涂平板分离，(平板培养基和培养条件同斜面)平板培养7天。
5)选取不同诱变因子对应的丰满，正常菌落接种斜面，斜面培养基和培养条件同1)
6)将5)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，种瓶培养基及培养条件同2)
7)将培养好的6)中的种子液接种到发酵瓶中，接种量为10％(V/V)。
发酵培养基的成分为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0，CaCl22.0，CaCO34.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm转速200-220h，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期96h。
8)发酵结束后，使用液相色谱法，每个发酵瓶检测一个效价
表4诱导因子诱导后结果
获得菌株SD00604菌株效价高出对照34.8％,，A组份含量提高了到21.4％，制备成砂土进行保存
9)起始菌株有效组份A+B含量为74.06％，经过诱变和诱导后有效组份A+B含量达到85.59，提高了15.57％，效果明显，为量产工作提供了可能。
实施例4：
第四步：诱变菌株的纯化,进行五代稳定性考察
1)将产绿链霉菌SD00604接到斜面上进行培养
所用斜面培养基成分为(g/L)：玉米淀粉20.0，KNO31.0，K2HPO40.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0；培养基pH7.0-7.2，
培养条件：培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期7天。
2)在1)中斜面加入10mL生理盐水，制备成孢子悬液，分离到固体平板上，(固体平板培养基同斜面培养基)得到单菌落。
3)将2)中单菌落接斜面，斜面培养同1)
4)将3)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，
所用种子瓶培养基成分及配比为(g/L)：黄豆饼粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖5.0，糊精20.0，CaCl22.0，CaCO31.0，pH 7.0-7.2。
培养条件：摇床振幅5cm，转速为220-250rpm，温度27.0-29.0℃，周期培养24-28h。
5)将4)中培养好的种子液接种到发酵瓶中，接种量为10％(V/V)。
发酵培养基成分及配比为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉 10.0，CaCl22.0，CaCO34.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm转速200-220h，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期96h。
6)发酵结束后，使用液相色谱法，每个发酵瓶检测一个效价，得到SD00605 菌株，制备成砂土进行保存。
表5五代稳定性实验结果
从表5可以看出。突变菌株在5代之间效价的相对标准偏差是0.99％，A％的相对标准偏差是0.93％，B％的相对标准偏差是2.42％，所以产生的高产菌株在5代以内具有较好的遗传稳定性。
Claims (2)
1.一种提高阿维拉霉素效价及有效组份的菌种改造方法，其特征在于本发明具体实施步骤如下：
第一步和第二步为菌株诱变，第三步添加诱导因子诱导激活酶系，进一步提高效价，改变有效组份的含量，第四步，对诱变获得的菌株进行纯化，经过Ⅴ代稳定性验证，得到稳定的供量产使用的菌株。
2.根据权利要求1所述的一种提高阿维拉霉素效价及有效组份的菌种改造方法，其特征在于其具体操作过程为：
第一步：
1)将产绿链霉菌SD00601接到斜面上进行培养
所用斜面培养基成分为(g/L)：玉米淀粉20.0，KNO3 1.0，K2HPO4 0.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0；培养基pH7.0-7.2，
培养条件：培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期7天；
2)在1)中斜面加入10mL生理盐水，制备成孢子悬液，使孢子浓度达到107-108；进行ARTP诱变，80秒致死率为92.8％；分离到固体平板上，(固体平板培养基同斜面培养基)得到单菌落；
3)将2)中单菌落接斜面，斜面培养同1)
4)将3)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，所用种子瓶培养基成分及配比为(g/L)：黄豆饼粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖5.0，糊精20.0，CaCl2 2.0，CaCO3 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为220-250rpm，温度27.0-29.0℃，周期培养24-28h；
5)将4)中培养好的种子液接种到发酵瓶中，接种量为10％(V/V)；
发酵培养基成分及配比为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0，CaCl22.0，CaCO3 4.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm转速200-220h，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期96h；
6)使用液相色谱法检测效价，得到高产菌株，制备成砂土进行保存；
第二步：
7)将产绿链霉菌6)的菌株接到斜面上进行培养
斜面培养基成分为(g/L)：玉米淀粉20.0，KNO3 1.0，K2HPO4 0.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0；培养基pH7.0-7.2，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期7天；
8)在7)中斜面加入10mL生理盐水，制备成孢子悬液，使孢子浓度达到107-108；进行微波诱变，50秒致死率为97.6％；分离到固体平板上，(固体平板培养基同斜面培养基)得到单菌落；
9)将8)中单菌落接斜面，斜面培养同7)
10)将9)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，所用种子瓶培养基配比为(g/L)：黄豆饼粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖5.0，糊精20.0，CaCl2 2.0，CaCO31.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为220-250rpm，温度27.0-29.0℃，周期培养24-28h。
11)将培养好的10)中的种子液接种到发酵瓶中，接种量为10％(V/V)；
发酵培养基的成分为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0，CaCl2 2.0，CaCO3 4.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm转速200-220h，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期96h；
12)使用液相色谱法检测效价，得到高产并且A组份明显提升的菌株，制备成砂土进行保存；
第三步：
13)将产绿链霉菌12)的菌株接到斜面上进行培养
斜面培养基成分为(g/L)：玉米淀粉20.0，KNO3 1.0，K2HPO4 0.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0；培养基pH7.0-7.2，
培养条件：培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期7天；
14)将13)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，所用种子瓶培养基配比为(g/L)：黄豆饼粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖5.0，糊精20.0，CaCl2 2.0，CaCO31.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为220-250rpm，温度27.0-29.0℃，周期培养24-28h。
15)将14)中长好的种子液接种到恒化器200/1000mL玻璃罐培养基中，接种量为10％(V/V)
所用恒化器培养基配比为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0，CaCl22.0，CaCO3 4.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；在不用的恒化器玻璃培养罐里分别添加诱导活化因子，并且进行编号
培养条件：空气流量为1.2L/分，培养温度27.0-29.0℃，通气比1:1vvm，罐压0.02-0.04MPa，转速300rpm，发酵培养pH值为6.8-7.2。培养＞40h开始补入料液，培养基的流加速度为20mL/h；
16)在36h后，每8h无菌取样进行涂平板分离，(平板培养基和培养条件同斜面)平板培养7天；
17)选取对应不同诱导因子的单菌落接种斜面，斜面培养基和培养条件同13)
18)将17)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，种瓶培养基及培养条件同14)
19)将培养好的18)中的种子液接种到发酵瓶中，接种量为10％(V/V)。
发酵培养基的成分为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0，CaCl2 2.0，CaCO3 4.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm转速200-220h，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期96h；
20)使用液相色谱法检测效价，得到高产且A组份含量进一步提高的菌株，制备成砂土进行保存；
第四步：
21)将产绿链霉菌20)的菌株接到斜面上进行培养
所用斜面培养基成分为(g/L)：玉米淀粉20.0，KNO3 1.0，K2HPO4 0.5，CaCl2 2.0，琼脂30.0；培养基pH7.0-7.2，
培养条件：培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期7天；
22)在21)中斜面加入10mL生理盐水，制备成孢子悬液，分离到固体平板上，(固体平板培养基同斜面培养基)得到单菌落；
23)将22)中单菌落接斜面，斜面培养同1)
24)将23)中长好的斜面孢子接种到种瓶培养基中，接种量为25mm2的斜面，
所用种子瓶培养基成分及配比为(g/L)：黄豆饼粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖5.0，糊精20.0，CaCl2 2.0，CaCO3 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm，转速为220-250rpm，温度27.0-29.0℃，周期培养24-28h。
25)将24)中培养好的种子液接种到发酵瓶中，接种量为10％(V/V)；
发酵培养基成分及配比为(g/L)：玉米淀粉40.0，葡萄糖20.0，黄豆饼粉10.0，CaCl22.0，CaCO3 4.0，NaCl 1.0，pH 7.0-7.2；
培养条件：摇床振幅5cm转速200-220h，培养温度27.0℃-29.0℃，培养周期96h；
26)使用液相色谱法检测效价，得到纯化后的菌株，制备成砂土进行保存，并进行五代稳定性验证。
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|---|---|---|---|
| CN201910657174.8A CN110408564A (zh) | 2019-07-19 | 2019-07-19 | 一种提高阿维拉霉素效价及有效组份的菌种改造方法 |
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Patent Citations (1)
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| CN104404112A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-03-11 | 江西兴鼎科技有限公司 | 微生物发酵补料生产阿维拉霉素的方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111607531A (zh) * | 2019-12-13 | 2020-09-01 | 上海莫息生物科技有限公司 | 一种产生阿维拉霉素的菌种 |
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