CN104531548A - 雄烯二酮耐底物突变株及其诱变选育方法 - Google Patents

雄烯二酮耐底物突变株及其诱变选育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种雄烯二酮耐底物突变株及其诱变选育方法。突变菌株新金分枝杆菌WS3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2014322，保藏日期为2014年7月4日。本发明以新金分枝杆菌JXNU02为出发菌株，利用硫酸二乙酯和紫外线诱变方法进行复合诱变，结合梯度平板法进行初筛以及摇瓶发酵法进行复筛和验证，选育出一株底物耐受性高且遗传稳定的突变菌株－新金分枝杆菌WS3。利用这种方法可以有效的提高分枝杆菌降解植物甾醇生成雄烯二酮的能力，为利用微生物法生产雄烯二酮提供了优良菌种，对我国制药行业具有重要意义。

Description

雄烯二酮耐底物突变株及其诱变选育方法
技术领域
本发明涉及利用硫酸二乙酯和紫外线复合诱变新金分枝杆菌，并结合梯度平板法初筛技术和摇瓶发酵复筛技术，选育出耐底物且能有效降解植物甾醇侧链获取雄烯二酮的新金分枝杆菌WS3 (Mycobacterium neoaurumWS3)，属生物工程技术领域。
技术背景
雄烯二酮（AD）作为合成甾体类激素药物的重要原料和关键中间体，是当前国家急需解决的激素药物的重要原料，对机体起着非常重要的调节作用，被誉为“生命的钥匙”。几乎所有甾体激素类药物都是以雄烯二酮为起始原料进行生产的，如：性激素、蛋白质同化激素、孕激素、皮质激素及地塞米松、可的松等，具有重要的商业价值。
分枝杆菌、节杆菌及棒杆菌等很多微生物都能以植物甾醇作为碳源产生雄烯二酮等代谢中间体。通过微生物转化法生产雄烯二酮可以充分利用长期以来被用作废物的植物甾醇，摆脱了原材料来源因“黄姜”和“穿地龙”供应受季节、地域等自然因素对生产的制约，同时对保护自然资源和生态环境起到了很好的作用。但微生物对植物甾醇的转化过程仍然存在很多限制因素：甾体化合物疏水性强，在水中的溶解度低；菌株转化能力普遍较低，高浓度底物投加量对转化过程的抑制等。因此提高菌株的转化能力，改善菌种对底物的耐受性进而提高投料浓度等都是甾体生物转化中要解决的关键问题
为了提高微生物对植物甾醇的转化效率和产物产量，紫外、DES等物理和化学等诱变及高浓度底物驯化培养法常被用来选育优良菌株。吴宝华等用紫外线照射和NTG复合诱变的方法处理节杆菌，经筛选获得一株株ADD分解酶缺陷型菌株，能有效积累ADD，该菌对豆甾醇的降解率达到95%。杨英等分别采用紫外线照射、60Co、紫外线与60Co复合诱变处理出发菌株Mycobacterium sp.BD696，筛选得到一高转化率突变株，其AD产量较出发菌株提高39.2%，且没有结构类似物ADD产生。黄丽君等以一株降解植物甾醇产生雄烯二酮的分枝杆菌为研究对象，先后利用亚硝基胍（NTG）和N＋注入技术对其进行诱变处理，最终选育出一株高产突变株Mycobacterium sp.N-2，其雄烯二酮生产能力较出发菌株提高了37.8%。Vidal等在含有14 g/L ß-谷甾醇的培养基中反复培养分枝杆菌Mycobacterium sp.MB-3683和Mycobacterium fortuitum B-11045（这两株菌均能以谷甾醇作唯一碳源），连续转接培养7次后，两株菌对谷甾醇的转化率分别提高了44%和21%。Malaviya A等将Mycobacterium sp.在谷甾醇浓度不断提高的液体培养基中驯化培养来提高分枝杆菌对谷甾醇的耐受性，结果显示在谷甾醇浓度为20g/L的转化体系中，驯化培养的Mycobacterium sp菌株的整体转化率达到23.8%，高于原始菌株的17.31%。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种雄烯二酮耐底物突变株及其诱变选育方法，该方法能够提高菌种对底物植物甾醇的耐受性，增加整个转化体系中的底物投料浓度，为微生物转化法生产雄烯二酮提供优良菌种－新金分枝杆菌WS3。
本发明所述的菌株新金分枝杆菌WS3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO. M 2014322，保藏日期为2014年7月4日，拉丁文学名为Mycobacterium neoaurum WS3。摇瓶发酵其雄烯二酮生成率达40.9%，是野生菌株的1.59倍，保藏地址是中国武汉大学。
所述的新金分枝杆菌有以下微生物学特征：
1. 形态学上特征为：
a. 细胞形态呈细长略弯曲的杆状，有时有分枝或出现丝状体，具有膨大或棒状末端；b. 大小为6～10μm；c. 菌落光滑、饱满、中间隆起、边缘不整齐、不透明，菌落呈橙黄色。
2. 该菌株的生理生化特征为：
a. 本菌株可以利用合成培养基生长；b. 培养时间：4~7天；c. 对氧气的需求：好气；d. 生长pH范围：6.0～8.5；e. 生长最适宜温度：28～32°C；f. 转化的主要产物为雄烯二酮。
本发明还提供新金分枝杆菌WS3的选育方法，即利用硫酸二乙酯和紫外线诱变方法进行复合诱变、结合梯度平板法初筛以及摇瓶发酵进行复筛和验证、选育出一株产雄烯二酮耐底物且遗传稳定的突变菌株。
本发明所述选育方法包括如下步骤：
① 菌悬液的制备：
取斜面上培养4~7天的新金分枝杆菌出发菌株，用pH 7.0的无菌磷酸缓冲液配制菌悬液，经10~15倍系列稀释达到浓度100~1000cfu/mL备用；
② 硫酸二乙酯和紫外线复合诱变；
③ 初筛：通过梯度平板法对耐底物突变株进行初筛；
④ 复筛：挑取生长较好的菌落在梯度板上连续传代几次转接斜面，进行摇瓶发酵复筛；
⑤ 验证高产菌株：
将复筛后得到的耐底物菌株传代培养5次，每次都用与复筛一样的方法对菌株雄烯二酮生产稳定性进行验证；
⑥ 高产菌株的保藏：
将筛选出的一株雄烯二酮耐底物突变菌株采用甘油管法和冷冻真空干燥法进行保藏。
本发明所述方法的具体步骤为：
取培养4~6天的新鲜斜面一只，用20mL 0.lmoL/L pH7.0的磷酸盐缓冲液将斜面菌种洗下，倒入装有数粒玻璃珠的150mL已灭菌三角瓶中，充分振荡20min后，用塞有脱脂棉的无菌漏斗过滤，制得菌悬液，将菌悬液进行稀释，浓度控制在100-1000cfu/mL；
用DES溶液诱变处理中培养的新金分枝杆菌出发菌株10~40分钟后，加入0.5mL25%硫代硫酸纳终止剂，5~30分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变；
取0.1mL经步骤处理的培养液稀释至一定浓度，取0.1mL 分别涂布到基本培养基平板及添加甾醇浓度为2%~4%的梯度培养基平板上，黑暗培养6~24小时，然后置于恒温培养箱中30 ~32°C避光培养4−7 天；
将步骤中培养出的菌落挑出，接入发酵培养基中培养5~7天，控制相同的培养条件，收集发酵液；
用高效液相色谱法分析经步骤培养的发酵液中的雄烯二酮含量，并挑出雄烯二酮含量高的菌株进行复筛；
将初筛中挑选出来的菌株，接入发酵培养基中培养5~7天，控制相同的培养条件，收集发酵液，计算雄烯二酮生成率，挑选出雄烯二酮高产菌株；
将复筛后得到的高产菌株扩大培养5~7次，每次采用的方法对菌株的稳定性进行验证，筛选得到高产、稳定的突变菌株。
本发明DES和紫外线复合诱变处理的出发菌株培养物处于对数生长期。
本发明所述梯度平板中底物植物甾醇的浓度为2%~4%；化学诱变剂DES的诱变浓度为1%。
本发明紫外照射诱变采用15W或30W紫外灯，提前预热20~30分钟后，将菌液置于距离紫外灯20~30cm处进行紫外照射30~240秒。
本发明所述的发酵培养基为改良后的合成培养基（%）：玉米浆2~5，NaNO3 0.3~0.6，葡萄糖0.1~0.5， (NH4)2HPO4 0.06，豆油16，植物甾醇2，泡敌0.01，pH 6.0-8.5。
本发明所述诱变后菌株WS3的摇瓶培养条件为温度28～32°C、摇床转速200～300转/分钟。
本发明利用新金分枝杆菌对化学和物理诱变剂比较敏感，生命力比较顽强，有较强的植物甾醇转化潜力，提出了利用DES和紫外线复合诱变手段，结合梯度平板法初筛技术和摇瓶发酵复筛技术，选育出植物耐受性高且遗传稳定的新金分枝杆菌WS3，通过这种方法可以有效的提高新金分枝杆菌降解植物甾醇的能力，为利用微生物转化法生产雄烯二酮提供了优良菌种。突变菌株新金分枝杆菌WS3可用于雄烯二酮的生产。
附图说明：
图1为本发明方法流程图；
图2所示为出发菌株JXNU02的AD浓度与AD生成率图；
图3所示为突变株新金分枝杆菌WS3的AD浓度与AD生成率图；
具体实施方式：
以下结合实施实例对本发明进行详细说明。
实施例1：
新金分枝杆菌的硫酸二乙酯和紫外线复合诱变：
分别配制0.lmoL/L的K2HPO4溶液(甲液)和0.lmoL/L的KH2P04溶液(乙液)，取甲液61.5mL，乙液38.5mL混合，得到pH7.0的磷酸盐缓冲液100mL。
用10mL 0.lmoL/L pH7.0的磷酸缓冲液将培养6天的新金分枝杆菌JXNU02斜面菌苔洗下，倒入装有无菌玻璃珠的三角瓶中，充分振荡10min，用塞有脱脂棉的无菌漏斗过滤，得到菌悬液，经10倍系列稀释达到浓度为100-1000cfu/mL备用。
分别吸取2mL于5个锥形瓶内，并加入18mL lmoL/L pH7.0磷酸缓冲液。取上述四个锥形瓶，各加硫酸二乙酯0.2mL，最终配成3%的诱变溶液。
诱变混合液放在振荡仪中分别振荡处理10min，20min，30min，40min，使菌与诱变试剂充分的混合，取出后立即加入0.5mL的25%硫代硫酸钠溶液终止反应。
硫代硫酸钠溶液终止反应5分钟之后， 将反应液置于无菌培养皿中，使之成为1mm厚的薄层，培养皿放于磁力搅拌器上，再置于紫外灯下（预先已经灭过菌）进行紫外照射，用15W紫外灯(提前预热30分钟)，距离30cm进行紫外照射60s。
⑥ 在基本培养基及梯度培养基平板中各加入0.1mL的上述诱变过的菌悬液，进行涂布处理，使菌能够均匀分布在平板上，用黑布包好，放入30~32°C培养箱内培养3天。凡接触DES试剂的器具都放置在浓度为2%的硫代硫酸钠溶液中浸泡1天去毒后使用。
新金分枝杆菌诱变后的初步筛选：
将诱变后在梯度培养基中生长起来的菌落挑出，另取野生出发菌作为对照，转接斜面，培养4~6天，接入250mL三角瓶中，每瓶装液量为50mL，发酵培养基成分（玉米浆3，NaNO3 0.5，葡萄糖0.3， (NH4)2HPO4 0.06，豆油16，植物甾醇2，泡敌0.01，pH自然），在摇床上控制相同的培养条件，条件为30°C、230转/分钟，培养6天。
取转化后的发酵液1~2ml，加入同体积的乙酸乙酯，漩涡振荡10min至充分溶解。
取上层乙酸乙酯溶液，于6000转/分钟的条件下，离心10分钟，获得上清液。
上清液0.2mL于5mL离心管中，蒸去乙酸乙酯后，加入色谱甲醇2mL，超声溶解，并以0.22μm针头过滤器过滤，制得样品。
用HPLC法对样品中的产物进行定量分析。在245nm下用HPLC法测定雄烯二酮的浓度。对照出发菌株，计算雄烯二酮生成率的提高，将雄烯二酮产量高的菌株挑出进行保藏。
新金分枝杆菌诱变后的复筛：
发酵液的收集
a. 将初筛中挑选出来的菌株，另取野生出发菌作为对照，接入斜面培养基上扩大培养6天。
b. 将扩大培养的菌株接入250mL三角瓶中，每瓶装液量为50mL，液体培养基成分（%）（玉米浆3，NaNO3 0.5，葡萄糖0.3， (NH4)2HPO4 0.06，豆油16，植物甾醇2，泡敌0.01，pH自然），在摇床上控制相同的培养条件，条件为30°C、230转/分钟，培养6天。
c. 取转化后的发酵液2mL，加入等体积的乙酸乙酯，振荡混匀后，静置分层。取上清进行HPLC检测。
用HPLC法定量测定雄烯二酮含量。
a. HPLC条件
1）色谱柱：RC-MC 18 (5μ,250mm×4.6mm)；
2）流动相：甲醇-水(V/V=70:30)；
3）检测波长：245nm；
4）柱温：30℃；
5）进样量：10μL~20μL；
6）流速：1mL/min。
b. 通过产物雄烯二酮的含量XAD（g/L），计算雄烯二酮的生成率。
AD的生成率方程式为：
式中d代表样品稀释倍数；V为发酵液的计算体积；msub为V体积内底物的投加量；其中MAD、Msub分别为AD与底物的相对分子质量，分别为286.6g/mol、406.8g/mol。
c. 对照出发菌株，计算生成率的提高，将雄烯二酮产量高的挑出进行保藏。
筛选所得耐底物、稳定的突变菌株WS3经摇瓶发酵培养，其雄烯二酮生成率达40.9%，是出发菌株的1.59倍，具体见图2和3。
实施例2：
用为pH7.0的磷酸缓冲液将培养6天的新金分枝杆菌JXNU02斜面菌苔洗下，倒入装有无菌玻璃珠的三角瓶中，充分振荡10min，用塞有脱脂棉的无菌漏斗过滤，得到菌悬液，经10倍系列稀释达到浓度为500cfu/mL备用。
② 用浓度为1%的DES溶液诱变处理中培养的处于对数生长期的新金分枝杆菌出发菌株10~40分钟后，加入0.5mL25%硫代硫酸钠终止剂，5~20分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变；用15W紫外灯，提前预热20~30分钟后，将菌液置于距离紫外灯20~30cm处进行紫外照射60~120秒。
③ 各取0.1mL的上述诱变过的菌悬液涂布基本培养基及梯度培养基平板，用黑布包好，放入28~32°C培养箱内培养6天，待菌落长出后转接斜面。
④ 将步骤中培养出的菌落挑出，接入发酵培养基中培养4~7天，控制相同的培养条件，收集发酵液，用HPLC法测定雄烯二酮含量，所述的发酵培养基为改良后的合成培养基（%）：玉米浆2，NaNO3 0.5，葡萄糖0.4， (NH4)2HPO4 0.06，豆油16，植物甾醇2，泡敌0.01，pH6.0~8.5。
⑤ 用HPLC法分析经步骤④培养的菌体发酵液中雄烯二酮含量高的菌株进行复筛。
⑥ 将初筛挑选出来的菌株，接入发酵培养基中培养6天，用乙酸乙酯萃取发酵液，经HPLC法检测发酵液中的产物含量。
将复筛后得到的高产菌株摇瓶培养5~8次，每次采用⑥的方法对菌株的稳定性进行验证，筛选得到高产、稳定的菌株WS3。诱变后菌株WS3的摇瓶培养条件为温度28～32°C、摇床转速200～300转/分钟。
筛选得到突变菌株WS3形态学上特征为：细胞形态呈细长略弯曲的杆状，有时有分枝或出现丝状体，具有膨大或棒状末端；菌落光滑、饱满、中间隆起、边缘不整齐、不透明，菌落呈橙黄色，大小为6～10μm；生理生化特征为：该菌株可以利用合成培养基生长；培养时间：4~7天；对氧气的需求：好气；生长pH范围：6.5～8.0；生长最适宜温度：28～32°C。
实施例3：
用pH为7.0的磷酸缓冲液将培养6天的新金分枝杆菌JXNU02斜面菌苔洗下，用塞有脱脂棉的无菌漏斗过滤，经10~15倍系列稀释达到浓度300cfu/mL备用；
②用浓度为1%的DES溶液诱变处理中培养的处于对数生长期的新金分枝杆菌出发菌株10~40分钟后，加入0.5mL25%硫代硫酸钠终止剂，5~20分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变；用15W紫外灯，提前预热20~30分钟后，将菌液置于距离紫外灯20~30cm处进行紫外照射60~120秒。
各取0.1mL的上述诱变过的菌悬液涂布基本培养基及梯度培养基平板，用黑布包好，放入31°C培养箱内培养6天，待菌落长出后转接斜面。
④ 将步骤中培养出的菌落挑出，接入发酵培养基中培养4~7天，控制相同的培养条件，收集发酵液，用HPLC法测定雄烯二酮含量，所述的发酵培养基为改良后的合成培养基：玉米浆3.5，NaNO3 0.4，葡萄糖0.5， (NH4)2HPO4 0.06，豆油16，植物甾醇2，泡敌0.01，pH6.0~8.5。
用HPLC法分析经步骤③培养的菌体发酵液中雄烯二酮含量高的菌株进行复筛。
将初筛挑选出来的菌株，接入发酵培养基中培养6天，用乙酸乙酯萃取发酵液，经HPLC法检测发酵液中的产物含量。
将复筛后得到的高产菌株摇瓶培养5~8次，每次采用的方法对菌株的稳定性进行验证，筛选得到高产、稳定的菌株WS3。诱变后菌株WS3的摇瓶培养条件为温度28～32°C、摇床转速200～300转/分钟。
经显微形态观察和油脂成分分析，突变菌株B3形态学特征和菌体生物油脂成分同于实施例2。
实施例4：
取斜面培养基培养5~6天的新金分枝杆菌出发菌株，用pH 7.0的无菌磷酸缓冲液配制菌悬液，经10~15倍系列稀释达到浓度1000cfu/mL备用；
用浓度为1%的EMS溶液诱变处理中培养的处于对数生长期的新金分枝杆菌出发菌株10~40后，加入0.2mL25%硫代硫酸钠终止剂，5~20分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变；用30W紫外灯，提前预热20~30分钟后，将菌液置于距离紫外灯20~30cm处进行紫外照射60~120秒。
取0.1mL经步骤处理的培养液均匀涂布于梯度培养基及基本培养基平板上，黑暗培养12~24小时，然后置于30～32°C培养箱中正常培养4~6天；
将步骤中培养出的菌落挑出，接入发酵培养基中培养4~7天，控制相同的培养条件，收集发酵液，用HPLC法测定雄烯二酮含量，所述的发酵培养基为改良后的合成培养基：玉米浆4，NaNO3 0.6，葡萄糖0.5， (NH4)2HPO4 0.06，豆油16，植物甾醇2，泡敌0.01，pH6.0~8.5。
用HPLC法分析经步骤培养的菌体发酵液中雄烯二酮含量高的菌株进行复筛。
将初筛挑选出来的菌株，接入发酵培养基中培养6天，用乙酸乙酯萃取发酵液，经HPLC法检测发酵液中的产物含量。
将复筛后得到的高产菌株摇瓶培养5~8次，每次采用的方法对菌株的稳定性进行验证，筛选得到高产、稳定的菌株WS3。诱变后菌株WS3的摇瓶培养条件为温度28～32°C、摇床转速200～300转/分钟。
经显微形态观察和雄烯二酮含量分析，突变菌株WS3形态学特征和菌体生物油脂成分同于实施例3。
本发明采用了紫外线反复多次诱变，所得菌株效果和形态相同，因此本发明在诱变中虽采用了紫外线诱变的方法，因视为可以重复的技术手段。

Claims (10)

1.一种雄烯二酮耐底物突变株，命名为新金分枝杆菌WS3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO. M 2014322，保藏日期为2014年7月4日，拉丁文学名为Mycobacterium neoaurum WS3。
2.根据权利要求1所述的新金分枝杆菌WS3，其特征在于：
形态学特征为：细胞形态呈细长略弯曲的杆状，有时有分枝或出现丝状体，具有膨大或棒状末端；菌落光滑、饱满、中间隆起、边缘不整齐、不透明，菌落呈橙黄色，大小为6～10μm；
生理生化特征为：该菌株可以利用合成培养基生长；培养时间：4~7天；对氧气的需求：好气；生长pH范围：6.5～8.0；生长最适宜温度：28～32°C。
3.一种DES和紫外线复合诱变选育耐底物雄烯二酮突变株的方法，其特征在于包括以下步骤：
① 菌悬液的制备：
取斜面上培养4~7天的新金分枝杆菌出发菌株，用pH为7.0的无菌磷酸缓冲液配制菌悬液，经10~15倍系列稀释达到浓度100~1000cfu/mL备用；
② 硫酸二乙酯和紫外线复合诱变；
③ 初筛：通过梯度平板法对耐底物突变株进行初筛；
④ 复筛：挑取生长较好的菌落在梯度板上连续传代几次转接斜面，进行摇瓶发酵复筛；
⑤ 验证高产菌株：
将复筛后得到的耐底物菌株传代培养6次，每次都用与复筛一样的方法对菌株雄烯二酮生产稳定性进行验证；
⑥ 高产菌株的保藏：
将筛选出的一株雄烯二酮耐底物突变株采用甘油管法和冷冻干燥法进行保藏。
4.根据权利要求3所述的诱变育种方法，其特征在于：包括如下步骤：
取培养4~7天的新鲜斜面一只，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液将斜面菌种洗下，倒入装有数粒玻璃珠的已灭菌三角瓶中，充分振荡摇匀，用塞有脱脂棉的无菌漏斗过滤，制得菌悬液，经10~15倍系列稀释达到浓度100-1000cfu/mL，备用；
用DES溶液诱变处理中培养的新金分枝杆菌出发菌株10~40分钟后，加入0.5mL25%硫代硫酸纳终止剂，5~20分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变；
取0.1mL经步骤处理的培养液稀释至一定浓度，取0.1mL 分别涂布到基本培养基平板及添加甾醇浓度分别为2%~4%的梯度培养基平板上，黑暗培养12~24小时，然后置于恒温培养箱中30~32 °C避光培养4−7 天；
将步骤中培养出的菌落挑出，接入发酵培养基中培养5~7天，控制相同的培养条件，收集发酵液；
用高效液相色谱法分析经步骤培养的发酵液中的雄烯二酮含量，并挑出雄烯二酮含量高的菌株进行复筛；
将初筛中挑选出来的菌株，接入发酵培养基中培养5~7天，控制相同的培养条件，收集发酵液，计算雄烯二酮生成率，挑选出雄烯二酮高产菌株；
将复筛后得到的高产菌株扩大培养5~8次，每次采用的方法对菌株的稳定性进行验证，筛选得到高产、稳定的突变菌株。
5.根据权利3要求所述的诱变育种方法，其特征在于：梯度平板中底物植物甾醇的浓度为2%~4%；化学诱变剂DES的诱变浓度为1%。
6.根据权利要求3所述的诱变育种方法，其特征在于：DES和紫外线复合诱变处理的出发菌株培养物处于对数生长期。
7.根据权利3或4或5要求所述的诱变育种方法，其特征在于：紫外照射诱变采用15W或30W紫外灯，提前预热20~30分钟后，将菌液置于距离紫外灯20~30cm处进行紫外照射30~240秒。
8.根据权利要求3或4或5所述的诱变育种方法，其特征在于：所述的发酵培养基为改良后的合成培养基（%）：玉米浆2~5，NaNO3 0.3~0.6，葡萄糖0.1~0.5， (NH4)2HPO4 0.06，豆油16，植物甾醇2，泡敌0.01，pH 6.0-8.5。
9.根据权利4要求所述的方法，其特征在于：所述步骤的具体步骤包括：
a. 发酵结束后，取上层转化液1~2ml，加入同体积的乙酸乙酯，漩涡振荡10min至充分溶解；
b. 取上层乙酸乙酯溶液，于6000转/分钟的条件下，离心10分钟，获得上清液；
c. 上清液0.2mL于5mL离心管中，蒸去乙酸乙酯后，加入色谱甲醇2mL，超声溶解，并以0.22μm针头过滤器过滤，制得样品；
d. 用HPLC法对样品中的产物进行定量分析，
在245nm下用HPLC法测定雄烯二酮的浓度，计算雄烯二酮生成率。
10.根据权利要求3或4或5所述的诱变育种方法，其特征在于：诱变后菌株WB3的摇瓶培养条件为温度28～32°C、摇床转速200～300转/分钟。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055350A (zh) * 2018-10-16 2018-12-21 内蒙古格林特制药有限责任公司 一种通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法
CN109251870A (zh) * 2018-07-09 2019-01-22 沈阳旺宁生物科技有限公司 一种新金色分枝杆菌突变株及其在制备hip的应用
CN109929785A (zh) * 2019-04-22 2019-06-25 南京农业大学 一株能够降解2,6-二甲基苯酚的细菌及其生产的菌剂

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MALAVIYA A KA ET AL.: "staged protocol for acclimatization of mycobacterium sp. Dsmz-2966 toβ-sitosterol for improving biotransformation efficiency", 《NFMNPR》 *
VIDAL M ET AL.: "selection of mycobacterium sp strains with capacity to biotransform high concentration of β-sitosterol", 《APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOLGY》 *
张小燕: "新金分枝杆菌ZJUVN-08转化植物甾醇合成雄甾烯二酮的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *
杨英等: "菜籽甾醇转化制备雄烯二酮高产菌株的诱变育种", 《食品科学》 *
黄丽君: "雄烯二酮产生菌的诱变选育及发酵条件优化的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109251870A (zh) * 2018-07-09 2019-01-22 沈阳旺宁生物科技有限公司 一种新金色分枝杆菌突变株及其在制备hip的应用
CN109251870B (zh) * 2018-07-09 2020-09-22 沈阳博泰生物制药有限公司 一种新金色分枝杆菌突变株及其在制备hip的应用
CN109055350A (zh) * 2018-10-16 2018-12-21 内蒙古格林特制药有限责任公司 一种通过硫酸二乙酯及紫外线诱变灰黄霉素菌种的方法
CN109929785A (zh) * 2019-04-22 2019-06-25 南京农业大学 一株能够降解2,6-二甲基苯酚的细菌及其生产的菌剂
CN109929785B (zh) * 2019-04-22 2021-12-17 南京农业大学 一株能够降解2,6-二甲基苯酚的细菌及其生产的菌剂

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