CN109251870A

CN109251870A - 一种新金色分枝杆菌突变株及其在制备hip的应用

Info

Publication number: CN109251870A
Application number: CN201810744531.XA
Authority: CN
Inventors: 张驰; 彭金金
Original assignee: Shenyang Wangning Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenyang Botai Biopharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2018-07-09
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2019-01-22
Anticipated expiration: 2038-07-09
Also published as: CN109251870B

Abstract

本发明提供一种能够将植物甾醇转化为HIP的新金色分枝杆菌突变株MN PJ‑5及其应用，该菌株的保藏编号为CGMCC No.15575。该菌株以植物甾醇为底物，转化HIP的产率为0.47‑0.52g/g植物甾醇(折纯)，HIP的产率是已公开菌株HIP产率的1.82倍。以植物甾醇为底物，发酵液中HIP比例占产物的90.74‑99.10％，同时副产物的产率大大低于已公开菌株，可用于HIP的生产。本发明还提供了基于该新金色分枝杆菌制备HIP的方法。本发明提供的新金色分枝杆菌与已有方法相比，HIP得率高，副产物少，并且对环境没有污染。此外，本发明的菌株MN PJ‑5具有高产性状稳定的特点，该菌株经过6个月的传代，性能保持稳定。

Description

一种新金色分枝杆菌突变株及其在制备HIP的应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种新金色分枝杆菌的新菌株及其在制备甾体化合物中间体HIP中的用途。

背景技术

甾体激素类药物是我国医药领域的重要门类，在临床上被广泛使用。最初人们主要是从动物肾上腺、性腺和尿液中提取甾体药物，如雌酮、雌二醇、睾丸酮等天然甾体激素晶体，由于这些原料来源少、含量低、合成路线长、成本高等，并不能满足实际生产的需要。随后科研人员开始从植物中寻求起始原料，20世纪30年代中期，日本科学家分离出了薯蓣皂素，为甾体药物工业提供了资源丰富又廉价易得的天然原料，在相当长的一段时间内，人们利用薯蓣皂素原料为原料，通过化学合成法生产甾体药物。但是，因甾体化合物结构复杂，合成步骤多、生产工艺复杂，污染大，收率低，导致成本很高，经济效益薄弱。后来人们发现一些微生物，如诺卡氏菌、假单胞菌、分枝杆菌、节杆菌等能以甾醇为唯一碳源生长，随后又发现细菌、放线菌、酵母、霉菌中的某些菌株可以使甾体化合物的特定部位发生转化，其反应专一性表现出了巨大优势。在微生物降解甾醇的代谢过程中很多代谢中间体可用于生产甾体药物的原料，具有明显的优势，如AD、9-OH AD、ADD等。但甾体并不是微生物代谢途径中起生理作用的物质，而是作为能够被菌体利用的碳源和能源物质，最终被分解为CO₂和H₂O。因此，利用微生物降解甾醇生产有用的甾体中间体，必须首先改变微生物的甾体代谢途径。有大量文献报道，利用诺卡氏菌、分枝杆菌、假单胞菌、红球菌、节杆菌属等微生物的突变株能够降解甾醇类物质来生产甾体药物及其中间体，其中以分支杆菌属和红球菌属的应用最为广泛。微生物降解甾醇生产甾体药物中间体已逐渐成为现代医药工业生产甾体激素类药物的主流，占据着极其重要的地位。

甾体类物质在上述菌中的降解为有氧降解，以分支杆菌降解胆固醇为例，其降解过程(见图3)为：一、胆固醇(I，cholesterol)转化为胆甾-4-烯-3-酮(cholest-4-en-3-one)；二、侧链降解：与第一步的氧化同时进行，过程类似于脂肪酸的β-氧化，在一系列酶的催化下，生成一种重要的甾体激素前体物质雄甾-4-烯-3,17-二酮(II，androst-4-ene-3,17-dione，简称AD)；三、中心环的降解：在一系列酶作用下，AD分裂为2-羟-2,4-二烯己酸(III，2-hydroxyhexa-2,4-dienoic acid)和9,17-二氧代-1,2,3,4,10,19-六降雄甾烷-5-羧酸(IV，9,17-dioxo-1,2,3,4,10,19-hexanorandrostan-5-oic acid，简称HIP)；四、下游降解途径：2-羟-2,4-二烯己酸经过一系列酶逐步分解，能量进入三羧酸循环，而HIP被转化为3aα-H-4α-(3’-丙酸)-5α-羟基-7aβ-甲基六氢-1-印酮-δ-内酯(V，3aα-H-4α-(3’-propionic acid)-5α-hydroxy-7aβ-methylhexahydro-1-indanone-δ-lactone，简称HIL)，进一步被完全降解为CO₂和H₂O。其中，HIP可用于合成雌酚酮、雌二醇及其衍生物等重要药物或中间体。

利用微生物降解植物甾醇直接制备HIP的报道很少，专利US4,062,729、US4,097,335报道的分枝杆菌突变株虽然可以降解植物甾醇积累HIP，但同时产生大量的副产物，如HIL和HK(VI，3aα-H-4α-(3’-丙醇)-7aβ-甲基六氢-1,5-印二酮半缩酮，3aα-H-4α-(3’-propanol)-7aβ-methylhexahydro-1,5-indandione hemiketal，简称HK)等，HIP比例只有56.24％。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种新金色分枝杆菌的突变株，本发明提供的新金色分枝杆菌的突变株丧失由HIP转化为HIL的能力，能够降解植物甾醇积累更多的HIP，HIP、HIL及HK结构式如下：

9,17-二氧代-1,2,3,4,10,19-六降雄甾烷-5-羧酸(HIP，IV)

3aα-H-4α-(3’-丙酸)-5α-羟基-7aβ-甲基六氢-1-印酮-δ-内酯(HIL，V)

3aα-H-4α-(3’-丙醇)-7aβ-甲基六氢-1,5-印二酮半缩酮(HK，VI)

气相色谱结果显示，摇瓶发酵液的HIP的比例高达90.74％，比已有菌株(US4,062,729、US4,097,335中的NRRL B-8129)提高了34.50％，HIP的产量提高82.13％；本发明菌株HIP的摇瓶产率为0.47g/g植物甾醇(折纯)，是对照菌株产率的1.82倍；发酵罐发酵液中HIP的产率为0.52g/g植物甾醇(折纯)，HIP比例占产物的99.10％。

本发明的具体技术方案如下。

一方面，本发明提供一种新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)突变株MNPJ-5，该新金色分枝杆菌的保藏编号为CGMCC No.15575。

该菌株已于2018年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为新金色分枝杆菌：(Mycobacterium neoaurum MN PJ-5)，保藏号为CGMCC No.15575。

该菌株具有下述性质：

1、菌落形态学特征：

将本发明的菌株于32℃下，在营养固体培养基上培养生长，3-5天后，得到直径约为3～10mm的金黄色菌落，菌落呈圆形，表面光滑。

2、菌株形态学特征：

本发明的菌株显微镜下呈现圆杆状，与分枝杆菌属镜下形态一致。

3、生理与生化特性：

本发明的菌株培养温度为28-32℃，最适生长温度为32℃，并且在pH为7.0-7.6的条件下生长较好。

4、营养特征：

本发明的菌株无需特殊营养素，使用基础培养基例如营养肉汤培养基培养，专性需氧。

本发明的新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5是通过从发明人所在实验室保藏的新金色分枝杆菌菌株MNPJ-1诱变培育得到的。诱变过程见实施例1。

另一方面，本发明提供了上述新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5的种子培养物。

所述种子培养物是通过培养新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5制备得到，例如是该突变株的种子培养物。

优选地，所述种子培养物通过包括以下步骤的培养方法制备得到：将新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5接种于种子培养基，振荡培养，所述种子培养基包含：牛肉膏0.1～0.5g/L，蛋白胨0.5～1.5g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，甘油1.0～2.0g/L，吐温1.5～2.5g/L，pH7.0～7.4；

优选地，所述种子培养基包含：牛肉膏0.3g/L，蛋白胨1.0g/L，酵母粉0.3g/L，甘油1.5g/L，吐温2.0g/L，pH 7.2。

关于种子培养基的制备，各成分与水配制后，调节pH，高压蒸汽121℃灭菌30分钟，冷却后使用。

优选地，所述种子培养物通过包括以下步骤的培养方法制备得到：将新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5(例如保存于1ml冷冻甘油管的菌株)接种于所述种子培养基，在28～32℃下、优选地在32℃下，以200～250转/分钟、优选220转/分钟振荡培养36～60小时，优选48小时。

本发明提供的上述新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5或种子培养物均可用于制备HIP。

因此，再一方面，本发明提供新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5或者种子培养物在制备HIP中的用途。

还一方面，本发明提供一种制备HIP的方法，所述方法包括使用本发明的新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5或种子培养物将植物甾醇转化为HIP。植物甾醇是从各种植物中提取的多种甾醇的混合物，主要包括谷甾醇、二氢谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇等，可直接购买得到。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)将新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5或种子培养物接种于包含植物甾醇的转化培养基中进行发酵培养；

(2)从步骤(1)得到的发酵培养液中提取HIP。

其中，步骤(1)中，优选地，所述转化培养基包含：大豆蛋白胨1～5g/L，酵母提取物0.5～2g/L，葡萄糖0.5～2g/L，柠檬酸0.1～0.3g/L，柠檬酸铁铵0.01～0.05g/L，K₂HPO₄ 0.5～1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.1g/L，NH₄NO₃ 0.1～0.5g/L，植物甾醇8.5-85g/L，吐温801～5g/L，pH 7.0-7.6；

优选地，所述转化培养基包含：大豆蛋白胨3g/L，酵母提取物1g/L，葡萄糖1.0g/L，柠檬酸0.2g/L，柠檬酸铁铵0.01g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.05g/L，NH₄NO₃ 0.3g/L，植物甾醇8.5-85g/L，吐温80 2g/L，pH 7.2。

可以理解的是，本发明的转化培养基中的植物甾醇可以由包含植物甾醇的植物甾醇提取物代替，相应地，折纯后，植物甾醇在该转化培养基中的含量为8.5-85g/L。

关于转化培养基的制备，先用50℃的水配制吐温80溶液，边搅拌边加入植物甾醇或相应的植物甾醇提取物，再加入其他上述成分，调节pH，高压蒸汽灭菌。摇瓶灭菌条件为121℃灭菌30分钟，发酵罐灭菌条件为130℃，灭菌30min。冷却后摇匀使用。

优选地，步骤(1)中采用本发明的种子培养物，将所述种子培养物以相对于转化培养基的体积比3～10％、优选4～6％、进一步优选5％的接种量接种于所述转化培养基中。

并且，优选地，步骤(1)中，所述发酵培养为摇瓶振荡培养或发酵罐深层培养。

优选地，步骤(1)中，用于摇瓶振荡培养的转化培养基中，植物甾醇17g/L；

更优选地，所述摇瓶振荡培养包括：在28～32℃下，优选地在32℃下，以200～250转/分钟、优选220转/分钟摇瓶振荡培养5～13天；或者

优选地，步骤(1)中，用于发酵罐深层培养的转化培养基中，植物甾醇42.5g/L；

更优选地，所述发酵罐深层培养为通气搅拌培养，包括：在28～32℃、优选地在32℃，通气搅拌培养7～14天；其中控制空气流量0.5L/L/M、罐压0.05MPa和搅拌速度300rpm，使溶解氧保持在30％以上，pH为7.0～7.2。

关于发酵液中的产物积累情况，可以取步骤(1)中发酵培养的发酵液，经气相色谱分析。例如，取200μL步骤(1)中发酵液样品，HCl酸化至pH＝2后用4倍体积的乙酸乙酯萃取，涡旋震荡2min，12000rpm，离心10min，收集上清液，氮气吹干，将得到的产物用乙酸乙酯溶解，配制成1mg/mL的溶液，并通过0.22μl的有机膜过滤除杂，滤液送气相色谱检测。

气相色谱分析条件包括：

色谱柱为Agilent HP-5；检测器为FID检测器；进样量1μl，进样口温度为240℃；检测器温度为280℃；

采用程序升温：初温180℃，7min，升温速率30℃·min^-1，升到240℃，6min。

优选地，步骤(2)中，提取HIP包括：收获步骤(1)中发酵培养得到的发酵液，离心，上清液过滤，滤液调pH 2～3，加入0.2-0.6倍体积、优选0.4倍体积的二氯甲烷，混合，分层，收集有机相。

优选地，步骤(2)中，提取HIP还包括：有机相过滤后，常压蒸馏浓缩至有机相原体积的1/10-1/6、优选1/8，加入0.2-0.6倍体积、优选0.4倍体积的正己烷，降温至12～14℃，养晶，过滤，洗涤和干燥，得到HIP，并送样检测；

更优选地，所述过滤均使用5μm滤器进行。

本发明的有益效果包括：

1.本发明筛选获得可以植物甾醇为底物高产HIP的新金色分枝杆菌突变株，利用该突变株首次实现了HIP的高效转化，摇瓶发酵液HIP产率为0.47g/g植物甾醇(折纯)，发酵液产物中HIP占全部产物比例达到90.74％；发酵罐培养HIP产率为0.52g/g植物甾醇(折纯)，发酵液产物中HIP占全部产物比例达到99.10％；

2.本发明的方法为微生物转化法，反应条件温和，对环境没有污染；

3.本发明的新金色分枝杆菌突变株具有高产性状稳定的特点，该菌株经过6个月的传代，性能保持稳定；

4.本发明只需使用本发明的菌株进行转化，生产成本低，工艺简单，经济效益可观。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1中的图1-1为对照菌株NRRL B-8129摇瓶发酵制备HIP的发酵产物气相图谱；图1-2为使用MN PJ-5制备HIP摇瓶发酵产物气相图谱；图1-3为使用MN PJ-5制备HIP发酵罐发酵产物气相图谱。

图2显示了根据本发明的气相色谱法，HIP、HIL和HK标准品的出峰时间，其中图2-1是标准品HIP的检测结果，图2-2是标准品HIL的检测结果，图2-3是标准品HK的检测结果，保留时间如图所示。

图3显示了分枝杆菌内胆固醇分解代谢途径。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的菌株、质粒、试剂盒等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

下述实施例中采用的新金色分支杆菌MN PJ-5，已于2018年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为新金分支杆菌(Mycobacterium neoaurum MNPJ-5)，保藏号为CGMCC No.15575。下述实施例中采用的新金色分支杆菌MNPJ-1为本发明的发明人所在实验室保藏；另外，新金色分枝杆菌NRRL B-8129得自美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection)。

下述实施例中，发酵液中的产物积累情况如下进行分析：

取200μL发酵液样品，HCl酸化至pH＝2后用4倍体积的乙酸乙酯萃取，涡旋震荡2min，12000rpm，离心10min，收集上清液，氮气吹干，将得到的产物用乙酸乙酯溶解，配制成1mg/mL的溶液，并通过0.22μl的有机膜过滤除杂，滤液利用气相色谱检测。

固体样品的制备方法：将得到的产物用乙酸乙酯溶解，配制1mg/mL的溶液，并通过0.22μm的有机膜过滤除杂，滤液利用气相色谱法分析产物的含量；

气相色谱测定法：

取样品1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图；另取HIP、HIL和HK样品25mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算出供试品中HIP、HIL和HK的浓度。

计算公式

Ax为供试品中HIP(HIL、HK)峰面积

Ar为对照品中HIP(HIL、HK)峰面积

Cr为对照品中HIP(HIL、HK)的浓度(mg/ml)

进样要求：含量测定的样品，单样双针，平行测定。

气相色谱测定条件：

色谱柱为Agilent HP-5；

检测器为FID检测器；

进样量1μl，进样口温度为240℃；

检测器温度为280℃；

分流比：20:1；

载气：高纯N₂，流速3.0ml/min；

利用各物质的出峰时间不同，对比HIP、HIL及HK标准品来检测产物的生成，其中HIL购买自保定九孚生物科技有限公司，HIP和HK由实验室分离获得。各物质的出峰时间分别如图2-1，2-2，2-3所示。

下述实施例中采用植物甾醇含量为85％的植物甾醇提取物。

实施例1：制备本发明的菌株

以新金色分枝杆菌MNPJ-1作为出发菌株，采用以下方法制备得到本发明的新金色分枝杆菌：

1)称取6mg亚硝基胍(简称NTG，购自Sigma)于无菌离心管中，再加0.05mL丙酮助溶，加入0.2mM的pH 6.0的磷酸缓冲液1mL使其完全溶解；

将本实验室保藏的新金色分枝杆菌MNPJ-1制成浓度在10^8-9个/mL的菌悬液，将5mL菌悬液与上述亚硝基胍溶液混合；

2)将步骤1)得到的混合液立即置于30℃水浴振荡处理10min～1h；

3)通过离心收集菌体，然后使用5mL上述磷酸缓冲液洗涤菌体两次以终止NTG的诱变作用，最后向离心管中加5mL无菌生理盐水，摇匀；

4)将诱变处理的菌悬液进行10倍稀释后涂营养琼脂培养基平板，培养4-6天得单菌落；

5)挑取单菌落进行以植物甾醇为底物的转化试验，从中筛选得到本发明的突变菌株新金色分枝杆菌MN PJ-5。

实施例2：新金色分枝杆菌MN PJ-5的种子培养与传代

种子培养基配方为：牛肉膏0.3g/L，蛋白胨1.0g/L，酵母粉0.3g/L，甘油1.5g/L，吐温2.0g/L。各成分与水配制后，调节pH至7.2，高压蒸汽121℃灭菌30分钟，冷却后使用。

将新金色分枝杆菌MN PJ-5接种于上述种子培养基，在32℃下，以220转/分钟振荡培养48小时。

菌株经过6个月的平板培养基传代，接种于营养肉汤固体培养基，32℃进行活化培养48h。传代后的菌株形态与母代菌株一致，具有下述性质：

1、菌落形态学特征：

将本发明的菌株于28℃下，在营养固体培养基上培养生长，3-5天后，得到直径约为3～10mm的金黄色菌落，菌落呈圆形，表面光滑。

2、菌株形态学特征：

3、生理与生化特性：

实施例3：摇瓶振荡培养新金色分枝杆菌MN PJ-5制备HIP

(一)种子培养：

按照实施例2所述进行。

(二)转化培养：

转化培养基配方为：大豆蛋白胨3g/L，酵母提取物1g/L，葡萄糖1.0g/L，柠檬酸0.2g/L，柠檬酸铁铵0.01g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.05g/L，NH₄NO₃ 0.3g/L，吐温802g/L，植物甾醇17g/L(折纯)，pH 7.2。配制时，用50℃的水先配制吐温80溶液，边搅拌边加入植物甾醇提取物，再加入上述成分并用水补足体积，调节pH 7.2，分装摇瓶为100ml/500ml摇瓶，高压蒸汽121℃灭菌30min，冷却后使用。

将制备的种子培养物以5％的接种量接种于上述转化培养基中，在32℃下，220转/分钟摇瓶振荡培养13天。

此外，如上分别制备出发菌株新金色分支杆菌MNPJ-1和US4,062,729、US4,097,335中的NRRL B-8129的发酵液。

比较两株菌株的发酵液中产物积累情况，分析结果参见表1。

表1本发明菌株与原专利菌株产物积累比较

注：产率为产物HIP g/g植物甾醇(折纯)；数值经四舍五入。

结果发现，对照菌株NRRL B-8129发酵液可产生HIP 4.42g/L，除含有HIP外，还积累大量的HIL和HK，HIP的比例只占56.24％。本发明的菌株新金色分枝杆菌MN PJ-5，发酵液中可产生HIP 8.05g/L，HIP比例占产物的90.74％，产物中副产物比例远远低于原专利菌株NRRL B-8129。本发明的菌株新金色分枝杆菌MN PJ-5与原专利菌株相比，本发明菌株以植物甾醇为底物转化HIP的产率为0.47g/g植物甾醇(折纯)，是对照菌株产率的1.82倍；HIP的积累量提高了82.13％，发酵液中HIP比例提高34.5％。

以上结果证明，利用本发明的菌种新金色分枝杆菌MN PJ-5发酵生产HIP比美国专利US 4,062,729的方法具有明显优势。

NRRL B-8129摇瓶发酵气相色谱结果见图1-1，MN PJ-5摇瓶发酵结果见图1-2。

实施例4：发酵罐深层培养新金色分枝杆菌MN PJ-5制备HIP

(一)种子培养：

按照实施例2所述进行。

(二)转化培养：

转化培养基配方为：大豆蛋白胨3g/L，酵母提取物1g/L，葡萄糖1.0g/L，柠檬酸0.2g/L，柠檬酸铁铵0.01g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.05g/L，NH₄NO₃ 0.3g/L，植物甾醇47.5g/L(折纯)，吐温80 2g/L，pH 7.2。配制时，用50℃的水先配制吐温80溶液，边搅拌边加入植物甾醇提取物，再加入上述成分并用水补足体积，调节pH 7.2。

将制备的种子培养物以5％的接种量接种于含有15L转化培养基的30L自动发酵罐中，在32℃下培养13天；其中控制空气流量0.5L/L/M、罐压0.05MPa和搅拌速度300rpm，使溶解氧浓度大于30％。

取400μL发酵液样品，如上通过气相色谱法分析产物积累情况。本发明的菌株新金色分枝杆菌MN PJ-5，发酵液中HIP的浓度为21.96g/L，HIP以植物甾醇为底物的产率为0.52g/g植物甾醇(折纯)，HIP比例占产物的99.10％。

MN PJ-5发酵罐发酵产物气相色谱结果见图1-3。

实施例5：HIP的提取

收获转化培养后的发酵液，8000rpm离心10min，分离得上清液。再使用5μm滤器过滤，滤液入提取罐。将滤液用硫酸调pH至2～3，加入0.4倍体积的二氯甲烷，充分混合，静止分层，收集下部有机相。有机相使用5μm滤器过滤后，常压蒸馏至有机相原体积的1/8，浓缩至料液粘稠，挂壁明显。

向浓缩料液中加入0.4倍体积的正己烷，逐渐降温至12-14℃，养晶1小时。晶体过滤，正己烷洗涤。晶体干燥，并送样检测，不合格产品重结晶。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims

1.一种新金色分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)突变株MN PJ-5，保藏编号为CGMCCNo.15575。

2.权利要求1所述的新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5的种子培养物。

3.根据权利要求2所述的种子培养物，其特征在于，所述种子培养物通过培养权利要求1所述的新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5制备得到；

优选地，所述种子培养物通过包括以下步骤的培养方法制备得到：

将所述新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5接种于种子培养基，振荡培养，所述种子培养基包含：牛肉膏0.1～0.5g/L，蛋白胨0.5～1.5g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，甘油1.0～2.0g/L，吐温1.5～2.5g/L，pH 7.0～7.4；

优选地，所述种子培养基包含：牛肉膏0.3g/L，蛋白胨1.0g/L，酵母粉0.3g/L，甘油1.5g/L，吐温2.0g/L，pH7.2。

4.根据权利要求2或3所述的种子培养物，其特征在于，所述种子培养物通过包括以下步骤的培养方法制备得到：

将所述新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5接种于所述种子培养基，在28～32℃下、优选地在32℃下，以200～250转/分钟、优选220转/分钟振荡培养36～60小时、优选48小时。

5.权利要求1所述的新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5或权利要求2至4中任一项所述的种子培养物在制备HIP中的用途。

6.一种制备HIP的方法，所述方法包括使用权利要求1所述的新金色分枝杆菌突变株MNPJ-5或权利要求2至4中任一项所述的种子培养物将植物甾醇转化为HIP。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的新金色分枝杆菌突变株MN PJ-5或权利要求2至4中任一项所述的种子培养物接种于包含植物甾醇的转化培养基中进行发酵培养；

(2)从步骤(1)得到的发酵培养液中提取HIP。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述转化培养基包含：大豆蛋白胨1～5g/L，酵母提取物0.5～2g/L，葡萄糖0.5～2g/L，柠檬酸0.1～0.3g/L，柠檬酸铁铵0.01～0.05g/L，K₂HPO₄ 0.5～1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.1g/L，NH₄NO₃ 0.1～0.5g/L，吐温80 1～5g/L，植物甾醇8.5～85g/L，pH 7.0-7.6；

优选地，所述转化培养基包含：大豆蛋白胨3g/L，酵母提取物1g/L，葡萄糖1.0g/L，柠檬酸0.2g/L，柠檬酸铁铵0.01g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.05g/L，NH₄NO₃ 0.3g/L，吐温80 2g/L，植物甾醇8.5-85g/L，pH 7.2；

优选地，步骤(1)中采用权利要求2至4中任一项所述的种子培养物，将所述种子培养物以相对于转化培养基的体积比3～10％、优选4～6％、进一步优选5％的接种量接种于所述转化培养基中。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养为摇瓶振荡培养或发酵罐深层培养；

优选地，用于摇瓶振荡培养的转化培养基中，植物甾醇17g/L；

更优选地，所述摇瓶振荡培养包括：在28～32℃下、优选地在32℃下，以200～250转/分钟、优选220转/分钟摇瓶振荡培养5～13天；或者

优选地，用于发酵罐深层培养的转化培养基中，植物甾醇42.5g/L；

更优选地，所述发酵罐深层培养为通气搅拌培养，包括：在28～32℃下、优选地在32℃下，通气搅拌培养7～14天；其中控制空气流量0.5L/L/M、罐压0.05MPa和搅拌速度300rpm，使溶解氧保持在30％以上，pH为7.0～7.2。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，提取HIP包括：收获步骤(1)中发酵培养得到的发酵液，离心，上清液过滤，滤液调pH 2～3，加入0.2-0.6倍体积、优选0.4倍体积的二氯甲烷，混合，分层，收集有机相；

优选地，步骤(2)中，提取HIP还包括：有机相过滤后，常压蒸馏浓缩至有机相原体积的1/10-1/6、优选1/8，加入0.2-0.6倍体积、优选0.4倍体积的正己烷，降温至12～14℃，养晶，过滤，洗涤，干燥；

更优选地，所述过滤均使用5μm滤器进行。