CN104403974A - 一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮的植物甾醇转化菌株的选育 - Google Patents

一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮的植物甾醇转化菌株的选育 Download PDF

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Abstract

一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮的植物甾醇转化菌株的选育，属于生物工程中发酵技术领域。本发明以实验室保藏的一株能有效转化植物甾醇为AD和ADD的菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloiquefaciens)ST 06为出发菌株；经常压室温等离子体(ARTP)诱变后，经过一系列的初筛和复筛，从500株变异菌株中筛选得到一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮AD的菌株ST12-96，对其进行发酵优化显示在温度30℃、pH 7.0、160rpm的条件下培养48h达到对数生长期，将对数生长期的菌体以10％(V/V)的接种量接入发酵培养基，在30℃、pH 7.0、160rpm的条件下培养7d，对发酵产物进行定量检测，植物甾醇转化为AD的转化率达到了75.95％，产物AD含量达到8.41g/L，AD占到AD与ADD总和的95.02％。本发明首次将解淀粉芽孢杆菌用于AD的生物合成。

Description

一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮的植物甾醇转化菌株的选育
技术领域
一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮的植物甾醇转化菌株的选育，属于生物工程中发酵技术领域。
背景技术
甾体药物(steroid hormone drugs)是指分子结构中含有甾体结构的药物，其具有很强抗感染、抗过敏、抗病毒及抗休克的药理作用，是临床上一类重要的药物。主要分为两类药物：糖皮质激素和性激素。糖皮质激素用于临床上的药物主要有醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸氟轻松等。性激素主要有雌性激素、雄性激素、蛋白同化激素及孕激素等。性激素药剂主要包括：黄体酮、苯丙酸诺龙、甲睾酮等。近年来随着人们对生活质量、身体健康需求的日益提高以及当今社会日益加重的老龄化问题，甾体药物体现的价值日益显著。甾体药物被广泛用于抗肿瘤，抗炎，抗痉挛和抗过敏；预防和治疗许多严重性的疾病，例如：激素依赖型的乳腺和前列腺癌、结肠癌、肥胖症、慢性糖尿病、类风湿性关节炎、高血压、哮喘、湿疹、炎症、代谢紊乱、神经性退化老年症、中枢神经系统紊乱症、妇科疾病、过敏性休克、肾上腺激素分泌不全、抑制HIV整合酶、HIV的感染、AIDS等。在最畅销的药物产品中，甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物，甾体药物的年产量超过了100万吨，全球销售总额超过了100亿美元。
在甾体激素的生产过程中AD(androst-4-ene-3,17-dione，雄甾-4-烯-3，17-二酮)和ADD(androsta-1,4-diene-3,17-dione，雄甾-1，4-二烯-3,17-二酮)是重要的中间体，它们可用于合成矿质皮质激素(螺内酯)、氢化可的松、雄激素(睾酮、甲基睾酮)、甲基雄甾烷醇酮、卵泡激素(乙炔雌二醇、乙炔雌二醇甲酯、雌二醇、雌三醇)、黄体激素等十几种甾体药物。
目前雄甾烯酮AD(D)的制备方法主要有以下三种：(一)从动植物的组织液中直接提取，产率很低而且成本较高，不适宜大规模工业化生产；(二)由非甾化合物化学法直接合成，不仅成本高、收率低，而且污染严重；(三)从植物和动物中分离出的类固醇中间体原料合成。
第三种生产方式是目前生产雄甾烯酮的主要方式，这种生产方式使用的原料主要是薯蓣皂素，由于以薯蓣皂素为原料存在成本高昂等诸多缺点，因此各国科学家都在寻找新的廉价原料代替皂素用来生产甾体药物。由于动植物甾醇是从制糖、食用油精炼等行业的废料中提取出来的，具有价格低廉易获得的优点，因此微生物法转化动植物甾醇为雄甾烯酮成为各国科学家新的研究热点。20世纪50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有双链的大豆甾醇为原料生产出AD和ADD。20世纪70年代初，日本的研究学者有马启利用微生物降解胆固醇成功生产ADD。2002年Dias等将油脂脱臭蒸馏物中富集的植物甾醇混合物用分枝杆菌NRRLB-3805处理得到AD和ADD，且收率相当高。
由于大多数甾醇侧链降解菌无法积累单一产物，而是同时积累三个结构相近且很难进行分离纯化的化合物(AD、ADD与9α-OH-AD)，所以大多数甾醇侧链降解菌无法在工业上应用。本实验室保藏有一株能有效转化植物甾醇为AD和ADD混合物的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloiquefaciens)ST 06，其混合产物中AD:ADD＝2.5：1，混合物中ADD的比例还是比较大，15g/L底物投加量，30℃，160rpm条件下，发酵7d，AD的产量为2.84g/L，ADD的产量为1.18g/L。实验室前期选育获得一株转化植物甾醇为单产雄甾-1，4-二烯-3,17-二酮ADD的菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloiquefaciens)ST 06-95，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 208135。已获得国家发明专利，专利号ZL200810155130.7。
本发明通过常压室温等离子体快速诱变的方法，对原始菌株B.amyloiquefaciens ST 06进行诱变处理，经过一系列的初筛和复筛，从500株变异菌株中选育获得了一株高产AD的菌株，15g/L底物投加量，30℃，160rpm条件下，发酵7天，AD产量为8.41g/L，ADD产量为0.45g/L，AD：ADD＝18:1。对其发酵条件进行了初步研究，为微生物转化甾体药物工业化提供了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供：运用常压室温等离子体诱变技术，对一株有效地转化植物甾醇为AD和ADD的菌株B.amyloiquefaciens ST 06进行诱变处理，得到了一株能高产AD的菌株B.amyloiquefacien ST 12-96，诱变后得到的菌株不仅提高了AD和ADD的转化率，从39.04％提高到了86.05％，还将AD在产物中的比例从2.5:1提高到了18:1。为微生物甾体转化的工业化提供了有益的指导。
本发明的技术方案：
本发明采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术，得到一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮的植物甾醇转化菌株，该菌株中，植物甾醇转化为AD和ADD的转化率从39.04％提高到了86.05％，产物中AD的比例从2.5:1提高到了18:1，该菌株命名为B.amyloiquefaciens ST 12-96。
菌株诱变选育方法：
(1)出发菌株生长曲线与常压室温等离子体(ARTP)诱变致死率曲线的制定：以实验室保藏的能有效转化植物甾醇为AD和ADD的菌株B.amyloiquefaciens ST 06作为出发菌株，选用10μl处理菌液在进行诱变处理，选择的照射时间60s、90s、120s、150s、180s，制定致死率曲线，选择致死率在70～90％的时间作为诱变时间；
(2)出发菌株经ARTP照射150s，诱变后用无菌生理盐水适当稀释，然后涂布于以甾醇作为唯一碳源的培养基LC1上，30℃培养48h；
(3)从LC1平板中挑取单菌落克隆500株，接种到以雄甾-4-烯-3,17-二酮AD为唯一碳源的培养基LC2固体培养基中，30℃培养48h；选择在LC1上长势良好，LC2上不长或长势缓慢的菌落268株进行摇瓶发酵复筛，挑选转化率提高及产物中AD所占比例提高的菌株；
所述培养基组成：
基本培养基LC(g/L)为：CH2COONH41.5，MgSO4﹒7H2O 0.2，K2HPO40.4，KH2PO40.8，FeSO4﹒7H2O 5×10-3，ZnSO4﹒7H2O 2×10-3，MnCl2﹒4H2O 5×10-4；
培养基LC1：在LC基础上，以甾醇为唯一碳源，含量为15g/L；甾醇成分中豆甾醇﹥96％；
培养基LC2：在LC基础上，以AD为唯一碳源，含量为10g/L；
发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，K2HPO40.2，MnCl25×10-4，植物甾醇15，羟丙基-β-环糊精45，大豆蛋白胨10，初始pH 7.0；
发酵条件：30℃，160rpm发酵7d，接种量10％。
用所述ST12-96菌株发酵产雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征是ST12-96在固体培养基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖5，牛肉膏3，琼脂20，pH 7.0，培养46～48h，然后转入种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏6，NaCl 15，pH 7.0，培养24h，按10％接种量接种于发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，K2HPO40.2，MnCl25×10-4，植物甾醇15，羟丙基-β-环糊精45，大豆蛋白胨10，初始pH 7.0，发酵7d。
产物的分离提纯：取一定的量的发酵液，用5倍体积的乙酸乙酯萃取，剧烈振荡1～2min，沉淀后，取上清过0.22μm的有机滤头。
液质联用对产物进行鉴定：将萃取处理后的发酵产物进行检测，确定产物的分子量，确定产物为雄甾-4-烯-3，17-二酮和雄甾-1，4-二烯-3,17-二酮。
薄层层析(TCL)定性分析：用处理好的样品点样于GF254薄板，展开相为石油醚：乙酸乙酯＝6:4，饱和30min后，自然风干薄板，喷涂50％的硫酸，在100℃下烘烤20min，然后缓慢降至室温。
紫外比色定量：将上述样品用乙酸乙酯稀释适当的倍数，用U3000型紫外分光光度计测其吸光值，与标准品对照，检测波长为254nm和298nm。高效液相色谱定量：采用高效液相对产物进行定量测定，确定该菌的转化得率。
本发明的有益效果：以本实验室保藏的一株有效转化植物甾醇为AD和ADD的菌株ST 06作为出发菌株；经常压室温等离子体(ARTP)诱变后，通过一系列的初筛和复筛，从500株变异菌株中筛选得到高产AD的菌株ST12-96，并对该菌的发酵条件进行了探索与初步优化，结果显示在30℃、pH 7.0、160rpm的条件下培养48h达到对数生长期，将对数生长期的菌株以10％(V/V)的接种量接入发酵培养基，在30℃、pH 7.0、160rpm的条件下培养7d，对发酵产物进行定量检测，产物AD含量为8.41g/L，AD占AD和ADD总和的95.02％。该发明为微生物转化甾体药物的工业化提供了基础。
转化所用底物为生产其他药物的下脚料——植物甾醇(主要含谷甾醇，菜油甾醇和豆甾醇等，本发明所用的植物甾醇中豆甾醇含量＞96％)，或毛纺工业和油脂工业的废水和下脚料，实现废物的综合再利用。产品的纯度较高，转化率高，菌株稳定性好，传代至十代后其转化率没有下降。技术的可移植性强，只要一般的发酵车间(如抗生素、维生素、氨基酸生产车间)即可满足其生产需要，不需要购置特殊设备和仪器，易于推广应用，经济效益显著！
附图说明
图1ADD、AD标样的HPLC图谱；
图2发酵产物的HPLC图谱；
具体实施方式
实施例1：高产雄甾-4-烯-3，17-二酮菌株的常压室温等离子体诱变筛选
以实验室保藏的一株能有效转化植物甾醇为AD和ADD的菌株ST 06为出发菌株，制定其生长曲线、常压室温等离子体(ARTP)诱变致死率曲线，诱变后稀释适当梯度涂布于以植物甾醇为唯一碳源的固体培养基LC1(LC+植物甾醇)中培养48h。从LC1平板上挑取500株长势良好的菌株接种到LC2(LC+AD)固体培养基上，30℃培养48h，进行初筛，初筛共得到268株阳性突变株。对在LC1上长势良好，LC2上不长或长势缓慢的268株菌株进行摇瓶复筛，挑选转化率提高，AD所占比例提高的菌株。菌落经鉴定为解淀粉芽孢杆菌B.amyloiquefaciens ST12-96。
实施例2：突变菌株的转化能力的研究
将实施例1中筛选的到的菌株ST12-96在固体培养基(g/L)蛋白胨5，葡萄糖5，牛肉膏3，琼脂20，pH 7.0，培养46～48h，然后转入种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏6，NaCl 15，pH7.0，培养24h，按10％接种量接种于发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，K2HPO40.2，MnCl25×10-4，植物甾醇15，羟丙基-β-环糊精45，大豆蛋白胨10，初始pH 7.0，发酵7d。取一定量的发酵液，用5倍体积的乙酸乙酯萃取发酵液，用0.22μm的有机滤膜过滤上清，过滤后用HPLC分析该溶液中AD、ADD的含量。如图2所示，标样AD对应的出峰时间为7.28min，标样ADD对应的出峰时间为9.88min，诱变后的菌株发酵后，发酵液中的AD含量明显提高。
由表中可以看出诱变后的菌株转化能力提高了54.07％，AD所占比例提高了24.37％。

Claims (3)

1.采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术，得到一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮AD的植物甾醇转化菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌ST 12-96，该菌株相较于出发菌株解淀粉芽孢杆菌ST 06，在底物投加量为15g/L情况下，发酵7d后，AD的产量从2.84g/L提高到了8.41g/L，AD在AD与ADD的产物混合物中的比例由2.5:1提高到了18:1。
2.权利要求1所述菌株ST 12-96是通过如下方法获得的
(1)出发菌株ST 06常压室温等离子体(ARTP)诱变致死率曲线的制定：本研究采用高纯氦气作为等离子体的工作气体，电源功率40W，照射距离2mm，等离子体的温度<40℃，气流量12.5L/min，处理菌液10μl，选择照射时间60s、90s、120s、150s、180s，制定致死率曲线，选择致死率在70～90％的时间作为诱变时间；
(2)出发菌株ST 06经ARTP照射150s，诱变后用无菌生理盐水适当稀释，然后涂布于以甾醇作为唯一碳源的培养基LC1上，30℃培养48h；
(3)从甾醇平板LC1中挑取单菌落克隆菌株500株接种到以雄甾-4-烯-3,17-二酮AD为唯一碳源的培养基LC2固体培养基中，30℃培养48h；选择在LC1上长势良好，LC2上不长或长势缓慢的菌落268株进行摇瓶发酵复筛，挑选转化率及产物中AD所占比例提高的菌株；得到一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮AD的植物甾醇转化菌株；
所述培养基组成：
基本培养基LC(g/L)为：CH2COONH41.5，MgSO4﹒7H2O 0.2，K2HPO40.4，KH2PO40.8，FeSO4﹒7H2O 5×10-3，ZnSO4﹒7H2O 2×10-3，MnCl2﹒4H2O 5×10-4；
培养基LC1：在LC基础上，以甾醇为唯一碳源，含量为15g/L；甾醇成分中豆甾醇﹥96％；
培养基LC2：在LC基础上，以AD为唯一碳源，含量为10g/L。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，K2HPO40.2，MnCl25×10-4，植物甾醇15，羟丙基-β-环糊精45，大豆蛋白胨10，初始pH 7.0；
发酵条件：30℃，160rpm发酵7d，接种量10％。
3.用权利要求1所述ST12-96菌株发酵产雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征是ST12-96在固体培养基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖5，牛肉膏3，琼脂20，pH 7.0，培养46～48h，然后转入种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏6，NaCl 15，pH 7.0，培养45h，按10％接种量接种于发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，K2HPO40.2，MnCl25×10-4，植物甾醇15，羟丙基-β-环糊精45，大豆蛋白胨10，初始pH 7.0，发酵7d。
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