CN104419646B - 一株能生物合成1,2‑二氢睾内酯(testololactone)的简单青霉及合成方法 - Google Patents

一株能生物合成1,2‑二氢睾内酯(testololactone)的简单青霉及合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134‑2及用该菌发酵转化C21或C19甾体化合物生产1,2‑二氢睾内酯(testololactone)的方法。该菌株在2013年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.8017。生产方法为：采用简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134‑2为菌种，经过一级种子培养和二级发酵扩大培养，在菌体发酵液中投入粉碎的甾体化合物，经酸化、有机溶剂萃取、硅胶柱层析分离得到产物1,2‑二氢睾内酯，产率为56‑96％。该方法简单方便、条件温和、副产物少，并且不对环境产生污染。

Description

一株能生物合成1,2-二氢睾内酯(testololactone)的简单青 霉及合成方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，本发明涉及一种生物合成1，2-二氢睾内酯(testololactone)的菌株及合成方法。
背景技术
1，2-二氢睾内酯，英文名为testololactone，化学式为C19H24O3，分子量为302.41，白色或类白色粉末，CAS4416-57-3。1，2-二氢睾内酯作为一类激素类药物，是第一代芳香酶抑制剂。它能够抑制体内雌激素如雌二醇、雌酚酮的合成，使雌激素的产生减少，血液中雌激素的水平降低，用于假性性早熟的治疗。此外，它的衍生物在临床上用作细胞抗癌药和治疗男性不育等疾病(Dao T L.Estrogen synthesis in human breast tumor and itsinhibition by testololactone and bromoandrostenedione.Cancer Research，1982，42：3338-3341；Cocconi G.First generation aromatase inhibitors--aminoglutethimide and testololactone.Breast cancer research and treatment，1994，30：57-80)。
通过化学合成法和微生物转化法均可制备1,2-二氢睾内酯(testololactone)。有机化学合成上主要采用过氧化剂，但传统氧化剂大多是有毒和／或易爆的，对环境污染大(Zinczuk J，Bacigaluppo J A，Colombo M I.An efficient and environmentallybenign chemical synthesis of testolactone.Journal of the Brazilian ChemicalSociety，2003，14：970-974)。微生物转化法制备1，2-二氢睾内酯条件温和，有环境友好性，因而具有较大的应用前景。到目前为止，能催化雄甾烷或孕甾烷甾体化合物生成1,2-二氢睾内酯的微生物主要为青霉和曲霉，例如黄绿青霉以孕酮，雄甾-4-烯-3，17-二酮等为底物制备1，2-二氢睾内酯，(Liu H M，Li H P，Shan L H.Synthesis of steroidal lactone bypenicillium citreo-viride.Steroids，2006，71(11-12)：931-934)，其底物投料浓度为1g／L，转化时间5天，1,2-二氢睾内酯最高产率为73％；卡地干酪青霉以孕酮，3β-羟基-5-雄烯-17-酮，雄甾-4-烯-3，17-二酮等为底物制备1，2-二氢睾内酯，(Kolek T，Szpineter A，S'wizdor A.Studies on Baeyer-Villiger oxidation of steroids：DHEA andpregnenolone D-lactonization pathways in Penicillium camembertiAM83.Steroids，2009，74：859-862)，其底物投料浓度仅为0.67g／L；溜曲霉转化17a-羟基孕酮，脱氧皮质酮为1,2-二氢睾内酯，底物投料 浓度低，副产物多且产率低(Hunter A C，Carragher N E.Flexibility of the endogenous progesterone lactonisationpathway in Aspergillus tamarii KITA：transformation of a series of corticalsteroid analogues.Journal of Steroid Biochemistry&Molecular Biology，2003，87：301-308)。尽管已有上述研究，并取得了相应的研究成果，但是存在底物投料浓度低，转化时间长，副产物多等问题，仍需要探索利用不同菌种转化不同甾体底物制备1,2-二氢睾内酯的研究，从而提高投料浓度和产率，以进一步降低生产成本，同时减少对环境的污染。
我们之前报道的一株尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum SC1301(专利申请号：201210194657.7)，能转化多种甾体化合物(如：雄甾-4-烯-3，17-二酮，雄甾-1，4-烯-3，17-二酮，3β-羟基-5-雄烯-17-酮，孕酮)生成睾内酯(英文名为testolactone或1,2-dehydrotestololactone)；但本发明中的简单青霉(Penicillium simplicissimum)能转化17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮和前一专利中的甾体化合物为1，2-二氢睾内酯(testololactone)。目前国内外均未见简单青霉一步转化直接合成1,2-二氢睾内酯的报道，通过对菌种培养条件和转化条件的优化，达到较高底物投料浓度，获得高收率的目标产物。
发明内容
本发明提供了一株能转化甾体底物生成1,2-二氢睾内酯(testololactone)的简单青霉菌；并提供了使用该简单青霉菌生物合成1，2-二氢睾内酯的方法，其特征是，以具有4-烯-3-酮或5-烯-3-醇的C21和C19类甾体底物，利用简单青霉(Penicilliumsimplicissimum)生物转化得到1,2-二氢睾内酯。
为实现本发明目的，本发明技术方案如下：
本发明提供一株能生物合成1，2-二氢睾内酯的简单青霉(Penicilliumsimplicissimum)WY134-2，该菌株已于2013年8月12日在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为Penicillium simplicissimum，保藏编号为CGMCC NO.8017。菌株简单青霉(Penicilliumsimplicissimum)WY134-2是从四川省都江堰市青城山采集的土壤中分离、筛选得到的一株真菌。
所述简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134-2的形态特征如下：该菌株在PDA固体培养基上生长迅速，菌落圆形，扩展，厚绒状，白色菌丝。菌落表面平坦，菌落背面无色或黄色。孢子呈粉状覆盖在菌落的表面，整个菌落与培养基结合很紧密。显微镜下观察菌丝体透明，分生孢子梗呈扫帚状，分生孢子椭圆形，表面光滑呈青灰色，长径2.5～3μm。
该菌株的rDNA-ITS基因序列特征：其rDNA-ITS具有如序列表中所示的核苷酸序列，序列长度为559bp。
根据其形态特征及rDNA-ITS基因序列，鉴定该菌株为简单青霉(Penicilliumsimplicissimum)。
本发明以有如下结构通式和结构式的甾体化合物做底物，利用上述的简单青霉进行生物转化制备1，2-二氢睾内酯(testololactone)：
通式1表示具有4-烯-3-酮结构的甾体底物，其中R1为羰基、羟基或β-乙酰基；通式2表示具有5-烯-3-醇结构的甾体底物，其中R2为羰基或β-乙酰基。
上述菌株简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134-2转化甾体底物为1,2-二氢睾内酯的方法，包括以下步骤：
(1)种子与发酵培养：取简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134-2菌种接种于一级种子培养基中，30℃，200～300r／min培养16h-20h，得到种子培养液。以接种量3％～5％转接于新鲜的发酵培养基，30℃，200～250r／min进行二级发酵培养，培养16～20h得到菌体发酵液。
(2)转化反应：将底物粉碎投入菌体发酵液中，投料浓度为1～3g／L，28～31℃，250r／min转化24～48h终止反应。上述粉碎投料时，向发酵液中加入促溶剂，所述促溶剂为吐温80。
(3)产物的提取与精制：步骤(2)转化反应结束后，加入浓盐酸调节pH至1.0～2.0，40℃，振荡24h，用乙酸乙酯萃取发酵液数次，合并萃取液，干燥，减压浓缩，浓缩后采用硅胶色谱柱分离得到1,2-二氢睾内酯。
所述的生物转化所用的培养基采用以下配比：
种子培养基：葡萄糖30g／L，玉米浆干粉10g／L，NaNO32g／L，KCl0.5g／L，K2HPO4·3H2O2g／L，KH2PO41g／L，MgSO4·7H2O0.5g／L，FeSO4·7H2O0.02g／L，pH6.2。
发酵培养基：葡萄糖30g／L，玉米浆干粉10g／L，NaNO32g／L，KCl0.5g／L，K2HPO4·3H2O2g／L，KH2PO41g／L，MgSO4·7H2O0.5g／L，FeSO4·7H2O0.02g／L，pH8.0。
本发明的有益效果：1、本发明所提供的菌种生长速度快，且易于培养和保存，接种后12h即进入对数期，24h到达稳定期。催化稳定，对甾体底物转化能力强，转化率高，达到70-100％；2、本发明所提供的1,2-二氢睾内酯(testololactone)的制备方法简单方便、条件温和、环境友好，副产物少，能以较高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，产物收率可达 到56-96％。
附图说明
图1所示的是简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134-2的孢子形态图；
图2所示的是基于rDNA-ITS序列，简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134-2与相关菌株系统进化树的图。
具体实施方式
下面的实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1：菌株的筛选与鉴定
从四川省都江堰青城山、天津市蓟县山区、山东潍坊等地采集土样，称取各种土样5g分别悬浮于无菌水中，振荡混匀后静置。从中取上清稀释涂于PDA固体培养基上，分离平板上的霉菌，将获得的单菌转接到PDA培养基制成的斜面保藏，并用于转化实验。
分别将上述得到的单个霉菌接种至液体转化培养基(葡萄糖30g/L，玉米浆干粉10g／L，NaNO32g／L，KCl0.5g／L，K2HPO4·3H2O2g／L，KH2PO41g／L，MgSO4·7H2O0.5g／L，FeSO4·7H2O0.02g／L，pH6.2)中，30℃，200r／min摇床上振荡培养24～48h，加入0.5g／L17α-羟基孕酮开始反应，分别转化24h，48h，72h后取样分析。取一定体积的发酵液，用等体积的乙酸乙酯萃取两次，每次涡旋振荡10min以萃取充分，12000r／min离心1min，取上清并合并萃取液，进行薄层色谱(TLC)分析。
通过上述方法筛选得到一株转化能力强，定向性好的菌株。该菌株菌落圆形，扩展，厚绒状，白色菌丝。菌落表面平坦，菌落背面无色或黄色。孢子呈粉状覆盖在菌落的表面，整个菌落与培养基结合很紧密。显微镜下观察菌丝体透明，分生孢子梗呈扫帚状，分生孢子椭圆形，表面光滑呈青灰色，长径2.5～3μm，如图1所示。进一步以该菌株的总DNA为模板，用rDNA-ITS基因的通用引物进行PCR扩增，得到扩增片段进行回收、测序。经测序，其序列如序列表所示，该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比对分析，并从数据库获得相关种属rDNA-ITS序列，构建系统发育树，如图2所示。根据形态特征及其rDNA-ITS基因序列，鉴定该菌株为简单青霉(Penicillium simplicissimum)。
实施例2：以孕甾-4-烯-3,20-二酮为底物合成1,2-二氢睾内酯(testololactone)的方法
1制备种子液
取简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134-2菌种接种于一级种子培养基中，于30℃培养16h，摇床转速300r／min，得到种子培养液。
所述种子培养基的成分为：葡萄糖30g／L，玉米浆干粉10g／L，NaNO32g／L，KCl0.5g／L，K2HPO4·3H2O2g／L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g／L，FeSO4·7H2O0.02g／L，pH6.2。
2二级发酵培养
将步骤1得到的种子培养液按接种量3％转接于新鲜的发酵培养基中，培养条件：30℃，摇床转速250r／min，发酵时间20h，即得到菌体发酵液。
所述发酵培养基的成分为：葡萄糖30g／L，玉米浆干粉10g／L，NaNO32g/L，KCl0.5g／L，K2HPO4·3H2O2g／L，KH2PO41g／L，MgSO4·7H2O0.5g／L，FeSO4·7H2O0.02g／L，pH8.0。
3转化反应
在菌体发酵液中加入用吐温80促溶的孕甾-4-烯-3,20-二酮I，底物浓度为3g／L，28℃，250r／min转化24h后终止反应。
4产物的提取与鉴定
反应结束后，向发酵液中加入浓盐酸调节pH至1.0，40℃，振荡24h，再用乙酸乙酯萃取发酵液数次，合并萃取液，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，浓缩后采用硅胶色谱柱分离产物，洗脱液为乙酸乙酯：石油醚=1：3，得到产物1,2-二氢睾内酯，产率为96％。结构如下所示：
实施例3：以17β-羟基-雄甾-4-烯-3-酮为底物合成1，2-二氢睾内酯(testololactone)的方法
1制备种子液
取简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134-2菌种接种于一级种子培养基中，于30℃培养20h，摇床转速200r／min，得到种子培养液。
所述种子培养基的成分如实施例2所示。
2二级发酵培养
将步骤1得到的种子培养液按接种量4％转接于新鲜的发酵培养基中，培养条件：30℃，摇床转速220r／min，发酵时间18h，即得到菌体发酵液。
所述发酵培养基的成分如实施例2所示。
3转化反应
在菌体发酵液中加入用吐温80促溶的17β-羟基-雄甾-4-烯-3-酮II，底物浓度为3g／L，31℃，250r／min转化24h后终止反应。反应结束后，向发酵液中加入浓盐酸调节pH至1.0，40℃，振荡24h，再用乙酸乙酯萃取发酵液数次，合并萃取液，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，浓缩后采用硅胶色谱柱分离产物，洗脱液为乙酸乙酯：石油醚=1：3，得到产物1，2-二氢睾内酯，产率为93％。结构如下所示：
实施例4：以3β-羟基-5-雄烯-17-酮为底物合成1,2-二氢睾内酯(testololactone)的方法
1制备种子液
取简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134-2菌种接种于一级种子培养基中，于30℃培养18h，摇床转速250r／min，得到种子培养液。
所述种子培养基的成分如实施例2所示。
2二级发酵培养
将步骤1得到的种子培养液按接种量5％转接于新鲜的发酵培养基中，培养条件：30℃，摇床转速200r／min，发酵时间16h，即得到菌体发酵液。
所述发酵培养基的成分如实施例2所示。
3转化反应
在菌体发酵液中加入用吐温80促溶的3β-羟基-5-雄烯-17-酮III，底物浓度为2g／L，30℃，250r／min转化24h后终止反应。反应结束后，向发酵液中加入浓盐酸调节pH至1.0，40℃，振荡24h，再用乙酸乙酯萃取发酵液数次，合并萃取液，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，浓缩后采用硅胶色谱柱分离产物，洗脱液为乙酸乙酯：石油醚=1：9，得到产物1，2-二氢睾内酯，产率为58％。结构如下所示：
实施例5：以17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮为底物合成1，2-二氢睾内酯(testololactone)的方法
同实施例4，将简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134-2进行一级培养和二级培养，在菌体发酵液中加入用吐温80促溶的17α-羟基孕甾-4-烯-3，20-二酮IV，底物浓度为1g／L，30℃，250r／min转化48h后终止反应。反应结束后，向发酵液中加入浓盐酸调节pH至1.0，40℃，振荡24h，再用乙酸乙酯萃取发酵液数次，合并萃取液，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，浓缩后采用硅胶色谱柱分离产物，洗脱液为乙酸乙酯：石油醚=1：3，得到产物1，2- 二氢睾内酯，产率为56％。结构如下所示：
以上实例中所得产物1，2-二氢睾内酯(testololactone)结构检测数据如下：
1H NMR：(600MHz，CDCl3)δ：1.09-1.16(1H，m)，1.17(3H，s，18-H3)，1.25-1.36(2H，m)，1.38(3H，s，19-H3)，1.40-1.41(1H，m)，1.53-1.59(1H，m)，1.65-1.83(4H，m)，2.00-2.08(4H，m)，2.33-2.46(4H，m)，2.56-2.62(1H，m)，2.68-2.73(1H，m)，5.76(1H，s，4-H).
HRMS(ESI)：C19H26O3[M+H]+：calcd.303.1960，found303.1952.

Claims (3)

1.简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.8017。
2.权利要求1所述简单青霉WY134-2的发酵培养方法，其包括以下步骤：
1)种子培养
将简单青霉(Penicillium simplicissimum)WY134-2接入灭菌后的种子液体培养基中，于30℃，200～300r/min培养16h～20h，得到种子液，
液体培养基的配制如下：葡萄糖30g/L，玉米浆干粉10g/L，NaNO32g/L，KCl0.5g/L，K2HPO4·3H2O2g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.02g/L，pH6.2；
2)发酵培养
将步骤(1)得到的种子液体按接种量3～5％接种到发酵培养基中进行发酵培养，培养条件：30℃，摇床转速200～250r/min，发酵时间16～20h，即得到菌体的发酵液，
所述发酵培养基的成分为：葡萄糖30g/L，玉米浆干粉10g/L，NaNO32g/L，KCl0.5g/L，K2HPO4·3H2O2g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeSO4·7H2O0.02g/L，pH8.0。
3.一种制备1，2-二氢睾内酯(testololactone)的生物合成方法，其特征是，以孕甾-4-烯-3，20-二酮或17β-羟基-雄甾-4-烯-3-酮或3β-羟基-5-雄烯-17-酮或17α-羟基孕甾-4-烯-3，20-二酮为底物，利用权利要求1所述简单青霉菌株通过如下步骤实现1，2-二氢睾内酯的制备：将1～3g/L上述底物加入到简单青霉菌发酵液中，于28～31℃，250r/min条件下，转化24～48h终止反应，加入浓盐酸调节pH至1.0～2.0，40℃，振荡24h，用乙酸乙酯萃取发酵液数次，合并萃取液，干燥，减压浓缩，浓缩后采用硅胶色谱柱分离得到1，2-二氢睾内酯。
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