CN101760494A - 一种采用静息细胞的雄烯二酮生物发酵方法 - Google Patents
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Abstract
一种采用静息细胞的雄烯二酮生物发酵方法，具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种的静息细胞，加入到植物甾醇转化液中进行第一次静息细胞转化反应，使转化液中的植物甾醇转化得到雄烯二酮/雄二烯二酮转化结束后，去除菌体细胞，将转化液经溶剂提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。在第一次静息细胞转化反应结束后，被去除的菌体细胞可以直接或经适当处理后，加入到第二批植物甾醇转化液中进行第二次静息细胞转化反应，使转化液中的植物甾醇转化得到雄烯二酮/雄二烯二酮后，去除菌体细胞，将转化液经溶剂与第一次静息细胞的转化液合并，通过溶剂提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。
Description
技术领域：
本发明涉及一种新的关于雄烯二酮及雄二烯二酮发酵工艺。本发明一种以所述雄甾化合物为活性成分的药物制剂及该雄甾化合物在制备治疗人或哺乳动物疾病的药物中的应用。
发明内容
雄甾4-烯-3，17-双酮(androst-4-ene-3，17-dione，简称：雄烯二酮或AD)是甾体激素类药物不可替代的中间体，对机体起着非常重要的调节作用。可以说几乎所有甾体激素药物都是以AD作为起始原料进行生产的。如用于生产性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮质激素，又可用于合成氢化可的松，氧化泼尼松，黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也是直接用于生产抗早孕米非司酮和各类计划生育用药的必不可少的基本原料。如今AD不断被一些发达国家用于开发和生产新的医药主品，如福美司坦(Formestane或Lentaron)，等及类固醇类激素免疫抗原等，目前全世界范围内，AD的应用领域日益拓宽，用AD做原材料生产的医药品种不断增加。
由于化学全合成雄烯二酮成本较高，国内外很多科学家一直研究如何通过生物发酵方法得到雄烯二酮。50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有双链的大豆甾醇和麦角甾醇为原料生产出雄甾-4-烯-3，17二酮(AD)及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)并以此作为合成甾体药物的原料。近年来，由于甾体药物应用量逐年增加，人们的目光又转到在动植物界中含量较多的胆甾醇，谷甾醇，菜油甾醇等，并被认为是具有巨大潜能的甾体激素类药物的起始原料。20世纪60年代中期，由Sih等首先发现有些微生物可以选择性降解切除甾醇的饱和侧链而得到AD和ADD，70年代初，日本的有马启利用微生物降解胆甾醇生产ADD获得成功，受到许多制药公司的高度重视。为了大量生产类固醇激素，研究者试图使用甾醇为唯一碳源分离微生物和改变甾醇结构用作发酵的底物，并用能防止甾醇核降解的化学添加剂来提高类固醇的收得率，这一努力已获得很大进展(Marsheck等，Aplied Microobiology，23(1)：72～77，1972)。此外，埃及国家研究中心生物与天然产品化学系的和Sallam等研究发现，利用磷酸盐缓冲液调节底物培养基pH值5.5～7.38可提高生物降解AD、ADD的转化率。由于AD与ADD结构非常类似，两者的混合物分离较为困难，而且在使用中AD的用途远多于ADD，AD也可以通过生物法得到ADD，所以科学家更希望通过控制生物转化，减少ADD的含量，更多得到高含量的AD。Upjohn公司在美国专利No.4,293,644中描述了一种通过分枝杆菌(ATCC 29472)的突变株从多种类固醇中得到以高产量的雄-4-烯-3，17-二酮(AD)为主，并有少量雄-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的产物的方法。以后的研究发现节杆菌，诺卡氏菌和分枝杆菌等微生物均可用于直接切除甾醇的饱和侧链，在一定条件下得到AD和ADD，这使得微生物转化工业化生产成为可能。近年来该工艺主要是通过菌种的改造，提高收率和含量，如WO9949075A1公开了一种植物甾醇向雄烯二酮(AD)和雄二烯二酮(ADD)的微生物转化方法，并具体公开以下技术特征：利用一种培养基增殖分枝杆菌属的分枝杆菌MB3683菌种；利用一种或多种增溶剂将植物甾醇组合物溶解成溶液；将分枝杆菌MB3683培养物和植物甾醇组合物溶液置于生物反应器中，并保持足够的时间，将植物甾醇组合物转化为AD和/或ADD。
以上工艺基本上采取生长细胞培养转化法，即是在微生物细胞培养前或培养一段时间后，将底物直接加到微生物培养基中，微生物在自身繁殖生长的同时对底物进行生物转化。这是生物转化法最简单和最常用的一种方法。该法的优点是微生物生物转化容易，缺点是产品的后发酵时间长，易产生多种产物，处理分离纯化困难。如CN03804973中说明按照1％的投料浓度时，植物甾醇转化为AD/ADD的时间在87-91小时，而且AD/ADD的比例一般为9/1。如果降低底物的投料浓度，反应时间可以缩短，但相应工业化成本会大大提高。
名为“一种采用静息细胞在浊点系统中进行生物转化”(CN200310108967)的中国专利中提到，利用分支杆菌Mycobacterium NRRL B-3683静息细胞在浊点系统发酵胆固醇得到1，4雄烯-3，17-酮。但是由于该浊点系统需要使用非离子表面活性剂如Triton X 100或114，这类表面活性剂一般价格较高，同时该专利发明人在《中国工程科学》2005年7卷5期73-78页《两相分配生物反应器——浊点系统在生物转化中的应用》中提到“有关大规模表面活性剂回收工艺的文献报道不多，进一步研究产物与浊点系统中表面活性剂的分离工艺对完善浊点系统在生物过程中的应用具有实际意义。”说明浊点系统中表面活性剂的回收问题尚未解决。而雄烯二酮、雄二烯二酮由于市场价格一般不超过800-900元/公斤，所以采用非离子表面活性剂形成的浊点系统进行生物转化，成本极高，实现工业化困难。
发明内容：
通过发明人的长时间科研，惊奇的发现采用微生物静息细胞直接降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮，可以不使用昂贵的非离子表面活性剂，可以较好的保证在较高的投料浓度下，反应时间缩短，提高反应效率。尤其是通过静息细胞可以进行二次发酵，可以提高菌种的使用效率，减少总体反应时间和能源、物料的消耗，有利于节能环保。更重要的是通过对生物转化时间的控制可以使植物甾醇更多的转化为雄烯二酮，减少雄二烯二酮的含量，便于产物的提纯和精制。
静息细胞转化法，是将微生物培养至一定阶段后分离出菌丝体，将其重新悬浮于缓冲液或不完全培养基(缺少某种营养物质如氮源等)中，使其处于不再生长但仍保持原有各种酶活的状态，然后添加底物，在适当温度、振荡条件下进行转化的方法。
本文中提到的分支杆菌是Mycobacterium。雄烯二酮/雄二烯二酮表示雄烯二酮和雄二烯二酮，以及雄烯二酮或雄二烯二酮。
一种微生物静息细胞降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮转化工艺，步骤如下：
具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种的静息细胞可直接或经适当处理后，加入到植物甾醇转化液中进行第一次静息细胞转化反应，使转化液中的植物甾醇转化得到雄烯二酮/雄二烯二酮转化结束后，去除菌体细胞，将转化液经溶剂提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。
在第一次静息细胞转化反应结束后，被去除的菌体细胞可以直接或经适当处理后，加入到第二批植物甾醇转化液中进行第二次静息细胞转化反应，使转化液中的植物甾醇转化得到雄烯二酮/雄二烯二酮后，去除菌体细胞，将转化液经溶剂与第一次静息细胞的转化液合并，通过溶剂提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。
优选第一次静息细胞转化反应时间不超过45小时。
微生物静息细胞的制作工艺为将具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种接种到培养液中，培养结束后，将培养液与菌体分离，所获菌体沉淀作为静息细胞。
微生物静息细胞的制作工艺为将具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种接种到含植物甾醇的培养液中，进行植物甾醇微生物转化发酵培养，同时不断添加底物植物甾醇到转化发酵培养液中，维持植物甾醇浓度在0.1％以上，转化发酵培养结束后，将转化发酵培养液与菌体分离，所获转化发酵培养液经溶剂提取，得到雄烯二酮/雄二烯二酮，所获菌体沉淀作为静息细胞。
转化液可以仅为水或磷酸盐的缓冲液。磷酸盐的缓冲液pH为6.5～8.0。
本文中所述的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer，PB)配制方法如下：
先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(PB)，根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。
(1)0.2mol/L的Na2HPO4；称取Na2HPO4.12H2O 31.2g(或NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。
(2)0.2mol/L的Na2HPO4：称取NaHPO4.·12H2O 71.632g(或Na2HPO4·7H2O 53.6g或Na2HPO4·2H2O 35.6g)加重蒸水至1000ml溶解。
0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5～8.0)
| pH | 0.2mol/L NaH2PO4(ml) | 0.2mol/L Na2HPO4(ml) |
| 6.5 | 68.5 | 31.5 |
| 6.6 | 62.5 | 37.5 |
| 6.7 | 56.5 | 43.5 |
| 6.8 | 51.0 | 49.0 |
| 6.9 | 45.0 | 55.0 |
| 7.0 | 39.0 | 61.0 |
| 7.1 | 33.0 | 67.0 |
| 7.2 | 28.0 | 72.0 |
| 7.3 | 23.0 | 67.0 |
| 7.4 | 19.0 | 81.0 |
| pH | 0.2mol/L NaH2PO4(ml) | 0.2mol/L Na2HPO4(ml) |
| 7.5 | 16.0 | 84.0 |
| 7.1 | 33.0 | 67.0 |
| 7.2 | 28.0 | 72.0 |
| 7.3 | 23.0 | 67.0 |
| 7.4 | 19.0 | 81.0 |
| 7.5 | 16.0 | 84.0 |
| 7.6 | 13.0 | 87.0 |
| 7.7 | 10.5 | 89.5 |
| 7.8 | 8.5 | 91.5 |
| 7.9 | 7.0 | 93.0 |
| 8.0 | 5.3 | 94.7 |
转化液也可以含有玉米浆或Refiner糖蜜之一及无机盐，其中优选玉米浆和无机盐；也可以仅含有无机盐。无机盐可以优选磷酸铵和硝酸钠，其比例优选磷酸铵∶硝酸钠为10∶40-99，可以利用无机碱调节PH至7.0-7.5。
转化液也可以加入磷酸盐、镁和/或亚铁离子、缓冲液，其中的一种或多种。
上述转化过程中植物甾醇可以进行粉碎或与溶剂混合后缓慢与转化液混合，便于植物甾醇与静息细胞接触。其中植物甾醇通过常规方法粉碎粒径D90≤100微米，优选D90≤10微米，更优选D90≤10微米。溶剂优选N，N-二甲基甲酰胺、四个碳以内的醇如甲醇和乙醇、六个碳以内的醚如乙醚和四氢呋喃。
静息细胞培养所使用的培养基为每升培养基含有玉米浆或Refiner糖蜜、无机盐，还可以增加糖，其中优选玉米浆，无机盐可以优选磷酸铵和硝酸钠，其比例优选磷酸铵∶硝酸钠为10∶40-99，糖优选葡萄糖，静息细胞可以用磷酸缓冲液洗涤，优选PH可以优选为6.5-7的磷酸缓冲液。每升培养基优选含有玉米浆5-50ml，无机盐4-10g，葡萄糖5-15g。培养基可以加入磷酸盐、镁和/或亚铁离子、缓冲液，其中的一种或多种。
微生物菌种的静息细胞直接或经适当处理加入到植物甾醇转化液中，直接使用是指是微生物培养结束后，直接从培养液经离心或过滤获得的菌体沉淀；使用经适当处理是指前述的菌体沉淀经40-90℃加热处理一段时间后所获得的死菌体；或是指前述的菌体沉淀经任意一种已知的固定化方法处理所获得的固定化菌体；或是指前述的菌体沉淀，通过细胞自溶、或细胞破碎等方法使酶释放到溶液中，通过离心或过滤等方法除去菌体细胞碎片后，所得的细胞酶提取液，或经硫酸按盐析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等纯化后的酶制剂。
上述具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种优选为分枝杆菌属(Mycobacterium)或诺卡氏菌属(Nocardia)，更优选分枝杆菌属(Mycobacterium)，更优选为NRRL B-3683，NRRL B-3805，NRRL B-8153。
菌种中提到的NRRL是美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service CultureCollection)的缩写，该中心是国际菌种保藏机构之一。
具体实施方式：
以下实施例的
无菌水是自来水灭菌(121℃持续20分钟)得到。
静息细胞的量以培养静息细胞培养液的量计算，例如静息细胞1L，相当于1L培养液过滤得到的菌丝的量。
转化液用二氯甲烷抽提，减压浓缩后稀释适当倍数，10000r/min离心除去可能的不溶物，然后采用天津科技大学学报第23卷第1期“气相色谱法测定植物甾醇发酵液中雄甾烯酮和植物甾醇的含量”中的方法进行检测AD、ADD。
实施例1
菌种：分枝杆菌：Mycobacterium fortuitum.NRRL B-3683。
1.1静息细胞培养方法
静息细胞培养基(每升)：
40ml玉米浆，5.2g NaNO3，0.8g NH4H2PO4，5.3g葡萄糖，其余为无菌水。
培养基量：200ml/烧瓶
接种物量：每200ml新培养基接种来自琼脂斜面的3ml细胞悬液
容器：1000ml锥形瓶
搅拌：振荡器(1”throw)200rpm
温度：30℃
生长时间：50小时培养
注解：如果在底部有黄色细胞沉淀形成则表示为良好的培养物生物
方法：
在培养基中制备用于生物转化的接种物。从琼脂料面(在玻璃试管中培养)接种锥形瓶，在无菌条件下进行接种，移取无菌水(5mL)到琼脂抖面上.用移液管末端轻轻刮下细菌培养物.然后移取该混悬培养物并放入锥形瓶中.在旋转振荡器上进行细菌增殖(200rpm，l″throw，30度)。在培养50小时后，过滤，用无菌水洗涤，得到菌丝，即静息细胞。
在操作中，还可以针对种子进行二级乃至三级培养，得到更多的静息细胞。
1.2菌体静息转化方法
甾体发酵转化液(每升)：
底物：10.0g植物甾醇(1.0％)粉碎粒径D90≤90微米。静息细胞量：0.5L。余量的无菌水。
无菌水用1M NaOH溶液(40g/L NaOH)调培养基的pH值至7.5，将转化液转移至生物反应器中，随后加热至40-50℃。
在烧杯中称重植物甾醇，倒入生物反应器中已加热的转化液中(40-50℃)，搅拌均匀，然后冷却至30℃，加入静息细胞，保持该温度进行生物转化，培养时间50小时，通气量0.3L/L/min，搅拌300rpm。
70小时后转化液中AD和ADD的含量是表1中的含量。
表1
注：AD：ADD是AD峰面积除以ADD峰面积的值。
实施例2
菌种：分枝杆菌.Mycobacterium fortuitum.NRRL B-3683。
2.1静息细胞培养方法
静息细胞培养基(每升)：
40ml Refiner糖蜜，5.2g NaNO3，0.8g NH4H2PO4，5.3g葡萄糖，1.5g植物甾醇(粉碎粒径D90≤90微米)，Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲液调pH至7.0，其余为无菌水。
培养基量：200ml/烧瓶
接种物量：每200ml新培养基接种来自琼脂斜面的3ml细胞悬液
容器：1000ml锥形瓶
搅拌：振荡器(1”throw)200rpm
温度：30℃
生长时间：72小时培养
注解：如果在底部有黄色细胞沉淀形成则表示为良好的培养物生物
方法：
在培养基中制备用于生物转化的接种物。从琼脂料面(在玻璃试管中培养)接种锥形瓶，在无菌条件下进行接种，移取无菌水(5mL)到琼脂抖面上.用移液管末端轻轻刮下细菌培养物.然后移取该混悬培养物并放入锥形瓶中.在旋转振荡器上进行细菌增殖(200rpm，l″throw，30度)。维持植物甾醇浓度在0.1％以上，在培养72小时后，过滤，用PH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤，得到菌丝，即静息细胞。
在操作中，还可以针对种子进行二级乃至三级培养，得到更多的静息细胞。
2.2菌体静息转化方法
甾体发酵转化液(每升)：
底物：20.0g植物甾醇(2.0％)粉碎粒径D90≤30微米。静息细胞量：0.75L。余量的无菌水。
无菌水用1M NaOH溶液(40g/L NaOH)调培养基的pH值至7.5，将转化液转移至生物反应器中，随后加热至40-50℃。
在烧杯中称重植物甾醇12g，倒入生物反应器中已加热的转化液中(40-50℃)，搅拌均匀，然后冷却至30℃，加入静息细胞进行第一次转化，保持该温度进行生物转化，通气量0.3L/L/min，搅拌300rpm，转化时间40小时；过滤得到静息细胞，再用PH为7.0的磷酸盐缓冲液洗涤后再次按照第一次转化的方法投入8g甾醇，进行第二次转化，转化时间为50小时，过滤得到的过滤液与第一次转化过滤得到的过滤液合并。
两次转化液合并后的AD和ADD的含量是表2中的含量。
表2
注：AD：ADD是AD峰面积除以ADD峰面积的值。
实施例3
菌种：分枝杆菌：Mycobacterium fortuitum.NRRL B-3805。
3.1静息细胞培养方法
静息细胞培养基(每升)：
10ml Refiner糖蜜，8.6g NaNO3，0.4g NH4H2PO4，4.8g葡萄糖，1.5g植物甾醇(粉碎粒径D90≤10微米)，Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲液调pH至7.0，其余为无菌水。
培养基量：200ml/烧瓶
接种物量：每200ml新培养基接种来自琼脂斜面的3ml细胞悬液
容器：1000ml锥形瓶
搅拌：振荡器(1”throw)200rpm
温度：30℃
生长时间：45小时培养
注解：如果在底部有黄色细胞沉淀形成则表示为良好的培养物生物。
方法：
在培养基中制备用于生物转化的接种物。从琼脂料面(在玻璃试管中培养)接种锥形瓶，在无菌条件下进行接种，移取无菌水(5mL)到琼脂抖面上.用移液管末端轻轻刮下细菌培养物.然后移取该混悬培养物并放入锥形瓶中.在旋转振荡器上进行细菌增殖(200rpm，l″throw，30度)。维持植物甾醇浓度在0.1％以上，在培养45小时后，过滤，用PH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤，得到菌丝，即静息细胞。
在操作中，还可以针对种子进行二级乃至三级培养，得到更多的静息细胞。
3.2菌体静息转化方法
甾体发酵转化液(每升)：pH为7.0的磷酸盐缓冲液
底物：20.0g植物甾醇(2.0％)。静息细胞量：1L。余量的无菌水。
无菌水用1M NaOH溶液(40g/L NaOH)调培养基的pH值至7.5，将转化液转移至生物反应器中，随后加热至40-50℃。
在烧杯中称重植物甾醇全溶于N，N-二甲基甲酰胺中，倒入生物反应器中已加热的转化液中(40-50℃)，搅拌均匀，然后冷却至30℃，加入静息细胞进行第一次转化，保持该温度进行生物转化，通气量0.3L/L/min，搅拌300rpm，转化时间45小时；过滤得到滤液。
过滤后转化液合并后的AD和ADD的含量是表3中的含量。
表3
注：AD：ADD是AD峰面积除以ADD峰面积的值。
实施例4
菌种：分枝杆菌：Mycobacterium fortuitum.NRRL B-8153。
4.1静息细胞培养方法
静息细胞培养基(每升)：
40ml玉米浆，5.2g NaNO3，0.8g NH4H2PO4，2g葡萄糖，1.5g植物甾醇(粉碎粒径D90≤30微米)，Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲液调pH至7.0，其余为无菌水。
培养基量：200ml/烧瓶
接种物量：每200ml新培养基接种来自琼脂斜面的3ml细胞悬液。
容器：1000ml锥形瓶
搅拌：振荡器(1”throw)200rpm
温度：30℃
生长时间：72小时培养
注解：如果在底部有黄色细胞沉淀形成则表示为良好的培养物生物。
方法：
在培养基中制备用于生物转化的接种物。从琼脂料面(在玻璃试管中培养)接种锥形瓶，在无菌条件下进行接种，移取无菌水(5mL)到琼脂抖面上.用移液管末端轻轻刮下细菌培养物.然后移取该混悬培养物并放入锥形瓶中.在旋转振荡器上进行细菌增殖(200rpm，l″throw，30度)。在培养72小时后，维持植物甾醇浓度在0.1％以上，过滤，用PH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤，得到菌丝，即静息细胞。
在操作中，还可以针对种子进行二级乃至三级培养，得到更多的静息细胞。
4.2菌体静息转化方法
甾体发酵转化液(每升)：PH为7.5的磷酸盐缓冲液。
底物：20.0g植物甾醇(2.0％)。静息细胞量：1L。余量的无菌水。
无菌水用1M NaOH溶液(40g/L NaOH)调培养基的pH值至7.5，将转化液转移至生物反应器中，随后加热至40-50℃。
在烧杯中称重植物甾醇10g全溶于乙醇中，倒入生物反应器中已加热的转化液中(40-50℃)，搅拌均匀，然后冷却至30℃，加入静息细胞进行第一次转化，保持该温度进行生物转化，通气量0.3L/L/min，搅拌300rpm，转化时间45小时；过滤得到静息细胞，再用PH为7.0的磷酸盐缓冲液洗涤后再次按照第一次转化的方法对剩余10g甾醇进行第二次转化，转化时间为45小时，过滤得到的过滤液与第一次转化过滤得到的过滤液合并。
过滤后转化液合并后的AD和ADD的含量是表1中的含量。
表4
注：AD：ADD是AD峰面积除以ADD峰面积的值。
实施例5
菌种：诺卡氏菌：Nocardia.aliena MCI-0710(JP54067098，JP54067099中介绍)
5.1静息细胞培养方法
静息细胞培养基(每升)：
40ml玉米浆，5.8g NaNO3，0.5g NH4H2PO4，4.3g葡萄糖，Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲液调pH至7.0，其余为无菌水
Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲液调pH至7.0
培养基量：200ml/烧瓶
接种物量：每200ml新培养基接种来自琼脂斜面的3ml细胞悬液
容器：1000ml锥形瓶
搅拌：振荡器(1”throw)200rpm
温度：30℃
生长时间：50小时培养
注解：如果在底部有黄色细胞沉淀形成则表示为良好的培养物生物
方法：
在培养基中制备用于生物转化的接种物。从琼脂料面(在玻璃试管中培养)接种锥形瓶，在无菌条件下进行接种，移取无菌水(5mL)到琼脂抖面上.用移液管末端轻轻刮下细菌培养物.然后移取该混悬培养物并放入锥形瓶中.在旋转振荡器上进行细菌增殖(200rpm，l″throw，30度)。在培养50小时后，过滤，用无菌水洗涤，得到菌丝，即静息细胞。
在操作中，还可以针对种子进行二级乃至三级培养，得到更多的静息细胞。
5.2菌体静息转化方法
甾体发酵转化液(每升)：
底物：15g植物甾醇(1.0％)粉碎粒径D90≤90微米。静息细胞量：0.7L。余量的无菌水。
无菌水用1M NaOH溶液(40g/L NaOH)调培养基的pH值至7.5，将转化液转移至生物反应器中，随后加热至40-50℃。
在烧杯中称重植物甾醇，倒入生物反应器中已加热的转化液中(40-50℃)，搅拌均匀，然后冷却至30℃，加入静息细胞，保持该温度进行生物转化，培养时间60小时，通气量0.4L/L/min，搅拌300rpm。
60小时后转化液中AD和ADD的含量是表5中的含量。
表5
注：AD：ADD是AD峰面积除以ADD峰面积的值。
Claims (10)
1.一种微生物静息细胞降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮转化工艺，步骤如下：
具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种的静息细胞可直接或经适当处理后，加入到植物甾醇转化液中进行第一次静息细胞转化反应，使转化液中的植物甾醇转化得到雄烯二酮/雄二烯二酮转化结束后，去除菌体细胞，将转化液经溶剂提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。
2.如权利要求1所述，其特征在于第一次静息细胞转化反应结束后，被去除的菌体细胞可以直接或经适当处理后，加入到第二批植物甾醇转化液中进行第二次静息细胞转化反应，使转化液中的植物甾醇转化得到雄烯二酮/雄二烯二酮后，去除菌体细胞，将转化液经溶剂与第一次静息细胞的转化液合并，通过溶剂提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。
3.如权利要求2所述，其特征在于第一次静息细胞转化反应时间不超过45小时。
4.如权利要求1所述，其特征在于微生物静息细胞的制作工艺为将具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种接种到培养液中，培养结束后，将培养液与菌体分离，所获菌体沉淀作为静息细胞。
5.如权利要求1所述，其特征在于微生物静息细胞的制作工艺为将具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种接种到含植物甾醇的培养液中，进行植物甾醇微生物转化发酵培养，同时不断添加底物植物甾醇到转化发酵培养液中，维持植物甾醇浓度在0.1％以上，转化发酵培养结束后，将转化发酵培养液与菌体分离，所获转化发酵培养液经溶剂提取，得到雄烯二酮/雄二烯二酮，所获菌体沉淀作为静息细胞。
6.如权利要求3或4所述，其特征在于静息细胞培养所使用的培养基为每升培养基含有玉米浆或Refiner糖蜜、无机盐，还可以增加糖，其中优选玉米浆，无机盐可以优选磷酸铵和硝酸钠，其比例优选磷酸铵∶硝酸钠为10∶40-99，糖优选葡萄糖，静息细胞可以用磷酸缓冲液洗涤。
7.如权利要求1所述，其特征在于植物甾醇可以进行粉碎或与溶剂混合后缓慢与转化液混合，便于植物甾醇与静息细胞接触。
8.如权利要求1所述，其特征在于微生物菌种的静息细胞直接或经适当处理加入到植物甾醇转化液中，直接使用是指是微生物培养结束后，直接从培养液经离心或过滤获得的菌体沉淀；使用经适当处理是指前述的菌体沉淀经40-90℃加热处理一段时间后所获得的死菌体；或是指前述的菌体沉淀经任意一种已知的固定化方法处理所获得的固定化菌体；或是指前述的菌体沉淀，通过细胞自溶、或细胞破碎等方法使酶释放到溶液中，通过离心或过滤等方法除去菌体细胞碎片后，所得的细胞酶提取液，或经硫酸按盐析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等纯化后的酶制剂。
9.如权利要求1-8所述，其特征在于具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种为分支杆菌。
10.如权利要求9所述，其特征在于降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种为NRRL B-3683，NRRL B-3805，NRRL B-8153。
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