JPH022395A - ９α―ヒドロキシ―１７―ケトステロイドの微生物学的製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発胡は、マイコバクテリウム属の新しい微生１勿を用
いた、９α−ヒドロキシ−１７−ケトステロイド類の製
造法に関するものである。

〔発明の背景〕

ステロイド分子は微生物によって変換されることが良く
知られている（ＩＩｌ、　　シャー　−−−（Ｃｈａｒ
ｎｅｙ）、Ｈ，Ｌ、　　ハーゾク（）Ｉｅｒｚｏｇ）　
、ステロイド類の微生物による変換）。繁雑で高洒な化
学過程と置換するために、微生物によるステロイド類の
変換を用いた多くの方法が開発されてきた。有用なステ
ロイド中間体の安価な製造源としては、豊富に人手でき
るステロール類、例えばコレステロール及びシトステロ
ールがある。微生物としては、これらのステロイド類を
炭素源として利用できるものが選ばれてきた。例えばオ
ランダ特許公報ＮＬ６５１３７１８およびＮＬ６７０５
４９０など、いくつかの特許出願においては、ステロイ
ド核を保存した、Ｃ−１７側鎖の微生物による分解が報
告されている。米国特許第３６８４６５７号、第３７５
９７９１号又は第４３４５０２９号で報告されているよ
うに、特異的インヒビター化合物およびその後に、特別
に開発した変異株を用いて、治療に有用なステロイド類
の合成の原料となる、アンドロスト−４−エン−３，１
７−ジオンおよびアンドロスタ−１，４−ジエン−３，
１７−ジオンを高収率で製造することが可能である。

微生物学的に合成したステロイド類の中で、９−α−ヒ
ドロキシ−１７−ケトステロイド類は、コルチコステロ
イド類の合成のための価値ある原料化合物であることか
ら重要である（ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミ
ストリー（Ｊ、Ｏｒｇ。

Ｃｈｅｍ、）　（１９７９年）４４巻、１５８２頁）。

コルチコステロイド頒に必要な、Ｃ−１１への水酸基、
及び場合によっては、Ｃ−９へのハロゲン原子の導入は
、このタイプの化合物とは異なり、容易で、よく知られ
た方法で行なわれる。

上記タイプの好ましい化合物には、始めてジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテｄＪ、Ａｍｅ
ｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）　　８０巻（１９５８年
）６１４８頁に報告された９α−ヒドロキシアンドロス
ト−４−エン−３，１７−’；オンがアル。それは、抗
アンドロゲン、及び抗エストロゲン活性を有するが、こ
れは主に医療的に価値のあるコルチコステロイド類の合
成中間体として用いられる（例えばヨーロッパ特許出願
Ｅ　Ｐ　−Ａ　−０２６３５６９参照）。

次に示す特許公報では、９α−ヒドロキシ−１フーケド
ステロイド類、特に、９α−ヒドロキシアンドロスト−
４−エン−３，１７−ジオンを得るいくつかの方法が公
開されている。

ａｌ例えばノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄ　ｉａ）属（米
国特許４３９７９４７）又は、コリネスポラ・カシコラ
（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ　ｃａｓｓｉｃｏｌａ）　株
（ヨー０ツバ特許出願ＥＰ−Ａ−００２７８２９）を用
いて、アンドロスト−４−エン−３，１７−ジオンから
出発する、９−α−ヒドロキシ基の微生物学的導入。

ｂ、米国特許３７５９７９１　　（例６及び７）は、マ
イコバクテリウム（！、ｆｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ
）　株でのステロイド類の発酵後の培地中に、９α−ヒ
ドロキシアンドロスト−４−エン−３，１７−ジオンが
存在することを報告している。米国特許４０３５２３６
によれば、収率はかなり低いが、マイコバクテリウム・
ホルツイタム（！Ｊ　ｙ　ｃ　ｏ　−ｂａｃｔｅｒｉｕ
ｒｎ　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）　　ＮＲＲＬ　　Ｂ　−８
１１９は、ステロール類のＣ−１７側鎖及び同時に９α
−ヒドロキシ基の導入を行うことができる。

インキュベーション中、目的産物がさらに徐々に分解す
ることを主因とする低収率は別にして、この方法の欠点
は、この微生物が便宜的病原（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔ
ｉｃ　ｐａｔｈｏｇｅｎ）であるということである。

Ｃ０東ドイツ特許２３２１６７は、マイコバクテリウム
・ホルツィ９　Ａ（、’ｌｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）　１５１０株（Ｚ　ＩＭ’ＥＴ　
１０８４９）にょる９α−ヒドロキシアンドロスト−４
−エン−３，１７−ジオンの製造を公開している。特別
な性質により、よく分散させた疎水佐有機ポリマーを発
酵培地に加えることにより、収率が４０〜５０％上昇し
た。

ｄ、マイコバクテリウム（！Ｊｙｃｏｂａｃｔｅｒ　ｉ
ｕｍ）株を用いることによる、ステロール類とは異なる
９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−３゜１７−
ジオンの製法も、日本特許出願ＪＰ５５／８５３９７に
報告されているが、収率は低い。

ｅ、１９８８年６月２日に公開された英国特許出願ＧＢ
−２１９７８６９によると、９α−ヒドロキシアンドロ
スト−４−エン−３，Ｌ７−ジオンの生産が、新しいマ
イコバクテリウム・ロセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ）種の株を用いたステロール発酵に
より効果的に行うことができる。１００ｇのステロール
から２８．５　ｇの産物が得られた。

〔発明の開示〕

本発明は、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
　ｉｕｍ）属の新しい微生物を用い、５〜１０個の炭素
原子を含むＣ−１７炭素側鎖を特徴とするステロイド類
を９α−ヒドロキシ−１７−ケトステロイド類へ、特に
種々のステロール類から、９α−ヒドロキシアンドロス
ト−４−エン−３，１７−ジオンへ変換する発酵法を提
供する。この発酵法によれば希望のステロイド類を選択
的かつ高収率で生産できる。

（微生物） 米国特許３７５９７９１で報告されているように、マイ
コバクテリウム・スピーシーズ（Ｍ　ｙ　ｃ　。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｐｅｃｉｅｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−
３８０５の培養物から新しいマイコバクテリウム株が得
られた。

マイコバクテリウム・スピーシーズＮＲＲＬ−Ｂ−３８
０５は、米国特許４３４５０２９第２欄、３４〜４０行
から明らかなように、マイコバクテリウム・バカｊ−（
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖａｃｃａｅ）の−船釣
特徴を示す。マイコバクテリウム・スピーシーズＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−３８０５は、高収率でステロール類をアンドロ
スト−４−エン−３，１７−’；オンに変換する。

ＮＲＲＬ−Ｂ−３８０６を、β−シトステロール及びア
ンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンの混合
物を含む培地中で子世代増殖させることにより選択操作
にかけた。この操作により最終的にマイコバクテリウム
・スピーシーズと命名した新しい株を調製し、１９８６
年１１月２４日、セントラル・ブリニー・ボア・シメル
力ルチャーズに（Ｃｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖ
ｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍ＋＋＋ｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ。

Ｐ、０．ＢＯＸ　２７３．　３７４０　ＡＧ　Ｂａａｒ
ｎ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）第ＣＢＳ４８
２．８６号で寄託した。親株マイコバクテリウム・スピ
ーシーズＮＲＲＬ−Ｂ−３８０５から新しい種を区別す
る最も顕著な特性は、ステロイド類を安定に９α−ヒド
ロキシステロイド頚に変換する能力である。

新しいマイコバクテリウム・スピーシーズＣＢＳ４８２
、８６は、コロニーの色や形で、上述のマイコバクテリ
ウム・ホルツイタムＮＲＲＬＢ−８１１９と明確に区別
される。それらは、通常のＡＰＩ−２０Ｂテスト検定法
を用いたとき、生化学的性質に関し、わずか約７５％の
類似性しか有していないようだ。さらに第１表を参照せ
よ。さらに、上記マイコバクテリウム・ホルツイタムと
は対照的に、新しいマイコバクテリウム株は、ステロー
ル分子の８０％にも昇る、驚くべき高い変換率を示す。

さらに、通常の発酵条件下、それは主産物である９α−
ヒドロキシアンドロスト−４−ニンー３．１７−ジオン
をさらに分解せず、従って、その発酵液中に蓄積してい
き、それを従来法により高収率で容易に単離することが
できる。

（基　質） ９α−ヒドロキシ−１７−ケトステロイド類の製造のた
め、この新しいマイコバクテリウム・スピーシーズ（！
、ｌｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｐｅｃｉｅｓ）は種
々の基質、特に、コレステロール、α＋　　Ｘはβ−シ
トステローノペスチグマステロール、カンペステロール
、エルゴステロール、コールＬＩＪトコール酸、ｌＬ１
２−デヒドロ−リトコール酸、及びコレスト−４−エン
−３−オンのような、５〜１０個の炭素原子を有するＣ
−１７側鎖をもつステロイド類を利用することができる
。得られた発酵液中、例えば３−ケト−デルタ−４ステ
ロイド頌又は３−ケト−デルタ−１，４ステロイド頚の
ようなそのいくつかはＣ−１７上にヒドロキシイソプロ
ピル基を有する、９α−ヒドロキシ基を欠いた少量の副
産物が見い出されることがある。基質の種類に依存して
、そのようなｇす産物には、例えば、アンドロスト−４
−エン−３，１７−ジオン、アンドロスタ−１，４−ジ
エン−３，１７ジオン、９α−ヒドロキシ−２０−ハイ
ドロキシメチルプレダン−４−エン−３−オンなどがあ
る。

また、上述のＣ−１７−置換ステロイド類の混合１’ｌ
Ｊ、例文ｌｆ、５８％β−シトステロール、５％カンペ
ステロール及び２５％スチグマステロールと１２％のそ
の池の化合物を含む、大豆由来の既知混合物なども基質
に適している。９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エ
ン−３，１７−ジオン製造のための好ましい基質は、ス
テロール、特にβ−シトステロールであるが、リトコー
ル酸も適している。その池の種々のＣ−１７−置換ステ
ロイド基質も、新しいマイコバクテリウム株を用いて、
本目当する９α−ヒドロキシ−１７−ケトステロイド類
に変換される。

表　　１ マイコバクテリウム・スピーシーズＣＢＳ４８２．８６
、マイコバクテリウム・スピーシーズＮＲＲＬ−Ｂ−３
８０５及びマイコバクテリウム・ホルツイタムＮ　ＲＲ
Ｌ　−Ｂ−８１１９の特性 λ１．スど−シーズ　　　　ｊ、１．スど−シーズ　　
　　Ｖ、ホルツイタムｃａｓ　　４８２．８６　　　Ｎ
ＲＲＬ−８−３８０５ＮＲＲＬ−８−１ｔ９ＡＰ　Ｉ−
２０Ｂテスト ゼラチン・ダンバク　分解 亜硝酸塩 β−ガラクトシダーゼ 酸生産 サッカロース しく＋）アラビノース マンニトール フラクトース グルコース マルトース デンプン 十　　　　　　　二 ｉ　　　　　　　　″ 二　　　　　　　　十 ＋ ＋ ＋ ラムノース ガラクトース マンノース ソルビトール グリセロール 一 インドール ウレアーゼ ＬＳ形成 アセトイン シモンズクエン酸塩 チトクロムオキシダーゼ カタラーゼ 増毎温度依存性　３７℃ ４０℃ ４５℃ マクコンキー寒天上 での増殖 色素沈着 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 十 ：ネガティブ；十：ポシティブ；　Ｗ：弱；Ｓ：暗所で
の色素沈着（スコトクロマゲン性）（方　法） 発酵は当分野でよく知られている方法で行なう。

その媒体は、インキュベーション中、培養物中に選択し
たステロイドを添加するか、または、接種前、栄養培地
中にそれを添加しておくことにより、マイコバクテリウ
ム・スピーシーズＣＢ　Ｓ　４８２．８６を培養して作
る。ステロイド基質は単独で添加することもあるし、ま
た、他のステロイドと組合せて用いることもできる。基
質は、懸濁物としてか、又は、例えばジメチルホルムア
ミドのような、適用な有機溶媒中に溶かして混合物に加
えることができる。培養培地中のステロイド濃度は０．
１〜１００ｇ／ｊ、好ましくは、０．５１５０ｇ／でで
あることが望ましい。培養物は、同化可能な炭水化物の
ような炭素源及び同化可能な窒素化合物又はタンパク質
性物質のような窒素源を含む栄養培地中で増殖される。

好ましい炭素源には、グルコース、赤砂糖、ショ糖、グ
リセリン、デンプン、特にコーンスターチ、ラクトース
、デキストリン及び糖みつが含まれている。好ましい窒
素源には、コーンスターチ液、イースト、固型ミルクを
含む自己分解した醸造イースト、大豆粉、綿実粉、コー
ン扮、固型ミルク、カゼインのパンクレア消化物、魚粉
、酒蒸留固型分、動物ペプトンリカー肉及び骨破片及び
アンモニア塩類が含まれる。これら炭素源及び窒素源を
組合せて使用した方が良い。培地の滅菌前に培地成分と
して水道水及び未精製原料を用いるなら、例えば亜鉛、
マグネシウム、マンガン、コバルト及び鉄のような微量
金、嘱を発酵培地に加える必要はない。

基質の所望の生成物への変換法は通常４８時間から１２
日間で終了する。この方法におけるインキュベーション
温度は、２０℃から３５℃の温度範囲、好ましくは３０
℃が用いられる。培養容器の内容物を好ましくは滅菌空
気で通気し、撹拌することにより微生物を増殖させ、そ
うすることにより、変換プロセスの効率を高揚した。

変換プロセスの完了がシリカゲルプレートによる薄層ク
ロマトグラフィーにより示されたら（Ｅ。

メルク　（！Ｊｅｒｋ）　、タルムスタット（Ｄａｒ＋
ｒ＋５ｔａｄｔ）　）、変換した目的産物を当分野でよ
く知られている手法で回収する。例えば、発酵液及び細
胞を含む発酵（変換）反応混合物から、非水溶性有機溶
媒を用いて、ステロイドを抽出することができる。溶媒
には、メチレンクロライド（好ましい）、クロロホルム
、四塩化炭素、エチレンクロライド、トリクロロエチレ
ン、ジエチルエーテノペ酢酸ペンチル、ベンゼン及びイ
ソブチルメチルケトンが適している。

それとは別に、発酵液と細胞を、例えば濾過や遠心など
の従来法で分離し、それからそれを別々に適当な溶媒で
抽出することができる。細胞は水溶性又は非水溶性溶媒
で抽出することができる。

細胞を含まない発酵液は、次いで当分野でよく知られて
いる方法で抽出することができる。

抽出物をケイソウ土で濾過し、その濾液を乾燥するまで
蒸留することができる。変換した目的とするステロイド
を含む残査を１０％クロロホルムメタノール溶液に溶か
し、つづいて、結晶が出現するまで、スチーム浴上、窒
素を通気して濃縮していくこともできる。その溶液を室
温にまで冷却し、濾過して純粋な沈殿ステロイドを取り
出す。

変換された目的ステロイドは、残りの上清から溶媒を蒸
発することによってさらに得ることができる（粗産吻）
。

変換の進行は、薄層プレートで追跡できるが、一方、定
量的データは、高速液体クロマトグラフィーカラムを用
い、メタノールで、培養液の混合物を分離することによ
って得ることができる。

得られた化合物の構造はＮＭＲ分析で確認することもで
きる。

発酵過程の生きたマイコバクテリウム（Ｍｙｃ。

ｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）細胞を用いる代りに、上述のマ
イコバクテリウム株の細胞から誘導される酵素調製物に
よっても、目的とする変換を行うことができる。

その調製物の１つとして回収が容易な固定化された酵素
がある。同様の変換を行い得る新規株マイコバクテリウ
ム・スピーシーズ（！、１ｙｃｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ
ｓｐｅｃｉｅｓ）　ＣＢ　Ｓ　４８２．８６の変異株又
は突然変異株も同様に本発明に用いることができる。

本発明はさらに、次に示す例で証明されるが、これは本
発明を制限するものとして理解すべきではない。

例の中では、次の略号を用いている。

ＡＤ　＝アンドロストー４−エンー３．１１−ジオン ＡＤＤ　：アンドロストー１．４−ジエンー３゜１７−
ジオン ９−［ＩＨ−Ａｎ：　９α−ヒドロキシアンドロスト−
４−エン−３，１７−ジオン ９−０Ｈ−１１１，ｌＰ：　　９α−ヒドロキシ−２０
−ヒドロキシメチルプレダン−４−エン−３ −オン 実施例１ 三角フラスコ（５００ｍ）中に、１００読の培地Ａを調
製する。

培地Ａ １０ｇ　　イースト抽出物（デイフコ）３．４ｇ　リン
酸２水素カリウム ４．０ｇ　　トウィーン８０Ｔ′４ １０００彪　蒸留水 ｐ）１７．０に調整 このフラスコを滅菌（１２０℃、２０分）し、３０℃に
冷却後、マイコバクテリウム・スピーシーズＣＢＳ４８
２．８６の懸濁液を接種する。接種した培地を、２８Ｏ
ｒｐｍのロータリーシェーカー上、３０℃で４８〜７２
時間インキュベートする。

つづいて、この培養物１０ｍをコレステロール（１００
ｍｇ）を？Ｎっだ１００ｄの新しい培地Ａに接種する。

コレステロールは次のように調製した、懸濁液として、
培地Ａに添加した。

２．５ｇ　コレステロール ４０ｇ　　ガラスピーズ（直径０．５ｃｍ）５０ｇ　　
蒸留水 ０．２５）ウィーン８０Ｔ８ を入れたセラムボトルを滅菌（１２０℃１．２０分）し
、室温で２００時間、ロータリーシェーカ（２８Ｏｒｐ
ｍ　）上で振盪する。接種した混合物を２８Ｏｒｐｍの
ロータリーシェーカー上、３０℃で１４４時間インキュ
ベートする。インキュベーションにつづいて、その培養
物をメタノールと混合し、濾過する。その濾液をＨＰＬ
Ｃで分析する。

培養培地中には、 ２５ｍｇ　　９−９−０Ｈ− ＡＤ６　　ＡＤ ）ｍｇ　　ＡＤＤ　　及び １ｍｇ　　９−ＯＨ−ＨＭＰ が同定された。

実施例２ 実施例１の操作におけるコレステロールを種々のステロ
イドに置き換えることにより、主産物として９−０Ｈ−
ＡＤを得ることができる。その収量を第■表に示す。

第■表 ９−０Ｈ−、八〇　　ＡＤ　　ＡＤＤ ｌｏｏ　　　　　　　３０　　１　　　＜１１００　　
　　　　　５０　　　　１　　　＜１１００　　　　　
　　　２６　　　　１　　　　＜１１００　　　　　　
　　　４５　　　　１　　　＜１１００　　　　　　　
　　３０　　　　１　　　＜１１００　　　　　　　　
　　１２　　　１１　　　　＜１α１−シトステロール β−７トステロール スチグマステロール カンペステロール エルゴステロール リ　　ト　　コ　　−　ル　酸 実施例３ 先の例（実施例１及び２）で述べたステロイド基質を例
えば実施例５の混合物のように、種々組合せて、発酵培
地に添加し、実施例１で述べたような操作を行った。主
産物は、９−０Ｈ−ＡＤであった。

実施例４ 実施例１のコレステロールｇ濁液の代りに、コレステロ
ール溶液（２，５ｍｉ！ｚタノール中、５０ｍｇ）を用
い、実施例と同様の操作により、主産物として９−０Ｈ
−ＡＤが得られた。

５ｍｇ　　９−０Ｈ−ＡＤ ｍｇＡＤ ＜１ｍｇＡＤＤ く１田ｇ　９−○Ｈ−ＨＭＰ 実施例５ 実施例１のコレステロール懸濁液の代りに、β−シトス
テローノベカンベステロール及びスチグマステロール（
およそ１０：５：１の比率で、総ステロール含量９０％
）を含む、粗シトステロール混合物の溶液（２，５ｍア
セトン中５０ｍｇ＞を用い、実施例１と同様の操作によ
り主産物として９−○Ｈ−ＡＤが得られた。収量は： １３ｍｇ　　９−０Ｈ−ＡＤ ｍｇＡＤ ＜１ｍｇＡＤＤ ＜　ｌ　ｍｇ　　９−９−０Ｈ−Ｈ であった。

実施例６ 実施例１のコレステロール懸濁液の代りに、コール酸を
用い、実施例１と同様の操作により、７α、９α、１２
α−トリヒドロキシアンドロスト−４−エン−３，１７
−ジオンが主産物として得られ、またいくつかの少量の
副産物も生成していることが、薄層クロマトグラフィー
で明らかとなった。主産物の構造は、ＮＭＲ分析で確認
した。

実施例７ 実施例１のコレステロールの代すｉ、ｌ：ｌ　１．　１
２−デヒドロ−リトコール酸を用いると、９−α−ヒド
ロキシアンドロスト−４，１１−ジエン−３゜１７−ジ
オンが主産物として得られ、またいくつかの少量の副産
物も生成していることが、薄層クロマトグラフィーで明
らかとなった。主産物の構造は、ＮＭＲ分析で確認した
。

実施例８ 実施例１で述べたように培地Ａ（２０００ｍＲ三角フラ
スコ中５００ｍ）に、マイコバクテリウム・スピーシー
ズＣＢＳ４８２．８６の培養液１０ｒｎＩ！を接種した
。この接種した混合物を、２０Ｏｒｐｍのロータリーシ
ェーカー上、３０℃で４８時間インキュベートした。こ
の培養物を１０βファーメンタ−用の接種物として用い
る。このファーメンタ−中の培地は、 ５０ｇ　　イースト抽出物（デイフコ）２０ｇ　トウィ
ーン８０” ２５００ｍＪｌ！　　蒸留水 （ｐＨ６，８に調整） を含んでいた。

この培地を滅菌しく１２０℃、４５分）、約３０℃に冷
却してから、リン酸２水素カリウム（蒸留水５００ｄ中
中子７）及び硫酸アンモニウム（蒸留水５００ｍ１中１
５ｇ）の滅菌（１２０℃、２０分）溶液を添加した。こ
の混合物に、例５で述べた粗β−シトステロール混合物
の懸濁液２０００ｇを添加した。ステロール懸濁液は次
のように調製した。

４個のセラムボトル（２０００ｄ）は各々次のものを含
んでいる ２５ｇ　　粗β−シトステロール ２００ｇ　ガラスピーズ（直径０．５ｃｍ）５００ｍｊ
！　　蒸留中 ４ｇ　　）ウィーン８０” この混合物を４５分間、１２０℃で滅菌し、ついで１５
（ｌｒｐｍのロータリーシェーカー上、室温で４００時
間振盪した。接種した混合物を撹拌反応器（６００ｒｐ
ｍ　）中、３０℃で培養し、その間無菌空気を１００β
／ｈの流量で培地に通気し、かつそのｐＨを、ＮＨ，Ｏ
Ｈ（蒸留水中５％、メンブレンフィルターで除菌）を用
いて、自動的にｐＨ７，０に保持した。７２時間後、ト
ゥイーン８０Ｔ０（５００ｇを蒸留水で２５００ｇとし
たもの）の供給を、１５ｇ／ｈの速度で開始した。この
発酵を２１６時間続け、その後、この発酵培地をメチレ
ンクロライドで抽出した。抽出物をケイソウ土で濾過し
、その濾液を乾燥するまで減圧蒸留した。

残査を１０％クロロホルムメタノール溶液にとかし、そ
れから結晶が析出するまで、スチームバス上で窒素を通
気してａＦＭした。その溶液を室温にまで冷却し、沈殿
したステロール頚を濾過して取り除いた。上清から、溶
媒をエバボレートすると徂β−ＯＨ−Ａ　Ｄ結晶が得ら
れた。粗結晶には３７．９ｇ　　９−０Ｈ−ＡＤ ２．９ｇＡＤ ＜０．１ｇ　　ＡＤＤ ０．２ｇ　　９−９−０Ｈ−Ｈ が含まれていた（ＨＰＬＣ検定）。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）５〜１０個の炭素原子を含む、Ｃ−１７側鎖を少
   なくとも１個有する１個以上のステロイド化合物を、好
   気培養条件下、栄養培地中、Ｃ−１７側鎖分解微生物又
   はその１個以上の酵素と反応させの作用に付し、かつ培
   養液から９α−ヒドロキシ−１７−ケトステロイドを回
   収する工程を含む９α−ヒドロキシ−１７−ケトステロ
   イド類の製造法であって、上記微生物がマイコバクテリ
   ウム種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐｅｃｉｅｓ
   ）ＣＢＳ４８２．８６、又はその突然変異株あるいは変
   異株であって、それと同じ変換を行いうるものでること
   を特徴とする上記製造法。
2. （２）ステロイド化合物が、α＿１−又はβ−シトステ
   ロール、スチグマステロール、コレステロール、コレス
   ト−４−エン−３−オン、カンペステロール、エルゴス
   テロール、コール酸、リトコール酸、１１，１２−デヒ
   ドロ−リトコール酸又はこれらの混合物から選ばれるこ
   とを特徴とする、請求項（１）記載の方法。
3. （３）９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−３，
   １７−ジオンを、好ましくはβ−シトステロールから製
   造することを特徴とする、請求項（１）もしくは（２）
   記載の方法。
4. （４）７α，９α，１２α−トリヒドロキシアンドロス
   ト−４−エン−３，１７−ジオンをコール酸から製造す
   ることを特徴とする、請求項（２）記載の方法。
5. （５）９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−３，
   １７−ジオンを１１，１２−デヒドロリトコール酸から
   製造することを特徴とする、請求項（２）記載の方法。
6. （６）マイコバクテリウム・スピーシーズＣＢＳ４８２
   ．８６。