DE3876769T2

DE3876769T2 - Mikrobiologische herstellung von 9-alpha-hydroxy-17-keto-steroiden.

Info

Publication number: DE3876769T2
Application number: DE8888202997T
Authority: DE
Inventors: Arthur Friedrich Marx; Harmen Slijkhuis
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1987-12-23
Filing date: 1988-12-23
Publication date: 1993-06-09
Anticipated expiration: 2008-12-24
Also published as: ES2052693T3; DE3876769D1; EP0322081B1; JPH022395A; EP0322081A1; US5166055A; GR3006578T3; JP2719377B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 9α- Hydroxy-17-ketosteroiden unter Verwendung eines neuen Mikro-Organismus des Genus Mycobacterium.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es ist bekannt, daß es Steroidmoleküle durch Mikroorganismen umgewandelt werden können (W. Charney, H. L. Herzog, Microbial Transformations of Steroids). Es wurden viele Verfahren unter Verwendung mikrobiologischer Umwandlungen von Steroiden entwickelt, um beschwerliche und kostspielige chemische Verfahren zu ersetzen. Eine billige Quelle für die Herstellung von nützlichen Steroidzwischenprodukten sind die reichlich zur Verfügung stehenden Sterine, beispielsweise Cholesterin und Sitosterin. Es wurden Mikroorganismen ausgewählt, welche in der Lage sind, diese Steroide als Kohlenstoffquelle zu benutzen. In mehreren Patentveröffentlichungen, z. B. niederländische Patentanmeldungen NL 6513718 und NL 6705450, ist der mikrobiologische Abbau der C-17-Seitenkette unter Erhaltung des Steroidkerns beschrieben. Mit spezifischen Inhibitorverbindungen und später auch mit speziell entwickelten Mutanten, wie beispielsweise in den US- Patenten 3 684 657, 3 759 791 oder 4 345 029 beschrieben, war es möglich, in hohen Ausbeuten Androst-4-en-3,17-dion und Androsta-1,4-dien-3,17-dion zu erhalten, welche Ausgangsverbindungen für die Synthese von therapeutisch nützlichen Steroiden sind.
Unter den mikrobiologisch hergestellten Steroiden sind 9α-Hydroxy-17-ketosteroide wichtig, da sie wertvolle Ausgangsverbindungen für die Herstellung von Corticosteroiden sind (J. Org. Chem. (1979), 44, 1582). Die notwendige Einführung einer Hydroxylgruppe am C-11 und gegebenenfalls eines Halogenatoms am C-9 in künftige Corticosteroide kann durch leichte, gut eingeführte chemische Reaktionen ausgehend von dieser Klasse von Verbindungen durchgeführt werden.
Eine bevorzugte Verbindung dieses Typs ist 9α-Hydroxyandrost- 4en-3,17-dion, das ursprünglich in J. Amer. Chem. Soc. 80 (1958), 6148, beschrieben ist. Es besitzt anti-androgene und anti-östrogene Wirksamkeit, wird jedoch hauptsächlich als Zwischenverbindung bei der Synthese von therapeutisch wertvollen Corticosteroiden verwendet (vgl. z. B. europäische Patentanmeldung EP-A- 0 263 569).
In den folgenden Patentveröffentlichungen sind verschiedene Methoden zur Erzielung von 9α-Hydroxy-17-ketosteroiden, besonders 9α-Hydroxy-androst-4-en-3,17-dion, geoffenbart:
a. Mikrobiologische Einführung der 9α-Hydroxylgruppe, ausgehend von Androst-4-en-3,17-dion unter Verwendung von beispielsweise einem Mikroorganismus des Genus Nocardia (US-Patent 4 397 947) oder eines Corynespora cassicola-Stammes (europäische Patentanmeldung EP-A-0 027 829).
b. Das US-Patent 3 759 791 (Beispiele 6 und 7) beschreibt die Anwesenheit von 9α-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion in der Brühe nach der Fermentation von Sterolen mit einem Mycobacterium-Stamm. Gemäß US-Patent 4 035 236 ist Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 in der Lage, obzwar in ziemlich niedriger Ausbeute, die C-17-Seitenkette von Sterolen abzubauen unter gleichzeitiger Einführung der 9α-Hydroxylgruppe. Neben der niedrigen Ausbeute, welche vorwiegend durch den allmählichen weiteren Abbau des gewünschten Produkts während der Bebrütung verursacht ist, ist es ein Nachteil dieses Verfahrens, daß der Mikroorganismus als ein opportunistisches Pathogen angesehen wird.
c. Das ostdeutsche Patent DD 232 167 beschreibt die Herstellung von 9α-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion durch den Stamm Mycobacterium fortuitum N10 (ZIMET 10849). Gemäß einem speziellen Merkmal stieg die Ausbeute auf 40-50 % durch Zusatz eines fein verteilten, hydrophoben organischen Polymeren zu dem Fermentationsmedium.
d. Die Herstellung von 9α-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion, ausgehend von Sterolen durch Verwendung eines Mycobacterium-Stammes, ist auch in der japanischen Patentanmeldung JP 55/85397 beschrieben, jedoch wird nur eine niedrige Ausbeute berichtet.
e. Gemäß der britischen Patentanmeldung GB-2 197 869, veröffentlicht am 2. Juni 1988, wird die Erzeugung von 9α-Hydroxyandrost- 4-en-3,17-dion bewirkt durch Sterolfermentation unter Verwendung eines Stammes der neuen Mycobacterium roseum-Species. Aus 100 g Sterin werden 28,5 g Produkt erhalten.

DIE ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung schafft ein Fermentationsverfahren unter Verwendung eines neuen Mlkroorganismus des Genus Mycobacterium, um Steroide, die durch eine C-17-Kohlenstoffseitenkette, enthaltend von 5-10 Kohlenstoffatomen einschließlich, charakterisiert sind, in 9α-Hydroxy-17-ketosteroide umzuwandeln und insbesondere 9α-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion aus verschiedenen Sterinen. Dieses Fermentationsverfahren kann die gewünschten Steroide selektiv und in hoher Ausbeute erzeugen.

DER MIKROORGANISMUS

Der neue Mycobacterium-Stamm wird erhalten ausgehend von einer Kultur der Mycobacterium-Species NRRL-B-3805, die im US-Patent 3 759 791 beschrieben ist. Die Mycobacterium-Species NRRL-B-3805 zeigt die allgemeinen Charakteristika von Mycobacterium vaccae, wie aus dem US-Patent 4 345 029, Spalte 2, Zeilen 34-40, ersichtlich ist. Die Mycobacterium-Species NRRL-B-3805 überführt Sterine in Androst-4-en-3,17-dion in hoher Ausbeute.
NRRL-B-3805 wurde einem Selektionsverfahren unterworfen, indem es für viele Generationen in Medien enthaltend ein Gemisch von β-Sitosterin und Androsta-1,4-dien-3,17-dion gezüchtet wurde. Dieses Verfahren erzeugte gegebenenfalls einen neuen Stamm, der als Mycobacterium-Species bezeichnet wurde und am 24. November 1986 beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, Niederlande, unter der Nummer CBS 482.86 hinterlegt wurde. Das augenfälligste Merkmal, welches die neue Species von ihrem ursprünglichen Stamm Mycobacterium species NRRL-B-3805 unterscheidet, ist seine Fähigkeit, Steroide dauerhaft in 9α- Hydroxysteroide zu überführen.
Die neue Mycobacterium-Species CBS 482.86 ist klar von dem oben erwähnten Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 hinsichtlich Farbe und Form der Kolonien unterschieden. Im Hinblick auf biochemische Eigenschaften scheinen sie bei Anwendung der üblichen API- 20B-Testversuche eine Ähnlichkeit von nur etwa 75 % zu besitzen. Vergleiche weiter Tabelle I. Außerdem kann im Gegensatz zu dem genannten Mycobacterium fortuitum der neue Mycobacterium-Stamm eine überraschend hohe Umwandlung, bis zu 80 % der Sterinmoleküle, erzeugen. Außerdem baut er unter den üblichen Fermentationsbedingungen das Hauptprodukt 9α-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion nicht weiter ab, das sich daher in der Fermentationsflüssigkeit ansammelt und leicht in hoher Ausbeute durch eingeführte Verfahren isoliert werden kann.

DIE SUBSTRATE

Zur Herstellung von 9α-Hydroxy-17-ketosteroiden ist die neue Mycobacterium-Species in der Lage, verschiedene Substrate zu verwenden, besonders Steroide mit einer C-17-Seitenkette mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie Cholesterin, α&sub1;- oder β-Sitosterin, Stigmasterin, Campesterin, Ergosterin, Cholsäure, Lithocholsäure, 11,12-Dehydro-lithocholsäure und Cholest-4- en-3-on. In der resultierenden Fermentationsflüssigkeit können kleine Mengen von Nebenprodukten ohne die 9α-Hydroxylgruppe gefunden werden, z. B. 3-Keto-delta-4-steroide oder 3-Keto-delta-1,4-steroide, wovon einige die Hydroxyisopropylgruppe am C-17 enthalten. Tabelle 1 Charakteristika von Mycobacterium species CBS 482.86, Mycobacterium species NRRL-B-3805 und Mycobacterium fortuitum NRRL-B-8119. API-20B-Test M. species CBS 482.96 M. species NRRL-B-3805 M. species NRRL-B-8119 Gelatinproteolyse Nitrite β-Galactosidase Säuren von Saccharose L(+)arabinose Mannit Fructose Glucose Maltose Stärke Rhamnose Galactose Mannose Sorbit Glyzerin Indol Urease H&sub2;S-Bildung Acetoin Simmons-Zitrat Cytochromoxidase Katalase Wachstum bei Wachstum auf Mac Conkey-Agar Pigmentierung - : negativ + : positiv W : schwach S : Pigmentierung sogar im Dunklen (scotochromogen)
In Abhängigkeit von der Art des Substrats sind beispielsweise folgende Nebenprodukte:
Androst-4-en-3,17-dion
Androsta-1,4-dien-3,17-dion
9α-Hydroxy-20-hydroxymethylpregn-4-en-3-on.
Mischungen der oben genannten C-17-substituierten Steroide sind auch geeignete Substrate, z. B. das bekannte Gemisch stammend aus Soja, enthaltend 58 % β-Sitosterin, 5 % Campesterin und 25 % Stigmasterin neben 12 % anderer Verbindungen. Zur Herstellung von 9α-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion ist das bevorzugte Substrat ein Sterin, besonders β-Sitosterin, jedoch ist auch Lithocholsäure geeignet. Verschiedene andere C-17-substituierte Steroidsubstrate können zu den entsprechenden 9α-Hydroxy-17-ketosteroiden unter Verwendung des neuen Mycobacterium-Stammes umgewandelt werden.

DAS VERFAHREN

Die Fermentation wird unter Verwendung von Methoden, welche auf diesem Gebiet gut bekannt sind, durchgeführt. Das Medium kann mit einer Züchtungskultur von Mycobacterium species CBS 482.86 hergestellt werden, entweder durch Zugabe des ausgewählten Steroids zu der Kultur während der Bebrütungsdauer oder durch Einverleibung derselben in das Nährmedium vor der Beimpfung. Das Steroidsubstrat kann einzeln zugegeben werden oder in Kombination mit einem anderen Steroid. Das Substrat kann zu dem Gemisch entweder als Suspension oder gelöst in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z. B. Dimethylformamid, zugesetzt werden. Die Konzentration des Steroids in dem Züchtungsmedium ist vorzugsweise von 0,1 bis 100 g/l und bevorzugter 0,5 bis 50 g/l. Die Kultur wird in einem Nährmedium wachsen gelassen, das eine Kohlenstoffquelle wie ein assimilierbares Kohlenhydrat und eine Stickstoffquelle, wie eine assimilierbare Stickstoffverbindung, z. B. ein Eiweißmaterial, enthält. Bevorzugte Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, braunen Zucker, Saccharose, Glyzerin, Stärke, besonders Maisstärke, Lactose, Dextrin und Melasse. Bevorzugte Stickstoffquellen umfassen Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauerhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasauszug von Kasein, Fischmehl, Schlempe, Feststoffe aus der Branntweinbrennerei, tierische Peptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenschnitzel bzw. -abfälle und Ammoniumsalze. Es kann vorteilhaft sein, Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zu verwenden. Spurenmetalle wie beispielsweise Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt und Eisen braucht dem Fermentationsmedium nicht zugesetzt werden, wenn Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums vor der Sterilisation des Mediums verwendet werden.
Der Umwandlungsprozeß zur Umwandlung des Substrats zu dem gewünschten Produkt ist gewöhnlich in 48 Stunden bis 12 Tagen vollständig. Die Bebrütungstemperatur während des Verfahrens kann von 20 ºC bis 35 ºC gehen, wobei 30 ºC bevorzugt ist. Der Inhalt des Fermentationsgefäßes wird vorzugsweise mit sterilisierter Luft belüftet und bewegt, um das Wachsen der Mikroorganismen zu erleichtern, wodurch die Wirksamkeit des Umwandlungsverfahrens erhöht wird.
Nach Vollendung des Umwandlungsverfahrens, die durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silicagelplatten (E. Merck, Darmstadt) festgestellt wird, wird das gewünschte umgewandelte Steroid mittels auf diesem Gebiet gut bekannter Verfahren gewonnen. Beispielsweise kann die Fermentations- (Umwandlungs)-Reaktionsmischung einschließlich der Fermentationsflüssigkeit und Zellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel umfassen Methylenchlorid (bevorzugt), Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Ethylenchlorid, Trichlorethylen, Diethylether, Pentylacetat, Benzol und Isobutylmethylketon.
Alternativ kann die Fermentationsflüssigkeit und Zellen zuerst durch übliche Methoden, z. B. Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt werden und dann separat mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können mit mit Wasser mischbaren oder nicht-mischbaren Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Fermentationsflüssigkeit, befreit von den Zellen, kann dann nach bekannten Methoden extrahiert werden.
Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden und das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne destilliert. Der entstandene Rückstand, welcher das gewünschte umgewandelte Steroid enthält, kann dann in 10 % Chloroform in Methanol gelöst und anschließend mit Stickstoff auf einem Dampfbad eingeengt werden, bis Kristalle auftreten. Die Lösungen können dann auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert werden, um reines ausgefälltes Steroid zu entfernen. Eine weitere (rohe) Ausbeute des gewünschte umgewandelten Steroids kann durch Eindampfen des Lösungsmittels aus dem verbleibenden Überstand erhalten werden.
Das Fortschreiten der Umwandlung kann durch Dünnschichtplatten verfolgt werden, während quantitative Daten erhalten werden können, indem ein Gemisch der Kulturflüssigkeit mit Methanol auf einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule abgetrennt wird. Die Struktur der erhaltenen Verbindungen kann durch NMR-Analyse bestätigt werden.
Anstelle der Verwendung von lebenden Mycobacterium-Zellen bei dem Fermentationsverfahren kann die gewünschte Umwandlung auch mit einem Enzympräparat durchgeführt werden, das von Zellen des genannten Mycobacterium-Stammes stammt. Ein geeignetes Präparat ist ein solches, das die Enzyme in einer immobilisierten Form, die leicht gewonnen werden kann, enthält.
Varianten oder Mutanten des neuen Stammes Mycobacterium species CBS 482.86, welche in der Lage sind, die gleiche Umwandlung zu bewirken, sind ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen. Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, welche jedoch nicht als eine Beschränkung der Erfindung angesehen werden sollen.
In den Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet:
AD Androst-4-en-3,11-dion
ADD Androsta-1,4-dien-3,17-dion
9-OH-AD 9α-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion
9-OH-HMP 9α-Hydroxy-20-hydroxymethylpregn-4-en-3-on

Beispiel 1

Erlenmeyer-Kolben (500 ml) mit 100 ml Medium A wurden hergestellt.

Medium A

10 g Hefeextrakt (Difco)
3,4 g Kaliumdihydrogenphosphat
4,0 g Tween 80WZ
1000 ml destilliertes Wasser
pH eingestellt auf 7,0.
Die Kolben wurden sterilisiert (20 Minuten bei 120 ºC) und nach dem Abkühlen auf 30 ºC mit einer Suspension von Mycobacterium species CBS 482.86 beimpft. Das beimpfte Medium wurde bei 30 ºC während 48-72 Stunden auf einem Drehschüttler bei 280 Upm*/ bebrütet. Anschließend wurden 10 ml dieser Kultur in 100 ml frisches Medium A ergänzt mit Cholesterin (100 mg) geimpft. Cholesterin wurde zu dem Medium A als Suspension gegeben, welche folgendermaßen hergestellt war. */ Umdrehungen je Minute
Eine Serumflasche (250 ml) enthaltend
2,5 g Cholesterin
40 g Glaskügelchen (Durchmesser 0,5 cm)
50 g destilliertes Wasser
0,25 g Tween 80WZ
wurde sterilisiert (20 Minuten, 120 ºC) und auf einem Drehschüttler (280 Upm) bei Raumtemperatur während 200 Stunden geschüttelt. Das beimpfte Gemisch wurde bei 30 ºC während 144 Stunden auf einem Drehschüttler bei 280 Upm bebrütet. Nach der Bebrütung wurde die Kultur mit Methanol vermischt und filtriert, das Filtrat wurde durch HPLC analysiert. In der Kulturbrühe wurde identifiziert
25 mg 9-OH-AD
6 mg AD
1 mg ADD und
1 mg 9-OH-HMP

Beispiel 2

Durch Austausch verschiedener Steroide für das Cholesterin in dem Verfahren des Beispiels 1 wurde 9-OH-AD als Hauptprodukt erzeugt. Die Ausbeuten sind in Tabelle II angegeben. Tabelle II mg Substrat in 100 ml Fermenationsflüssigkeit mg Produkt gewonnen unter Verwendung von Mycobacterium species CBS 482.86 α&sub1;-Sitosterin β-Sitosterin Stigmasterin Campesterin Ergosterin Lithocholsäure Cholest-4-en-3-on

Beispiel 3

Die in den vorhergehenden Beispielen erwähnten Steroidsubstrate wurden zu dem Fermentationsgemisch in verschiedenen Kombinationen gegeben, z. B. das Gemisch von Beispiel 5. Das Verfahren wurde im übrigen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Hauptprodukt war 9-OH-AD.

Beispiel 4

Durch Ersatz einer Cholesterinlösung (50 mg in 2,5 ml Ethanol) für die Cholesterinsuspension in Beispiel 1 und Befolgung des Verfahrens von Beispiel 1 wurde 9-OH-AD als Hauptprodukt erhalten.
Ausbeuten:
5 mg 9-OH-AD
2 mg AD
< 1 mg ADD
< 1 mg 9-OH-HMP

Beispiel 5

Durch Ersatz einer Lösung (50 mg in 2,5 ml Aceton) eines rohen β-Sitosteringemisches, bestehend aus β-Sitosterin, Campesterin und Stigmasterin (in einem Verhältnis von etwa 10 : 5 : 1 und einem Gesamt-Steringehalt von 90 %) für die Cholesterinsuspension in Beispiel 1 und Befolgung des Verfahrens von Beispiel 1 wurde 9-CH-AD als Hauptprodukt erhalten.
Ausbeuten:
13 mg 9-OH-AD
1 mg AD
< 1 mg ADD
< 1 mg 9-OH-HMP

Beispiel 6

Durch Ersatz von Cholsäure für die Cholesterinsuspension in Beispiel 1 und Befolgung des Verfahrens von Beispiel 1 wurde 7α,9α,12α-Trihydroxyandrost-4-en-3,17-dion als Hauptprodukt erhalten zusammen mit etwas Nebenprodukten, wie durch Dünnschichtchromatographie gezeigt wird. Die Struktur des Hauptprodukts wurde durch NMR-Analyse bestätigt.

Beispiel 7

Durch Ersetzen von 11,12-Dehydro-lithocholsäure für das Cholesterin in Beispiel 1 und Befolgung des Verfahrens von Beispiel 1 wird 9α-Hydroxyandrost-4,11-dien-3,17-dion als Hauptprodukt erhalten zusammen mit etwas Nebenprodukten, wie durch Dünnschichtchromatographie gezeigt wird. Die Struktur des Hauptprodukts wurde durch NMR-Analyse bestätigt.

Beispiel 8

Medium A (500 ml in einem 2000 ml Erlenmeyer-Kolben) wie in Beispiel 1 beschrieben wurde mit 10 ml einer Flüssigkeitskultur von Mycobacterium species CBS 482.86 beimpft. Das beimpfte Gemisch wurde bei 30 ºC während 48 Stunden auf einem Drehschüttler mit 200 Upm bebrütet. Diese Kultur wurde als Impfkultur eines 10 l-Fermentationsgefäßes verwendet. Das Medium in dem Fermentationsgefäß bestand aus
50 g Hefeextrakt (Difco)
20 g Tween 80WZ
2500 ml destilliertem Wasser
pH eingestellt auf 6,8.
Das Medium wurde sterilisiert (45 Minuten bei 120 ºC), woraufhin es auf etwa 30 ºC abgekühlt und dann nimmt Kaliumdihydrogenphosphat (17 g in 500 ml destilliertem Wasser) und Ammoniumsulfat (15 g in 500 ml destilliertem Wasser), beide bei 120 ºC während 20 Minuten sterilisiert, ergänzt wurde. Zu diesem Gemisch wurden 2000 g einer Suspension des rohen β-Sitosteringemisches von Beispiel 5 zugegeben. Die Sterinsuspension wurde folgendermaßen hergestellt:
4 Serumflaschen (2000 ml) jeweils enthaltend
25 g rohes β-Sitosterin
200 g Glaskügelchen (Durchmesser 0,5 cm)
500 ml destilliertes Wasser
4 g Tween 80WZ.
Dieses Gemisch wurde bei 120 ºC während 45 Minuten sterilisiert und dann bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler mit 150 Upm während 400 Stunden geschüttelt. Das beimpfte Gemisch wurde in dem gerührten Reaktor (600 Upm) bei 30 ºC gezüchtet, während sterile Luft durch die Brühe in einer Rate von 100 l/h geleitet wurde und das pH wurde automatisch bei 7,0 mit NH&sub4;OH (5 % in destilliertem Wasser; sterilisiert durch Membranfiltration) gehalten. Nach 72 Stunden wurde eine Zugabe von Tween 80WZ (500 g mit destilliertem Wasser auf 2500 g aufgefüllt) mit einer Rate von 15 g/h begonnen. Die Fermentation wurde dann während 216 Stunden fortgesetzt, wonach die Fermentationsbrühe mit Methylenchlorid extrahiert wurde. Der Extrakt wurde durch Diatomeenerde filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockne destilliert. Der Rückstand wurde in 10 % Chloroform in Methanol aufgenommen und dann mit Stickstoff auf einem Dampfbad eingeengt, bis Kristalle auftraten. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert, um die ausgefällten Sterine zu entfernen. Aus dem Überstand wurden beim Eindampfen des Lösungsmittels rohe 9-OH-AD-Kristalle erhalten. Die rohen Kristalle enthielten (HPLC-Prüfung):
37,9 g 9-OH-AD
2,9 g AD
< 0,1 g ADD
0,2 g 9-OH-HMP.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von 9α-Hydroxy-17-ketosteroiden, welches umfaßt das Unterwerfen einer oder mehrere Steroidverbindungen mit wenigstens einer C-17-Kohlenstoffseitenkette, enthaltend 5-10 Kohlenstoffatome einschließlich, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Fermentationsbedingungen der Einwirkung eines C-17-Seitenketten-abbauenden Mikroorganismus oder einem oder mehreren Enzymen davon, und Gewinnen des 9α-Hydroxy-17-ketosteroids aus der Kulturbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Mycobacterium species CBS 482.86 ist, oder eine Mutante oder eine Variante davon, die in der Lage ist, die gleiche Umwandlung zu bewirken.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Steroidverbindung ausgewählt wird aus der Gruppe α&sub1;- oder β-Sitosterin, Stigmasterin, Cholesterin, Cholest-4-en-3-on, Campesterin, Ergosterin, Cholsäure, Lithocholsäure, 11,12- Dehydrolithocholsäure oder ein Gemisch davon.

3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß 9α-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion hergestellt wird, vorzugsweise aus β-Sitosterin.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß 7α,9α,12α-Trihydroxyandrost-4-en-3,17-dion aus Cholsäure hergestellt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß 9α- Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion aus 11,12-Dehydrolithocholsäure hergestellt wird.

6. Mycobacterium species CBS 482.86.