AT396480B - Verfahren zur herstellung von 9alpha-hydroxy-4-androsten-3,17-dion - Google Patents
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Description
AT 396 480 B
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion durch mikrobiologischen Seitenkettenäbbau von natürlichen Sterinen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder aus einem Gemisch derselben durch belüftete, submerse Fermentation eines enzymdefekten, Sterin abbauenden Mikroorganismus in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthaltenden Nährmedium, und Isolieren des entstehenden Produktes. 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion ist ein wichtiges Ausgangsmaterial für die Synthese von Corticosteroid-Arzneimitteln \W. Van Rheenen, K. P. Shephard: J. Org. Chem. M, 1582 (1979)].
In der Patentliteratur sind Verfahren, die 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion durch mikrobiologische Hydroxylierung von Steroiden mit Androstanskelett hersteilen, wohl bekannt Die Hydroxylierung von 4-Androsten-3,17-dion mit Nocardia corallina (Britische Patentschrift Nr. 862 701) und Nocardia canicruria (US-Patentschrift Nr. 4 397 947) · beide aus der Nocardia Gattung - oder mit Corynebacterium equi (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 79-147998), einem Mitglied der Corynebacterium Gattung, ergibt 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion.
Ein Corynespora cassicolaPilz aus der Caliciales Gattung hydroxyliert4-Androsten-3,17-dion in 9a-Stellung (Iranische Offenlegungsschrift Nr. 80-77897), während Circinella muscae da- Mucorales Gattung Testosteron in 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion umwandelt [P. G. Rao: Indian J. Chem. L 314 (1963)].
Seit kurzem wird 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion durch mikrobiologische Konversion von Sterinen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs hergestellt Gemäß der Patentliteratur wird diese Konversion mit folgenden Mikroorganismus durchgeführt: Mycobacterium fortuitum (US Patentschriften Nr. 4 175 006 und 4 035 236), Mycobacterium parafortuitum (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 80-138395) und Mycobacterium vaccae (Japanische Offenlegungsschrift^ Nr. 80-085397 und 82-0897).
Sterine, besonders jene pflanzlichen Ursprungs (ß-Sitosterin, Campesterin), sind wenig kostspielige, leicht zugängliche Ausgangsstoffe. So kann die Produktion von 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion durch den Abbau von natürlichen Sterinen wirtschaftlich vorteilhaft sein. Während der industriellen Realisation des obigen Verfahrens für den Seitenkettenabbau von Sterinen wurde aber gefunden, daß sich die Fermentation ziemlich verzögert und die Ausbeuten an 9-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion viel zu niedrig sind
Im Laufe unserer Untersuchungen wurden aus unterschiedlichen Erdproben gemäß dem Verfahren von G. E. Peterson und Mitarbeiter [J. Lipid Research 2., 275 (1962)] Sitosterin abbauende Mikroorganismen isoliert. Aus diesen, an Sterinen wachsenden Mikroorganismen wurde ein Mycobacterium Stamm selektiert, und seine Mutanten wurden mit einer von und früher entwickelten mutagenen Behandlung von Spheroplasten hergestellt. Gemäß dieser Methode wurde der selektierte Stamm in einer Glycin und Vancomycin enthaltende Nährlösung gezüchtet, dann wurde die Zellwand des Mikroorganismus durch Lysozym-Behandlung aufgelöst und die erhaltenen Sphäroplaste und/oder Protoplaste wurden in einem mit Saccharose osmotisch stabilisierten Medium mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt Nach dieser mutagenen Behandlung wurden die Sphäroplaste und/oder Protoplaste in osmotisch stabilisiertem, festem Agarmedium, bei einer Temperatur, die optimal für den Wuchs des Mikroorganismus ist zwecks Regenerierung der Zellwand inkubiert
Aus den regenerierten Bakterienkolonien wurden jene Mutanten, die die Sterinseitenkette abspalten und gleichzeitig mit hoher Ausbeute Steroide mit Androstan-Skelett anreichem konnten, selektiert. Für Selektionszwecke wurden die obige Kolonien in natürliche Sterine (Sitosterin, Cholesterin) und 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion enthaltenden, minimales Agarmedium oder Glycerin als Kohlenstoffquelle enthaltenden Agamährboden geimpft Jene Stämme, die in Nährböden, die Glycerin und natürliche Sterine enthalten, gut wuchsen, dagegen in 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion enthaltendem Medium überhaupft nicht wachs«! kennten, wurden selektiert 14 000 Isolate wurden für ihre Fähigkeit, Sterine abbauen zu können, mit dieser Methode überprüft Jene Stämme, die keine 1,2-Steroiddehydrogenase Aktivität besaßen und größere Mengen von 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion mittels Abbau von natürlichen Sterinen anreichem konnten, wurden isoliert und der Stamm, der die größte Ausbeute an 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion ergab, wurde selektiert Während der taxono-mischen Identifizierung konnte dieser Stamm in keine bekannte Mycobacterienart eingestuft werden, er wurde als eine neue Species innerhalb dieser Gattung erkannt Die Hauptmerkmale der neuen Species, die während der taxonomischen Vergleichsprüfung mit bekannten, Sterine umsetzenden Bakterien verglichen wurden, sind in Tabelle 1 zusammengefaßt Der neue Stamm wurde Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 genannt -2-
AT 396 480 B
Tabelle 1
Taxonomische Vergleichsuntersuchung von Mycobacterium roseum so. nov. 1108/1 und bekannten schnell wachsenden. Steroiden abbauenden Mycobacterien gemäß ausgewählten diagnostischen Merkmalen M. roseum sp. nov. M. phlei M. fortuitum M. vaccae M. smegmatis Pigmentation der Kolonien Rot Orange scoto-chromogen Farblos Gelb, photo-u. scotochro* mögen Farblos Wuchs bei 6 °C +++ - - - - Wuchs an MacConkey Agar - - +++ - - Wärmebeständigkeit bei 60 °C/4 Stunden +++ +++ “ • “ Tween-80 Hydrolyse +++ +++ Variabel +++ +++ Säurebildung an Aräbinose - +++ - ? +++ Dulcit - - - - +++ Fruktose +++ +++ +++ +++ +++ Galactose - +++ - - +++ Inosit - - - +++ +++ Mannit - +++ - +++ +++ Mannose +++ +++ +++ +++ +++ Sorbit + +++ - Variabel +++ Trehalose +++ +++ +++ +++ +++ Xylose ±; +++ +++ - +++ +++
Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 ist ein neues Taxon der Mycobacterien Gattung, der auf Speciesniveau differenziert werden kann. Dieser Organismus, der bei 45 °C nicht mehr proliferiert, unterscheidet sich merklich von Mycobacterium phlei, das auch noch bei 52 °C aktiv bleibt, Citrat und Succinat als Kohlenstoffquelle benützt, Säure aus Aräbinose, Galactose und Mannit bildet und tiefgelbe und orangefarbene Kolonien formt, ferner noch von Mycobacterium smegmatis, das - ähnlich zu Mycobacterium phlei - auch an Citrat und Succinat, außerdem noch an Oxalat und Benzoat wachsen kann, was Mycobacterium roseum sp. nov. -3-
AT 396 480 B 1108/1 nicht zu tun fähig ist Im Gegensatz zu Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 bildet Mycobacterium smegmatis außerdem noch Säure an beinahe allen diagnostischen Kohlenstoffquellen, wie Aiabinose, Galactose, Sorbit, Mannit, Inosit und Fructose. Mycobacterium smegmatis kann eine vierstündige Hitzebehandlung bei 60 °C nicht überleben und bildet keine Pigmente. Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 kann auch von Mycobacterium fortnitum differenziert werden, da dieses immer farblose Kolonien hat und bei niedriger Temperatur nicht wachsen kann. Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 ist ein schnell wachsendes Mycobacterium mit charakteristischer roter Pigmentation, ist psychrophil (kältebeständig) und kann sich selbst bei 6 °C in der Form von reifen, roten Kolonien vermehren, während die Mycobacterium fortuitum Stämme schon bei 17 °C gehemmt werden. Die 100 %-ige, tiefrote Endopigmentation der Kolonien und Kulturen von Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 ist von höchster taxonomischer Bedeutung, da Good (1985) bei der Reihenuntersuchung von einer großen Zahl, mehr als 500 Mycobacterium fortuitum Stämmen, keinen einzigen mit Pigmentation vorfand, und so Mycobacterium fortuitum für pigmentfrei und nicht-photochromogen «klärte.
Es ist auch eine wichtige Differenz, daß Mycobacterium fortuitum Stämme gut an MacConkey-Agar wachsen, während Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 das nur in Spuren tun kann. Weiterhin besteht auch ein großer Unterschied in der Wärmebeständigkeit. Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 ist nicht nur kältebeständig, sondern auch wärmebeständig. Die ganze Population kann eine vierstündige Wärmebehandlung bei 60 °C überleben, während dieselbe Behandlung die ganze Zellenmasse von Mycobacterium fortuitum zerstört. Xylose als Kohlenstoffquelle benützend - die kein Substrat für Säurebildung bei Mycobacterium fortuitum ist -kann Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 mit einer bestimmten Variabilität Säure bilden, also ist die Säureproduktionsrate des Stammes für Monate hoch und wieder für Monate niedrig. Abschließend können die meist gelben, photochromogenen Stämme von Mycobacterium vaccae und Mycobacterium parafortuitum, die gemäß Literaturangaben taxonomisch als identisch zu betrachten sind, von Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 unterschieden werden, in dem sie Citrat und Succinat als Kohlenstoffquelle benützen, keine Wärme· beständigkeit bei 60 °C haben, und Säure aus Inosit und Mannit produzieren.
Aufgrund der obigen diagnostischen Merkmale wird Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 als ein Mitglied der neuen, schnell wachsenden Mycobacterienspezies betrachtet Dieser Stamm wird als "typisch«1 Stamm" bezeichnet, und die neue Spezies wird roseum genannt (Mycobacterium roseum sp. nov.). Das Adjektiv roseum weist auf die charakteristische rosa bis tief rote Farbe der Spezies hin.
Die taxonomische Vergleichsuntersuchung der neuen Spezies und der bekannten Mycobacterienspezies wurde aufgrund der nachfolgenden Literatur ausgefuhrt: H. C. Good: Ann. Rev. Microbiol. 22, 347-69 (1985) und Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition, The William-Wilkins Company, Baltimore, 1975.
Die taxonomischen Merkmale von Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 sind in Tabelle 2 zusammengefaßt
Tabelle 2
Taxonomie von Mycobacterium roseum so. nov. 1108/1 N=negativ P = positiv (P) = schwach positiv
Gelatin-Hydrolyse N Stärke-Hydrolyse N Tween-40 Hydrolyse P Tween-80 Hydrolyse P Phosphatase-Aktivität P Catalase-Aktivität P Oxydase-Aktivität P Urease-Aktivität P Ammoniabildung aus Nitrat N Nitritbildung aus Nitrat P Adeninabbau P Äsculinabbau P Hypoxanthinabbau N Xanthinabbau N Auflösung von Tyrosin N Verbrauch als einzige Kohlenstoffauelle: Adonit N Ambitiöse N -4-
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Tabelle 2 (Fortsetzung)
Dulcit Fructose Galactose Glycerin Glucose Inosit Stärke Lactose Maltose Mannit Mannose Mucinsäure Raffinose Rhamnose Xylose Calciumlaktat Natriumacetat Natriumbenzoat Natriumcitrat Natriumgluconat Natriummalonat Natriumoxalat Natriumpyruvat Natriumsalicylat Natriumsuccinat Verbrauch als einzige Stickstoffauelle: N P N P P N N N N N P N N N N P N N N N N N N N N Ammoniumphosphat P Ammoniumcarbonat P Ammoniumchlorid N Ammoniumnitrat P Ammoniumsulfat P Calciumnitrat P Kaliumnitrat P Säurebildune aus Adonit P Arabinose N Dextrin N Dulcit N Fructose P Galactose N Glycerin P Glucose P Inosit N Inulin N Stärke N Lactose N Mannit N Mannose P Melicitose N Raffinose N Saccharose P Salycin (P> Sorbit P Sorbose N Tiehalose P Xylose P (variabel) -5-
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Tabelle 2 (Fortsetzung)
Wuehsjn 2% Natriumchlorid P 4 % Natriumchlorid P 6 % Natriumchlorid P 10 % Natriumchlorid N MacConkey-Agar N Wuchs bei 6 °C P Wärmebeständigkeif 60 °C/4 Stunden P
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion ist somit dadurch gekennzeichnet, daß das für den Seitenkettenabbau vorgesehene Sterin oder Steringemisch mit der Kultur eines 1,2-Steroiddehydrogenase-Aktivität nicht enthaltenden Stammes der neuen Mycobacterium roseum Species, welcher fähig ist, natürliche Sterine abzubauen, vorzugsweise mit dem Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 Stamm, der in der Nationalen Sammlung von Landwirtschaftlichen und Industriellen Mikroorganismen, Budapest, Ungarn unter der Zugriffsnummer NCAIM B (P) 000339 deponiert ist, gezüchtet wird.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird der Seitenkettenabbau mit Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 durchgeführt. Der selektierte Stamm ist wegen seinem Mangel an 1,2-Steroid-dehydrogenase-Aktivität und kräftigem Wuchs besonders für die Fermentation geeignet Es ist auch günstig, daß das Nährmedium keine kostspieligen Ingredienzien benötigt, so kann der Stamm außer Stickstoffquellen natürlichen Ursprungs (Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Hefeextrakt) auch anorganische Stickstoffquellen nutzen.
Gemäß den DE-OS 26 47 895, US-PS 4 221 868, JP-OS 55-85397, JP-OS 55-138395, DE-OS 31 23 413 und der DD-PS 249 284 wird die Fermentbrühe nach der Fermentation nicht aufgearbeitet, sondern es wird nur mittels verschiedener Methoden der 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion-Gehalt der Fermentbrühe bestimmt Details der Bestimmung werden nicht dargelegt so daß eigentlich nicht beurteilt werden kann, ob bei diesen Messungen tatsächlich nur der 9a-Hy droxy-4-androsten-3,17-dion-Gehalt, oder aber auch andere -beider Fermentation entstehende - Steroide mit verwandter Struktur bestimmt werden.
Im Falle der DD-PS 248 145 und 232 167 ist bereits auch von Isolation die Rede, die angegebenen Ausbeuten können jedoch nicht ausgewertet werden, da in bezug auf die isolierten Verbindungen keinerlei Identifikationsangabe gemacht wird. Es kann nicht festgestellt werden, was für eine Qualität das Produkt besitzt Bei einer Fermentation entstehen auch zahlreiche Verbindungen mit ähnlicher Struktur. Aus der Beschreibung geht nicht hervor, in welchem Ausmaß die Verunreinigungen vom Zielprodukt entfernt wurden.
Die bekannten Verfahren können daher nicht mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verglichen werden.
Die DE-OS 26 47 895 betrifft die Herstellung von 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion (im weiteren 9-OH-4AD) durch Fermentation. Bei diesem Verfahren wird der Mikroorganismus Mycobacterium fortuitum NRKL B-8119 in Gegenwart von eine C2.iQ-Alkylkette enthaltendem Sterin auf wässerigem Nährboden unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Die Zeitdauer der Umwandlung beträgt 72-360 Stunden. Die Ausführungsbeispiele der Beschreibung enthalten keine Zahlenangäben, so daß die Wirksamkeit des Verfahrens nicht mit der des erfindungsgemäßen Verfahrens verglichen werden kann.
Gemäß der DE-OS 31 23 413 wird über den Abbau der Seitenketten von Sterolen 9-OH-4AD hergestellt, indem man einen zum Stamm Mycobacterium gehörenden Mikroorganismus in einem mindestens 0,1 Gew.-% Eigelb (auf die Trockensubstanz berechnet) enthaltenden Nährmedium züchtet. Die Fermentation »folgt mit den Stämmen M. vaccae MCI-1104, M. vaccae MCI-1117, M. parafortuitum MCI-1297 und M. parafortuitum NRRL B-8119. Zeitdauer der Fermentation: 48 - 480 Stunden.
Gemäß Beispiel 1 kann, ausgehend von 10 g Cholesterin, nach 140-stündiger Fermentation die Entstehung von 1,65 g, nach 210-stündiger Fermentation die Entstehung von 1,85 g 9-OH-4AD nachgewiesen werden.
Gemäß Beispiel 2 konnte, ausgehend von 750 mg Cholesterin nach 144-stündiger Fermentation die Entstehung von 95 mg, nach 192-stündiger Fermentation die Entstehung von 115 mg 9-OH-4AD nachgewiesen werden.
Gemäß Beispiel 3 konnten, ausgehend von 750 mg rohem Sitosterin nach 140 Stunden in der Fermentbrühe 57 mg, ausgehend von 750 mg eines 2:1-Gemisches aus ß-Sitosterin und Campesterin 62 mg 9-OH-4AD nachgewiesen werden.
Gemäß Beispiel 10 entstanden aus 24 g Cholesterin nach 160-stündiger Fermentation 2,88 g, nach 168-stiindiger Fermentation 3,28 g 9-OH-4AD.
Die US-PS 4 221 868 beschreibt nicht die Herstellung von 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion. sondern die -6-
AT 396 480 B mikrobiologische Herstellung von 9a-Hydroxytestosteron, 9a-Hydroxy-3-keto-bisnorchol-4-en-22-ol und 9a-Hydroxy-3-keto-bisnorchol-en-22-säure.
Gemäß der JP-OS 55-85397 erfolgt.der Abbau der Seitenketten von Sterolen mit Mutantenstämmen von Mycobacterium vaccae (MCI-1104, MCI-1117). Zeitdauer der Fermentation: kürzer als 20 Tage, vorzugsweise 6-9 Tage.
Gemäß dem Ausführungsbeispiel konnten bei der Fermentation von 1 g Cholesterin nach 200 Stunden gaschromatographisch 0,83 g 9-OH-4AD in der Fermentbrühe nachgewiesen werden.
Der Abbau der Sterolseitenkette erfolgt gemäß der JP-OS 55-138395 mit Hilfe des Mutantenstammes Mycobacterium parafortuitum (MCI-1297).
Zeitdauer der Fermentation: 210 Stunden. Gemäß dem Ausführungsbeispiel konnten, ausgehend von 10 g Sterol bei Stillstand der Fermentation 1,38 g 9-OH-4AD gaschromatographisch nachgewiesen werden.
Gemäß der nicht vorveröffentlichten DD-PS 249 284 wird aus Sterolen 9-OH-4 AD derart hergestellt, daß die Umwandlung mit einem Stamm der Mikroorganismenart Mycobacterium vaccae erfolgt und in das wässerige Nährmedium das Sterol gegebenenfalls in Form eines Steroltensid-Präparates gegeben wird.
Gemäß dem Beispiel 1 entstanden nach 96-stündiger Fermentation aus 10 g Sitosterin durchschnittlich 330 mg 9-OH-4AD (auf Grund der dünnschichtchromatographischen Auswertung). Gemäß dem Beispiel 2 entstanden aus 500 mg Sitosterin 90,6 mg 9-OH-4AD, gemäß Beispiel 3 aus 10 g Sitosterin 120 mg 9-OH-4AD, gemäß Beispiel 4 aus 500 mg Sitosterin 206 mg 9-OH-4AD.
Die mikrobiologische Herstellung von 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion aus Sterolen erfolgt gemäß der DD-PS 248 145, indem man die Umwandlung in Gegenwart eines Polyäthylenoxyd-Polypropylenoxyd-Blockpolymers einer Molekülmasse von 1000 - 3500 mit dem Stamm Mycobacterium furtuitum ZIMET10851 vomimmt.
Gemäß Beispiel 7 wird, ausgehend von 2 kg Sterolgemisch (90 % Sitosterin und 10 % Campesterin) nach 72-stiindiger Fermentation 500 g 9-OH-4AD enthaltende Fermentbrühe hergestellt.
In Beispiel 9 werden, ausgehend von 10 g Sterolgemisch 3 g 9-OH-4AD isoliert.
In Beispiel 10 werden, ausgehend von 10 g Sterolgemisch 4 g 9-OH-4AD isoliert.
Gemäß Beispiel 11 werden aus 10 g Sitosterin 3,7 g, gemäß Beispiel 12 aus 10 g Sitosterin 4,5 g, gemäß Beispiel 13 aus 10 g Sitosterin 4,5 g, gemäß Beispiel 14 aus 10 g Sitosterin 4,0 g 9-OH-4AD hergestellt.
Gemäß der DD-PS 232 167 wird 9-OH-4AD aus Sterolen hergestellt, indem der Abbau mit einem Stamm der Art M. fortuitum erfolgt und während der Umwandlung ein fein verteiltes, festes, hydrophobes organisches Polymer zum Nährmedium gegeben wird.
Im Beispiel 1 werden aus 10 g Sitosterin nach 48-stündiger Fermentation 5 g 9-OH4AD hergestellt.
Wie nachfolgend gezeigt wird, gelingt es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, ausgehend von Sitosterin (Stamm Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1) nach siebentägiger Fermentation Fermentbrühen bereits mit einer 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion-Konzentration von 15000 pg/ml herzustellen.
Keines der oben erwähnten bekannten Verfahren gewährleistet innerhalb so kurzer Zeit in der Fermentbrühe eine solch hohe 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion-Konzentration.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren können Kohlenstoffquellen, die in der Fermentationsindustrie üblich sind, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Melasse, Glycerin und Fette, günstig eingesetzt werden. Der Metall-ionenbedarf wird durch den Metallgehalt der Nährmedienkomponenten natürlichen Ursprungs gedeckt
Da die Sterin-Substrate den Wuchs des Stammes nicht beeinflussen, können diese zusammen mit dem Nährmedium vor dem Inokulieren sterilisiert werden.
Die Gegenwart von Polyoxyäthylen-sorbitanmonooleat (Tween-80) im Nährmedium sichert günstigen, einheitlichen und kräftigen Wuchs. Die Züchtung und biologische Umwandlung können zwischen 28 °C und 37 °C, vorzugsweise bei 32 °C durchgeführt werden. Der Fortschritt der Umwandlung wird dünnschicht-chromatographisch verfolgt. Die Konversionsperiode ist kurz, beträgt 100 bis 120 Stunden.
Anhand der Versuchungsergebnisse wird 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion als Hauptprodukt durch Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 in hohen Ausbeuten aus natürlichen Sterinen hergestellt. In der Fermentationsbriihe werden auch kleinere Mengen von Produkten mit teilweise abgebauter Seitenkette angeieichert, wie 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor4-cholen-22-sänre-methylesler, 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinar-4-cholen-22-säure, 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dmor-4,17(20)-choladien-22-säure und 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor4,17(20)-choladien-^-aldehyd.
Es ist vorteilhaft, die Zellen des Mikroorganismus mittels Filtrieren oder Zentrifugieren abzutrennen. Die mikrobiologischen Konversionsprodukte, die an der Zellenmasse adsorbiert sind, können mit Alkoholen, z. B. mit Methanol, abgewaschen werden, während jene in der Kulturbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie chlorierte Kohlenwasserstoffe oder Äthylacetat, nach Ansäuerung der Brühe auf pH 2 extrahiert werden.
Das Hauptprodukt, 9a-Hydroxy4-androsten-3,17-dion wird von den in kleineren Mengen anwesenden Nebenprodukten mittels Säulenchromatographie oder präparativer Dünnschichtchromatographie und nachfolgendem Kristallisieren getrennt.
Die Struktur der isolierten Konversionsprodukte wurde mit UV, IR, PMR und Massenspektrometrie aufgeklärt -7-
AT 396 480 B
Die Erfindung wild an Hand der nachstehenden Beispiele näh» erläutert, ohne den Schutzumfang auf diese Beispiele einzuschränken.
Beispiel 1 S Aus 4-5 Tage alten Kartoffel-Glucose-Schrägagar Kolonien von Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 wird mit 10 ml sterilem Wasser eine Zellsuspension zubereitet. Mit 5 ml dieser Suspension wird in einem 31 Erlenmeyerkolben 800 ml eines sterilen UFR Inoculummediums der folgenden Zusammensetzung beimpft:
Glycerin 8,0 g 10 Carbamid 0,4 g
Sojamehl 1,6 g
Hefeextrakt 0,8 g
Ammoniumchlorid 2,4 g
Calciumcarbonat 2,4 g 15 Dibasisches Kaliumphosphat 0,4 g
Magnesiumsulfat-Wasser 1:7 0,4 g
Ferrichlorid-Wasser 1:6 0,4 g
Tween-80 0,4 g
In 800 ml Leitungswasser 20
Vor dem Sterilisieren wird das Nährmedium auf pH 2 angesäuert und 45 Minuten lang bei 121 °C sterilisiert Der Kolben wird drei Tage lang bei 32 °C auf einem Rotationsschattier (340 U/Minute, Durchmess» 3,5 cm) inkubiert. Mit dieser Vorkultur wird dann 51 eines 60 Minuten lang bei 121 °C sterilisierten UHF-Mediums in einem 101 Ferment» inkubiert. Zusammensetzung des UHF-Mediums: 25
Glycerin 50 g Ammoniumchlorid 15 g Calciumcarbonat 15 g Sojamehl 10 g Dibasisches Kaliumphosphat 23 g Carbamid 23 g ß-Sitosterin-Campesterin Gemisch (2:1) 100 g Polypropylenglycol 30 g Tween-80 10 g 35 In 5 Liter Leitungswasser
Vor dem St»ilisieren wird der pH-Wert des Nährmediums auf 7 eingestellt.
Die inokulierte Kulturbrühe wird in ein Wasserbad von 32 °C gesetzt, die Fermentation wird bei einer Rührgeschwindigkeit von 350 U/Minute, erst unt» Belüftung von 901/Stunde, nach abnehmendem Schäumen 40 bei 150 1/Stunde, 120 Stunden lang fortgesetzt, und die aus dem ß-Sitosterin-Campesterin (2:1) Gemisch umgesetzten Konversionsprodukte werden isoliert.
Die Sterin-Konversionsprodukte in einem Liter Kulturbrühe, die am Anfang 20 g rohes Sitosterin (ß-Sitosterin-Campesterin 2:1) enthielt, werden folgendermaßen isoliert.
Die Zellenmasse der Kulturbrühe wird filtriert, und die darauf adsorbierten Sterin-Konversionsprodukte sowie 45 die nicht umgesetzten Ausgangsstoffe werden (beimal mit je 200 ml Methanol ausgewaschen. Die vereinten Methanol-Eluate werden im Vakuum eingedampft. Der Rückstand beträgt 12 g.
Das Filtrat der Kulturbrühe wird mit 2 N Schwefelsäure auf pH 2 angesäuert. Das ausfallende Präzipitat, ein Gemisch von 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-cholen-22-säure und 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,17(20)-choladien-22-säure wird filtriert und 4 Stunden lang im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute: 50 lg Säuregemisch. Das Filtrat wird zweimal mit 200 ml Äthylacetat extrahiert, die vereinten Äthylacetat-Extrakte werden üb» wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand beträgt 3,1g.
Die aus der Zellenmasse und aus der angesäuerten Kulturbrühe gewonnenen rohen Konversionsprodukte werden vereint und an einer aus 250 g Silicasäure bestehenden Säule Chromatographien. Als Entwicklungslösung 55 werden n-Heptan - Äthylacetat Gemische, die stufenweise imm» größere Mengen von Äthylacetat enthalten, eingesetzt. Nicht transformierte Ausgangsmaterialien werden mit einem n-Heptan - Äthylacetat Gemisch, das 25 % Äthylacetat enthält, eluiert. Bei dem Eindampfen dieser Fraktionen werden 1,5 g des ß-Sitosterin-Campesterin Gemisches gewonnen. Eluierung wird mit einem Gemisch von n-Heptan - Äthylacetat (6:4) fortgesetzt Die vereinten Fraktionen werden im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird aus Aceton 60 umkristallisiert.
Ausbeute: 03 g 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-cholen-22-säuie-methylest», Schmp. 212-216 °C.
Eluierung mit dem weiteren n-Heptan - Äthylacetat (55:45) Gemisch, Einengen im Vakuum der -8-
AT 396 480 B entsprechenden Fraktionen und Umkristallisieren aus Aceton ergibt 0,1 g 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,17(20)-choladien-22-aldehyd, Schmp. 204-209 °C.
Weitere Eluierung mit einem 45:55 Gemisch von n-Heptan und Äthylacetat, Einengen im Vakuum der entsprechenden Fraktionen und Umkristallisieren des Rückstandes aus Methanol ergibt 5,7 g 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion, Schmp. 219-221 °C, [a]D = +180° (c = 1, Chloroform).
Eluierung mit einem nächsten n-Heptan-Äthylacetat (3:7) Gemisch und Einengen im Vakuum der entsprechenden Fraktionen gibt einen Rückstand, der aus einem Gemisch von 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-cholen-22-säure und 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,17(20)-choladien-22-säuie besteht. Dieser Rückstand wird mit dem nach Ansäuerung der Kulturbrühe gewonnenem Säuregemisch vereint und das ganze Gemisch wird zweimal aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 0,4 g chromatographisch reine 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,17(20)-choladien-22-säure, Schmp. 242-248 °C.
Das in der Mutterlauge des Umkristallisierens zurückgebliebene Gemisch von 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-cholen-22-säure und 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,17(20)-choladien-22-säure wird mit präparativer Dünnschichtchromatographie in Komponenten geteilt [Adsorbent: Gemisch von Kieselgel G (Reanal, Budapest) und Kieselgel 60 HF254.366 (Reanal, Budapest) (2:1), Entwicklungslösungsmittel: Benzol-Aceton (1:1)].
Ausbeute: 0,1 g chromatographisch reine 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-cholen-22-säure (Schmp. 258-262 °C) und 0,2 g 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,17(20)-choladien-22-säure.
Beispiel 2
Sitosterin-Abbau mit dem Stamm Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1. NCAIM B (P) 000339
Von der 4 - 5 Tage alten, auf Schrägagar mit Kartoffelglucose gezüchteten Kultur des Stammes Mycobacterium sp. 1108/1 wird mit 10 ml sterilem Wasser eine Zellsuspension hergestellt, und mit 5 ml dieser werden 800 ml eines in einem 3 Liter-Erlenmeyerkolben sterilisierten MI-Inoculum-Nährbodens geimpft. Der MI-Nährboden hat folgende Zusammensetzung:
Glucose 8,0 g Sojamehl 1,6 g Harnstoff 0,4 g Hefeextrakt 0,8 g Ammoniumchlorid 2,4 g Kaliumdihydrogenphosphat 0,4 g Magnesiumsulfat-Wasser (1:7) 0,4 g Eisen(HI)-chlorid-Wasser (1:6) 0,4 g Tween 80 0,4 g in 800 ml Leitungswasser. Der pH-Wert des Nährbodens wird vor dem Sterilisieren; luf 7,0 eingestellt, und die Sterilisation erfolgt 45 Minuten lang bei 121 °C.
Der Kolben wird bei 32 °C in einem Mühlensieb-Rüttler (250 Umdrehungen/Minute, Ablenkung 2,5 cm) 2 Tage lang gerüttelt, dann werden mit der erhaltenen Inoculum-Kultur 4,2 Liter eines MF-Nährbodens geimpft, der in einem 10 Liter-Laborfermentor 60 Minuten lang bei 121 °C sterilisiert wurde.
Der MF-Nährboden wird wie folgt hergestellt. 50 g Glucose, 10 g Sojamehl, 2,5 g Harnstoff, 15 g Ammoniumchlorid und 2,5 g Kaliumdihydrogen-phosphat werden in 1,5 Liter Leitungswasser gekocht. Der so hergestellte Grundnährboden wird unter ständigem Rühren einer 150 g Sitosterin (2:1 Gemisch aus ß-Sitosterin und Campesterin), 40 g Polypropylenglycol, 10 g Tween 80 und 800 ml Leitungswasser enthaltenden, eine Stunde lang bei 121 °C sterilisierten Sitostennschmelze zugesetzt, dann wird mit heißem Leitungswasser auf 4 Liter ergänzt. Der so erhaltene Nährboden wird eine Stunde lang bei 121 °C sterilisiert, danach werden 15 g in 200 ml Leitungswasser extra sterilisiertes Kalziumcaibonat zugesetzt.
Die durch das Impfen mit MF-Nährboden erhaltene Kultur wird 24 Stunden lang, unter Zuleitung von 100 Liter/Stunde Luft von oben bei 32 °C mit einer Umdrehungszahl von 750/Minute gerührt. Dann wird die Fermentation 6 Tage lang derart fortgesetzt, daß von unten 300 Liter/Stunde Luft in die mit 750 Umdrehungen/Minute gerührte Kultur geleitet wird. Am Ende der Fermentation erreicht die 9a-Hydroxy-4-andiosten-3,17-dion-Konzentration einen Wert von 15 000 |ig/ml. Die Bestimmung der 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion Konzentration, erfolgt aus dem Äthylacetat-Extrakt der Fermentbrühe-Proben mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie.
Nach Beendigung der Fermentation werden die Zellen durch Zentrifugieren aus der Fermentbrühe isoliert, von denen die Sterinabbauprodukte und der nicht umgebildete Ausgangsstoff dreimal mit 500 ml Methanol abgelöst werden. Das vereinigte Methanol-Eluat wird im Vakuum eingedampft. So erhält man 130 g Rohprodukt. Aus der Fermentbrühe wird der nach dem Zentrifugieren erhaltene Überstand zweimal mit 500 ml Äthylacetat extrahiert Der vereinigte Äthylacetat-Extrakt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum -9-
AT 396 480 B eingedampft So erhält man weitere 13,5 g Rohprodukt. Die beiden Rohprodukt-Fraktionen werden vereinigt und in 750 ml Diisopropyläther suspendiert, dann wird die Suspension 1 Stunde lang gerohrt und danach bei 5 °C eine Nacht lang stehengelassen. Der abgeschiedene kristalline Niederschlag wird abfiltriert, zweimal mit je 100 ml Diisopropyläther gewaschen, dann im Vakuum getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird in 1 Liter Methanol heiß aufgelöst, und die Lösung wird mit 3,5 g Aktivkohle geklärt. Dann wird die Lösung abfiltriert und die Aktivkohle mit 100 ml Methanol gewaschen. Nach Eindampfen des Filtrats und der Waschflfissigkeit erhält man 70,1 g 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion einer Reinheit von 87 %. Durch seine Umkristallisierung aus Toluol kann man zu reinem 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion gelangen. Schmelzpunkt: 219 - 220 eC. [a]jj = +180 (c = 1, Chloroform).
Bei Eindampfen der Diisopropyläther-Mutterlauge und der Waschflüssigkeit im Vakuum «hält man 65,2 g öligen Rest. Die im Eindampfrest befindlichen Steroide werden durch Chromatografieren an einer aus 600 g Kieselsäure bereiteten Säule, mit Gemischen von n-Heptan und Äthylacetat mit allmählich ansteigendem Äthylacetat-Gehalt voneinander getrennt. Nach Eindampfen der sich mit dem 25 % Äthylacetat enthaltendem Gemisch von n-Heptan und Äthylacetat ablösenden chromatographischen Fraktionen gelangt man zu 3,5 g Gemisch von ß-Sitosterin und Campesterin. Nach Eindampfen der sich mit 40 % Äthylacetat enthaltendem Gemisch von n-Heptan und Äthylacetat äblösenden chromatographischen Fraktionen und Umkristallisieren des Eindampfrestes aus Aceton erhält man 4,1 g 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-cholen-22-säure-methylester.
Schmelzpunkt: 212 - 216 °C.
Ultraviolettes Spektrum (EtOH): 242 nm.
Infrarotes Spektrum (KBr): v OH 3395, v C=01730 (Ester) 1650 (3-er Keton), v C=C 1615 cm**. 1 H-NMR-Spektrum (CDC13, δ): 5,8 s (H-4), 3,6 s (OCH3), 1,3 s (3 H-19), 1,2 d (3 H-21), 0,7 s (3 H-18) ppm.
Massenspektrum: Molekül-Ion (m/z): 374.
Charakteristische Ionen (m/z): 374,180,151,137,136,124,109,81.
Nach Eindampfen im Vakuum der sich mit den 55 % Äthylacetat enthaltenden Gemischen von n-Heptan und Äthylacetat ablösenden Fraktionen und Umkristallisieren des Eindampfrestes aus Methanol erhält man 5,1 g 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion. Der Eindampfrest der Mutterlauge des Umkristallisierens wird mittels präparativer Dünnschichtchromatographie, unter Verwendung eines 8:2 Gemisches von Benzol und Aceton als Entwickler gereinigt. So «hält man 0,45 g 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion und 0,45 g 9a,22-Dihydroxy- 23.24- dinor4-cholen-3-on. Letzteres wird aus Aceton umkristallisiert.
Schmelzpunkt: 179 -180 °C.
Ultraviolettes Spektrum (EtOH): Xjna* 241 nm.
Infrarotes Farbbild (KBr): v OH 3600-3200, max. 3415, v C=01657 (3-er Keton), v C=C 1620 cm'1. ^H-NMR-Spektrum (CDCI3, δ): 5,85 s (H4), 3,5 ABXm (2 H-22), 1,3 s (3 H-19), 1,05 d (3H-21), 0,75 s (3 H-18) ppm.
Massenspektrum: Molekül-Ion (m/z): 346.
Charakteristische Ionen (m/z): 346,328,151,137,136,124,121,93.
Nach Eindampfen der sich mit 60 % Äthylacetat enthaltendem Gemisch von n-Heptan und Äthylacetat ablösenden Fraktionen und Umkristallisieren des Eindampfrestes aus Methanol erhält man 0,42 g 9a,17ß-Dihydroxy-4-androsten-3-on.
Schmelzpunkt: 196 -199 °C.
Ultraviolettes Spektrum (EtOH): 241 nm.
Infrarotes Spektrum (KBr): v OH 3500-3200, max. 3455, v C=01660 (3-er Keton), v C=C 1605 cm"1. iH-NMR-Spektrum (CDCI3,5): 5,75 s (H-4), 3,5 m (H-17), 1,25 s (3 H-19), 0,7 s (3 H-18) ppm.
Massenspektrum: Molekül-Ion (m/z): 304.
Charakteristische Ionen (m/z): 304,168,150,137,136,124,109,108.
Die sich mit dem 70 % Äthylacetat enthaltendem Gemisch von n-Heptan und Äthylacetat ablösenden Fraktionen werden im Vakuum eingedampft. Der Eindampfrest wird mittels präparativer Dünnschichtchromatographie (entwickelndes Lösungsmittel 1:1 Gemisch von Benzol und Aceton) gereinigt Die das sich von der Schicht ablösende, stärker apolare Produkt enthaltende Fraktion (240 mg) wird in 5 ml Methanol aufgelöst, dann mit 20 ml Äthylacetat verdünnt Die erhaltene Lösung wird zweimal mit 5 ml Wasser gewaschen, dann im Vakuum eingedampfk Nach Umkristallisieren des Eindampfrestes aus Äthylacetat erhält man 155 mg 9a-Hydroxy-3-oxo- 23.24- dinor-4,17(20)-choladien-22-säure. -10-
Claims (2)
- AT 396 480 B Schmelzpunkt: 242 - 248 °C. Ultraviolettes Spektrum (EtOH): λ^χ 237 nm. Infrarotes Spektrum (KBr): v OH 3600-3300, max. 3500 (9a-Hydroxylgruppe), 3200-2200 (22-er Säure), v C=0 1665 (3-er Keton, 22-er Säure), v C=C 1615 cm*1. 1H-NMR-Spektrum (CDC13, δ): 5,85 (H-4), 1,9 s (3 H-21), 13 s (3 H-19), 1,0 s (3 H-18) ppm. Massenspektrum: Molekül-Ion (m/z): 358. Charakteristische Ionen (m/z): 358,340,137,136,133,124,121,109. Die das von der Schicht abgelöste, stärker polare Produkt enthaltende Fraktion (460 mg) wird in 10 ml Methanol gelöst, und es werden 0,5 ml 10 %-ige methanolische Salzsäure zugesetzt, dann wird mit 30 ml Äthylacetat verdünnt. Die erhaltene Lösung wird zweimal mit je 10 ml Wasser gewaschen, dann eingedampft. Nach Umkristallisieren des Eindampfrestes aus Aceton erhält man 210 mg 9a-Hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-cholen-22-säure. Schmelzpunkt: 258 - 262 °C. Ultraviolettes Spektrum (EtOH): λυ^ 241 nm. Infrarotes Spektrum (KBr): v OH 3650-3300, max. 3450 (9a-Hydroxylgruppe), 3200-2300 (22-er Säure), v C=01720 (22-er Säure), 1665 (3-er Keton) cm"1. 1 H-NMR-Spektrum (CDCI3, δ): 5,8 s (H-4), 1,3 s (3 H-19), 1,15 d (3 H-21), 0,7 (3 H-18) ppm. Massenspektrum: Molekül-Ion (02/2): 360. Charakteristische Ionen (m/z): 360,237,224,206,151,137,136,124. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion aus natürlichen Sterinen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder aus einem Gemisch derselben durch belüftete, submerse Fermentation eines enzymdefekten, Sterin abbauenden Mikroorganismus in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthaltenden Nährmedium, und Isolieren des entstehenden Produktes, dadurch gekennzeichnet, daß das für den Seitenkettenabbau vorgesehene Sterin oder Steringemisch mit der Kultur eines 1,2-Steroiddehydrogenase-Aktivität nicht enthaltenden Stammes der neuen Mycobacterium ioseum Species, welcher fähig ist, natürliche Sterine äbzubauen, vorzugsweise mit dem Mycobacterium ioseum sp. nov. 1108/1 Stamm, der in der Nationalen Sammlung von Landwirtschaftlichen und Industriellen Mikroorganismen, Budapest, Ungarn unter der Zugriffsnummer NCAIM B (P) 000339 deponiert ist, gezüchtet wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch von ß-Sitosterin und Campesterin (2:1) als Sterin natürlichen Ursprungs eingesetzt wird. -11-
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