DD298278A5 - Verfahren zur herstellung von 9 alpha-hydroxy-androst-4-en-3,17-dion - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 9-alpha-Hydroxy-androst-4-en-3,17-dion (9-OH-AD) aus Sterolen bzw. Sterolgemischen durch mikrobiellen Abbau der Seitenkette. Zur Fermentation werden bevorzugt Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium mit ungestoertem Wachstum auf n-Alkanen, die sich darueber hinaus durch extrem verminderte Faehigkeit zur Steroid-1-Dehydrierung bei erhaltener Faehigkeit zum Sterolseitenkettenabbau auszeichnen, eingesetzt. Gegebenenfalls, insbesondere dann, wenn hohe Sterolmengen eingesetzt werden, werden dem Fermentationsmedium verfahrensgemaesz Adsorbentien zugegeben. Durch Anwendung dieser Mikroorganismen und bei Einsatz von Adsorbentien verringern sich die Verluste durch Totalabbau und durch Minimierung der Bildung anderer Nebenprodukte. Gleichzeitig werden bei kurzen Fermentationszeiten hohe Raum-Zeit-Ausbeuten an 9-OH-AD erreicht.{mikrobieller Sterolabbau; Wachstum auf n-Alkanen; Mikroorganismengattung Mycobacterium; Steroid-1-Dehydrogenase; Adsorbentien; 9-alpha-Hydroxy-androst-4-en-3,17-dion; hohe Raum-Zeit-Ausbeute; Glukokortikoid}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 9-alpha-Hydroxy-androst-4-en-3,17-dion (9-OH-AD) aus Sterolen durch mikrobiologische Umwandlung 9-OH-AD ist ein Schlüsselprodukt für die Herstellung von Steroidwirkstoffen. Aus diesem Produkt können durch bekannte Synthesen hochwirksame Steroide der Pregnanreihe mit einem großen Anwendungsgebiet gewonnen werden

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der pharmazeutischen Forschung und Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es ist bekannt, daß beim mikrobiellen Abbau von Sterolen 9-alpha-Hydroxy-Steroidabbauprodukte dann 'm Fermentationsmedium angereichert werden, wenn die Wirkung der Steroid-1-Dehydrogenase - eines Enzyms, welches gemeinsam mit der 9-alpha-Hydroxylase don Totalabbau der Steroide einleitet - ganz oder teilweise blockiert ist (M. G. Wovcha et al., Biochim. Biophys. Ada 531 [1976], 308-321). So wird z. B. 9-OH-AD durch mikrobiologischen Abbau von Sterolen bei Verwendung des Stammes Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 gebildet (vgl. DD127455). Dieser Mikroorganismus besitzt gegenüber dem Wildtyp M.fortuitum ATCC 6842 einen teilweisen Defekt in der Fähigkeit zur Steroid-1 -Dehydrierung (M.G. Wovcha et al., Biochim. Biophys. Acta 574 (19791,471-479). Hieraus resultiert beim Prozeß der 9-OH-AD-Herstellung eine

nachteilige Wirkung. Teilbeträge des an sich gewinnbaren 9-OH-AD unterliegen durch die Restaktivität der Steroid-1 Dehydrogenase einem weiteren Abbau und gehen dem Prozeß somit verloren.

Ein weiterer Nachteil des oben genannten Verfahrens ist in der langen Fermentationszeit von 336 Stunden zu sehen. Dieser Sachverhalt hat seine Ursache darin, daß bei der Erzeugung des Stammes M.fortuitum NRRL B-8119 gleichzeitig eine teilweise Schädigung jenes Enzymsystems eingetreten ist, welches den gewünschten Abbau der aliphatischen Seitenkette des Sterols bewirkt.

Die unzureichende Hemmung derSteroid-1-Dehydrierung sowie der unvollständige Seitenkettenabbau verursachen die Bildung von Nebenprodukten, die bei der präparativen Darstellung des 9-OH-AD nur durch aufwendige Reinigungsoperationen abgetrennt werden können.

Sch'ießlich weist das genannte Verfahren noch den Nachteil auf, daß die Abtrennung der FermentationsproduHe von nicht umgesetztem Sterol erforderlich ist, da bei einer Extraktion der Fermentationsbrühe sowohl Substrat als auch Produkt im Extrakt enthalten sind. Eine erste Lösung zur Überwindung dieser Schwierigkeit versuchten Aoki et al. (s. Patentschrift JP 77 57.161, Kokai), die unpolaren Adsorber vom XAD-Typ nach Beendigung der Fermentation zu setzen und die gebildeten Produkte auf diese Weise selektiv abtrennen konnten.

Bekannt ist weiterhin ein mikrobielles Verfahren zur 9-OH-AD-Herstellung gemäß JP-KTK 8085.397, in welchem die selektive Steroltransformation mit Hilfe eines Stammes der Art M. vaucae durchgeführt wird (Stamm M. vaccoe MCJ-1104). Auch bei diesem Verfahren findet eine nur wenig befriedigende Produktbildung nach langen Fermentationszeiten statt (aus 20g Cholesterol innerhalb von reichlich 8 Tagen beispielsweise nur 0,83g 9-OH-AD).

Es wurde auch bereits vorgeschlagen Stämme von M. vaccae in einem weiteren Verfahren zur Herstellung von 9-OH-AD einzusetzen.

Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß als Nebenprodukt AD auftritt und damit zusätzliche Reinigungsoperationen notwendig werden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, aus Sterolen durch mikrobielle Transformation g-alpha-Hydroxy-androst-'l-en-S.ndion herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes mikrobielles Verfahren zur Herstellung ve, 19-alpha-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion zu beschreiben, das diesos Produkt bei hohem Steroldurchsatz, effektiver Sterolverwertung und wesentlich kürzeren Fermentationszeiten in hohen Ausbeuten liefert

Erfindungsgemäß wird das Verfahren in seinem Grundzug wie folgt durchgeführt:

Ein Mikroorganismus, der neben einer extrem niedrigen Steroid-1-Dehydrogenase-Aktivität bei normal intakter Steitenkettenabbau-Aktivität durch ein ungestörtes Wachstum auf n-Alkonen charakterisiert ist, vorzugsweise ein Organismus aus der Gruppe der Bakteriengattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevlbacterlum, Corynebacterlum, Mikrobacterium, Mycobacterlum, Nocardla, Protamlnobacter, Serratla und Streptomyces, wird einem Fermentationsansatz zugegeben. Der Fermentationsansatz enthält zunächst die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Nährstoffe, so Kohlenstoffquellen wie z.B. Glycerol, Glucose, Saccharose, Stärke, Lactose usw. Stickstoffquellen wis z.B. Hefeextrakt, Harnstoff, Caseinhydrolysate, Meisquellwasser, Mycobacterienhydrolysate, sowie weiterhin Mineralsalze verschiedener Zusammensetzung und schließlich eine (gegebenenfalls nach dem in der Patentschrift DD 232166 angegebenen Verfahren hergestellte) Sterol-Tensid-Präp' .ation mit einem Mindestgehalt von 10g Sterol je Liter Fermentationslösung. Zur Herstellung der Sterol-Tensid-Präparation werden Sterole (wie Sito-, Campe-, Stigma-, Ergo-oder Cholesterol) bzw. Gemische dieser Sterole verwendet. Die Fermentation wird über 48 Stunden bis 170 Stunden bei 25⁰C bis 35°C sowie einem pH-Wert im Bereich von pH 6,0 bis pH 9,0 unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Wahlweise werden dem Fermentationsansatz von Beginn an oder nach einem Zeitintervall bis zu 72 Stunden Adsorbentien in einem Mengenverhältnis von 1 g/l bis 200g/l zugegeben. Die Fermentation wird erforderlichenfalls durch 30minütiges Erhitzen auf 90°C beendet; hierbei wird gleichzeitig die Kultur abgetötet.

Im weiteren Ausbau des Verfahrens werden Stämme der Art Mycobacterlum fortuitum, insbesondere entweder der Stamm M.fortuitum N10 oder der Stamm M.fortuitum N3/138 zur Fermentation eingesetzt. Die letztgenannten Mikroorganismen sind in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, DDR - 6900Jena, Beutenbergstr.11, unter

Mycobacterium fortuitum N10 ZIMET10849 und

Mycobacterlum fortuitum N 3/138 ZIMET10850

hinterlegt.

In der Verfahrensvariante ohne Adsorberzusatz wird das 9-OH-AD aus der Fermentationslösung in reiner Form l jrch an sich bekannte Methoden der Extraktion, vorzugsweise mit Butylacetat, und anschließender Kristallisation gewonnen.

wie Filtration, Zentrifugation oder Separation von der ausfermentierten Kulturlösung einschließlich Biomasse und gegebenenfalls nicht umgesetztem Sterol abgetrennt. Anschließend wird das am Adsorber befindliche Produkt durch Behandeln mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit Methanol, Ethanol oder Aceton bzw. deren wäßrigen Lösungen, eluiert. Nach dem Einengen des Eluats auf ca. 10% des Ausgangsvolumens wird das Eluat filtriert. Das 9-OH-AD wird z. B. durch Umkristeüisation dann in reiner Form erhalten.

Das Verfahren wird vorteilhaft im einzelnen wie folgt ausgeführt: Stamm M.fortultum N10 oder Stamm M.fortultum N 3/138 wird auf bereits genannten Medien kultiviert. Der pH-Wert liegt um

den Neutralpunkt. Die Temperatur beträgt vorzugsweise 3O⁰C ± 5⁰C; die Bebrütungsd&uer beträgt 24 Stunden bis 72 Stunden.

Mit 1 % bis 20% einer solchen Submorskultur wird der Fermentationsansatz, der die gleiche oder eine andere Zusammensetzung

wie das Medium der Impfkultur haben kann, beimpft.

Eine Sterol-Tensid-Präparation, vorzugsweise in der Konzentration von 10g bis 50g Sterol und 0,5g bis 5g Tensid je Liter Fermentationslösung, wird dem Fermentationsmedium bis zu 72 Stunden nach der Beimpfung zugegeben. Als Tensid wird

bevorzugt ein Polyethylenoxid-Polypropylenoxid (PEO-PPOJ-Blockcopolymer mit einem Anteil von 30% bis 70%

Polypropylenglycol und mit einem Molekulargewicht von 10OOg/mol bis 3500g/mol und/oder der Gruppe der PEO-PPO- Addukte des N,N"-Tetra-(-Oxypropylpropyol)-N'-(2-Oxypropyl)-diethyltriamins eingesetzt. Die Fermentation wird als aerobe Schüttelkultur oder in belüfteten Fermentern durchgeführt. In gerührten und belüfteten Systemen wird das Belüftungsregime so gewählt, daß die Sauerstoffgelöstkonzentration zeitweise in der Nähe des 10-%- Niveaus liegt. Der pH-Wert wird erneut aufwerte um den Neutralpunkt eingestellt; die Fermentationstemperatur liegt im Bereich

zwischen 25°C und 35'C, wobei während der Fermentation eine Temperaturverschiebung innerhalb des genannten Bereicheswie folgt vorzunehmen ist:

- in den ersten 24 Stunden wird die Fermentation bei 35⁰C geführt,

- bis zur Beendigung der Reaktion Fortsetzung bei 28⁰C.

Insbesondere dann, wenn hohe Sterolmengen zum Einsatz kommen, werden dem Fermentationsansatz Adsorbentien entweder

bereits vor d6r Sterilisation oder bis zu 72 Stunden nach der Beimpfung zugegeben. Als anorganische Adsorbentien kommenvorteilhaft Bentonit oder Kaolin und als organische Adsorber Copolymerisate aus Ethylvinylbenzen und Divinylbenzen ohneoder mit Acrylsäureesterbestandteilen und mit einer spezifischen Oberfläche von mindestens 100 m²/g sowie einer Korngrößeoberhalb 0,4mm zum Einsatz.

Die erforderliche Menge der Adsorbentien liegt zwischen 1 g/l bis 200 g/l. Die genannte Menge ist sowohl von der Kapazität und

der Adsorbtionsgesclr.vindigkeit des gewählten Adsorbers als auch von der eingesetzten Sterolkonzentration und damit von derzu erwartenden Produktmenge abhängig. Beispielsweise ist für die Fermentation von 10g/l Sitosterol die Zugabe von 80g/leines Adsorberpolymerisates des Ethylvinylbenzen und Divinylbenzen mit einer spezifischen Oberfläche von 45OmVgausreichend.

Für die Prozeßkontrolle werden die Mikroorganismen erforderlichenfalls durch 30minütiges Erhitzen auf 80°C bis 9C⁰C abgetötet. Die Prozeßkontrolle erfolgt sowohl durch bekannte analytische Verfahren (wie z. B. durch HPLC-, GC-, DC-Bestimmung) des

mittels Butylacetat aus der Fermentationsbrühe extrahierten Gemisches aus Sterol und Zielprodukt als auch durch GC-, HPLC-oder DC-Bestimmung der von den Adsorbentien elulurten Produkte.

Die Fermentation wird gegebenenfalls durch 30minütiges Erhitzen auf 90⁰C beendet. Die Vorteile des dargestellten Verfahrens bestehen In der Gewinnung von chemisch einheitlichem 9-OH-AD in hohen Ausbeuten,

bei hohem Steroldurchsat?, unter effektiver Sterolverwertung und bei wesentlich vorkürzten Fermentationszeiten.

Als Folge der Verwendung von Stämmen mit extrem niedriger Steroid-1-Dehydrogenase-Aktivität wie der Mikroorganismen M.fortuitum N10 bzw. M.fortultum N3/138 werden Verluste durch den Totalabbau des Ausgangsmaterials wie bei Einsatz des Stammes M.fortuitum NRRL B-8119 weitgehend vermieden. Hierdurch un J durch die uneingeschränkte Fähigkeit zum Abbau

der aliphatischen Sterolseitenkette unter den angegebenen Verfahrensbedingungen wird eine wesentlich höhere Effektivität des

Verfahrens erzielt. In der Verfahrensvariante mit Adsorberzusatz entsteht darüber hinaus der zusätzliche Vorteil der Bindung des 9-OH-AD, so daß

es einem weiteren Abbau durch 1-Dehydrogenase-Restaktivität nicht mehr zugänglich ist, wobei verfahrensgemäß nebenbekannten organischen Adsorbentien allerdings mit einer geringeren spezifischen Oberfläche auch anorganische Adsorbentieneingesetzt werden können.

Ausführungsbeispiele

1. M.fortultum N10 wird 3 Tage bei 35⁰C als Schrägagarkultur auf 10ml Nähragor mit 2% Glycerol angezüchtet. Diese Kultur dient zur Beimpfung eines 500-ml-Standrundkolbens mit 50ml Nährmedium folgender Zusammensetzung:

10g Glycerol, 10g Hefeextrakt, 0,5g KH₂PO₄,0,5g K₂HPO₄,1,5g (NH₄I₂HPO₄,0,2g MgSO₄ 7H₂0,0,01 g FeSO₄ 7H₂O und 0,02g ZnSO₄ 7 HiO, 1000ml Aqua dest, pH 7,0. Nach einer Inkubation von 48 Stunden bei 28⁰C auf einer Rotationsschüttelmaschine (180U/min) werden mit dieser Submerskultur im Verhältnis 1:10 20 Standrundkolben mit 50ml Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung beimpft:

10g Sitosterol, 0,5g Polyethylen-Polypropylenglycol, 7,5g Glucose, 15g Lactose, 2,0g Caseinhydrolysat, 2,5g (NH₄I₂SO₄,4,5g KH₂PO₄,0,3g MgSO₄ 7H₂O, und 0,05g FeCI₃ 6H₂O ad 1000ml Leitungswasser; pH 7,0. Die Fermentition erfolgt auf einem Rundschwingtisch bei 28⁰C über 72 Stunden. Danach wird die Fermentation durch Erhitzen auf 9O⁰C beendet; hierbei erfolgt gleichzeitig das Abtöten dor Mycobaterien.

Die Fermentationsbrühe wird anschließend zentrifugiert und der Überstand mit Butylacetat 3mal im Verhältnis Kulturfiltrat:Butylacetat-2:1 extrahiert. Die mit Natriumsulfat getrockneten Extrakte werden im Vakuum eingeengt bis die Kristallisation einsetzt. Die 9-OH-AD-Kristalle werden mit wenig Butylacetat gewaschen und die Mutterlauge wird nochmals ziτ Kristallisation gebracht. Das Rohprodukt (3,5g) wird aus Aceton umkristallisiert. Man erhält 3,2g 9-OH-AD, F.: 222°C.

2. Analog Beispiel 1 wird der Mikroorganismus M. fortuitum N 9/198 für die Sitosterol-Fermentation verwendet. Bei Einsatz von 10g Sitosterol/I Fermentationsmedium werden 4g/l 9-OH-AD erhalten.

3. M.fortuitum N3/138 wird analog Beispiel 1 angezüchtet, 250 ml Submerskultur dienen als Impfmaterial für einen belüftbaren 2,5-l-Laborfermenter mit 1,51 Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung:

22,6g Sterolgemisch (u.a. enthaltend 50% ß-Sitosterc', 39% Campesterol, 3,6% Stigmasterol), 1,5g Polyethylen-

Polypropylenglycol, 1,5g Siliconöl, 11,25g Glucose, 22,5g Lactose, 3,0g Caseinhydrolysat, 3,75g (NH₄I₂SO₄, ύ 75g KH₂PO₄, 0,45g MgSO₄ 7 H₂0,0,075g FeSO₄ 6H₂O. Der pH-Wert wird mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt. Die Fermentationstemperatur beträgt während der ersten 24 Stunden 35°C, danach für weitere 48 Stunden 28"C. Die Belüftungsrate wird so gewählt, daß eine Sauerstoffgelöstkonzentration von größer als 70% erreicht wird. Nach der Gesamtfermentationszeit von 72 Stunden wird auf 9O⁰C erhitzt. Im Ergebnis der chemischen Aufarbeitung analog Beispiel 1 erhält man 7 g kristallines 9-OH-AD.

4. M.fortuftum MOwirdam ig Beispiel 1 angezüchtet. Mit dieser Submerskultur werden im Verhältnis 1:10

20 Standrundkolben mit 50ml Fermentationsmedium der gleichen Zusammensetzung wie die Submerskultur beimpft. Die Zugabe der Sitosterol-Tensid-Präparation erfolgt zum Zeitpunkt des Beimpfens, so daß die Konzentration von Sitosterol 10g/l und vom Tensid (PEO-PPO-Addukt des N,N"-Tetra-(-Oxypropylpropyol)-N'-(2-Oxypropyl)-diethylentriamins Ί g/l Fermentationslösung beträgt.

6 Stunden nach dem Beimpfen werden in jeden Standrundkolben 4,0g eines organischen Adsorbers mit den oben genannten Eigenschaften gegeben. Die Fermentation erfolgt auf einem Rundschwingtisch bei 28⁰C 72 Stunden. Danach wird die Fermentation durch Erhitzen auf 9O⁰C beendet. Der Adsorber wird von der Fermentationsbrühe abgetrennt, mit Wasser gewaschen und mit Methanol eluiert. Das Eluat wird im Vakuum auf ca. 10% des Ausgangsvolumens eingeengt, filtriert und anschließend mit Butylacetat im Verhältnis 1; 1 extrahiert. Die weitere Aufarbeitung des 9-OH-AD-haltigen Butylacetatextraktes erfolgt analog Beispiel 1. Man erhält 3,7g 9-OH-AD in kristalliner Form.

5. Bei sonst gleicher Verfahrensweise wie im Beispiel 4 wird der Stamm M.fortuitum N3/138 für die Sitosterol-Fermentation verwendet. Der Einsatz von 10g Sitosterol je Liter Fermentationsmedium führt zu 4,2g/l 9-OH-AD.

6. Nach der Verfahrensweise im Beispiel 4 aber einer Sterolkonzentration von 20 g/l und einer Tensidkonzentration von 2 g/l Fermentationsansa'.z gewählt und 7 Tage fermentiert. Es werden 9-OH-AD-Ausbeuton von 7,8g/l Fermentationslösung erhalten.

7. Im Unterschied zu Beispiel 5 wird eine Sterolkonzentration von 30g/l und eine Tensidkonzentration 3g/l Fermentationsansatz gewählt und 7 Tage fermentiert. Man erhält Ausbeuten an 9-OH-AD von 13,2 g/l Fermentationslösung.

8. Bei sonst gleicher Verfahrensweise wie im Beispiel 5 wird eine Sterolkonzentration von 30g/l und eine Tensidkonzentration von 3fi/l Fermentationsansatz gewählt; wobei 20g Sterol und 2g Tensid je Liter Fermer.tationsansatz zum Zeitpunkt des Beimpfens und der Rest nach 72 Stunden in das Fermentationsmedium gegeben werden. Nach 7 Tagen werden 9-OH-AD-Ausbeuten von 14,0g/l Fermentationslösung erhalten.

9. Im Unterschiedzu Beispiel 4 wird als Tensid ein Gemisch von 0,5g Polyethylen-Polypropylenglycol und 0,5g PEO-PPO-Addukt des N,N"-Tetra-(-Oxypropylpropyol)-N'-(2-Oxypropyl)-diethylentrlamln8 je Liter Fermentationsansatz eingesetzt. Es werden bei Verwendung von 10g Sterol je Liter Fermentationsansatz 3,7g/l 9-OH-AD erhalten.

10. Bei sonst gleicher Verfahrensweise wie im Beispiel 4 wird Bentonit als Adsorbens eingesetzt. Bei Einsatz von 10g Sitosterol je Liter Fermentationsansatz erhält man 3,6g/l 9-OH-AD.

Tabelle 1 Übersicht zu den Ausführungsbeispielen

Beispiel Nr.

StammN10 N3/138

Adsorber Sterolkonz. (g/l) 10 15 20

30

Maßstab RK LF

(50ml) (1,51)

Tensid 9-OH-AD-Ausbeute PEO-PPO Addukt Gew.-% g/|

1 2 3 4 5 6 7 8» 9 10

χ χ

X X

X X X X X X X

X X

χ χ

X X

χ χ χ

—	32	3,2
-	40	4,0
-	31,1	4,66
X	37	3,7
X	42	4,2
X	39	7,8
X	44	13,2
X	46,66	14,0
X	37	3,7
X	36	3,6

gestaffelte Sterolzugabe

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung von 9-alpha-Hydroxy-androst-4-en-3,17-dion (9-OH-AD) durch mikrobielle Transformation eines Sterols (wie Slto-, Stigma-, Campe-, Ergo- oder Cholesterol) bzw. Gemischen dieser Sterole unter aeroben Bedingungen in wäßrigen Medien, die neben einer Kohlenstoff- und einer organischen Stickstoffquelle sowie neben Mineralsalzen eine Sterol-Tensid-Präparation mit einem Mindestgehalt von 10g Sterol oder Sterolgerrvsch je Liter Fermentationslösung enthalten, bei pH-Werten um den Neutralpunkt, pH 7,0 ± 1,0, unter Temperaturregimen im Bereich von 25°C bis 35⁰C und unter Zusatz von Adsorbentien, gekennzeichnet dadurch, daß man

- aus der Gruppe der die Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mikrobacterium, Mycobacterium, Norcardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces umfassenden Mikroorganismen einen ausgewählt, der neben einer extrem niedrigen Steroid-1-Dehydrogenaseaktivität bei normal intakter Seitenkettenabbau-Aktivität über die Eigenschaft zu ungestörtem Wachstum auf n-Alkanen verfügt,

- für die Dauer von 48 Stunden bis 170 Stunden unter Belüftung kultiviert, das Sterol in Form einer Sterol-Tensid-Präparation zusetzt und entweder von Beginn an oder nach einem Zeitintervall bis zu 72 Stunden Adsorbentien zusetzt,

- nach Beendigung der Kultivierung, erforderlichenfalls unter Abtöten der Mikroorganismen-Zellen, 9-OH-AD aus der Fermentationslösung oder gegebenenfalls mittels Elution vom Adsorbens durch an sich bekannte Methoden gewinnt.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Fermentation Mikroorganismen der Art Mycobacterium fortuitum einsetzt.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Feimentation den Stamm Mycobacterium fortuitum N10 oder den Stamm Mycobacterium fortuitum N3/138 einsetzt.

4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß alsTensid eine Verbindung der Gruppe der Polyethylanoxid-Polypropylenoxid (FEO-PPCO-Blockcepolymeren mit einem Anteil von 30% bis 70%Polypropylenglycol und mit Molekulargewichten von 10OOg/mol bis3500g/mol und/oder der Gruppe der PEO-PPO-Addukte des N,N"-Tetra-(-Oxypropylpropyol)-N'-(2-Oxypropyl)-diethylentriamins einsetzt.

5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß man als wahlweise verwendete anorganische Adsorbentien Bentonit oder Kaolin zusetzt.

6. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß man als wahlweise verwendete organische Adsorbentien ein Copolymerisat aus Ethylvinylbenzen und Divinylbenzen ohne oder mit Acrylsäureesterbestandteilen und einer spezifischen Oberfläche von mindestens 10OmVg sowie mit einer Korngröße oberhalb von 0,4mm zusetzt.

7. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man die Fermentation während der ersten 24 Stunden bis 35°C führt und anschließend bei 28⁰C fortsetzt.

8. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Belüftungsregime realisiert, bei dem die relative Sauerstoffgelöstkonzentration zeitweise in der Nähe des 10-%-Niveaus liegt.