DD249284B1 - Verfahren zur herstellung von 9alpha-hydroxy-androst-4-en-3,17-dion - Google Patents
Verfahren zur herstellung von 9alpha-hydroxy-androst-4-en-3,17-dionInfo
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
mikrobiologische Umwandlung.
9-OH-AD ist ein Schlüsselprodukt für die Herstellung von Steroidwirkstoffen. Aus diesem Produkt können hochwirksame
Bekannt ist aus der Literatur zunächst ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von 9-OH-AD aus Sterolen (vgl. die Patentschriften DEtAS 2647895 bzw. DD 127455), bei dem ein unter den Registrier-Nm. NRRL B-8119 sowie DSM 752 registrierter Mikroorganismus der Art Mycobacterium fortuitum für die Steroltransformation zu o.g. Zielprodukt eingesetzt wird. .·· ,..·;. ; /·*. . ·
Dieses Verfahren weist einige wesentliche Nachteile auf: So wird hier zum einen ein Mikroorganismus eingesetzt der zu den fakultativ patogenen Species der Gattung Mycobacterium zu rechnen ist (R. E. Buchanan u.a., Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1975; D.P.Nicholson u. W.R.Servier, Am. Rev. Resp. Dis. 104 [1971] 747-750). Aus dem Einsatz dieses Mikroorganismus resultiert ein erheblicher zusätzlicher technischer Aufwand für den Gesundheits-, Arbeite- und Umweltschutz. Zum anderen haftet dieser technischen Lösung weiterhin der Nachteil an, daß selbst bei sehr langen Fermentationszeiten (14 bis 15 Tage) nur eine unbefriedigende Produktbildung erfolgt Nachteilig schlägt bei dieser Lösung außerdem noch zu Buche, daß eine Abtrennung des Ferrnentationsprodukr.es 9-OH-AD von nicht umgesetztem Sterol erforderlich ist, da bei einer Extraktion der Fermentationsbrühe neben dem Zielprodukt auch Substrat im Extrakt enthalten ist.
Über einen ersten Versuch zur Überwindung eines und zwar des letztgenannten Nachteils dieses Verfahrens berichteten M. Aoki u. a. (vgl. Patentschrift JP-Kokai 77 57161). die zur Aufarbeitung der Fermentationsbrühe unpolare Adsorber vom XAD-Typ einsetzten und auf diese Weise das gebildete Produkt selektiv weitgehend abtrennen konnten.
-2- 249 2&4
Ein weiterer Versuch zur Überwindung der Nachteile des Basisverfahrens gemäß DE 2647895 bzw. DD 127455 liegt außerdem mit der technischen Lösung aus der Patentschrift DD 232167 vor, bei der unter Einsatz des Stammes M. fortuitum ZIMET10 849 und unter Beifügung eines feinverteilten festen, hydrophoben organischen Polymeren zur fermentationsbrühe in Fermentationszeiten von 2 bis 6 Tagen nunmehr sine befriedigendere 9-OH-AD-Bildung erreicht wird, bei der aber nach wie vor ein Mikroorganismus aus einer Species eingesetzt wird, die ihrerseits eben auch fakultativ pathogene Stämme enthält. Bekannt ist schließlich das mikrobielle Verfahren zur 9-OH-AD-Herstellung gemäß der Patentschrift JP-KTK 80 85 397, in welchem die selektive Steroltransformation mit Hilfe eines Stammes der Art Mycobacterium vaccae durchgeführt wird (Stamm M. vaccae MCI-1104). Zwar kommt in dieser technischen Lösung ein apathogener Stamm zum Einsatz, jedoch findet auch nach langen Fermentaticnszeiten wiederum nur eine wenig befriedigende Prcduktbildung statt (aus 20g Cholesterol innerhalb von reichlich 8 Tagen beispielsweise nur 0,33g 9-OH-AD).
Ziel der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es* aus Sterolen in guten Ausbeuten 9a-Hydroxy-androst-4-en-3,17-d^on (9-OH-AD), ein Zwischenprodukt für die Erzeugung von Steroidpharmaka, herzustellen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Sa-Hydroxy-androst-4-en-3,17-dion (9-OH-AD) zu beschreiben, das dieses Produkt bei hohem Steroldurchsatz und wesentlich verkürzten Fermentationszeiten in guten Ausbeuten liefert.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch mikrobielle Transformation mit Stämmen der Art Mycobacterium vaccae dadurcn gelöst, daß zur Transformation des jeweiligen Sterols bzw. Sterolgemisches Stamm M. vaccae ZIMET11052 oder Stamm
M. vaccae ZlMET 11053 eingesetzt werden. Die verfahrensgemäß eingesetzten Stämme sind in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR, Beutenbergstraße 11, DDR - Jena 6900 unter den oben genannten Registriernummern hinterlegt worden.
Für den verfahrensgemäßen Zweck wird in den verschiedenen Varianten der Erfindung unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen Stamm M. vaccae ZIMET11052 oder Stamm M. vaccae ZIMET11 053 in einem wäßrigen Nährmedium fermentiert, welches neben Sterol eine Kohlenstcffquelle (wie beispielsweise Glycerol, Glucose, Saccharose, Stärke oder Lactose), eine Stickstoffquelle (wie beispielsweise Hefeextrakt, Harnstoff oder Caseinhydrolysat) sowie Mineralsalze enthält. Zu dieser Fermentation werden Sterole wie Sitosterol, Cholesterol, Carnpesterol, Stigmasterol bzw. Ergosterol oder Gemische dieser Sterole herangezogen. Das Sterol wird entweder als solches oder in Form einer Sterol-Tensid-Präparation in das wäßrige' Fermentationsmedium eingebracht, wobei die Sterol-Einsatzkonzentration im Bereich von 1,0g/l bis 50g/l Fermentationsmedium gewählt wird. Die gegebenenfalls zu verwendenden Sterol-Tensid-Präparationen werden bereitgestellt, indem das jeweilige Sterol mittels Naßvermahlung, Lyophilisierung oder Sprühtrocknung mit einem Tensid der nachstehend gekennzeichneten Gruppen A oder B vermengt wird, wobei das Tensid einen Anteil von 1,0 bis 20Gew.-% an der fertigen Präparation ausmacht. Unter Tensiden der Gruppen A bzw. B werden wie in einer unserer früheren Patentanmeldungen Polyethylenoxid(PEO)-Polyprophylenoxid(PPO)-Blockcopolymere mit einem Anteil von 30% bis 70% Polypropylenglycol bzw. die PEO-PPO-Addukte des N,N"-Tetra-(-oxypropylpropyol)-N'-(2-oxypropyl)-diethylentriamins verstanden.
Die Fermentation erfolgt zweckmäßigerweise in den Stufen Vor- und Hauptkultivierung; sie wird bei Temperaturen von 25°C bis 35°Cfür die Dauer von 48 Stunden bis 96 Stunden durchgeführt, wobei der pH-Wert im Bereich von pH 6,0 bis pH 9,0 gewählt
Weiterhin wird dem Fermentationsmedium gegebenenfalls entweder von Beginn an oder im Verlaufe der Kultivierung ein Adsorber vom Typ eines organischen Polymeren in einer Einsatzkonzentration von 10g/l bis 160g/l zugesetzt. Vorzugsweise wird als Adsorber hierbei ein organisches Polymere, entstanden aus Ethylvinyl- und Divinylbenzen, verwendet, das eine spezifische Oberfläche von mindestens 200m2/g aufweist. Speziell wird in den Verfahrensvarianten mit Adsorbereinsatz ein organisches Polymere, entstanden aus Ethylvinyl- und Divinylbenzen, mit polaren Gruppen, insbesondere mit polaren Gruppen auf der Basis von Acrylsäureestern, herangezogen.
Die Fermentation kann in Rundkolben und Steilbrustflaschen verschiedenen Inhalts, in gerührten Glasfermentern sowie in V2A-Stahltanks durchgeführt werden.
Nach Beendigung der Fermentation erfolgt die Gewinnung des gebildeten 9-OH-AD in der Verfahrensvariante ohne Adsorberzusatz in an sich bekannter Weise durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit Butylacetat, nebst anschließender Kristallisation.
In der Variante mit Adsorbereinsatz wird die Aufarbeitung mit der Abtrennung des Adsorbers von der Kulturlösung, vorzugsweise mittels Filtration, eingeleitet, und durch Elution des Adsorbers mit organischen Lösungsmittels wie Methanol, Ethanol bzw. Aceton oder mit wäßrigen Lösungen solcher Mittel, durch Einengen des Eluats auf ca. 10% des Ausgangsvolumens mit erneuter Filtration sowie durch Umkristallisation wird schließlich'das 9-OH-AD erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, bei der Zellen vom Stamm ZIMET11053 in einem Medium mit Zusatz von 140g/l Adsorber obiger Kennzeichnung für 96 Stunden bei 280C fermentiert worden sind, ergaben sich in Abhängigkeit von der Sterol-Einsatzmenge im Rundkolbehmaßstab 9-OH-AD-Ausbeuten im Bereich von 35 Gew.-% bis 50 Gew.-% (analytische Werte), wobei ein Reststerolgehalt von weniger als 5Gew.-% festgestellt wurde. Wie sich erwies, geht unter diesen Verfahrensbedingungen vom Einsatz eines Adsorbers ο. g. Beschaffenheit nicht nur ein günstiger Effekt hinsichtlich der Aufarbeitung des gebildeten 9-OH-AD aus; vielmehr resultiert hierdurch darüber hinaus eine Steigerung der Produktbildung selbst und damit auch eine Steigerung in der Sterolverwertung.
Die Vorteile des Verfahrens bestehen zusammengefaßt darin, daß
— das Produkt 9-OH-AD nach kurzen Fermentationszeiten und in guten Ausbeuten unter Einsatz jeweils eines als apathogen klassifizierten Mikroorganismenstammes herstellbar ist und daß
— in der Verfahrensvariante mit Adsorberzufügung nicht nur das Produkt 9-OH-AD aus der Kulturlösung entfernt wird, sondern zusätzlich noch weiter gesteigerte Ausbeuten erreichbar sind (vgl. Tabelle).
5g Bacto-Peptone; 5g Fleischextrakt; 15g Agar-Agar; Aqua dest. ad 1000ml; pH 7,0 (Röhrchenkultur).
0,01 g FeSO4 · 7H2O; 0,002g ZnSO4 · 7H2O; Aqua dest. ad 1000ml; pH 7,0.
(100g Sitosterol, 10g Tensid der Gruppe B, Aqua dest. ad 1000ml, naßvermahlen) und mit 50ml Fermentationsmediumbeschickt. Als Fermentationsmedium wird eine Lösung aus 5g Glukose; 10g Hefeextrakt; 1.3gK2HPO4· 3H3O; 1,5 g (NH4I2HPO4;0,2g MgSO4 · 7H2O; 0,01 g FeSO4 · 7H2O; 0,002g ZnSO4 · 7H2O; Aqua dest ad 1000ml; pH 8,0 eingesetzt.
96stündige Fermentation auf dem Rundschwingtisch bei 200 U/min und 28°C vorgenommen.
Gemäß den Bedingungen von Beispiel 1 für die Röhrchen· und Vorkultur wird Stamm Mycobacterium vaccae ZIMET11052 angezüchtet.
Zehn 500-ml-Stehrundkolben werden mit jeweils 4g feuchtem Adsorber obiger Kennzeichnung, mit 500-mg Sitosterol-Tensid-Präparation (500mg Sitosterol, 50mg Tensid der Gruppe B, in Benzen* gelöst und lyophilisiert) und mit 50ml Fermentationsmedium der Zusammensetzung von Beispiel 1 beschickt.
Die Ausbeute an 9-OH-AD betrug durchschnittlich 90,6 mg je Rundkolben nach 96stündiger Fermentation auf dem Rundschwingtisch bei 28°C.
angezüchtet.
genannten Standard.
und Divinylbenzen, ohne polare Gruppen), 5 ml Sitosterol-Tensid-Präparation obiger Zusammensetzung und 50 ml
sterilisiert und anschließend beimpft worden sind.
Vergleich
der Leistungsparameter bei der Herstellung von 9-OH-AD durch die Stämme Mycobacterium vaccae ZIMHT11052 und ZIMET11053 mit dem publizierten Stand der Technik
| Veröffentlichung | Stamm | Maßstab | Adsorber | Sitosterol- | Ferment.- | Ausbeute |
| (g/l) | anfangs- | zeit | 9-OH-AD | |||
| konzentr. | (h) | (g/l) | ||||
| (g/l) | ||||||
| Patentschrift | M.vaccae | 500-ml | ||||
| DD249284A1 | ZIMET | Rundkolben | ||||
| Beispiel 1 | 11053 | a 50 ml | 140 | 20 | 96 | 6,6 |
| Patentschrift | M.vaccae | 500-ml | ||||
| DD 249 284 A1 | ZIMET | Rundkolben | ||||
| Beispiel 2 | 11052 | a 50 ml | 80 | 10 | 96 | 1,8 |
| Patentschrift | M.vaccae | 500-ml | ||||
| DD 249 284 A1 | ZIMET | Rundkolben | ||||
| Beispiel 3 | 11053 | a 50 ml | — | 20, | 96 | 2,4 |
| Patentschrift | M.vaccae | 500-ml | ||||
| DD 249 284 A1 | ZIMET | Rundkolben | ||||
| Beispiel 4 | 11053 | a 50 ml | 100 | 10 | 72 | 4,2 |
| Patentschrift | M.vaccae | Schüttel | ||||
| JP 8085397 | 11CJ-1104 | flaschen | ||||
| (Mitsubishi) | 11053 | — | 20 | 200 | 0,83 | |
| Patentschrift | M.fortui- | 500-ml | ||||
| DD127455 | tum | Schüttel | ||||
| (Upjohn) | NRRL | flaschen | ||||
| ß-8119 | a 100 ml | — | 10 | 336 | ? |
Claims (11)
- Patentansprüche:1. Verfahren zur Herstellung von 9a-Hydroxy-androst-4-en-3,17-dion (9-OH-AD) durch mikrobielle Transformation von Sterolen mit Stämmen der Art Mycobacterium vaccae unter aeroben und sterilen Bedingungen in wäßrigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß zur Transformation des Sterols Stamm M. vaccae ZIMET11052 oder Stamm M. vaccae ZIMET11 053 eingesetzt werden.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Absorber vom Typ eines organischen Polymeren verwendet wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Sterol in Form einer Sterol-Tensid-Präparation eingebracht wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in der Sterol-Tensid-Präparation ein Tensid aus der Gruppe der Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Blockcopolymere mit einem Anteil von 30% bis 70% Polypropylenglycol eingesetzt wird.
- 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in der Sterol-Tensid-Präparation ein Tensid aus der Gruppe der Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Addukte des N,N"-Tetra-(-oxypropylpropyol)-N'-(2-oxypropyl)-diethylentriamins eingesetzt wird.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Sterol in das Nährmedium in einer Einsatzkonzentration von 1 g/l bis 50 g/l eingebracht wird.
- 7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorber ein organisches Polymer mit einer spezifischen Oberfläche von mindestens 200m2/g, erhalten aus Ethylvinyl- und Oivinylbenzen, eingesetzt wird.
- 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorber ein organisches Polymer mit polaren Gruppen eingesetzt wird.
- 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß ajs Adsorber ein organisches Polymer mit polaren Gruppen auf der Basis von Acrylestern eingesetzt wird.
- 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Adsorber dem wäßrigen Medium'in einer Konzentration von 10g/l bis 160g/l zugesetzt wird.
- 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß 9-OH-AD in der Weise isoliert wird, daß der Adsorber von der Kulturlösung abgetrennt, anschließend mit organischen Lösungsmittel eluiert und aus dem Eluat durch Umkristallisation das reine Produkt gewonnen wird.
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1987
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