DD140478A5

DD140478A5 - Verfahren zur herstellung von steroidalkoholen

Info

Publication number: DD140478A5
Application number: DD78208440A
Authority: DD
Inventors: Yukio Imada; Katsuhiko Takahashi
Original assignee: Mitsubishi Chem Ind
Priority date: 1977-10-14
Filing date: 1978-10-13
Publication date: 1980-03-05
Also published as: IT7828778A0; US4223091A; IE47369B1; IE781890L; EP0001622A1; HU180021B; CA1118376A; IT1099728B; DE2861166D1; EP0001622B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Steroidalkoholen durch Züchten eines Mikroorganismus,- der der Gattung Mycobacterium angehört und dazu in der Lage ist, als Hauptprodukt 20 α" Hydroxymethylpregna-1 ,4-dien-3-on oder 20 a-Hydroxyraethylpregna-4~en--3"On zu liefern, in Gegenwart eines Sterinsubstrats.

Description

- 1 - £

Anwendungsgebiete der Erfindung -.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Steroidalkoholen und insbesondere 20c£-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und/oder 20oc-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on durch mikorbiologische Oxidation von Sterinen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

2OcC -Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on (22-Hydroxy-23,24- J bisnorchola-1,4-dien-3-on) (im folgenden auch abgekürzt

als HPD bezeichnet) und 20<x-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on (22-Hydroxy-23,24-bisnorchola-4-en-3-on) (im folgenden auch abgekürzt als 4HP bezeichnet) sind wichtige Zwischenprodukte für die Synthese von wertvollen Steroiden, wie Corticosteroiden, Progestogenen bzw. Progestagenen, anabolen Hormonen und dergl.

20cc-Hydroxymethylpregna- . 20 cc-Hydroxymethylpregn-1,4-dien-3-on 4-en-3-on ·

Es ist bekannt, daß 20ct -Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und 20oc-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on gebildet werden, wenn man Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium züchtet (siehe (A) Applied Microbiology 23, No. 1 (1972), 72-77; (B) US-PS 3 684 65.7 und (C) US-PS 3 759 791). Bei den in den genannten Literaturstellen beschriebenen Verfahren werden jedoch 2Oo=- -Hydroxymethylpregna-1 , 4-dien-3-on und 2OcC-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on nur in geringen Mengen gebildet, so daß diese Verfahren kommerziell

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ohne Bedeutung sind.Hierzu ist zu sagen, daß die Konzentrationen, in denen 20c -Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on bei den in den oben angegebenen Literaturstellen A, B bzw. C beschriebenen Verfahrensweisen gebildet wird, mit etwa 20, 40 bzw. weniger als 20μg pro ml des Kulturmediums angegeben sind.

Weiterhin ist in einem Beispiel der. Literaturstelle C angegeben, daß 20c<- -Hydroxymethylpregn-4-en-3-on in einer

Konzentration von lediglich 40μg/ml gebildet wird. Das

Hauptprodukt der obenbeschriebenen Verfahren ist jedoch • Androsta-1,4-dien-3,17-dion oder Androst-4-en-3,17-dion, wobei das Verhältnis von gebildetem 20o^-Hydroxymethylpregna-1_/4-dien-3-dion und 20oC-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on zu dem Hauptprodukt weniger als 1:10 beträgt.

Es besteht daher ein anhaltendes Bedürfnis für die Entwicklung eines kommerziell attraktiven Verfahrens für die Herstellung von 20oc-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3~ on und 20<*--Hydroxyraethylpregn-4-en-3-on.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Es wurde nunmehr gefunden, daß 20oo-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und 20c*--Hydroxymethylpregn-4-en~3-on durch mikrobiologische Oxidation eines Sterins, eines C-3-Esterderivats davon, eines C-3-Ätherderivats davon oder eines Zwischenprodukts der Oxidation dieser Verbindungen mit einem der Gattung Mycobacterium angehörenden Mikroorganismus, der in der Lage ist, 20cc-Hydroxymethylpregna-1,4-

dien-3-on oder 20ex—Hydroxymethylpregn-4-en-3-on als Hauptprodukt zu liefern, mit hoher Ausbeute und in hohen Konzentrationen erhalten werden.

Gegenstand der Erfindung ist. daher ein Verfahren zur Her-. stellung von. Steroidaikohoien bzw.. Hydroxysteroiden,- das

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dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus, der der Gattung Mycobacterium angehört und der dazu in der Lage ist, als Hauptprodukt 20cc-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on oder 20oc-Hydroxymethylpregn-4~en-3-on zu liefern, in Gegenwart eines Sterinsubstrats züchtet. > '

Der Mikroorganismus der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, gehört der Gattung Mycobacterium an und ist dazu in der Lage, 20 oc-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on oder 20oc -Hydroxymethylpregn-4-en-3-on als Hauptprodukt zu bilden. Es versteht sich, daß irgendein beliebiger Mikroorganismus verwendet werden kann, vorausgesetzt,daß er 20cC-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on, 20oc-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on oder eine Mischung davon als Hauptprodukt zu bilden vermag. Die Aussage "20oc-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on oder 20o^-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on als Hauptprodukt zu bilden" steht für eine Ausbeute an 2Ooc-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on + 20a~-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on von mehr als 50 Mol-%, bezogen auf das umgesetzte Sterinsubstrat, d. h. es besteht die folgende Gleichung:

Y = ( —~- +. '—— ) χ 100 > 50

worin Y für die prozentuale Ausbeute, g.. . die Menge des gebildeten 20oc-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-ons (in Mol) , g„ die Menge des gebildeten 20ot.-Hydroxymethylpregn-4-en-3-ons(in Mol) und G die Menge des verbrauchten Sterins (in Mol) bedeuten.

Bekannte Mikroorganismen, die der Gattung Mycobacterium angehören (und die im folgenden als wilde Stämme be-

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zeichnet werden) bilden 20cc-Hydroxymethylpregna-1 ,4-dien-3-on oder 20 oL~Hydroxypregn-4-en-3-^on nicht als Hauptprodukt, selbst wenn die Fermentation unter Verwendung eines Sterins als Substrat durchgeführt wird. Daher unterscheiden sich die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Mikroorganismen deutlich von den wilden Stämmen dadurch, daß sie als Hauptprodukt 20oc -Hydroxyrnethylpregna-1,4-dien-3-on oder 2Ooc-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on liefern. Diese Mikroorganismen schließen Mutanten ein, die die En-zyme, die 20oc -Hydroxymethylpregna-1 ,4-dien-3-on und/ oder 20cc-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on abbauen, nicht oder nur in geringem Maße aufweisen bzw. bilden oder bei denen das Enzym bei einer späteren Stufe des Stoffwechselweges aktiv wird. Weiterhin schließen diese Mikroorganismen Mutanten ein, die Enzyme nicht oder nur in geringen Mengen aufweisen bzw. bilden, die -an irgendeiner Stelle in dem Stoffwechselweg von einem Sterin zu Androst-4-en-3,17-dion oder Androsta~1,4-dien-3,17-dion (beispielsweise 23,24-Bisnorchola-1,4-diencarbonsäure) aktiv sind und damit den Hauptstof fwechselweg in Richtung auf 20 <*--Hydroxymethylpregna-1 ,4-dien-3-on und/oder 20cc-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on verschieben, so daß sich 20 c*--Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und/oder 20 cc-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on ansammeln.

Ein Beispiel für solche Mutanten ist der Mycobacterium parafortuitum-Komplex MCI 0617, den man durch Behandeln des Mutterstarmts Mycobacterium parafortuitum-Komplex ATCC 25790 (Mycobacterium neoaurum ATCC 25790)

mit Ultraviolettlicht erhält. Diese Mutante hat von dem Fermentation

Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Inage, Chiba City, Japan, wo dieser Mikroorganismus hinterlegt worden ist, die Hinterlegungsnummer FERM-P-4258 erhalten. Diese Mutante wurde am 26. September 1978 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) 3400 Göttingen, Grisebachstraße 8, Bundesrepublik Deutschland, hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer DSM 1381 erhalten. Proben dieser Mutante können gemäß Regel 28 des Europäischen Patentübereinkomnens von der Hinterlegungsstelle bezogen werden.

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Gemäß der zweiten gemeinsamen Untersuchung der "International Working Group on Mycobacterial Taxonomy (IWGMT)" wird der Mikroorganismus ATCC 25790, d. h. der Mutterstamm der vorliegenden Mutante, als "Mycobacterium parafortuitum-Komplex" bezeichnet (H. Haito et al, Int. J. Syst. Bacteriol. 27 (1977), 75-85).

Der von M. Tsukamura in jüngster Zeit vorgeschlagene Stamm Mycobacterium aurum (der Standardstamm ist der Stamm Tsukamura No. 358 (ATCC 23366)) schloß ursprünglich den Stamm Tsukamura No. 309 (ATCC 257 90) ein (M. Tsukamura, Med. Biol. (Tokyo) 72 (1966) 270-273). Anschließend beschrieb Tsukamura den Stamm Mycobacterium neoaurum als neue Art (der Standardstamm ist der Stamm Tsukamura No. 3503 (ATCC 25795), der sich von M. aurum unterscheidet. Der Stamm ATCC 2 57 wurde jedoch in M. aurum belassen bzw. diesem Stamm zugerechnet (M. Tsukamura, Med. Biol. (Tokyo) 8 5 (1972) 22 9-233).

Bei der zweiten cooperativen IWGMT-Üntersuchung wurde jedoch vorgeschlagen (H. Saito et al, loc. cit., S. 77, Fig. 1), daß der Stamm ATCC 25790 (der

als M. neoaurum, nicht als M. aurum anzusprechen ist) mit 90%iger interner Ähnlichkeit in dem Cluster 8 enthalten ist, der acht Stämme enthält, einschließlich dem Stamm ATCC 257 95, den Standardstamm M. neoaurum. Weiterhin schlossen Saito et al (loc. cit.), daß "eine erhebliche intertaxonomische Ähnlichkeit in dem einen Komplex vorzuliegen scheint, der M. parafortuitum (Tsukamura), M.

diernhoferi (Bönicke und Juhasz), M. aurum (Tsukamura), M. neoaurum (Tsukamura) und einen Cluster von Kanazawa-Stämmen enthält. Es wird angenommen, daß diese eng verwandten, normal saprophytxschen, schnell wachsenden Mykobakterien nicht aufgespalten werden sollten, sondern als Komplex anzusehen sind, der als "M. parafortuitum-Komplex" bezeichnet werden soll, bis genauere Identifizierung möglich ist."

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M. Tsukarnura und S. Mizuno (J. Gen. Microbiol. 98 (1977), 511-517) kamen zu dem ähnlichen Schluß, daß M. parafortuitum, M. aurum und M. neoaurum als drei Unterarten der Art M. ' parafortuitum oder als ein Komplex, d. h. der "M. parafortuitum-Komplex" anzusehen sind.

Die morphologischen und physiologischen Eigenschaften des · M. parafortuitum-Komplexes und ein Vergleich mit seinen verwandten Taxa sind in den Tabellen der folgenden Veröffentlichungen zusammengestellt: H. Saito, Kekkaku 50 (1975), 402, Tabelle; H. Saito et al, loc. cit. (1977), 80-81, Tabelle 2; und M. Tsukamura und S. Mizuno, loc. cit. (1977), 515, Tabelle 3.

Wie oben angegeben, scheint es vernünftig zu sein, die taxonome Stellung des Mutterstammes ATCC 257 90 (Tsukamura No. 309) auf der Grundlage der zweiten gemeinsamen IWGMT-Untersuchung als M. parafortuitum-Komplex zu bezeichnen.

Die Eigenschaften des M. parafortuitum-Komplexes sind: grampositiv; säurebeständig; unbeweglich; nicht sporenbildend; tritt stäbchenförmig auf; schnelles Wachstum; scotochromogen; gehört der Runyon-Gruppe IV an. Die von dem Mutterstamm ATCC 25790 abgeleitete Mutante MCI-0617 unterscheidet sich taxonomisch kaum von dem Mutterstamm, mit dem Unterschied, daß die Mutante auf Agar-Medien rauhe Kolonien bildet. Daher ist der Stamm MCI-0617 dem M. parafortuitum-Komplex zuzurechnen, da der Mutterstamm, wie oben angegeben wurde, M. parafortuitum-Komplex bezeichnet wird.

Es ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäß verwendete Mutante sich von den Stämmen Mycobacterium sp. NRRL B-3683 und NRRL B-3805 (in jüngster Zeit wurde der Stamm NRRL B-3805 in der japanischen Offenlegungsschrift No. 105 289/ 1977 als Mycobacterium vaccae identifiziert und erwähnt) unterscheidet, die in den US-Patentschriften 3 759 791 und

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3 684 657 als mutante Stämme beschrieben sind, die Androst-4-en-3,17-dion und Androsta-1,4-dien-3,17-dion produzieren.

Hinsichtlich des Vergleiches dieser Taxa sei auf die folgenden Druckschriften verwiesen: R. E. Buchanan und N. E. Gibbons (Co-Autoren) "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage (1974), 659-696, Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA; H. Saito, Kekkaku 50 (1975), 402; H. Saito et al, Int."j. Syst. Bacteriöl. 27 (1977), 80-81; und M. Tsukamura und S. Mizuno, J. Gen. Microbiol. 98 (1977), 515. Der Stamm MCI-0617 unterscheidet sich sowohl taxonomisch als auch physiologisch (d. h. bezüglich des Abbaus von Androsta-1,4-dien-3,17-dion, Androst-4-dien-3 ,17-dion und 9<*--Hydroxy-androst-4-en-3 ,1 7-dion) von den beiden Stämmen NRRL B-3805 und NRRL B-3683, indem der Stamm MCI-0617 auf diesen Substraten schlecht wächst, während die beiden anderen genannten Stämme darauf nicht wachsen.

Wie oben bereits erwähnt, kann die von dem Mutterstamm ATCC 25790 abgeleitete Mutante MCI-0617 dem M. parafortuitum-Komplex zugerechnet werden und unterscheidet sich darüber hinaus taxonomisch von allen bekannten mutanten Stämmen, die Androsta-1,4-dien-3,17-dion und Androst-

4-en-3,17-dion bilden. '

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Steroidsubstrate umfassen Sterine, ihre C-3-Esterderivate, ihre C-3-Ätherderivate und die bei der Oxidation dieser Verbindungen anfallenden Zwischenprodukte.

Sterine besitzen in der C-3-Stellung eine Hydroxylgruppe, normalerweise eine Doppelbindung in der C-5-Stellung, eine Seitenkette mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen in der C-17-Stellung und in gewissen Fällen eine Doppelbindung in den C-7-, C--8-, C-9- (11) -Stellungen des Perhydrocyclo-

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pentanophenanthrenkerns und dergleichen. Beispiele für solche Sterine sind Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Sitosterin, Ergosterin, Brassicasterin, Fucosterin, Lanosterin, Agnosterin, Dihydrolanosterin und Dihydroagnosterin.. Besonders bevorzugt sind Cholesterin, Campesterin und Sitosterin.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man auch die C-3-Esterderivate von 3-ß-Hydroxy-sterinen mit anorganischen Säuren, beispielsweise Schwefelsäure, oder organischen Säuren, beispielsweise Fettsäuren, als Ausgangsmaterialien verwenden. Beispiele für solche C-3-Esterderivate sind Cholesteryloleat, Cholesterylpalmitat und Cholesterylsulfat.

Weiterhin kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsmaterialien die C-3-Ätherderivate verwenden, die man beispielsweise dadurch erhält, daß man ein Alkylenoxid an die 3-ß-Hydroxylgruppe der Sterine anlagert. Ein Beispiel für ein solches C-3-Ätherderivat ist PoIyoxyäthylen-cholesteryl-äther.

Es versteht sich von selbst, daß man Wollwachs bzw. Rohwollfett und Lanolin, die die oben beschriebenen C-3-Esterderivate der Sterine enthalten; cholesterinhaltigen Wollfettalkohol, den man durch Hydrolyse' von Lanolin enthält; und das C-3-Ätherderivat Polyoxyäthylenlanolinalkoholäther, den man durch Umsetzen von Wollfettalkohol mit Äthylenoxid erhält, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsmaterialien einsetzen kann.

Als Ausgangsmaterialien kann man bei dem erfindungsge- mäßen Verfahren auch Sterine enthaltende Naturprodukte und verarbeitete Materialien verwenden, wie Abfallöle, 35 die beim Reinigen von Fischöl oder Tintenfischöl durch Waschen mit Alkali anfallen, deodorierten Schaum und

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Schlamm von pflanzlischen ölen sowie Tallöl.

Geeignete Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemäße Verfahren sind auch Zwischenprodukte der Oxidation von Sterinen, ihrer C-3-Esterderivate oder ihrer C-3-Ätherderivate. Die Oxidationszwischenprodukte schließen die 4-en-3-on-Derivate und die 1,4-dien-3-on-Derivate der Sterine ein, beispielsweise Cholest-4-en-3-on, Cholesta-1,4-dien-3-on und Cholestä-4,22-dien-3-on.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßeri Verfahrens wird ein Medium verwendet, das mindestens 0,1 Gew.-% Glyceride enthält.

Die dem Kulturmedium zugesetzten Glyceride schließen Monoglyceride, Diglyceride und Triglyceride ein.

In ähnlicher Weise kann man einfache Glyceride, die identische Fettsäurereste enthalten, sowie gemischte Glyceride, die zwei oder drei verschiedene Fettsäurereste aufweisen, verwenden. Die Fettsäurereste schließen die Reste ungesättigter Fettsäuren und die Reste gesättigter Fettsäuren ein.

Aus Gründen des hydrphilen Verhaltens der Ausgangsmaterialien ist es bevorzugt, Materialien auf der Grundlage von Fettsäureresten mit bis zu 26 Kohlenstoffatomen zu verwenden.

Beispiele geeigneter einfacher Glyceride sind Monoglyceride, wie c^-Monoacetin, ß-Monoacetin, o^-Monopalmitin, ß-Monopalmitin, c^-Monostearin, ß-Monostearin, oe-Monoolein, ß-Monoolein und dergleichen; Diglyceride, wie oC, ex»¹-D iac et in, oc, ß-Diacetin, &,£*-'-Dipalmitin, cc,ß-Dipalmitin, oc,cC -Distearin, cc, ß-Distearin, <*_,<?-' -Diolein, cc,ß-Diolein und dergleichen; und Triglyceride,

i'lX Lu U JJ-LiJ U JL

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wie Triacetin, Trilaurin, Trimyristin, Tripalmitin, Tristeari.n, Triolein und dergleichen.

Beispiele für erfindungsgemäß geeignete gemischte Glyceride sind 1-Aceto-2,3-dipalmitin, 1-Palmito-2,3-dicaprin, 1 -Lauro~2-railisto-3-palmitin, 1 -Lauro^-myristo-S-palmitin, 2-0leo-1,3-dipalmitin und 2-Stearo-1,3-diolein.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man anstelle der Glyceride auch Fette verwenden. Der hierin verwendete Ausdruck "Fette" schließt pflanzliche Fette und öle und tierische Fette und öle unabhängig von ihrem physikalischen Zustand ein. Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Fette pflanzlichen Ursprungs sind Leinöl, Perillaöl, Tungöl, Sesamöl, Maisöl, Rapsöl, Baumwollsamenöl, Safioröl, .· Sojaöl, Sojalecithin, Kamelienöl; Kamillenöl, Reiskleieöl, Olivenöl, Rizinusöl, Erdnußöl, Kokosöl, Palmenöl und Palmkernöl. Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Fette tierischen Ursprungs sind Fischöl, Walöl, Rindertalg, Schweinefett bzw. Schweineschmalz, Hammeltalg bzw. Hammelfett, Rinderhuföl und Lebertran.

Es ist nicht erforderlich, die oben angeführten natürlich vorkommenden Fette in starkem Maße zu reinigen. Es ist doch bevorzugt, zunächst Substanzen zu entfernen, die der mikrobiologischen Oxidation abträglich sind.

Beispiele bevorzugter Fette pflanzlischen Ursprungs sind eßbare Fette, wie Olivenöl, Sojaöl, Sojalecithin, Baumwollsamenöl, Maisöl, Sesamöl, Rapsöl, Erdnußöl, Kamelienöl, Kamillenöl, Palmöl, Kokosöl und dergleichen. Baumwollsamenöl, Sojaöl, Rapsöl und Palmöl sind aufgrund ihrer stabilen Lieferbedingungen besonders bevorzugt. Beispiele für bevorzugte Fette tierischen Ursprungs sind Schweine-5 schmalz und Tallöl.

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Man kann die glyceridhaltige Substanz allein oder gewünschtenfalls in Form einer Mischung aus zwei oder mehreren glyceridhaltigen Substanzen gleicher oder verschiedener Art verwenden.

Die Anwendung einer geringen Menge glyceridhaltiger Substanzen erhöht die Ausbeuten an 20 o(.-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und/oder 20 Cv-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on nur in geringem Ausmaß. Andererseits ist die Anwendung eines Überschusses der glyceridhaltigen Substanzen nicht bevorzugt, da bei massiver Anwendung der glyceridhaltigen Substanzen eine Inhibierung bewirkt wird. Daher werden die glyceridhaltigen Substanzen dem Kulturmedium in einer Menge zugesetzt, die in dem Kulturmedium eine Glyceridkonzentration von normalerweise etwa 0,1 bis 10 Gew.-%, bevorzugter von etwa 0,2 bis 7 Gew.-% und noch bevorzugter von etwa 0,3 bis 4 Gew.-% ergibt.

Man kann ölsamen und Ölfrüchte zu dem Kulturmedium zugeben, um eine-Glyceridkonzentration im oben beschriebenen Bereich zu erzielen. Beispiele geeigneter ölsamen und Ölfrüchte sind Leinsamen, Sojabohnen, Rapssamen, Baumwollsamen, Sesamsamen, Erdnüsse, Saflorsarnen, Mais und Reiskleie

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Die Zugabe von Pflanzenölmehl zusammen mit der glyceridhaltigen Substanz zu dem Kulturmedium übt eine günstige Wirkung auf die Bildung von 20 t>(.-Hydroxymethylpregna-1 , 4~ dien-3-on und/oder 20 o(-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on aus und erhöht die Ausbeuten an diesen Verbindungen.

Der Ausdruck "Pflanzenölmehl", der hier verwendet wird, steht für die Rückstände der Gewinnung von pflanzlichen Fetten und ölen, d. h. für die vermahlenen Rückstände, die bei der Extraktion ölhaltiger Samen und Früchte anfallen. In Abhängigkeit von dem Extraktionsverfahren enthalten die

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Mehle unterschiedliche Prozentsätze Protein und Fett. Man kann jedoch' irgendwelche Pflanzenölmehle verwenden. Im allgemeinen sind im Handel erhätliche Pflanzeriölmehle bevorzugt.

Beispiele für geeignete Pflanzenölmehle sind Sojaölmehl, Leinsaraenölmehl, Perillaölmehl, Rapssamenölmehl,'Baumwollsamenölmehl, Sesamölmehl, Erdnußölmehl, Saflorölmehl, Tungölmehl, entfettetes Maispulver, Kamelienölmehl, Kamillenölmehl, entfettete Reiskleie, Olivenölmehl, Kokosölmehl und Palmölmehl.

Vorzugsweise sind die Pflanzenölmehle auf einen solchen Feinheitsgrad vermählen, daß sie ohne weiteres von dem Mikroorganismus assimiliert werden können.

Man kann die Pflanzenölmehle einzeln oder in Kombination mit anderen .Pflanzenölmehlen verwenden.

Die Anwendung einer geringen Menge der Pflanzenöimehle führt zu einer geringfügigen Steigerung der Ausbeute an 20 o^-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und/oder 20c<^- Hydroxymethylpregn-4-en-3-on. Andererseits erhöht die Anwendung eines Überschusses der Pflanzenöimehle die Viskosität der Fermentationsbrühe und erschwert das Rühren.

Daher werden die Pflanzenölmehle dem KuLturmedium in einer solchen Menge zugesetzt, daß sich eine Konzentration von normalerweise 0,5 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise etwa. 1 bis 15 Gew,-% und noch bevorzugter von etwa 1,5 bis 10 Gew.-% ergibt.

Neben der glyceridhaltigen Substanz und dem Pflanzenöl-mehl werden dem Kulturmedium Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Substanzen zugesetzt. 35

Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenwasserstoffe;

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Alkohole, wie Methanol und Äthanol; organische Säuren, wie Bernsteinsäure, Essigsäure u. dgl. und deren Salze; und Saccharide, wie Stärke, Maltose, Saccharose, Glucose, Rhamnose u. dgl.

Man kann dem Kulturmedium auch natürliche Nährstoffquellen, die Kohlenstoff queren, Stickstof f quellen und andere Nährstoffsubstanzen enthalten, zusetzen.

/ 10 Beispiele für derartige natürliche Nährstoffquellen sind

Melassen, einschließlich Hightestmelassen und Xylosemelassen, Maiskolben, Alfalfa, Maisquellwasser, lösliche Destillierrückstände bzw. Brennereirückstände, Mieki (eine wäßrige Lösung einer Aminosäuremischung, die man durch Hydrolyse von Sojaölmehl mit Chlorwasserstoffsäure erhält), Fischmehl, Hefe, Kleie, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Kartoffelextrakt, Malzextrakt, Gluten, Pepton, Glutamate, Asparagin, Glycin, Casein, Caseinhydrolysat und Magermilch.

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Beispiele für geeignete anorganische Substanzen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden, sind Stickstoffquellen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid u. dgl.; Kalium und Phosphor-Quellen, wie Dikaliumhydrogenphosphat; Eisensalze, Kupfersalze, Magnesiumsalze, Mangansalze, Kobaltsalze, Zinksalze, Calciumsalze ü. dgl·.; und Asche von Naturprodukten, wie von Melassen.

In-dem Kulturmedium"können auch,andere-Bestandteile, beispielsweise Vitamine, vorhanden sein, vorausgesetzt, daß sie die Wirkung der Hauptkomponenten nicht beeinträchtigen.

Die Zusammensetzung des erfindungsgemäß verwendeten KuI-turmediums hängt von dem angewandten Mikroorganismus ab.

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Kritische Bestandteile des Kulturmediums sind die Kohlenstoffquellen, die Stickstoffquellen, Kalium, Phosphor und Magnesium. .

Erforderlichenfalls kann man dem Kulturmedium Antischaummittel, beispielsweise ein Polyoxyalkylenglycol, zusetzen. Diese Materialien müssen jedoch nicht stets verwendet werden.

Das Kulturmedium kann weiterhin ein oberflächenaktives Mittel enthalten, das nicht notwendig ist, jedoch normalerweise die Handhabung des Kulturmediums erleichtert. Beispiele für geeignete oberflächenaktive Mittel sind nichtionische und anionische oberflächenaktive Mittel, wie Polyoxyäthylensorbitanmonostearat, Polyoxyäthylensorbitanmonopalmitat und Polyäthylenglycolmonostearat.

Im allgemeinen liegt die Inkubatiönstemperatur im Bereich von 20 bis 40°C und noch bevorzugter im Bereich von 30 bis 35⁰C.

Der pH-Wert des Kulturmediums wird normalerweise auf einen Wert von 5 bis 10 und vorzugsweise auf einem Wert von 6 bis 9 eingestellt. Da der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus der Gattung Mycobacterium angehört, vermag er, wie dem Fachmann bekannt ist, einem pH-Wert von etwa 10 zu widerstehen.

Im allgemeinen wird das Steroidsubstrat zusammen mit dem Kulturmedium sterilisiert. Man kann es auch dem Kulturmedium nach Beginn des Brütvorgangs zusetzen. Man kann das Steoridsubstrat auch portionsweise zugeben. .

Das Sterinsubstrat wird, nach dem Sterilisieren durch trockene Hitze oder durch feuchte Hitze in irgendeiner geeigneten Weise, zugesetzt, beispielsweise in Form eines

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.; ; - 15 - ä

Pulvers oder einer Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise in Dimethylformamid, oder in Form einer durch Ultraschalldispersion erhaltenen Suspension.

Vorzugsweise gibt man das Sterinsubstrat und das oberflächenaktive Mittel gemeinsam zu, um das Emulgieren des Sterinsubstrats zu begünstigen.

Die Inkubationszeit ist nicht kritisch. Im allgemeinen nimmt die Menge des gebildeten 20oc-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-ons und/oder des 20c^-Hydroxymethylpregn-4-en-3-ons drei Tage nach der Zugabe des Sterinsubstrats schnell zu. Anschließend nimmt die Menge des gebildeten 20 (/.-Hydroxymethylpregna-1 ,4-dien-3-ons und/oder des 20oc-Hydroxymethylpregn-4-en-3-ons graduell mit der Inkubationszeit zu. Eine Inkubationszeit von nicht weniger als 20 Tagen ist jedoch von geringem kommerziellen Wert.

Nach Beendigung der Fermentation wird das gebildete 20 ⁰^- Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und/oder das gebildete 20 ^-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on unter Anwendung üblicher Verfahrensweisen aus der Fermentationsbrühe gewonnen. Beispielsweise erhält man rohes 20 oc-Hydroxymethylpregna-1 ,4-dien-3-on und/oder 20«, -Hydroxymethylpregn-4-en-3-on durch Extrahieren dieser Verbindungen mit der mehrfachen Menge eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, beispielsweise Äthylacetat, bezogen auf die Menge 20c^-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on + 20oc-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on, und anschließendes Entfernen des Lösungsmittels aus dem Extrakt. Wenn die Trennung von 20o^c~-Hydroxymethylpregna-1 ,4-dien-3-on, 20oi--Hydroxymethylpregn-4-en-3-on, dem Sterinsubstrat und den Nebenprodukten erforderlich ist, kann man diese Materialien säulenchromatographisch unter Verwendung von Kieselgel, Aluminiumoxid oder porösen Harzen als Adsorbentien und Petroläther, Bemsol, Chloroform, Äther, Aceton,

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Methanol, Äthylacetat oder dergleichen als Elutionsmittel trennen. Die abgetrennten Produkte, 20 c^-Hydroxymethylpregna*-1 ,4-dien-3-on' oder 20 £?C-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on, kann man weiter reinigen, beispielsweise durch wiederholtes Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise einer 10%igen Lösung von Äthanol in Hexan.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man 20oL~ TO Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und/oder 20^-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on mit einer Ausbeute von nicht weniger als 50 Mol-% und im allgemeinen von nicht weniger als 70 Mol-%, bezogen auf das verbrauchte Sterin, gewinnen.

Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch von kommerziellem Vorteil, daß' die Inkubation bei hoher Substratkonzentration (beispielsweise 1 bis 4 %) die Ausbeute an 20 oC-Hydroxymethylpregna-1 ,4-dien-3-on und/oder 2OaC-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on erhöht.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

In den folgenden Beispielen wurden die Analysen hinsichtlieh der Sterine, ihrer Derivate, 20&C -Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on, 20 d.-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on, der noch

vorhandenen Sterine und der als Nebenprodukte anfallenden Steroide gaschromatographisch durchgeführt. Wenn nichts anderes angegeben ist, sind die in den folgenden Beispielen angegebenen Prozentsätze auf das Gewicht bezogen.

Beispiel 1

Man bereitet ein Impfmedium (mit einem pH-Wert von 7,2) der folgenden Zusammensetzung:

Case FD-80

- 17 - 2

1,0 Gew.-% Glucose 1,0 Gew.-% Fleischextrakt 1,0 Gew.-% Pepton und Wasser als Rest

Man beschickt einen 500 ml-Schüttelkolben mit 100 ml des Impfmediums. Dann sterilisiert man den Kolben und seinen Inhalt im Autoklaven während 15 Minuten bei einer Temperatur von T20°C. Man impft das Medium mit einer Platinöse Mycobäcterium parafortuitum-Komplex MCI 0617 an und inkubiert das beimpfte Medium während 72 h bei einer Temperatur von 30°C auf einem Reziprokschüttler, der mit einer Schüttelbewegung von 7 cm und 120 Schüttelbewegungen pro Minute betrieben wird.

Zu jeweils 10 der 500 ml-Schüttelkolben gibt man 50 ml eines Hauptfermentationsmediuras (mit einem pH-Wert von 7,0) der folgenden Zusammensetzung:

4 Gew.-% Sojaölmehl

0,2 Gew.-% K₂HPO₄

0,1 Gew.-% MgSO,-7H₉O

2 Gew.-% Fischölrückstand

0,2 Gew.-% NaNO₃

1,0 Gew.-% Cholesterin

Man sterilisiert die Kolben und ihren Inhalt im Autoklaven während 20 min bei einer Temperatur von 120°C. Dann beimpft man jeden der Kolben mit 2 ml der in der obenbeschriebenen Weise gebildeten Impfkulturbrühe. Die Hauptfermentation wird mit einer Temperatur von 30⁰C auf einem Reziprokschüttler durchgeführt, der mit einer Schüttelbewegung von 7 cm und 120 Schüttelbewegungen pro Minute betrieben wird. Nach Ablauf von 160 h seit Beginn der In-5 kubation unterbricht man die Inkubation. Man extrahiert die vereinigten Fermentationsbrühen zweimal mit 2 1 Äthyl-

Case FD-8O

acetat. Nach dem Abfiltrieren der unlöslichen Materialien, wie von Zellen, von dem vereinigten Extrakt zeigt die Analyse des Steroidgehalts des Extrakts,das dieser.O,05 g des als Substrat eingesetzten Cholesterins, 2,65 g 20e£--Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und 0,22 g 20oc-Hydroxymethylpregn-4-en~3-on enthält.

Daraus ist ersichtlich, daß 20cc -Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und 20o<- -Hydroxymethylpregn^-en-S-on mit einer Ausbeute von etwa 8 5 %, bezogen auf das verbrauchte Sterin, gebildet wurden. Die Nebenprodukte enthalten 0,03 g Androsta-1,4-dien-3,17-dion. Der Extrakt wird über Kieselgel chromatographiert und mit einer 20%igen Lösung von Äthylacetat in η-Hexan eluiert,um 20oc-Hydroxymethylpregna-

•j 5 1,4-dien-3-on und 20oc -Hydroxymethylpregn^-en-S-on von dem restlichen Substrat und den Nebenprodukten abzutrennen. Die 20oc -Hydroxymethylpregna-1., 4-dien-3-on enthaltende Fraktion'und- die 2Ooc -Hydroxymethylpregn-4-en-3-on enthaltende Fraktion werden jeweils eingeengt und dann durch Verdampfen des Lösungsmittels und zweimaliges Umkristallisieren aus einer 10%igen Lösung von Äthanol in Heptan gereinigt und ergeben 2,45 g 20oc-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on bzw. 0,17 g 20oc -Hydroxymethylpregn^-en-S-on in Form der reinen Kristalle.

Diese Verbindungen sind hinsichtlich ihres Schmelzpunkts, ihres Massenspektrums,ihres NMR-Spektrums und ihres IR-Spektrums mit den in der Literatur beschriebenen Materialien identisch.

Beispiel 2

Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels T mit dem Unterschied, daß man anstelle von Cholesterin die in der . 35- nachstehenden Tabelle 1 angegebenen Sterine als Ausgangs- materialien verwendet. . ·

Case FD-8P

- 19 Tabelle I

	HPD*	Produkt	(g)	Verbleibendes Substrat
	1 ,88			0,67
ß-Sitosterin + Campesterin (2:1-Mischung)	1,33			1 ,48
;Gholestr4-en-3-on	2,13			0,85
Cholesta-1,4-dien~3-on	0,29			3,10
Gholesteryloleat
	. 4HP**
0,12
0,08
0,02
0,03'

* HPD = 20c£-Hydroxymethylpregna-1 ,4-dien-3-on ** 4HP = 2Oo<- -Hydroxymethylpregn-4-en-3-on

Beispiel 3

Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 1 mit dem Unterschied, daß man ein wäßriges Hauptfermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

6 Gew.~% gemahlene Sojabohnen 0,25 Gew.-1 Gew.-% 0,1 Gew.-%

K₂HPO₄

Hefe MgSO₄-7H₂O

Cholesterin in der in der nachstehenden Tabelle II angegebenen Konzentration:

Die erzielten Ergebnisse sind ebenfalls in der nachstehenden Tabelle II zusammengestellt.

FD-80

Tabelle II

Cholesterinkonzentration (Gew.-%)	HPD* (g)	4HP** (g)	Verbleibendes Cholesterin (g)
0,2	0,68	0,06	0,0
0,5	1,35	0,10	0,0
0,8	2,57	0,13	0,15
1,0	2,81	0,18	0,40

* HPD = 20<£.-Hydroxymethylpregna-1 , 4-dien-3-on ** 4HP = 20cc-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on

Beispiel 4

Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 1 mit dem Unterschied, daß man einen 5 1-Schüttelkolben verwendet, der 800 ml eines. Kulturmediums enthält, das 1,0 Gew.-% Glucose, 1,0 Gew.-% Fleischextrakt, 1,0 Gew.-% Pepton, 0,5 Gew.-% eines oberflächenaktiven Mittels'(Tween-80 der Firma Kao Atlas Co., Ltd.), 1,0 Gew.-% Cholesterin und als Rest Wasser enthält. Man führt die Hauptfermentation weiterhin bei 30⁰C auf einem Reziprokschüttler mit einer Schüttelbewegung von 7 cm durch, der bei 100 Schüttelbewegungen pro Minute während 150 h . betrieben wird, nachdem der Kolben mit 20 ml der Impfkulturbrühe angeimpft worden ist. Die Analyse des fithylacetatextrakts zeigt, daß dieser 0,90 g 20 cc-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und 0,76 g 20oC-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on enthält. Die vorhandene nicht umgesethte Cholesterinmenge beträgt 4,8 g.

Case FD-80

Beispiel 5

1,0 Gew.-% Glucose 1,0 Gew.-% Fleischextrakt .1,0 Gew.-% Pepton und Wasser als Rest. .

.

Man beschickt einen 500 ml-Schüttelkolben mit 100 ml des Impfmediums und sterilisiert den Kolben und den Kolbeninhalt im Autoklaven während 15 min bei einer Temperatur von 120°C- Man beimpft das Medium mit einer Platinösenfüllung Mycobacterium parafortuitum-Komplex MCI 0617 und inkubiert dann das beimpfte Medium während 72 h bei einer Temperatur von 30°C auf einem Reziprokschüttler, der mit einer Schüttelauslenkung von 7 cm bei 120 Schüttelbewegungen pro Minute betrieben wird.

Man versetzt die zehn 500 ml-Schüttelkolben mit 50 ml eines Hauptfermentationsmediums (mit einem pH-Wert von 7,0) der folgenden Zusammensetzung:

5,0 Gew.-% Sojaölmehl

0,2	Gew.-%	K₂HPO₄
0,1	Gew.-%	MgSO₄-7H₂O
1,0	Gew..-%	Baumwollsamenöl
0,2	Gew.-%	NaNO₃
0,8	Gew.~%	Cholesterin und
Wasser als	Rest

Man sterilisiert die Kolben und die Kolbeninhalte im Autoklaven während 20 min bei einer Temperatur von 120°C. Dann beimpft, man jeden der Kolben mit 2 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Impfkulturbrühe. Man

Case

bringt die Hauptfermentation bei einer Temperatur von 30°C auf einem Reziprokschüttler in Gang, der mit einer Schüttelauslenkung von 7 cm und 120 Schüttelbewegungen pro Minute betrieben wird. Nach Ablauf von 1 50 h nach Beginn der Inkubation unterbricht man die Inkubation.

Man extrahiert die vereinigten Fermentationsbrühen zweimal mit 2 1 Äthylacetat. Nach dem Abfiltrieren der unlöslichen Materialien, wie Zellen, wird der Gehalt des Extrakts an 20 o^-Hydroxymethylpregna-i,4-dien-3-on und 20 oC-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on gaschromatographisch analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengestellt. Der Extrakt wird über Kieselgel chromatographiert und mit eine 20%igen Lösung von Äthylacetat in η-Hexan eluiert, wodurch 20c(.-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und 20<*--Hydroxymethylpregn-4-en-3-on getrennt und von dem als Substrat verwendeten Cholesterin und den Nebenprodukten abgetrennt werden. Man kann 20ck-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und 20 ci~-Hydroxymethylpregn-4~en-3-on durch Umkristallisieren entsprechender Fraktionen aus einer 10%igen Lösung von Äthanol in Heptan reinigen.

Man wiederholt die Inkubation unter Verwendung einer ß-Sitosterin/Campesterin-Mischung (2/1), von Cholest-4-en-3-on, von Cholesta-1,4-dien-3-on oder von "Cholesteryloleat anstelle von Cholesterin. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle III zusammengestellt.

Zu Vergleichszwecken sind auch die Ergebnisse angegeben, die man dann erhält,- wenn man kein Baumwollsamenöl zusetzt.

Das verwendete Baumwollsamenöl ist eine Mischung aus 5 annähernd 100 % Glyceriden. Das gleiche trifft auf die in den folgenden Beispielen verwendeten öle zu.

Case FD-ϊΒθ

\_* 2 1 Κ.-Ι L L _i- V^- Li -L.

- 23 - £ Tabelle III

Substrat	Zugesetztes Substrat	Produkt (g)	4HP**	Verbleibendes Substrat (g)
Cholesterin	keines Baumwoll- samenöl	HPD*	0,04 0,14	2,68 0,13
Sitosterin + Campester in	keines Baumwoll- samenöl	0,62 2,36	0,03 0,08	3,12 0,45
Cholest-4- en-3-on	keines Baumwoll- samenöl	0,43' 1 ,63	0,02 0,08	3,25 2,05
Cholesta-1,4- dien-3-on	keines Baumwoll- samenöl	0,44 1 ,16	0,01 0,03	3,05 0,65
Cholesteryl- oleat	keines Baumwoll- samenöl	0,57 1,89	0,01 0,03	3,65 3,20
0,11 0,28

* HPD = 20<X -Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on ** 4HP = 20cC-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on

Beispiel 6

Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 5 mit dem Unterschied, daß man anstelle des Baumwollsamenöls verschiedenen Glyceride und öle zu dem Fermentationsmedium zugibt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV zusammengestellt.

Case FD-&O

Tabelle IV

öl	keines	HPD*-Ausbeute	4HP**-Ausbeute
Olivenöl	(g) *	(g)
Maisöl	0/62	.0,04
Reiskleieöl	2,15	0,13
Palmöl	2,20	0,17
Kokosöl	2; 18	0,13
Sojaöl	2,45	0,19
Sesamöl	2,35	0,13
Erdnußöl	2,36	0,14
Leinöl	2,15	0,12
Sardinenöl	2,09	0,12
Schweinefett	2,09	0,12
Triolein	2,50	0,21
Tripalmitin	2,20	0,12
oC-Mono stearin	2,09	0,12
ei., oc' -Distearin	2,33	0,13
1,72	0,10
1,75	0,10

* HPD = 20cx -Hydroxymethylpregna-1 ,4-dien-3-on ** 4HP = 20=c -Hydroxymethylpregn-^-en-S-on

Beispiel 7

Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 5 mit dem Unterschied, daß man anstelle von 1 % Baumwollsamenöl Tristearin in verschiedenen Konzentrationen einsetzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle V zusammengestellt.

Case FD-8O

Tabelle V

Tristearin-Konzentration (Gew.-%)	" Produkt	HPD* (g)	4HP** (g)
0	0,55	0,04
0,10	0,98	0,07
0,2	1,15	0,07
0,3	1,43	0,08
0,5	1,75	0,10
1,0	2,40	0,15
1/5	2,61	0,15
2,0	2,55	0,16
3,0	1,55	0,08
4,0	1,21	0,07
7,0	0,80	0,05
10,0	0,70	0,05

* HPD = 20oc-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on ** 4HP = 2OaC-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on

Beispiel 8

Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 5 mit dem Unterschied, daß man ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

2	Gew.-%	Glucose
O,	15 Gew.-%	K₂HPO₄
1,	O Gew.-%	Palmöl
O,	2 Gew.-%	(NH₄)₂SO₄
O,	1 Gew.-%	MgSO₄-7H₂O
1,	O Gew.~%	Hefe
4	Gev;.-%	Pflanzenölmehl

Wasser als Rest.

Case FD-ao

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VI zusammengestellt.

Tabelle VI

Pflanzenölmehl	Produkt (g)	HPD*	4HP**
keines	0,42	0,07
Baumwollsamenölmehl	2,17	0,12
Sojaölmehl	2,25	0,20
Rapsölmehl	1 ,60	0,13
Sesamölmehl	2,01	0,21
Saflorölmehl	0,95	• 0,11

* HPD = 20cc-Hydroxymethlpregna-1 ,4-dien-3-on ** 4HP = 20<x-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on

Beispiel 9

Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 5 mit dem Unterschied, daß man ein Hauptfermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

2,0 Gew.-% Fischölrückstände

0,2 Gew.-% K₂HPO.

0,1 Gew.-% MgSO₄-7H₂O

0,2 Gew.-% NaNO₃

0,8 Gew.-% Cholesterin

6,0 Gew.-% gemahlene Sojabohnen (mit einem Glyceridgehalt von etwa 17 Gew.-%).

Wasser als Rest.

Man wiederholt die obigen Maßnahmen.mit dem Unterschied, daß man anstelle der gemahlenen Sojabohnen 3,0 Gew.-%

.--.. -^wwiWiij. ν», ι j. til ι IJU V_ Cl J-

Case FD-8Q

- 27 -

gemahlene Erdnüsse (Glyceridgehalt etwa 35 Gew.-%), 2,5 Gew.-% gemahlener Rapssame (Glyceridgehalt etwa 40 Gew\-%), 2,5 Gew.-% gemahlene Sesamsamen (Glyceridgehalt etwa 40 Gew.-%) verwendet.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VII zusammengestellt.

Tabelle

ölsamen bzw. Ölfrüchte	Produkt (g)	HPD*	4HP**
keines Sojabohnen Erdnüsse Rapssamen Sesamsamen	0,82 2,67 2,48 2,02 1,89	0,09 0,25 0,20 0,20 0,18

* HPD = 20oc-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on ** 4HP - 20<x-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on

Claims

Case FD-80

Erfindungsanspruch

• " .1 ι * ι . Ί

1. Verfahren zur Herstellung von Steroidalkoholen, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Mikroorganismus, der der Gattung Mycobacterium angehört und der dazu in der Lage ist, als Hauptprodukt 20 cC-Hydroxymethylpregna-i,4-dien-3-on oder 20cc-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on zu liefern, in Gegenwart eines Sterinsubstrats züchtet.
2. Verfahren nach Punkt 1 , dadurch gekennzeichnet , daß man als Sterinsubstrat Sterine, ihre C-3-Esterderivate, ihre C-3-Ätherderivate und/ oder die Zwischenprodukte der Oxidation dieser Verbindungen verwendet.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder Punkt 2, dadurch gekennzeichnet , daß man als Mikroorganismus eine Mutante verwendet.
4. Verfahren nach den Punkten 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Mikroorganismus des Mycobacterium parafortuitum-Komplex verwendet. .
5. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mycobacterium neoaurum angehörenden Mikroorganismus verwendet.
6. Verfahren nach Punkt 4, dad irrch' gekennzeichnet , daß man als Mikroorganismus Mycobacterium parafortuitum-Komplex MCI 0617 verwendet.

Case FD-80
7. Verfahren nach den Punkten 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet/ daß man einen Mikroorganismus verwendet, der die 20cC-Hydroxymethylpregna-1,4-dien~3-on oder 20<x.-Hydroxymethylpregn-4-en-on abbauenden Enzyme nicht oder nur in geringen Mengen bildet bzw. enthält.
8. Verfahren nach den Punkten 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß man das Züchten in einem Kulturmedium bewirkt, das mindestens ein
Glycerid in einer Glyceridkonzentration von mindestens 0,1 Gew.-% enthält.
9. Verfahren nach den Punkten 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Züchten in einem Kulturmedium bewirkt, das mindestens ein
Glycerid und mindestens ein Pflanzenölmehl enthält und eine Glyceridkonzentration von mindestens 0,1 Gew. aufweist.