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Herstellung von Retrosteroiden
Aus der USA-Patentschrift Nr. 2,004,472 ist bekannt, dass sich die 17-Seitenkette von Pregnanverbindungen mittels Fusarium solani abbauen lässt, wobei angeführt wird, dass das Ausgangsmaterial in beliebiger sterischer Konfiguration vorliegen könne. Während nun aber-wie sich aus der genannten USA-Patentschrift ergibt-die Inkubation mit Fusarium solani bei der Steroiden der Normalreihe stets eine Dehydrierung in 1, 2-Stellung zur Folge hat, lässt derselbe Mikroorganismus die 1, 2-Stellung von Retrosteroiden überraschenderweise, selbst bei länger dauernder Inkubation, praktisch unangegriffen.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäss die Verwendung von Fusarium solani zur Herstellung von am Ci, Sauerstoff enthaltenden, in 1, 2-Stellung gesättigten Retrosteroiden durch aerobe enzymatische Oxydation von in 1, 2-Stellung gesättigten Verbindungen der Retropregnanreihe mit je einer Ketogruppe in 3- und 20-Stellung und einer Doppelbindung in 4, 5-Stellung, insbesondere von A*-90, 10a-Pregnen-
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9-Substituent) die ss-Konfiguration aufweist. Steroide der Pregnanreihe mit Retrokonfiguration werden dementsprechend im folgenden als Retropregnane bzw. als 9ss,10α-Pregnane bezeichnet, Derartige Retrosteroide sind z. B. aus der belgischen Patentschrift Nr. 577 615 bekanntgeworden.
Die erfindungsgemässe Einwirkung der Enzyme von Fusarium solani (z. B. des unter der ATCC Nr. 12823 registrierten Pilzstammes) auf 20-Ketosteroide der Retropregnanreihe bewirkt den Abbau der 17-Seitenkette unter Ausbildung einer 17-Hydroxy-oder einer 17-Oxogruppe. Bei längerer Enzymeinwirkung kann sich aus dem D - Ring des Ausgangssteroids ein 5-Lactonring bilden. So kann z. B. aus dem #4,5-9ss,10α-Pregnadien-3,20-dion (I) (#6-Retroprogesteron) durch In-
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Die als Ausgangsstoffe verwendeten 20-Ketosteroide der Retropregnanreihe können gesättigt sein oder Doppelbindungen enthalten, beispielsweise in einer oder mehreren der Stellungen 4,5, 6,7, 8,9 (11) und 15, vorzugsweise in 4-Stellung und gegebenenfalls einer weiteren Stellung (wie z. B. zusätzlich in 6- oder in 6,9 (11)-Stellung). Die Ausgangsstoffe können ausser der 20-Oxogruppe noch weitere Substituenten im Ringsystem oder in der Seitenkette enthalten. Beispiele solcher Substituenten sind : Freie oder geschützte Oxogruppe, freie oder geschützte Hydroxygruppen, Halogenatome (wie Fluor- oder Chloratome) oder niedere Alkylgruppen. Eine geschützteOxogruppe ist insbesondere eine ketalisierte Oxogruppe, wie z. B. die Äthylendioxygruppe. Eine geschützte Hydroxygruppe ist beispielsweise eine veresterte Hydroxygruppe (verestert z.
B. mit einer niederaliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäure, wie Essigsäure, Propionsäure, Benzoesäure, Furancarbonsäure) oder eine verätherte Hydroxygruppe, wie die Tetrahydropyranyloxy-, Benzyloxy- oder Triphenylmethoxygruppe. Bevorzugte Ausgangsstoffe sind solche 20-Ketosteroide der Retropregnanreihe, welche in 3-Stellung eine Oxo- oder Hydroxy-
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Als Nährmedien für die Züchtung von Fusarium solani können die für die Entwicklung dieses Mikroorganismus an sich bekannten Nährlösungen verwendet werden, z. B. Nährlösungen mit einem Gehalt an einer Stickstoff- und Kohlenstoffquelle sowie anorganischen Salzen.
Als Stickstoffquellenseien beispielsweise erwähnt : Peptone, Maisquellwasser, Sojaprodukte, Hefeextrakte, Aminosäuren, Proteinhydrolysate, Nitrate und Ammoniumsalze. Als Kohlenstoffquellen kommen assimilierbare Kohlehydrate. wie Glucose, Saccharose sowie Aminosäuren in Betracht. Es können auch synthetische Nährlösungen verwendet werden.
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Die Züchtung des erfindungsgemäss für den Seitenkettenabbau eingesetzten Mikroorganismus (Fusarium solani) erfolgt unter aeroben Bedingungen, zweckmässig im Submersverfahren, beispielsweise in Schüttelkultur oder in Fermentern unter Rühren und Belüftung. Zweckmässig arbeitet man wie folgt : Die Nährlösung wird nach der Sterilisation angeimpft, z. B. mit einer vorgängig hergestellten Schüttelkolben-Kultur oder einer Mycel-Sporensuspension von Fusarium solani und hierauf 6-72 h, vorzugsweise 24 - 48 h, bei 15-40 C, vorzugsweise zwischen 24 und 30 C, unter Belüftung geschüttelt bzw. gerührt. Nach diesem Vorwachstum erfolgt unter sterilen Bedingungen die Zugabe des zu oxydierenden Retrosteroids in Form einer Lösung, z. B. in Aceton, Methanol oder Äthanol. Die Inkubationsdauer kann 1- 8 Tage oder auch länger, z.
B. bis zu 25 Tagen, betragen. Der Verlauf der Fermentation lässt sich durch Entnahme von Proben und deren dünnschichtchromatographische Untersuchung kontrollieren. Die Isolierung der Verfahrensprodukte kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen, wie Chromatographie, Gegenstromverteilung und fraktionierte Kristallisation.
Die Verfahrensprodukte können als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heilmitteln verwendet werden. Zum Teil sind die Verfahrensprodukte selbst physiologisch aktiv (z. B. anabolischoder antiandro- gen).
Beispiel 1 : 41 einer Nährlösung, enthaltend 20g Saccharose, 3gHefeextrakt, 19G1ykokoll, 1 g Natriumnitrat, 1 g primäres Kaliumphosphat, 0, 5 g Magnesiumsulfat, 0, 5 g Kaliumchlorid und 10 mg Eisensulfat/1000 ml destilliertes Wasser, werden in einem Schüttelgefäss 45 min bei 1200C sterilisiert.
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Lösung, deren pu-Wert 5, 0 beträgt,dien-3,20-dion (#6-Retroprogesteron) in 40 ml Aceton zugegeben. Dann wird die Kultur 8 Tage lang unter gleichbleibenden Bedingungen weiter gezüchtet.
Zwei auf die vorstehend beschriebene Art erhaltene Kulturen werden vereinigt und die Gärbrühe (total 8 l) vom Mycel abgetrennt. Die Gärbrühe wird zunächst mit 8 1, dann noch dreimal mit je 4 l Essigester extrahiert. Das abgetrennte Mycel wird mit 3 1 Essigester ausgerührt. Die vereinigten Extrakte werden mit einer wässerigen 10o ; oigen Kochsalzlösung gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet und schliesslich unter reduziertem Druck eingedampft.
Der ölige Eindampfungsrückstand (total 4, 6g) wird in 100 ml Essigester-Benzol (l : l) gelöst und mit 5 g Aktivkohle behandelt. Nach Filtration durch einen Filter aus Diatomeenerde erhält man eine hellgelbe, klare Lösung, welche auf Grund des Plattenchromatogrammes (Systeme Benzol-Aceton 7 : 3 und 4:1 auf Kieselgel) zur Hauptsache #4,6-9ss,10α-Androstadien-3,17-dion und #4,6-9ss,10α- Androstadien-17ss-ol-3-on enthält.
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zu 10 ml gesammelt. Jede zweite Fraktion wird plattenchromatographisch untersucht. Die übereinstimmenden Fraktionen werden vereinigt und unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft. Die Fraktionen 1 - 15 enthalten Verunreinigungen in geringer Menge.
Die Fraktionen 16-25 enthalten 1, 75 g'
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A*'169 - 1710C (nach zweimaliger Kristallisation aus Methylenchlorid-Aceton-Isopropyläther).#max(U.V.) = 285 mJ. l : E = 27 500.
Aus den Fraktionen 26 - 29 erhält man 0, 27 g eines Gemisches der vorgenannten 17-Hydroxy-und 17-Ketoverbindungen. Das hellgelbe Öl wird in 200 ml Benzol gelöst und mit einem Äquivalent Chromsäure in 5% iger Essigsäure versetzt. Das Gemisch wird 10 h geschüttelt, hierauf die organische Phase abgetrennt und diese mit Wasser, dann mit gesättigter Bicarbonatlösung und wieder mit Wasser gewaschen, schliesslich über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck zur Trockne eingeengt.
Man erhält so weitere 0,19 g #4,6-9ss,10α-Androstadien-3,17-dion.
Beispiel 2 : Vier mit Rührwerk versehene Fermenter werden mit je 61 des im Beispiel 1 beschriebenen Nährmediums unter Zusatz eines Schaumbekämpfungsmittels (Siliconöl) beschickt. Nach Sterilisation wird das Nährmedium mit einer 3 Tage alten Schüttelkolben-Kultur von Fusarium solani angeimpft und die Kultur unter Rühren und Belüften bei 280C 48 h wachsen gelassen. Es bildet sich dabei bereits eine reichliche Menge Mycel. In jenen Fermenter werden nun 1, 5gA -9ss, 10a-Pregnadien- - 3, 20-dion (. . 6-Retroprogesteron) in 40 ml Aceton gegeben.
Nach abgeschlossener Umsetzungwirddie
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Fermentation unterbrochen (im vorliegenden Versuch waren für die einzelnen Ansätze Inkubationszeiten von 2 bis 6 Tagen für die Umsetzung erforderlich), Nach Abtrennung des Mycels werden die Gärbrühen nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren extrahiert und aufgearbeitet (die einzelnen Rohextrakte zeigten bei der plattenchromatographischen Prüfung keinerlei Unterschiede bezüglich der Zusammensetzung und wurden deshalb vereinigt). Man erhält 10, 05 g eines gelben Öls, welches an 600 ml Kieselgel chromatographiert wird. Als Eluierungsmittel dient Benzol-Aceton 4 : 1.
Es werden Fraktionen zu 25ml
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Aus den Fraktionen ! in - 100 können durch fraktionierte Kristallisation aus Methylenchlorid - Methanol und Methylenchlorid - Methanol-Isopropyläther 230 mg reines #4,6-9ss,10α-Androstadien-17ss-ol-3-on vom Schmelzpunkt 108-1700C isoliert werden. Aus den Mutterlaugen dieser Fraktionen kann durch weitere Kristallisation dasA-9ss, 10a-Testolakton isoliert werden. Schmelzpunkt 192-194 C; #max (U.V.) = 286 m ; # = 25 000.
Beispiel 3 : 10 Erlenmeyerkolben Åa 500 ml werden mit je 100 ml einer Nährlösung der im Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung beschickt, mit Wattepfropfen verschlossen und bei 1200C 20 min sterilisiert. Dann wird mit einer ab einer Schrägagar-Kultur von Fusarium solani auf Bierwürze-Agar gewonnenen Sporenmycel-Suspension angeimpft. Die zur besserenDurchlüftung mit Schikanen versehenen Kolben werden auf einer rotierenden Sehüttelmaschine bei 24-28 C geschüttelt. Nach 66 h Wachstumszeit werden pro Kolben 20 mg #4-9ss,10α-Pregnen-3,20-dion (Retroprogesteron) in 1 ml Aceton unter aseptischen Bedingungen zugegeben.
Die dilnnschichtchromatographische Kontrolle der Fermentation nach 24,48 und 96 h, zeigte dass das eingesetzte Retroprogesteron schon nach 24 h praktisch vollständig zum A4-90, 10a-Androsten- : !, 17-dion abgebaut wird.
Dasselbe Resultat wird erhalten, wenn man wie oben beschrieben vorgeht, aber eine Nährlösung verwendet, welche 15 g Pepton, : 3 g Trockenrückstand aus Maisquellwasser und 50 mg Glucose in 1000 ml Leitungswasser enthält und mit Natriumhydroxyd auf ein PH von 6, 5 eingestellt ist.
Beispiel 4 : 61 einer Nährlösung (15 g Pepton, 3 g Trockenrückstand aus Maisquellwasser, 50 mg Glucose/1000 ml Wasser, mit Natriumhydroxyd auf PH =6, 5 eingestellt) werden unter Zusatz eines Schaumbekämpfungsmittels in einem mit Rührer versehenen und belüfteten Fermenter unter sterilen Bedingungen mit einer 3 Tage alten Schüttelkolben-Kultur von Fusarium solani angeimpft. Nach 46 stündigem Wachstum bei 280C werden 1, 2gA*-98, 10a-Pregnen-3, 20-dion (Retroprogesteron), gelöst in 40 ml Aceton, zugegeben. Nach 48 h (End-pH = 4, 6) wird die Gärbrühe filtriert und das Filtrat, wie im Beispiel 1 beschrieben, extrahiert. Der Rohextrakt wird in 60 ml Aceton gelöst und in der Wärme mit 1, 2 g Aktivkohle behandelt.
Nach Filtration und Eindampfen erhält man 2, 28 g eines gelbes Öls. Dieses wird in wenig Benzol gelöst und an 400 ml Kieselgel chromatographiert. Es werden Fraktionen zu 10ml aufgefangen. Die Fraktionen 1 - 116 enthalten insgesamt 780 mg Verunreinigungen. Die Fraktionen 117 bis 170 (Benzol-2% Aceton) enthalten 490 mg plattenchromatographisch einheitliches #4-9ss-10α-Andro- sten-3, 17-dion.
Schmelzpunkt 155-1560C (nach mehrmaliger Umkristallisation aus Methylenchlorid- -Isopropyläther); #max (U.V.) = 241 m ; # = 16500. Aus den Fraktionen186-244 (Benzol-Aceton9 : 1) erhält man 540 mg einheitliches #4-9ss,10α-Androsten-17ss-ol-3-on. Schmelzpunkt 154-155 C (aus
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beschrieben, jedoch unter Verlängerung der Inkubationszeit auf 7 Tage (nach Steroidzugabe), der enzymatischen Oxydation unterworfen. Dabei erhält man 1,12 g einheitliches #4-9ss,10α-Androsten -3,17- - dion (aus der Gärbrühe konnte bei diesem Versuch kein #4-9ss,10α-Androsten-17ss-ol-3-on isoliert werden).