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Verfahren zur Herstellung von neuen Steroidverbindungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Steroidverbindungen der allgemeinen Formel
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worin R Wasserstoff oder eine aliphatische, alicyclische, heterocyclische oder aromatische Acylgruppe mit 1 - 20 Kohlenstoffatomen bedeutet und wobei die Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen 1 und 2 gesättigt oder ungesättigt sein kann.
Die erfindungsgemäss herstellbaren neuen Verbindungen sind stark entzündungshemmend und besonders bei der Behandlung von Arthritis und verwandten KranKheiten wirksam ; wegen ihrer cortisonähnlichen Wirkung können sie in sehr geringer Dosis verabfolgt werden, so dass störende Nebenwirkungen weitgehend ausgeschaltet werden.
Gemäss der Erfindung erfolgt die Herstellung der neuen Verbindungen dadurch, dass man 3-Äthylen- dioxy-17a, 20, 20, 21-bismethylen-dioxy-16a-methyl-allopregnan-6, ll-dion mit einem Methylmagnesiumhalogenid unter Bildung von 3-Äthylendioxy-17a, 20, 20, 21-bismethylen-dioxy-6a, 16a-dimethyl- allopregnan-6ss-ol-ll-on umsetzt und dieses mit einem Dehydratisierungsmittel in 3-Äthylendioxy-
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Verbindung zuerst in Gegenwart einer Säure in einem organischen Lösungsmittel und danach in Gegenwart einer Säure in wässeriger Lösung zum 6a, 16a-Dimethyl-4-pregnen-17a, 21-diol-3, ll, 20-trion hydroly- siert und diese Verbindung, wenn gewünscht, mit Selendioxyd oder mikrobiologisch mit Hilfe von Schizomyceten, insbesondere Bacillus sphaericus, zum 6a,
16a-Dimethyl-1, 4-pregnadien-na, 21-diol- -3,11,20-trio dehydriert und dass man gegebenenfalls die 21-ol-Verbindungen in die entsprechenden 21-Acylate umwandelt.
Die Ausgangsverbindung kann folgendermassen hergestellt werden ; 16-Methyl-4-pregnen- -17 < x, 21-diol-3, 11, 20-trion wird mit Formaldehyd unter sauren Bedingungen unter Bildung von
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20, 20, 21-Bismethylen-dioxy-16a-methyl-4-pregnen-3, ll-dion umgesetzt,- allopregnan-3, 6-11-trion umgesetzt. Die letztgenannte Verbindung wird mittels Butanon-Dioxolan in 3-Äthylendioxy-17a, 20, 20, 21-Bismethylen-dioxy-16a-methyl-allopregnan-6, 11-dion übergeführt.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird vorzugsweise eine Lösung von 3-Äthy- lendioxy-17a, 20, 20, 21-bismethylen-dioxy-16a-methyl-allopregnan-6, ll-dion in Benzol unter Rühren während eines Zeitraumes von 10 min zu einer Lösung von Methylmagnesiumjodid in Diäthyläther zugegeben. Die resultierende Mischung wird noch eine weitere halbe. Stunde gerührt, hierauf Wasser und dann weiteres Benzol zugesetzt ; die organische Schicht wird getrocknet und eingedampft und liefert das entsprechende 3-Äthylendioxy-17 < x, 20, 20, 21-bismethylen-dioxy-16a, 16a-dimethyl-allopregnan-6ss-ol- -11-on.
Die Reaktion zwischen dieser Verbindung und Thionylchlorid, falls dieses als Dehydratisierungsmittel verwendet wird, erfolgt zweckmässig durch tropfenweisen Zusatz einer Lösung von Thionylchlorid in wasserfreiem Pyridin zu einer Lösung des Steroids in dem gleichen Lösungsmittel, wobei die Temperatur der Lösung auf ungefähr 400C gehalten wird. Die resultierende Lösung wird während einer weiteren halben Stunde gerührt, abgekühlt, in Eiswasser gegossen und die wässerige Mischung mit einem halogenierten Kohlenwasserstofflösungsmittel wie Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wird neutralisiert, getrocknet und eingedampft und ergibt so ein Rohprodukt, das durch Chromatographie über Aluminiumoxyd gereinigt, 3-Äthylendioxy-17alpha;,20,20,21-bismethylen-dioxy-6,-16alpha;-dimethyl-5-pregnen-11-on liefert.
Die letztgenannte Verbindung wird in wasserfreiem Aceton, das p-Toluolsulfonsäure-monohydrat enthält, gelöst und die Lösung während ungefähr 15 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die resultierende Lösung wird dann in Wasser gegossen und die wässerige Mischung mit einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie Chloroform, extrahiert. Nach Neutralisieren der Chloroformlösung, Trocknen und Eindampfen, erhält man 17alpha;,20,20,21-Bismethylen-dioxy-6alpha;,16alpha;-dimethyl-4-pregnen-3,11-dion.
Die Reaktion dieses Dions mit dem wässerigen, organischen, sauren Hydrolysierungsmittel, im be-
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6a, 16a-Dimethyl-4-pregnen-17a, 21-diol-3, 11, 20-trion,gnen-17a, 21-diol-3, 20-dion-verbindungen mit Sauerstoff in der 11-Stellung, 6a, 16a-Dimethyl-4-pre- gnen-17a, 21-diol-3,11,20-trion; 6alpha;,16alpha;-Dimethyl-4-pregnen-11ss,17alpha;,21-triol-3,20-dion sowie der 21-Ester dieser Verbindungen wird zweckmässig unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Schizomycetes durchgeführt.
Die Dehydrierungsreaktion erfolgt entweder durch Zusammenbringen der Steroidverbindung mit den Mikroorganismen selbst oder, wenn vorgezogen, mit Enzymsystemen von Schizomyceten, wobei der an die C-1- und C-2-Kohlenstoffatome gebundene Wasserstoff selektiv entfernt und das entsprechende A-Steroid praktisch frei von Verunreinigungen durch unerwünschte Produkte erhalten wird. In dieser Weise wird aus der 6a, 16a-Dimethyl-4-pregnen-17a, 21-diol-3, 20-dion-ver- bindung mit Sauerstoff in 11-Stellung direkt und in hohen Ausbeuten die entsprechende 1, 4-pregnadien- verbindung erhalten. Diese mikrobiologische #-Dehydrierung wird gewöhnlich so durchgeführt, dass das Steroid in fester Form oder gelöst in einem Lösungsmittel, wie z.
B. einem Dialkylketon wie Aceton, einem Dialkylformamid wie Dimethylformamid od. dgl. unter sterilen Bedingungen zu einer Kultur der Mikroorganismen in einem Nährmedium zugesetzt wird, wobei die resultierende Mischung bewegt und dabei Wachstum der Mikroorganismen und Dehydrierung der Steroidverbindung bewirkt wird. Das Steroid kann dem Nährmedium zu dem Zeitpunkt zugesetzt werden, wenn es mit der Kultur der Schizomyceten beimpft wird, oder man kann es einer bereits ausgebildeten Kultur zusetzen.
Anstatt das Steroid zu der ausgebildeten Kultur im Nährmedium zuzusetzen, kann auch die Zellmasse einer solchen Kultur von der Brühe abfiltriert, mit destilliertem Wasser gewaschen und dann in einer gepufferten wässerigen Lösung, welche die Steroidverbindung enthält, suspendiert werden ; die resultierende Mischung wird bewegt und dabei die Dehydrierung der Steroidverbindung zum entsprechenden 1, 4-Pregnadien bewirkt. Das letztere lässt sich aus diesem Medium leichter gewinnen als aus dem Gemisch, das man erhält, wenn das Steroid im ursprünglichen Nährmedium mit dem Mikroorganismus bebrütet wird. Die zu dehydrierende Steroidverbindung kann aber auch mit dehydrierenden Enzylpräparaten aus Schizomycetenkulturen in Kontakt gebracht werden.
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Die bei dieser bakteriologischen Dehydrierung verwendeten Nährmedien sind die für die Züchtung von Schizomyceten üblichen. Sie enthalten eine Quelle für Stickstoff und Kohlenstoff, anorganische Salze und, wenn erforderlich, Wachstumsfaktoren. Der Kohlenstoff kann durch Verbindungen wie Acetate, Laktate od. dgl. geliefert werden. Als Stickstoffquelle dienen Ammoniumsalze, Aminosäuren oder Proteine wie Sojabohnen, Hafer, Hefe, Hefeextrakte, Trypsin-Verdauungsprodukte von Casein, Fleischextrakt, Blutmehl, proteinhaltige Fleisch- und Knochenabfälle, Lachsmehl, andere Fischmehle, lösliche Fischprodukte, lösliche Destillationsrückstände aus Brennereien u. dgl.
Wenn gewünscht, können die Schizomyceten unter Verwendung von Proteinen (oder Aminosäuren) in Abwesenheit jeglicher Kohlehydrate in dem Medium gezüchtet werden, wobei die Proteine oder Aminosäuren sowohl als Quelle für den von den Organismen benötigten Kohlenstoff wie den Stickstoff dienen.
Während, wie oben ausgeführt, die Dehydrierung der boa, 16a-Dimethyl-4-pregnen-17oc, 21-diol- - 3, 20-dion-verbindungen mit Sauerstoff in 11-Stellung unter Verwendung von dehydrierenden Enzympräparaten aus Schizomycetenkulturen oder durch Kontakt mit einer ausgebildeten Kultur in destilliertem Wasser durchgeführt werden kann, wird gewöhnlich vorgezogen, die zu dehydrierende Steroidverbindung einem eine 24 h-Kultur von Schizomyceten enthaltenden Nährmedium zuzusetzen. Die Mengen der Steroidverbindung variieren je nach dem speziellen zu dehydrierenden Substrat ; vorzugsweise wird eine Konzentration von ungefähr 0, 005 bis 0, 20/0 der Steroidverbindung verwendet, wenn auch, wenn gewünscht, höhere oder niedrigere Konzentrationen angewendet werden können.
Nach Zusatz des Steroids wird die Kultur, vorzugsweise unter Bewegung und Belüftung, während einer zusätzlichen Zeit bebrütet, welche zwischen etwa 10 und 50 h variieren kann, wenn auch kürzere oder längere Fermentationszeiten für die Dehydrierung spezieller Substrate von Vorteil sein können. Mit Rücksicht darauf, dass eine zu lange Fermentation zu einer teilweisen Zerstörung des 6. 1-dehydrierten Steroidproduktes führt, wird im allgemein- nen eine Fermentationszeit von ungefähr 10 bis 24 h, abhängig vom Steroidsubstrat, vorgezogen, da hiebei die höchsten Ausbeuten an Dehydrierungsprodukten erhalten wurden.
Nach Vollendung des Dehydrierungsprozesses wird das erhaltene 1, 4-Pregnadienderivat aus der Gärbrühe zweckmässig durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. einem chlorierten Kohlenwasserstoff wie Chloroform, einem Keton wie Methyl-isobutylketon, einem Alkylester einer aliphatischen Carbonsäure wie Äthylacetat od. dgl. gewonnen. Der das 6. 1-dehydrierte Steroidprodukt und etwaiges nicht umgesetztes Ausgangsmaterial enthaltende Extrakt wird zweckmässig durch Chromatographie unter Verwendung von Silikagel, aktiviertem Aluminiumoxyd od. dgl., oder, wenn gewünscht, mittels Papierchromatographie gereinigt.
Nach der Abtrennung des dehydrierten Produktes von nicht umgesetztem Ausgangsmaterial kann es, wenn gewünscht, durch Umkristallisieren aus einem Lösungsmittel wie Äthylacetat, Äthylacetat-Petroläther od. dgl. weiter gereinigt werden.
Nach dieser mikrobiologischen Dehydrierungsmethode wird unter Verwendung der oben angeführten
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Gleichgültig, ob das Ausgangsmaterial dieser mikrobiologischen Dehydrierung ein freier 21-Alkohol oder ein 21-Ester ist, wird als Endprodukt der freie 21-Alkohol der entsprechenden Pregnadienverbindung erhalten, da jede vorhandene 21-Estergruppe im Verlauf der mikrobiologischen Dehydrierungsreaktion hydrolysiert wird. Die so erhaltenen freien 21-Alkohole können durch Umsetzung mit einem Acylierungsmittel, z.
B. einem Phosphorylierungsmittel, einem niederen Carbonsäureanhydrid oder-halogenid, wie Benzoesäureanhydrid, tert.-Butyl-acetylchlorid, Essigsäureanhydrid, Propionsäureanhydrid, einem Anhydrid einer mehrbasischen Säure, wie ss, ss-Dimethylglutarsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid u. dgl., in die entsprechenden 21-Ester übergeführt werden.
Gemäss diesem Acylierungsverfahren werden beispielsweise die folgenden 21-Ester der oben im vorletzten Absatz angeführten 1, 4-Pregnadienderivate erhalten : 21-Phosphate, 21-Benzoate, 21-tert.-Butylacetate, 21-Acetate, 21-Propionate.
An Stelle des oben beschriebenen mikrobiologischen Dehydrierungsverfahrens kann die 6a, 16a-Di- methyl-4-pregnen-17a, 21-diol-3, 20-trion-verbindung mit Sauerstoff in 11-Stellung auch mit Selendioxyd unter Dehydrierung im Ring A und Bildung der entsprechenden 1, 4-Pregnadienverbindung umgesetzt werden. Die Selendioxyd-Dehydrierung wird zweckmässig durch Erhitzen einer Mischung der Ausgangssteroidverbindung mit Selendioxyd in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels, wie z. B. Dioxan, eines Alkohols wie tert.-Butanol usw. auf höhere Temperaturen durchgeführt. Bei Verwendung von tert. Butanol als Lösungsmittel erfolgt diese Reaktion zweckmässig beim Siedepunkt des Lösungsmittels, wobei die Reaktion meist in etwa 15 h vollendet ist.
Die Reaktionsmischung wird vom metallischen Selen abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei die gewünschte 1, 4-pregnadienver-
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bindung erhalten wird. Das so gewonnene Rohprodukt kann zweckmässig durch Papierstreifenchromatogra- phie gemäss demselben Verfahren gereinigt werden, das oben im Zusammenhang mit der Reinigung durch mikrobiologische Dehydrierung erhaltenen Pregnadienverbindungen beschrieben wurde.
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zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird weitere 30 min gerührt und dann mit 70 cm3 Wasser zersetzt. Etwa 170 cm3 Benzol werden in das wässerige Gemisch eingebracht und die gebildeten Schichten voneinander getrennt. Die wässerige Schicht wird mit zwei Portionen Chloroform von je 100 cm3 extrahiert.
Die organischen Schichten werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhält 3-Äthylendioxy-17alpha;,20,20,21-bismethylen-dioxy-6alpha;,16alpha;-dimethyl -allopregnan-613-ol-II-on.
F = 175 . Diese Verbindung zeigt keine selektive Absorption in dem 233 mli-Bereich. Im Infrarotbereich liegt die Absorption bei 2,9 und 5, 92 p.
Eine Lösung von 5,5 cm frisch destilliertem Thionylchlorid in 26 cm3 kaltem wasserfreiem Pyridin wird tropfenweise unter Rühren in eine Lösung von 5, 0 g 3-Äthylendioxy-17alpha;20,20,21-bismethylen-dioxy-6alpha;,16alpha;-dimethyl-allopregnan-6ss-ol-11-on in 32 cm wasserfreiem Pyridin unter Aufrechterhaltung der Reaktionstemperatur auf 400 eingetragen. Die Reaktionslösung wird nach Zusatz von Thionylchlorid weitere 30 min gerührt, dann auf etwa 0 - 50 abgekühlt und in 180 cuP Eiswasser gegossen. Das wässerige Gemisch wird mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird neutralisiert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird in Benzol gelöst
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Aluminiumoxyd chromatographiert ;gnen-11-on.
Eine Lösung von etwa 5 g Äthylendioxy-17alpha;,20,20,21-bismethylen-dioxy-6,16alpha;-dimethyl-5-pre- gnen-11-on, 500 cm3 wasserfreiem Aceton und etwa 0, 5 g p-Toluolsulfonsäuremonohydrat bleibt etwa 15 h stehen. Die Reaktionslösung wird in Wasser gegossen und das wässerige Gemisch mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wird mit wässeriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Benzol umkristallisiert und ergibt 17alpha;20,20,21-Bismethylen-dioxy-6alpha;,16alpha;-dimethyl-4-pregnen-3,11-dion.
Diese Verbindung zeigt in methanolischer Lösung maximale Absorption im U. V.-Bereich bei 238 mu ; der entsprechende Wert für den molekularen Extinktionskoeffizienten beträgt 15300. Im InfrarotgebietliegtdieAbsorptionbei5,9, 6,0und6,2 .
Etwa 0, 1 g 17alpha;,20,20,21-Bismethylen-dioxy-6alpha;,16alpha;-dimethyl-4-pregnen-3,11-dion werden in 18 cm3 50o/ai. ger wässeriger Essigsäure suspendiert ; die Suspension wird sorgfältig mit Stickstoff durchspült, auf dem Dampfbad unter Stickstoff etwa 8 h erhitzt und dann bei Zimmertemperatur weitere 15 h stehen
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und 6, 2 jazz Letzteres wird in 20 cm3 Chloroform gelöst und die Chloroformlösung im Vakuum zur Trockne eingedampft. Zum trockenen Rückstand setzt man 1 cm Pyridin und 1 cm3 Essigsäureanhydrid zu und erhitzt das Gemisch auf dem Dampfbad etwa 15 min. Die Reaktionslösung wird auf 0 - 50 gekühlt und in Eiswasser gegossen.
Die wässerige Suspension wird mit Chloroform extrahiert und der Chloroformextrakt mit wässeriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Die Lösung des Rückstandes in 30 cm3 Benzol wird an 5 g sauer gewaschenem Aluminiumoxyd adsor- biert ; das Adsorbat wird mit 50 cm3 Äther gewaschen und mit 350 cm3 eines Gemisches von 5 Teilen Äther auf 5 Teile Chloroform sowie schliesslich mit 50 cm3 eines Gemisches von 3 Teilen Äther auf 7 Teile Chloroform eluiert. Die Eluate werden im Vakuum eingedampft ; der Rückstand ergibt beim Umkristallisieren aus Methanol 6alpha;,16alpha;-Dimethyl-4-pregnen-17alpha;,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat.
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eingedampft. Die Lösung des Rückstandes in Benzol wird mit einer wässerigen Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
Die Benzollösung wird mit Quecksilber über
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und ergibt 6a, 16a-Dimethyl-l, 4-pregnadien-17a, 21-diol-3, 11, 20-trion-21-acetat. À CH30Hwird mit KOH auf PH 6, 5 eingestellt, sterilisiert und mit ungefähr 2, - 5 cm3 einer Kultur von Bacillus sphaericus (ATCC-245) beimpft. Die beimpfte Kultur wird dann bei einer Temperatur von 280 unter Bewegung während eines Zeitraumes von 24 h bebrütet. Zu der so erhaltenen Kultur wird eine Lösung von
10 mg 6a, 16a-Dimethyl-4-pregnen-17 < x, 21-diol-3, 11, 20-trion hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, in 0, 2 cms Dimethylformamid gelöst, zugefügt. Die die Steroidverbindung enthaltende Kultur wird unter Bewegung während weiterer 24 h bei 280C bebrütet.
Die Gärbrühe wird mit vier Anteilen von je 50 ems Äthylacetat extrahiert, die Extrakte werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 5 cms eingeengt. Von der konzentrierten Lösung werden Streifenchromatogramme hergestellt, welche unter Verwendung von Formamid als stationäre Phase und 50ufo Benzol/50 Chloroform als mobile Phase entwickelt werden. Nach 8stündiger Entwicklung in einem absteigenden System wird die obere Bande jedes Chromatogramms, entsprechend der A'- Dehydroverbindung, abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material nochmals an Papierstreifen chromatographiert.
Die obere Bande wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird kristallisiert und ergibt 6alpha;,16alpha;-Dimethyl-1,4-pregnadien-17alpha;,21-diol-3,11,20-trion.
Dieses Trion wird mit Essigsäureanhydrid und Pyridin behandelt, wobei das 21-Acetylderivat erhal- ten wird, welches durch Umkristallisation gereinigt wird und praktisch reines 6ci, 16a-Dimethyl-l, 4-pre- gnadien-17a, 21-diol-3, 1, 20-trion-21-acetat ergibt.
An Stelle von Bacillus sphaericus können in ähnlicher Weise z. B. folgende Schizomycetenstämme eingesetzt werden : Nocardia asteroides (ATCC-9970), Mycobacterium smegmatis (NRRL B-1667), Nocar- dia leishmanii (ATCC-6855), Nocardia formica (NRRL-2470), Mycobacterium phlei (ATCC-12, 298) oder Mycobacterium lacticola (ATCC-12, 297).