DE1230797B - Verfahren zur 1- und/oder 4-Dehydrierung von Steroidverbindungen - Google Patents

Verfahren zur 1- und/oder 4-Dehydrierung von Steroidverbindungen

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DE1230797B
DE1230797B DEM31983A DEM0031983A DE1230797B DE 1230797 B DE1230797 B DE 1230797B DE M31983 A DEM31983 A DE M31983A DE M0031983 A DEM0031983 A DE M0031983A DE 1230797 B DE1230797 B DE 1230797B
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Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
DEUTSCHES
PATENTAMT
AUSLEGESCHRIFT
Int. CL:
C 07c
Deutsche Kl.: 12 ο - 25/05
Nummer: 1230797
Aktenzeichen: M 31983 IV b/12 ο
Anmeldetag: 6. Oktober 1956
Auslegetag: 22. Dezember 1966
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur 1- und/ oder 4-Dehydrierung von Steroidverbindungen durch Bebrütung entsprechender gesättigter Steroide mit Kulturen dehydrierend wirkender Mikroorganismen oder den daraus gewonnenen dehydrierend wirkenden Enzymen unter aeroben Bedingungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine in 1(2)- oder 1(2)- und 4(5)-Stellung gesättigte, in 3-Stellung durch Sauerstoff substituierte Steroidverbindung der dehydrierenden Aktivität von Mikroorganismen derGattungNocardia oder daraus gewonnener Enzyme aussetzt.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich zl4-3-Ketosteroide, wie Zl4-Pregnen-17«,21-diol-3,ll,20-trion und J4-Pregnen-ll/e,17Ä,21-triol-3,20-dion, in die entsprechenden Zl^-S-Keto-steroide J1>4-Pregnadien-17«,21-diol-3,ll,20-trion bzw. Zlx'4-Pregnadienll|S,17a,21-triol-3,20-dion überführen. Die letztgenannten Verbindungen besitzen die Wirksamkeit des Cortisons, unterscheiden sich jedoch insofern von Cortison, als sie praktisch keine unerwünschten Nebenwirkungen, wie Ödeme, hervorrufen, da sie keine nennenswerte Ansammlung von Natrium oder Wasser im Körper verursachen.
Die Herstellung von zd1>4-3-Keto-steroiden auf chemischem Wege hat den Nachteil, daß man bei den dazu erforderlichen chemischen Umsetzungen Gemische mehrerer Verbindungen erhält. Die Abtrennung der gewünschten Zwischen- und Endprodukte aus derartigen Gemischen ist kostspielig und führt nur zu geringen Ausbeuten an den gewünschten Δ 1>4-3-Keto-steroidverbindungen.
Es ist außerdem bereits bekannt, gewisse Δ 4-3-Ketosteroide unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattungen Fusarium, Calonectria, Ophiobolus, Alternaria, Didymella und Corynebacterium in 1-Stellung zu dehydrieren.
Es wurde nun gefunden, daß Mikroorganismen der Gattung Nocardia oder daraus gewonnene dehydrierend wirkende Enzyme nicht nur Zl4-3-Ketosteroide in 1-Stellung, sondern auch in 1(2)- und 4(5)-Stellung gesättigte, in 3-Stellung durch Sauerstoff substituierte Steroidverbindungen in 4- oder 1,4-Stellung dehydrieren. Dem gleichen Dehydrierungsverfahren können erfindungsgemäß auch in 3-Stellung durch Sauerstoff substituierte 45-Steroide unterworfen werden. Insgesamt erhält man im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens 4- bzw. 1- und 4- dehydrierte 3-Ketosteroide. Die Ausbeuten des vorliegenden Verfahrens liegen zum Teil über 60%; die Verfahrenserzeugnisse sind im wesentlichen frei von unerwünschten Nebenprodukten.
Verfahren zur 1- und/oder 4-Dehydrierung von
Steroidverbindungen
Anmelder:
Merck & Co., Inc., Rahway, N. J. (V. St. A.)
Vertreter:
Dr.-Ing. W. Abitz und Dr. D. Morf,
Patentanwälte, München 27, Pienzenauer Str. 28
Als Erfinder benannt:
Thomas Henry Stoudt, Westfield, N. J. (V. St. A.)
Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 14. Oktober 1955
(540 626)
Die verfahrensgemäß verwendeten Mikroorganismen der Gattung Nocardia erhält man aus bekannten Quellen, z. B. aus der »American Type Culture Collection«, Washington, D. C, V.St.A., oder sie lassen sich auch nach bekanntem Verfahren aus natürlichen Quellen gewinnen, z. B. aus dem Boden oder aus Krankheitsprozessen.
Wenn man auch das erfindungsgemäße mikrobiologische Dehydrierungsverfahren zur 1- und/oder 4-Dehydrierung von entsprechenden, in 3-Stellung durch Sauerstoff substituierten Steroidverbindungen ganz allgemein anwenden kann, ohne Rücksicht auf die Substituenten oder die Anzahl der ungesättigten Bindungen in den Ringen B, C und D, so werden doch gewöhnlich am Kohlenstoffatom 5 ungesättigte und in 3-Stellung durch Sauerstoff substituierte Steroidverbindungen der Pregnanreihe als Ausgangsstoffe für dieses Verfahren bevorzugt, z. B. /l4-3-Ketopregnenverbindungen oder deren 9-Halogenderivate sowie Zl6-3-Oxy- bzw. /J5-3-(niedrig-Alkanoyloxy)-pregnenverbindungen oder deren 9-Halogenderivate.
Die als Ausgangsstoffe dienenden 3-sauerstoffsubstituierten Zls-Pregnenverbindungen werden durch die dehydrierende Aktivität der Mikroorganismen der Gattung Nocardia unmittelbar in die entsprechenden /l1>4-3-Ketopregnadienverbindungen übergeführt, eine Umwandlung, die, wie man annimmt, auf dem Wege über die Δ 4-3-Ketoverbindung als Intermediärprodukt erfolgt. Bei den vorerwähnten Ausgangsstoffen dient als bevorzugte 3- bzw. oder 21-ständige Estergruppe normalerweise der Acetatrest; man kann
609 748/431
jedoch statt des Acetats auch andere Ester niederer salzen, Aminosäuren oder Proteinen, wie Sojabohnen,
Kohlenwasserstoffcarbonsäuren, z. B. das Propionat, Hafer, Hefe, Hefeextrakten, angedautem Casein,
Butyrat, tert.-Butylacetat oder Benzoat, verwenden. Fleischextrakt, Blutmehl, Protein, Fleisch- und
An Stelle dieser am Kohlenstoffatom 5 ungesättigten Knochenabfall, Lachsmehl, Fischmehl, löslichen
und in 3-Stellung durch Sauerstoff substituierten 5 Fischbestandteilen oder löslichen Schlempebestand-
Pregnenverbindungen kann man als Ausgangsstoffe teilen, vorhegen. Gegebenenfalls kann man die
auch 3-Ketopregnanverbindungen, 3-Oxypregnan- Mikroorganismen der Gattung Nocardia unter Ver-
oder 3-Oxy-allopregnanverbindungen verwenden, die Wendung von Proteinen (oder Aminosäuren) in
durch die Mikroorganismen der Gattung Nocardia Abwesenheit von Kohlehydraten züchten, wobei die
selektiv dehydriert werden. Hierbei entstehen 4- oder io Proteine oder Aminosäuren gleichzeitig als Quelle
1- und 4-ständige Doppelbindungen (und im Falle für Kohlenstoff dienen,
der 3-Oxypregnanverbindungen wird die 3-ständige Wenn man auch, wie oben beschrieben, die Dehy-
Hydroxylgruppe zu einer 3-Ketogruppe oxydiert), drierung der Ausgangssteroide unter Verwendung
wobei sich die entsprechende 3-Keto-zH-pregnen- von bei der Züchtung von Mikroorganismen der
bzw. -Zl1>4-pregnadienverbindung bildet. Sofern die 15 Gattung Nocardia gewonnenen, dehydrierend wir-
als Ausgangsstoffe dienenden Pregnanverbindungen kenden Enzympräparaten oder durch Einwirkung
3- und bzw. oder 21-Ester von niederen Kohlen- einer Suspension einer bereits vorhandenen Kultur
wasserstoffcarbonsäuren, wie Essigsäure, Propion- in destilliertem Wasser auf die Steroidverbindung
säure, tert-Butylessigsäure oder Benzoesäure, ver- durchführen kann, arbeitet man doch vorzugsweise
wenden. 20 so, daß man die Steroidverbindung zu einem Nähr-
Das erfindungsgemäße mikrobiologische Dehydrie- medium zusetzt, welches ein 24 Stunden altes Wachsrungsverfahren wird ausgeführt, indem man die turn von Mikroorganismen der Gattung Nocardia Ausgangssteroidverbindung der dehydrierenden Akti- enthält. Die Menge der dem Medium zuzusetzenden vität von Mikroorganismen der Gattung Nocardia Steroidverbindung richtet sich nach dem jeweils zu aussetzt. Dies kann erfolgen, indem man das Steroid 25 dehydrierenden Substrat; gewöhnlich arbeitet man in festem Zustand oder gelöst in einem Lösungsmittel, jedoch mit einer Steroidkonzentration von etwa z. B. einem Dialkylketon, wie Aceton oder einem 0,005 bis 0,2 %> obwohl man gegebenenfalls auch Dialkylformamid, wie Dimethylformamid, unter höhere oder niedrigere Steroidkonzentrationen ansterilen Bedingungen zu einer Kultur der Mikro- wenden kann. Die mit dem Steroid versetzte Kultur Organismen in einem Nährmedium zusetzt und das 30 wird dann, vorzugsweise unter Bewegung und Belüf-Gemisch in Bewegung hält, wobei das Wachstum tung, eine weitere Zeit, gewöhnlich im Bereich von des Mikroorganismus und die Dehydrierung des etwa 10 bis 50 Stunden, bebrütet; zur Dehydrierung Steroids vor sich geht. Das Steroid kann entweder besonderer Steroidsubstrate können jedoch kürzere gleichzeitig mit der Beimpfung des Nährmediums oder längere Fermentationszeiten von Vorteil sein, mit der Kultur der Mikroorganismen der Gattung 35 Da jedoch eine zu lange Fermentationsdauer zur Nocardia oder auch zu einer bereits bestehenden Zerstörung eines Teiles des erhaltenen ^d1>4-3-Keto-Kultur zugesetzt werden. Statt das Steroid zu der steroids führen kann, werden normalerweise, je nach bereits bestehenden Kultur in dem Nährmedium dem Steroidsubstrat, Fermentationsdauern von etwa zuzusetzen, kann man die Zellen einer solchen Kultur 10 bis 24 Stunden bevorzugt, wobei man maximale von der Nährbrühe abfiltrieren, mit destilliertem 40 Ausbeuten an dehydrierten Steroiden erhält.
Wasser waschen, dann in einer gepufferten wäßrigen Nach Beendigung der Dehydrierung wird das Lösung des Ausgangssteroids suspendieren und das Produkt vorteilhaft aus der fermentierten Brühe Gemisch in Bewegung halten, bis die Dehydrierung durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischdes Steroids erfolgt ist. Aus diesem Medium läßt sich baren Lösungsmittel, z. B. einem chlorierten Kohlendas Verfahrensprodukt leichter gewinnen als aus dem 45 wasserstoff, wie Chloroform, einem Keton, wie Gemisch, welches man erhält, wenn man das Steroid Methylisobutylketon, oder einem Alkylester einer zusammen mit dem Mikroorganismus in dem Ursprung- Fettsäure, wie Äthylacetat, gewonnen. Der Extrakt liehen Nährmedium bebrütet. Außerdem erhält man an dehydriertem Steroid und möglicherweise noch mit diesem Medium höhere Ausbeuten an Dehydrie- vorhandenem, nicht umgesetztem Ausgangsstoff wird rungsprodukt, wenn man von 3-Oxypregnanen aus- 50 vorteilhaft durch Chromatographie an Silicagel, oder geht. Schließlich kann man das Ausgangssteroid aktivierter Tonerde oder mittels absteigender Papierauch durch Behandlung mit dehydrierend wirkenden Chromatographie gereinigt. Nach Abtrennung des Enzympräparaten, die aus dem Wachstum von dehydrierten Produktes von dem nicht umgesetzten Mikroorganismen der Gattung Nocardia hergestellt Ausgangsstoff kann das Produkt durch Umkristalsind, in das entsprechende A*- bzw. Zl1>4-3-Keto- 55 lisieren aus einem Lösungsmittel, wie Äthylacetat steroid überführen. oder Äthyl acetat-Petroläther, weiter gereinigt werden.
Als Nährmedium zur Ausführung dieses mikro- Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsbiologischen Dehydrierungsverfahrens verwendet man gemäße Verfahren,
die gleichen, die gewöhnlich zur Zucht von Mikro- B e i s t> i e 1 1
Organismen der Gattung Nocardia dienen. Die 60 . p
üblichen Nährmedien enthalten eine Quelle für Es werden 50 ecm eines Nahrmedmms von folgen-
Stickstoff und eine Quelle für Kohlenstoff, anorga- der Zusammensetzung hergesteUt:
nische Salze und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren. Technische Dextrose (bekannt
Der Kohlenstoff kann in Form von Verbindungen, unter dem Handelsnamen
wie Acetaten oder Lactaten, welche im Falle bestimm- 65 Cerelose) Ig
ter Species, wie Nocardia blackwellii, ein verstärktes Technisches digeriertes Lactal-
Wachstum und höhere Ausbeuten bewirken, geliefert bumin (bekannt unter dem
werden. Der Stickstoffkann in Form von Ammonium- Handelsnamen Edamin) Ig
5 6
Maismaischflüssigkeit 0,25 ecm Die Aufarbeitung der Fermentationsbrühe durch
Mit destilliertem Wasser auf- Extraktion und Papierchromatographie wird, wie im
gefüllt auf 50 ecm Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Dabei erhält
man Δ 1> ^Pregnadien-llßlToc^l-triol-S^O-dion.
Dieses Medium wird mit KOH auf ein pH von 5
6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ecm Beispiel 3
einer Kultur von Nocardia asteroides (MA 272;
ATCC 9970) beimpft, worauf die beimpfte Kultur Es werden 50 ecm eines Nährmediums von folgen-
48 Stunden unter Bewegung bei 280C bebrütet wird. der Zusammensetzung hergestellt:
Dann setzt man der Kultur eine Lösung von 10 mg 10 Technische Dextrose (»Cerelose«) 1 g
Hydrocortison (Zl*-Pregnen-11^17a;21-tnol-3,20-dion) Technisches digeriertes Lactal-
m 0,1 ecm Dimethylformamid zu. Die die Steroid- bumin ()>Edamin<() lg
verbindung enthaltende Kultur wird dann weitere Maismaischflüssigkeit 0,25 ecm
24 Stunden unter Bewegung bei 28 C bebrütet. Mit destiiiiertem Wasser
Man extrahiert die Fermentationsbruhe viermal 15 aufgefüllt auf 50 ecm
mit je 50 ecm Äthylacetat, vereinigt die Äthylacetatextrakte und dampft sie im Vakuum auf etwa 5 ecm Dieses Medium wird mit KOH auf ein pH von ein. Aus der konzentrierten Lösung werden Papier- 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ecm streifenchromatogramme hergestellt, die unter Ver- einer Kultur von Nocardia asteroides (MA 289; Wendung von Formamid als stationärer flüssiger 20 ATCC 10904) beimpft, worauf die beimpfte Kultur Phase und von Chloroform als beweglicher flüssiger 48 Stunden unter Bewegung bei 28 0C bebrütet wird. Phase entwickelt werden. Hierbei erhält man zwei Dann setzt man der Kultur eine Lösung von 10 mg Bänder, von denen das eine (das der beweglicheren Hydrocortison(/d4-Pregnen-ll/?,17«,21-triol-3,20-dion) Komponente entsprechende) das für Hydrocortison in 0,1 ecm Dimethylformamid zu. Die die Steroidcharakteristische Absorptionsmaximum im Ultra- 25 verbindung enthaltende Kultur wird dann weitere violett und das andere (das der weniger beweglichen 24 Stunden unter Bewegung bei 280C bebrütet.
Komponente entsprechende) ein ultraviolettes Ab- Die Aufarbeitung der Fermentationsbrühe durch sorptionsmaximum bei etwa 242 ΐημ zeigt. Das Extraktion und Papierchromatographie wird, wie im Papierchromatogramm wird getrocknet, und das Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Dabei erhält der Absorption bei 242 πιμ entsprechende Band 3° manJ1'4-Pregnadien-ll18,17(X,21-triol-3,20-dion.
wird ausgeschnitten und mit Methanol extrahiert.
Der Methanolextrakt wird nochmals der Papier- Beispiel 4
süreifenchromatographie unterworfen, wobei man ein Es werden 50 ccm eines Nährmediums von folgen-
48 Stunden mit Methanol extrahiertes Papier und der Zusammensetzung hergestellt:
das oben beschriebene System von Chloroform und 35
Formamid verwendet. Das so erhaltene Chromato- Technische Dextrose (»Cerelose«) Ig
gramm zeigt nur Spuren eines dem als Ausgangsstoff Technisches digeriertes Lactal-
verwendeten Hydrocortison entsprechenden Bandes, bumin (»Edamin«) Ig
während das Hauptband ein ultraviolettes Absorp- Maismaischflüssigkeit 0,25 ecm
tionsmaximum bei 242 ΐημ aufweist. Das Papier- 40 Mit destilliertem Wasser
chromatogramm wird gründlich getrocknet, und das aufgefüllt auf 50 ecm
dem Absorptionsmaximum bei 242 πιμ entsprechende
Band wird ausgeschnitten und mit Methanol extra- Dieses Medium wird mit KOH auf ein pH von
hiert. Beim Eindampfen des Methanolextraktes im 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ecm
Vakuum zur Trockene erhält man zla'4-Pregnadien- 45 einer Kultur von Nocardia globerula (MA 280;
ll/3,17«,21-triol-3,20-dion. ATCC 9356) beimpft, worauf die beimpfte Kultur
48 Stunden unter Bewegung bei 28 0C bebrütet wird.
Beispiel 2 Dann setzt man der Kultur eine Lösung von 10 mg
, -Λ . .... ,. . , Hydrocortison (A 4-Pregnen-llß,17a,21-triol-3,20-dion)
Es werden 50 ecm eines Nährmediums von folgen- 50 in 01 ccm Dimethylformamid zu. Die die Steroid-
der Zusammensetzung hergestellt: verbindung enthaltende Kultur wird dann weitere
Technische Dextrose (»Cerelose«) Ig 24 Stunden unter Bewegung bei 28° C bebrütet.
Technisches digeriertes Lactal- Die Aufarbeitung der Fermentationsbrühe durch
bumin (»Edamin«) Ig Extraktion und Papierchromatographie wird, wie im
Maismaischflüssigkeit 0,25 ecm 55 Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Dabei erhält
Mit destilliertem Wasser man Zl1'4-Pregnadien-ll^,17«,21-triol-3,20-dion in
aufgefüllt auf 50 ecm einer Ausbeute von 61 % der Theorie.
Dieses Medium wird mit KOH auf ein pH von Beispiel 5
6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ecm 60 , .
einer Kultur von Nocardia minima (MA 292; ATCC A Es werden 50 ecm eines Nährmediums von folgen-
8674) beimpft, worauf die beimpfte Kultur 48 Stun- der Zusammensetzung hergestellt:
den unter Bewegung bei 280C bebrütet wird. Dann Technische Dextrose (»Cerelose«) Ig
setzt man der Kultur eine Lösung von 10 mg Hydro- Technisches digeriertes Lactal-
cortison (zl4-Pregnen-ll/3,17«,21-triol-3,20-dion) in 65 bumin (»Edamin«) Ig
0,1 ecm Dimethylformamid zu. Die die Steroid- Maismaischflüssigkeit 0,25 ecm
verbindung enthaltende Kultur wird dann weitere Mit destilliertem Wasser
24 Stunden unter Bewegung bei 280C bebrütet. aufgefüllt auf 50 ecm
7 8
Dieses Medium wird mit KOH auf ein pH von Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Dabei erhält
6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ecm man/I1'4-Pregnadien-ll/5,17a,21-triol-3,20-dion.
einer Kultur von Nocardia leishmanii (MA 281;
ATCC 6855) beimpft, worauf die beimpfte Kultur Beispiel 8
48 Stunden unter Bewegung bei 28° C bebrütet wird. 5
Dann setzt man der Kultur eine Lösung von 10 mg Es werden 50 ecm eines Nährmediums von folgen-
Hydrocortison (A 4-Pregnen-ll/?,17a,24-triol-3,20-dion) der Zusammensetzung hergestellt:
in 0,1 ecm Dimethylformamid zu. Die die Steroid-
verbindung enthaltende Kultur wird dann weitere Technische Dextrose (»Cerelose«) 1 g
24 Stunden unter Bewegung bei 28 ° C bebrütet. io Technisches digeriertes Lactal-
Die Aufarbeitung der Fermentationsbrühe durch bumin (»Edamin«) Ig
Extraktion und Papierchromatographie wird, wie im Maismaischflüssigkeit 0,25 ecm
Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Dabei erhält Mit destilliertem Wasser
man ^^-Pregnadien-llßlTa^l-triol-S^O-dion. aufgefüllt auf 50 ecm
Dieses Medium wird mit KOH auf ein pH von
Beispiele 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ecm
einer Kultur von Nocardia corallina (MA 277;
Es werden 50 ecm eines Nährmediums von folgen- ATCC 4273) beimpft, worauf die beimpfte Kultur der Zusammensetzung hergestellt: 20 48 Stunden unter Bewegung bei 28°C bebrütet wird.
Dann setzt man der Kultur eine Lösung von 10 mg
Technische Dextrose (»Cerelose«) Ig Hydrocortison(Zl4-Pregnen-llftl7a,21-triol-3,20-dion)
Technisches digeriertes Lactal- m 0,1 ecm Dimethylformamid zu. Die die Steroid-
bumin (»Edamin«) Ig verbindung enthaltende Kultur wird dann weitere
Maismaischflüssigkeit 0,25 ecm a5 24 Stunden unter Bewegung bei 28° C bebrütet.
Mit destilliertem Wasser Die Aufarbeitung der Fermentationsbrühe durch
aufgefüllt auf \ 50 ecm Extraktion und Papierchromatographie wird, wie im
Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Dabei erhält
'- Dieses Medium wird mit KOH auf ein pH von manZf1'4-Pregnadien-llj5,17a,21-triol-3,20-dion.
6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ecm 30
einer Kultur von Nocardia formica (MA 143; NRRL _ . . .
2470) beimpft, worauf die beimpfte Kultur 48 Stun- ü e 1 s ρ 1 e i y
den unter Bewegung bei 28° C bebrütet wird. Dann Sechs Ansätze des in den Beispielen 1 bis 8 beschrie-
setzt man der Kultur eine Lösung von 10 mg Hydro- benen, digeriertes Lactalbumin enthaltenden Nährcortison Cd4-Pregnen-ll/?,17a,21-triol-3,20-dion) in 35 mediums zu je 50 ecm werden auf ein pH von 6,5 0,1 ecm Dimethylformamid zu. Die die Steroid- eingestellt, durch 15 Minuten langes Erhitzen auf verbindung enthaltende Kultur wird dann weitere etwa 120° C in einem Autoklav sterilisiert und darauf 24 Stunden unter Bewegung bei 28° C bebrütet. je mit einer Kultur von Nocardia blackwellii (ATCC
Die Aufarbeitung der Fermentationsbrühe durch 6846) beimpft. Die beimpften Kulturen werden Extraktion und Papierchromatographie wird, wie im 40 48 Stunden unter Bewegung bei 28° C bebrütet, Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Dabei erhält worauf die sechs Kulturen mit Lösungen von je man/d1'4-Pregnadien-ll/?,17a,21-triol-3,20-dion. 10 mg von sechs verschiedenen 3-Ketosteroidverbin-
dungen in je 0,1 ecm Dimethylformamid versetzt
werden. Dann werden die die 3-Ketosteroidverbin-
B e i s ρ i e 1 7 45 düngen enthaltenden Kulturen weitere 24 Stunden
unter Bewegung bebrütet.
Es werden 50 ecm eines Nährmediums von folgen- Man extrahiert jede der so erhaltenen Fermen-
der Zusammensetzung hergestellt: tationsbrühen einzeln mit je vier Anteilen von 50 ecm
Äthylacetat, vereinigt die aus jeder Brühe eines
Technische Dextrose (»Cerelose«) Ig 50 bestimmten 3-Ketosteroidsubstrates erhaltenen Äthyl-
Technisches digeriertes Lactal- acetatextrakte jeweils miteinander und dampft sie im
bumin (»Edamin«) Ig Vakuum zur Trockene ein. Jeder der so erhaltenen
Maismaischflüssigkeit 0,25 ecm sechs Rückstände wird in Aceton gelöst, worauf man
Mit destilliertem Wasser von jedem Ansatz ein Papierstreifenchromatogramm
aufgefüllt auf 50 ecm 55 herstellt, welches mit dem in der nachstehenden
Tabelle angegebenen Lösungsmittelsystem entwickelt
Dieses Medium wird mit KOH auf ein pH von wird. Die den 1-Dehydroderivaten entsprechenden 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ecm oberen Bänder eines jeden Chromatogramms werden einer Kultur von Nocardia convoluta (MA 275; ausgeschnitten und einzeln mit Methanol extrahiert; ATCC 4275) beimpft, worauf die beimpfte Kultur 60 die Methanolextrakte werden dann nochmals der 48 Stunden unter Bewegung bei 28° C bebrütet wird. Papierstreifenchromatographie unterworfen. Dann Dann setzt man der Kultur eine Lösung von 10 mg werden die oberen Bänder wiederum abgeschnitten, Hydrocortison (^4-Pregnen-ll|e,17«,21-triol-3,20-dion) getrocknet und mit Methanol extrahiert; der Mein 0,1 ecm Dimethylformamid zu. Die die Steroid- thanolextrakt wird im Vakuum zur Trockene einverbindung enthaltende Kultur wird dann weitere 65 gedampft, wobei man für jedes als Ausgangsstoff 24 Stunden unter Bewegung bei 28° C bebrütet. verwendetes Substrat die entsprechende, in der nach-
Die' Auf arbeitung der Fermentationsbrühe durch stehenden Tabelle angegebene z!1>4-3-Ketosteroid-Extraktion und Papierchromatographie wird, wie im verbindung erhält:
Für die Papierstreifenchromatographie verwendetes Lösungsmittelsystem
Versuch
Nr.		 Substrat Stationäre
Phase		 Bewegliche Phase Erhaltenes ^1-4-3-Ketosterin
1 zl4-Pregnen- Formamid Chloroform Zl1'4-Pregnadien-
3,20-dio'n 3,20-dion
2 Pregnan-llj8,17a,21-triol- Formamid Chloroform ^!•i-Pregnadien-
3,20-dion llj?,17ix,21-triol-3,20-dion
(Ausbeute etwa 60%
der Theorie)
3 Pregnan-17oc,21-diol- Formamid Gemisch aus z!1'4-Pregnadien-
3,ll,20-trion-21-acetat Chloroform 17«,21-diol-3,ll,20-trion
und Toluol (1:1)
4 Allopregnan-17«,21-diol- Formamid Gemisch aus Zl1>4-Pregnadien-
3,ll,20-trion-21-acetat Chloroform 17a,21-diol-3,ll,20-trion
und Toluol (1:1)
5 Pregnan-17a,21-diol- Formamid Benzol Zl1'4-Pregnadien-
3,20-dion 17a,21-diol-3,20-dion
6 Allopregnan-17«,21-diol- Formamid Benzol zI1>4-Pregnadien-
3,20-dion-21-acetat 17a,21-diol-3,20-dion
Beispiel 10
Es werden 50 ecm eines Nährmediums von folgender Zusammensetzung hergestellt:
Technische Dextrose (»Cerelose«) 1 g
Technisches digeriertes Lactal-
bumin (»Edamin«) Ig
Maismaischflüssigkeit 0,25 ecm
Mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf 50 ecm
Dieses Medium wird mit KOH auf ein pH von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ecm einer Kultur von Nocardia asteroides (MA 272; ATCC 9970) beimpft, worauf die beimpfte Kultur 48 Stunden unter Bewegung bei 280C bebrütet wird. Dann setzt man der Kultur eine Lösung von 10 mg Pregnan-llß,17a,21-triol-3,20-dion in 0,1 ecm Dimethylformamid zu. Die die Steroidverbindung enthaltende Kultur wird dann weitere 12 Stunden unter Bewegung bei 28 0C bebrütet.
Man extrahiert die Fermentationsbrühe mit vier Anteilen von je 50 ecm Äthylacetat, vereinigt die Äthylacetatextrakte und dampft sie im Vakuum auf etwa 5 ecm ein. Aus der konzentrierten Lösung werden Papierstreifenchromatogramme hergestellt, die unter Verwendung von Formamid als stationärer flüssiger Phase und von Chloroform als beweglicher flüssiger Phase entwickelt werden. Das so erhaltene Hauptband zeigt das für Hydrocortison charakteristische Absorptionsmaximum im Ultraviolett. Das Papierchromatogramm wird getrocknet und dieses Band ausgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Der Methanolextrakt wird nochmals der Papierstreifenchromatographie unterworfen, wobei man ein 48 Stunden mit Methanol extrahiertes Papier und das oben beschriebene System von Chloroform und Formamid verwendet. Das so erhaltene Chromatogramm wird gründlich getrocknet, und das Band, welches das für Hydrocortison charakteristische ultraviolette Absorptionsmaximum zeigt, wird wiederum ausgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Beim Eindampfen des Methanolextraktes im Vakuum zur Trockene erhält man Hydrocortison ■ (A 4-Pregnan-ll|S,17a,21-triol-3,20-diori).
Die obige Verfahrensweise wird mit dem gleichen Nährmedium sowie mit Pregnan-ll/3,17«,21-triol-, 3,20-dion als Substrat und einer Bebrütungsdauer·, von 12 Stunden wiederholt, wobei jedoch an Stelle von Nocardia asteroides MA 272 die folgenden Mikroorganismen verwendet werden:
Nocardia minima — (MA 292; ATCC 8674); ; Nocardia globerula — (MA 280; ATCC 9356); : Nocardia leishmanii — (MA 281; ATCC 6855);· Nocardia formica — (MA 143; NRLL 2470);
Nocardia asteroides — (MA 289; ATCC 10904).-
Durch Extraktion der Fermentationsbrühen und-Papierchromatographie der getrockneten Extrakte mit einem aus Formamid und Chloroform bestehenden Lösungsmittelsystem erhält man auf jedem der Chro- ■ matogramme ein dem Hydrocortison entsprechendes: Band. Durch Eluieren dieses Bandes in der oben beschriebenen Weise erhält man Hydrocortison,' welches durch sein UV-Absorptionsspektrum als hauptsächliches Verfahrensprodukt identifiziert wird.
Beispiel 11
Es wird ein Nährmedium von folgender Zusammensetzung hergestellt:
Technische Dextrose (»Cerelose«) 68 g
Technisches digeriertes Lactal-
bumin (»Edamin«) 68 g
Maismaischfiüssigkeit 17 ecm ·:
Mit destilliertem Wasser
aufgefülltauf 3400 ecm
Dieses Medium wird mit KOH auf ein pH von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 200 ecm eines vegetativen Wachstums einer Kultur von Nocardia blackwellii (MA 273; ATCC 6846) beimpft, worauf die beimpfte Kultur 48 Stunden unter Bewegung und Belüftung bei 28° C bebrütet wird. Dann setzt man der Kultur eine Lösung von 0,64 g Pregnan-
609 748/435
in Dimethylformamid zu. Die die Steroidverbindung enthaltende Kultur wird dann weitere 24 Stunden unter Bewegung und Belüftung bei 280C bebrütet.
Man extrahiert die Fermentationsbrühe mit Äthylacetat, trennt den Extrakt ab und dampft ihn zur Trockene ein. Der trockene Rückstand wird zwischen Petroläther und 70%igeni wäßrigem Methanol verteilt; die Petrolätherschicht wird verworfen. Das das gewünschte Produkt enthaltende wäßrige Methanol wird unter vermindertem Druck eingedampft, um das Methanol abzutreiben. Die so erhaltene Wasserschicht wird mehrmals mit Äthylacetat extrahiert und die Äthylacetatschicht zur Trockene eingedampft, wobei man rohes Zl1>4-Pregnadien-17«,21-diol-3,11,20-trion erhält. Zwecks Reinigung wird dieses in Pyridin gelöst und mit einem Überschuß von Essigsäureanhydrid zu Zl1'4-Pregiadien-17«,21-diol-3,ll,20-trion-21-acetat umgesetzt, welches aus dem Acetylierungsgemisch durch Zusatz von Wasser und Abnltrieren des Niederschlages gewonnen wird. Das zl1'4-Pregnadien-17a,21-diol-3,ll,20-trion-21-acetat wird in Äther gelöst und an aktivierter Tonerde chromatographiert. Die Tonerdekolonne wird mit Äther und einem Gemisch von Äther und Chloroform entwickelt. Das gewünschte Produkt wird aus der Kolonne mit Chloroform eluiert und das Chloroformeluat eingedampft, wobei man eine hohe Ausbeute von praktisch reinem, kristallinem Zl1>4-Pregnadien-17«,21-diol-3,ll,20-trion-21-acetat erhält.
Beispiel 12
Zwei Ansätze des in den Beispielen 1 bis 8 beschriebenen, digeriertes Lactalbumin enthaltenden Nährmediums zu je 50 ecm werden mit KOH auf ein pH von 6,5 eingestellt, durch 15minutiges Erhitzen auf 120° C in einem Autoklav sterilisiert und dann je mit einer Kultur von Nocardia blackwellii (ATCC 6846) beimpft. Die beimpften Kulturen werden 48 Stunden unter Bewegung bei 280C bebrütet. Nach Ablauf der Bebrütüngsdauer werden die Kulturen zentrifugiert, worauf man die überstehende Flüssigkeit verwirft und die abzentrifugierten Zellen mit destilliertem Wasser wäscht und mit durch Pufferung auf ein pH von 7,0 eingestelltem Wasser auf ein Volumen von 25 ecm bringt. Die eine der Zellensuspensionen wird mit einer Lösung von 5 mg Pregnan-3,17oc,21-triolll,20-dion-2l-acetat in 0,1 ecm Dimethylformamid und die andere mit einer Lösung von 5 mg Pregnan-17oc,21-diol-3,ll,20-trion-21-acetat in 0,1 ecm Dimethylformamid versetzt. Die die Pregnanverbindungen enthaltenden Zellensuspensionen werden dann etwa 12 bis 15 Stunden unter Bewegung bebrütet.
Die beiden so erhaltenen Fermentationsbrühen werden jeweils mit vier Anteilen von je 50 ecm Äthylacetat extrahiert. Die zusammengehörigen Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei man in beiden Fällen reines zl1'4-Pregnadien-17«,21-diol-3,ll,20-trion erhält, Die polarographische Analyse zeigt, daß die Ausbeute in beiden Fällen 85% der Theorie übersteigt.

Claims (7)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur 1- und/oder 4-Dehydrierung von Steroidverbindungen durch Bebrütung entsprechender gesättigter Steroide mit Kulturen dehydrierend wirkender Mikroorganismen oder den daraus gewonnenen dehydrierend wirkenden Enzymen unter aeroben Bedingungen, d adurch gekennzeichnet, daß man eine in 1(2)- oder 1(2)- und 4(5)-Stellung gesättigte, in 3-Stellung durch Sauerstoff substituierte Steroidverbindung der dehydrierenden Aktivität von Mikroorganismen der Gattung Nocardia oder daraus gewonnener Enzyme aussetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine in 1(2)-Stellung gesättigte, in 3-Stellung durch Sauerstoff substituierte Steroidverbindung der Pregnanreihe, die eine vom C-Atom 5 ausgehende Doppelbindung aufweisen kann, als Ausgangsstoff verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine in 1(2)-Stellung gesättigte, in 3-Stellung durch Sauerstoff substituierte Steroidverbindung der Pregnanreihe, die am Kohlenstoffatom 5 eine Doppelbindung besitzt, mit Mikroorganismen der Arten Nocardia blackwellii, Nocardia asteroides, Nocardia minima, Nocardia globerula, Nocardia leishmanii, Nocardia formica, Nocardia convoluta oder Nocardia corallina behandelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 3-Ketopregnanverbindung als Ausgangsstoff verwendet und ein entsprechendes ^1-4-3-Ketopregnadien erhält.
5. Verfahren nach Anspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 3-Ketopregnanverbindung mit Mikroorganismen der Art Nocardia blackwellii behandelt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zl4-Pregnen-llß,17a,21-triol-3,20-dion, Pregnan-ll/J^a^l-triol-S^O-dion,
pregnan-na^l-diol-SJl^O-trion^l-acetat, Pregnan-17 α, 21 - diol- 3,20 - dion, Allopregnan-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat oder eine 3-Oxypregnanverbindung als Ausgangsstoffe verwendet und die entsprechenden Zl1>4-3-Ketopregnadiene erhält.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 3-Ketopregnanverbindung als Ausgangsstoff verwendet und eine entsprechende Δ 4-3-Ketopregnenverbindung erhält.
In Betracht gezogene Druckschriften:
HeIv. Chim. Acta, Bd. 38 (1955), S. 835 und 1502; Journ. Am. Chem. Soc, Bd. 77 (1955), S. 4184;
Arch. Biochem. Biophys., Bd. 59 (1955), S. 304, 305;
Expecientia, Bd. 9 (1953), S. 371.
Bei der Bekanntmachung der Anmeldung ist ein Prioritätsbeleg ausgelegt worden.
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