<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Herstellung oxigenierter Dehydrosteroide
EMI1.1
<Desc/Clms Page number 2>
B. USA-Patentschriftlung, oder durch eine Methylgruppe in 17 < x-oder 17B-Stellung. Spezifische Ausgangsstoffe sind unter anderem Progesteron, 17a-Progesteron, 16a-Oxy-, 17a-Oxy- oder 18-Oxy-progesteron, Cortexon, 18-Oxy-oder 18-Oxo-cortexon, ll-Keto-progesteron, ll < x- sowie llss-Oxy-progesteron, 9, 11- oder
EMI2.1
12-Dehydro-progesteron, 19-Oxy-progesteron, 9-Chlor-oder 9-Fluor-llS-oxy-progesteron, 11 ss, 18-Di-Pregnen-3-ol-20-on, Allopregnan-3, 20-dion, Pregnan-3, ll, 20-trion. Allopregnan-3, 11, 20-irlon-17c (-ol, oder ihre funktionellen Derivate.
Die verwendeten Enzyme für die Oxydation in 11-Stellung werden vorzugsweise von aeroben Kultu- ren von Pilzen der Gattungen Rhizopus, Mucor, Aspergillus, Penicillium, Curvularia, Cunninghamella, Spondylocladium oder Streptomyces produziert. Für die Oxydation in 17-Stellung eignen sich Enzyme aus aeroben Kulturen von Trichothecium roseum, Leptosphaeria maculans, Cucurbitaria laburni, Acrospeira levis, Lophotrichusmartinii, Melanospora parasitica oder Thielavia terricola. Die Enzyme für die Oxydation in 21-Stellung werden vorteilhaft mit Hilfe aerober Kulturen von Ophiobolus herpotrichus oder Sclerotiniafructicola erhalten. Die Dehydrierung in 1, 2- und/oder in 4, 5-Stellung wird mit Enzymen von Didymella lycopersici, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus oder Ophiobolus Miyabeanus durchgeführt.
Dabei kann man mit isolierten oder angereicherten Enzympräparaten, insbesondere aber mit rohen wachsenden Pilzkulturen, mit deren Filtraten oder mit Mycelsuspensionen arbeiten.
Die zur Züchtung dieser Pilze verwendeten Kulturlösungen werden zweckmässig bewegt, d. h. geschüttelt oder gerührt, und enthalten assimilierbaren Kohlenstoff, insbesondere Kohlenhydrate sowiegegebenenfalls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. Man verwendet zweckmässig solche Nährlösungen, die allen verwendeten Pilzen optimale Wachstumsbedingungen bieten. Es ist auch möglich, später für die Pilze speziell geeignete Nähr- und Wuchsstoffe zuzusetzen.
Das Verfahren wird in einem Arbeitsgang durchgeführt. Es hat sich aber als vorteilhaft erwiesen, die Dehydrierung und Oxigenierungen an den genannten Stellungen zeitlich nacheinander vorzunehmen. Das praktisch einfachste Verfahren ist im folgenden geschildert, ohne dass die Erfindung durch diese Angaben beschränkt sein soll.
Man züchtet den für die erste Oxigenierung bzw. die Dehydrierung benötigten Organismus in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotika-Fabrikation als sogenannte Tieftankverfahren bekannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol zu und inkubiert weiter, bis die maximale Umsetzung erreicht ist. Dann gibt man, ohne vorher zu filtrieren oder das Umsetzungsprodukt zu isolieren, zum Reaktionsgemisch eine ausgewachsene Kultur des zweiten Organismus und nötigenfalls entsprechende Nährsubstanzen und Wuchsstoffe zu und fährt mit der Inkubation fort. Gegebenenfalls wird diese Operation mit einem weiteren Mikroorganismus wiederholt.
Der Verlauf der Dehydrierung und der einzelnen Oxigenierungen kann papierchromatographisch verfolgt werden. Schliesslich trennt man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat und bzw. oder die Mycelmasse und isoliert aus dem Extrakt die Reaktionsprodukte in an sich bekannter Weise, z. B. durch Entmischungsverfahren, Adsorption, Chromatographie, Kristallisation, Überführung in funktionelle Derivate, wie Girard-Verbindungen u. dgl.
Die Pilzkulturen bzw. Enzyme können in beliebiger Reihenfolge zugegeben werden. Im übrigen lässt sich durch Vorversuche leicht feststellen, welche Reihenfolge gegebenenfalls Vorteile bietet.
Nach vorliegendem Verfahren gelangt man zu wertvollen Heilmitteln der Steroid-, insbesondere der Pregnanreihe, die sich verglichen mit den in 1, 2-Stellung gesättigten, therapeutisch wirksamen Verbin- dungen durch eine gesteigerte Wirksamkeit auszeichnen. Von den Verfahrensprodukten sind insbesondere zu nennen das A'-3,ll,20-Trioxo-17(x,21-dioxy-pregnadien,A'-3, 20-'Dioxo-110, 17et, 21-trioxy-
EMI2.2
<Desc/Clms Page number 3>
3, 20-Dioxo-17 < x, 21-dioxy-pregnadien, A- Halogen-, insbesondere die Fluor- oder Chlorverbindungen. Sofern die Verfahrensprodukte nicht die Konfiguration und die Substituenten von therapeutisch verwendbaren Sterolden aufweisen, können sie als Zwischenprodukte zu deren Herstellung, z. B. der obengenannten Verbindungen dienen.
Die verfahrensgemäss erhältlichen Umsetzungsprodukte lassen sich in an sich bekannter Weise in ihre funktionellen Derivate, wie Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffderivate, beispielsweise Ester, Äther, Enolester, Enoläther, Ketale, Thioäther und Thioketale, ferner Hydrazone, Oxime und Enamine überführen. In diesen Verbindungen können die Oxy- und bzw. oder Oxogruppen vollständig oder teilweise funktionell abgewandelt sein.
In den Estern und Enolestern sind die Säurereste solche beliebiger organischer und anorganischer Säuren, wie aliphatischer, alicyclischer, araliphatischer, aromatischer oder heterocyclischer Carbon-,
Thioncarbon-, Thiolcarbon- oder Sulfonsäuren, vorzugsweise der Ameisensäure, Essigsäure, Chloressigsäuren, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Buttersäuren, Valeriansäuren, Trimethylessigsäure, Diäthylessigsäure, Capronsäuren, Oenanthsäuren, Caprylsäuren, Palmitinsäure, Crotonsäure, Undecansäure, Undecylensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Pimelinsäure, Maleinsäure, Milchsäure, Carbaminsäuren, Alkoxycarbonsäuren, ss-Cyclopentylpropionsäure, Hexahydrobenzoesäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, Cyclohexylessigsäure, Phenylpropionsäuren,
Trimethylgallussäure, Phthalsäure, Furan-2-carbonsäure, Isonicotinsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Schwefelsäuren, Halogenwasserstoffsäuren oder Phosphorsäuren.
Wenn erwünscht, lassen sich in erhaltenen Verbindungen funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppen in freie Gruppen überführen. Auf diese Weise können insbesondere in polysubstituierten Derivaten die funktionell abgewandelten Gruppen auch teilweise in Freiheit gesetzt werden. Dies, erfolgt z. B. durch chemische oder enzymatische Hydrolyse, beispielsweise unter Verwendung saurer oder basischer Mittel, durch Umesterung oder Umacetalisierung. Aus den auf diese Weise oder auch direkt erhaltenen, nur partiell abgewandelten, wie veresterten bzw. verätherten Derivaten lassen sich durch anschliessende funk- tionelle Abwandlung, z. B. Veresterung oder Verätherung, polysubstituierte Derivate, insbesondere auch gemischte Ester oder Äther bzw. Ester-Äther, herstellen.
Die erhaltenen 9, 11B-Oxido-Verbindungen lassen sich durch Umsetzung mit Halogenwasserstoffsäuren, insbesondere Fluor- und Chlorwasserstoffsäure, in die entsprechenden 9, 11-Halogenhydrine über- führen.
Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel oder als Zwischenprodukte zu deren Herstellung Verwendung finden.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1: In einem Schüttelgefäss von 16 l Fassungsvermögen werden 3,6 1 Bierwürze sterilisiert und mit 400 cm3 einer 2 Tage alten, auf Bierwürze gewachsenen Schüttelkultur von Ophiobolus herpotrichus beimpft. Es wird 2 Tage lang bei 27 geschüttelt, wobei sich die Kultur gut entwickelt. Dann gibt man eine Lösung von 1, 0 g Progesteron in 25 cm3 Aceton unter sterilen Bedingungen zu. Gleichzeitig beimpft man in einem zweiten Schüttelgefäss 3, 61 sterile Bierwürze mit 400 cm3 einer 2 Tage alten, ebenfalls auf Bierwürze gezüchteten Schüttelkultur vonCalonectria decora. Die beiden Gefässe werden bei 270 3 Tage lang geschüttelt.
Die nun ausgewachsene Calonectria-Kultur wird unter sterilen Bedingungen in das 16 1 - Gefäss transferiert, welches nun weitere 2 Tage bei 270 geschüttelt wird. Dann wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat viermal mit je 2 1 Essigester ausgeschüttelt. Die Extrakte werden dreimal mit je 300 cm3 Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man löst den erhaltenen Rückstand (1, 4 g) in 160 cm3 Methanol, gibt 40 cm Wasser zu und schüttelt dreimal mit je 50 cm3 Pentan aus. Die Pentanextrakte enthalten nur ölige Verunreinigungen, während die Steroide in der methanolischen Lösung bleiben. Diese wird im Vakuum bei 300 eingedampft und im Hochvakuum getrocknet.
Man chromatographiert den Rückstand an 30 g Silicagel nach der Durchlaufmethode, wobei man zuerst mit Chloroform, dann mit Chloroform-Aceton-Gemischen steigenden Acetongehaltes und schliesslich mit Aceton eluiert. Die einzelnen Fraktionen (je 100 cm3) werden papierchromatographisch untersucht.
Die mit Chloroform eluierten Anteile enthalten neben Verunreinigungen etwas Ausgangsmaterial und die Chloroform-Aceton (97, 5 : 2, 5)-Gemische etwas Cortexon (11-Desoxy-corticosteron). Die Hauptmenge der Substanz befindet sich in den Chloroform-Aceton (95 : 5)-Fraktionen und besteht zur Hauptsache aus l-Dehydro-cortexon,welchesauseinemAceton-Petroläthergemisch kristallisiert erhalten wird, F=185 bis
EMI3.1
<Desc/Clms Page number 4>
hat sie sich gut entwickelt und man gibt dazu unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 15 mg Progesteron in 0,75 cm3 Aceton. Zur gleichen Zeit werden in einem zweiten Erlenmeyerkolben 50 cm3 Bierwürze sterilisiert und mit einem Stamm Curvularia brachyspora beimpft. Beide Kulturen werden nun in gleicher Weise bei 270 geschüttelt.
Nach 3 Tagen wird die ausgewachsene Curvularia-Kultur unter sterilen Bedingungen zur Ophiobolus-Kultur gegeben. Die vereinigten Kulturen werden weiter geschüttelt. Gleichzeitig werden in einem dritten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit Calonectria decora beimpft und bei 270 geschüttelt. Nach 3 Tagen wird diese Calonectria-Kultur unter sterilen Bedingungen zum Gemisch der beiden andern Kulturen gegeben, worauf weiter bei 270 geschüttelt wird. Nach 3 Tagen trennt man das Mycel ab und schüttelt das Kulturfiltrat dreimal mit je 30 cm3 Essigester aus. Die Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Die papierchromatographische Untersuchung des Rückstandes zeigt die Anwesenheit von 1-Dehydro-11 ss, 21-dioxy-progesteron (1-Dehydro-corticosteron).
Ersetzt man beim obigen Verfahren das Progesteron durch 18-Oxo-progesteron, so wird 1-Dehydroaldosteron erhalten.
Beispiel 3 : Wie in Beispiel 2 beschrieben, wird zu einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus in 50 cm Bierwürze eine Lösung von 15 mg Progesteron in 0,75 cm3 Aceton gegeben. Zu gleicher Zeit werden in einem zweiten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterilisierte Bierwürze mit Trichothecium roseum beimpft. Beide Kulturen werden nun bei 270 geschüttelt. Nach 3 Tagen werden sie unter Vermeidung von Infektionen vereinigt und das Gemisch wird weitere 3 Tage bei der gleichen Temperatur geschüttelt.
Gleichzeitig werden in einem dritten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit Calonectria decora beimpft und bei 27 geschüttelt. Nach 3 Tagen wird diese Calonectria-Kultur unter sterilen Bedingungen zum Gemisch der beiden andern Kulturen gegeben, worauf weiter bei 270 geschüttelt wird. Nach 3 Tagen trennt man das Mycel ab und extrahiert das Kulturfiltrat wie in Beispiel 1 beschrieben. Der Extraktionsrückstand enthält gemäss papierchromatographischer Auswertung I-Dehydro-17a. 21-dioxy-progesteron.
Beispiel 4 : Ersetzt man in Beispiel 3 das Progesteron durch 11-Keto-progesteronundinkubiert man in der beschriebenen Weise mit Kulturen von Ophiobolus herpotrichus, Trichotheciumroseum und
EMI4.1
21-Beispiel 5 : Ersetzt man in Beispiel 3 das Progesteron durch 11 ss-Oxy-progesteron und inkubiert man auf gleiche Weise mit Kulturen von Ophiobolus herpotrichus, Trichothecium roseum und Calonectria decora, so können im Extraktionsrückstand erheblicheMengen 1-Dehydro-llB, 17a, 21-trioxy-progesteron (1- Dehydro... hydrocortison) nachgewiesen werden.
Beispiel 6 : Wie in Beispiel 2 beschrieben, gibt man zu einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus in 50 cm3 Bierwürze unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 15 mg Progesteron in 0,75 cms Aceton.
Zu gleicher Zeit werden in einem zweiten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit Leptosphaeria maculans beimpft. Beide Kulturen werden bei 270 geschüttelt und nach 3 Tagen vereinigt. Gleichzeitig beimpft man in einem dritten Erlenmeyerkolben 50 cms sterile Bierwürze mit Curvularia lunata. Diese Kultur und das genannte Kulturgemisch werden 3 Tage lang bei 270 geschüttelt, wobei sich die Curvularia-Kultur gut entwickelt. Sie wird dann unter sterilen Bedingungen mit dem Kulturgemisch vereinigt.
Man lässt weitere 3 Tage bei 270 schütteln. Gleichzeitig werden in einem vierten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit Alternaria passiflorae beimpft und bei 270 geschüttelt. Nach 3 Tagen wird diese Alternaria-Kultur unter sterilen Bedingungen zum Gemisch der drei andern Kulturen gegeben, worauf weiter bei 270 geschüttelt wird. Dann trennt man das Mycel ab und extrahiert das Kulturfiltrat, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die papierchromatographische Untersuchung des Extraktionsrückstandes zeigt die Anwesenheit erheblicher Mengen von I-Dehydro-118. 17a-21-trioxy-progesteron (1-Dehydro-hydrocortison) neben 1-Dehydro-11-keto-17ct, 21-dioxy-progesteron (1-Dehydro-cortison).
Beispiel 7 : Variiert man in Beispiel 6 die Reihenfolge der Zugabe der genannten Kulturen, indem man das Progesteron zuerst mit einer Kultur von Curvularia lunata inkubiert, darauf zuerst inder beschriebenen Weise eine Kultur von Ophiobolus herpotrichus, dann eine solche von Alternaria passiflorae und zuletzt eine solche von Leptosphaeria maculans zugibt, so enthält der in der üblichen Weise erhaltene Extraktionsrückstand ebenfalls 1-Dehydro-Ilss, 17et, 21-trioxy-progesteron (1-Dehydro-hydrocortison) und l-Dehydro-ll-keto-17a, 21-dioxy-progesteron (1-Dehydro-cortison).
Beispiel 8 : 50 cm3 sterile Bierwürze werden mit Cunninghamella Blakesleena beimpft. Die Kultur wird 2 Tage bei 270 geschüttelt und dann unter sterilen Bedingungen mit einer Lösung von 15 mg 11-Desoxy-corticosteron (Cortexon) in 0,75 cm3 Aceton versetzt. Gleichzeitig beimpft man in einem zweiten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit Trichothecium roseum. Beide Kulturen werden weitere 2 Tage bei der gleichen Temperatur geschüttelt und dann unter sterilen Bedingungen vereinigt
<Desc/Clms Page number 5>
und weiter geschüttelt. Gleichzeitig werden in einem dritten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit Calonectria decora beimpft und bei 27 geschüttelt.
Nach 3 Tagen wird diese Caionectria-Kultur unter sterilen Bedingungen zum Gemisch der beiden andern Kulturen gegeben, worauf weiter bei 270 geschüttelt wird. Nach 2 Tagen trennt man das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates geschieht in gleicher Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben. Der Extraktionsrückstand enthält I-Dehydro-llss, 17cx, 21-
EMI5.1
impft man in einem zweiten Schüttelgefäss 3, 6 I sterile Bierwürze mit 400 cm einer 3 Tage alten, ebenfalls auf Bierwürze gezüchteten Schüttelkultur von Trichothecium roseum. Die beiden Gefässe werden bei 27 3 Tage lang geschüttelt.
Die nun ausgewachsene Trichothecium-Kultur wird unter sterilen Bedingungen in das 18 l-Gefäss transferiert und zur gleichen Zeit beimpft man in einem weiteren Schüttelgefäss 3,6 l sterile Bierwürze mit 400 cm3 einer 24 Stunden alten, auf Bierwürze gewachsenen Schüttelkultur von Calonectria decora. Man lässt dieses Schüttelgefäss sowie dasjenige, das das soeben beschriebene Kultur-Gemisch enthält, 3 Tage lang bei 270 schütteln und vereinigt deren Inhalt dann unter sterilen Bedingungen. Gleichzeitig werden 3 1 sterile Bierwürze mit 400 cm3 einer 36 Stunden alten, auf Bierwürze gewachsenen Schüttelkultur von Curvularia lunata beimpft.
Diese Kultur sowie das Kultur-Gemisch im 1. 8 1-Gefäss werden 2 Tage bei 270 geschüttelt, worauf man deren Inhalt unter sterilen Bedingungen vereinigt. Man schüttelt nochmals 2 Tage lang bei der angegebenen Temperatur und trennt dann das Mycel ab. Das Kulturfiltrat schüttelt man viermal mit je 3 1 Essigester aus. Die Extrakte werden dreimal mit je 50. 0 cm3 Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Man löst den erhaltenen Rückstand (1, 1 g) in 160 cm* Methanol, gibt 40 cm Wasser zu und schüttelt dreimal mit je 50 cm3 Pentan aus. Die Pentanextrakte enthalten nur ölige Verunreinigungen, während die Steroide in der methanolischen Lösung bleiben. Diese wird im Vakuum bei 30 eingedampft und im Hochvakuum getrocknet.
Man chromatographiert den Rückstand an 30 g Silicagel nach der Durchlaufmethode, wobei man zuerst mit Methylenchlorid, dann mit Chloroform und mit Chloroform-Aceton-Gemischen und schliesslich mit Aceton eluiert. Die einzelnen Fraktionen (150 cm3)werden papierchromatographisch untersucht.Die mit Methylenchlorid und mit Chloroform eluierten Fraktionen enthalten Verunreinigungen, etwas Ausgangsmaterial und 11-Desoxycorticosteron, während in den Gemischen von Chloroform und Aceton (9 : 1 und 8 : 2) 1-Dehydro-ll-keto- 17a, 21-dioxy-progesteron (1-Dehydro-cortison) anwesend ist.
Die betreffenden Fraktionen werden eingedampft und man erhält aas 1-Dehydro-cortison nach Umkristallisieren aus einem Aceton-Isopropyl- äther-Gemisch in Kristallen vom F=230-2330. Die Chloroform-Aceton (1 : 1)-Fraktionen enthalten 1-Dehydro-llss, 17ct, 21-trioxy-progesteron (1-Dehydro-hydrocortison), das aus Aceton-Petroläther kristallisiert ; F = 238-240 .
Beispiel 10 : Verwendet man in Beispiel 9 an Stelle der Kultur von Calonectria decora eine in gleicher Weise gezüchtete Kultur von Didymella lycopersici und geht man im übrigen wie in Beispiel 9 beschrieben vor, so erhält man ebenfalls das 1-Dehydro-11-keto-17cx, 21-dioxy-progesteron (1-Dehydrocortison), F = 230-233 sowie das 1-Dehydro-llB, 17cx, 21-trioxy-progesteron (1-Dehydro-hydrocortison), F = 238-2400.
Beispiel 11 : Je 3,6 1 sterilisierte Bierwürze werden mit Ophiobolus herpotrichus, Trichothecium roseum, Didymella lycopersici und Curvularia lunata beimpft und bei 270 geschüttelt. Nach 3 Tagen werden die Kulturen vereinigt und man gibt zum Gemisch eine Lösung von 1, 0 g Progesteron in 25 cm3 Aceton und lässt weiter bei 270 schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt. Wie in Beispiel 9 beschrieben extrahiert man das Kulturfiltrat und chromatographiert den Extraktionsrückstand an Silicagel.
EMI5.2
sion abfiltriert. Wie in Beispiel 9 beschrieben wird das Filtrat extrahiert und der Extraktionsrückstand chromatographiert. Man erhält 1-Dehydro-cortison vom F = 230'-233 und 1-Dehydro-hydrocortison vom F = 238-2400.
<Desc/Clms Page number 6>
Beispiel 13 : 120 cm3 sterilisierte Bierwürze werden mit Trichothecium roseum beimpft und 3 Tage bei 270 geschüttelt. Dann gibt man eine Lösung von 40 mg 9, llss-Oxido-cortexon-21-acetat in 1, 5 cm3 Aceton zu. Zu gleicher Zeit werden 120 cm3 sterile Bierwürze mit Didymella lycopersici beimpft. Beide Kulturen lässt man bei 270 schütteln. Nach 3 Tagen werden sie vereinigt und weitere 3 Tage bei 270 geschüttelt. Dann trennt man das Mycel ab und schüttelt das Kulturfiltrat dreimal mit je 50 cm3 Essigester aus. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft.
Der Extraktionsrückstand (42 mg) besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung zur Hauptsache ausl-Dehydro-9, llss-oxido-17 (X-oxy-cortexon. Dieses wird mittels präparativer Papierchromatographie (System Propylenglykol-Toluol) gereinigt und mit 4 cm3 Pyridin-Essigsäureanhydrid-Gemisch in üblicher Weise acetyliert. Das so erhaltene Rohprodukt löst man in 5 cm Dioxan, vermischt mit 1, 25 cm3 2, 5n-Fluorwasserstoffsäure in Chloroform und lässt 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Dann gibt man Wasser zu und extrahiert mit Chloroform-Äther (1 : 3). Nach dem Waschen mit Wasser, Trocknen und Verdampfen der Lösungsmittel im Vakuum erhält man das 1-Dehydro-9u.-fluor-hydrocortison-21-ace- tat.
Es wird aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch umkristallisiert, F = 235-2370.
Beispiel 14 : 120 cm3 sterilisierte Bierwürze werdenmitTrichothecium roseum beimpft und 3Ta- ge bei 270 geschüttelt. Dann gibt man eine Lösung von 40 mg 9a-Fluor-corticosteron-21-acetat in 1, 5 cm3 Aceton zu. Zu gleicher Zeit werden 120 cm3 sterile Bierwürze mit Didymella lycopersici be- impft. BeideKulturenlässtmanbei 27 schütteln. Nach 3 Tagen werden sie vereinigt und weitere 3 Tage bei 270 geschüttelt. Dann trennt man das Mycel ab und schüttelt das Kulturfiltrat dreimal mit je 50 cm3 Essigester aus. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft.
Der Extraktionsrückstand (42 mg) besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung zur Hauptsache aus 1-Dehydro-9K-fluor-hydrocortison. Dieses wird mittels eines präparativen Papierchromatogramms im System Propylenglykol-Toluol gereinigt. Das so erhaltene Rohprodukt wird im Hochvakuum bei 400 getrocknet, in 2 cm3 Pyridin aufgenommen und mit 2 cm3 Essigsäureanhydrid versetzt. Nach lestündigem Stehen wird auf Eis gegossen. Das ausgefallene kristalline Produkt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch umkristallisiert. Das so erhaltene 1-Dehydro-9cc-fluor-hydrocortison-21-acetat schmilzt bei 235-237 .
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung oxigenierter Dehydrosteroide, dadurch gekennzeichnet, dass man auf in 1, 2-und bzw. oder 4, 5-Stellung gesättigte Steroide, die in wenigstens einer der Stellungen 11, 17 und 21 nicht oxigeniert sind, in einem Arbeitsvorgang Enzyme aus aeroben Kulturen von Calonectria decora, Ophiobolus heterostrophus, Ophiobolus miyabeanus, Alternaria passiflorae oder Didymella lycopersici und Enzyme aus aeroben Kulturen oxydierend wirkender Pilze der Gattungen Rhizopus, Mucor, Aspergillus, Penicillium, Curvularia, Cunninghamella, Spondylocladium oder Streptomyces oder der Arten Trichothecium roseum, Leptosphaeria maculans, Cucurbitaria laburni, Acrospeira levis, Lophotrichus martini,
Melanospora parasitica oder Thielavia terricola oder Ophiobolus herpotrichus oder Sc1erotinia fructicola einwirken lässt.