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Verfahren zur Herstellung neuer Halogenpregnanverbindungen Gegenstand
der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Halogenpregnanverbindungen
der Formel
und der entsprechenden 1-Dehydroverbindungen. In obiger Formel bedeuten Rl, R2 und
R3 Wasserstoff oder eine freie oder veresterte Hydroxygruppe, R4 Wasserstoff oder
eine Methylgruppe, X ein Chlor- oder Fluoratom und Y eine Oxogruppe oder Wasserstoff
und eine freie oder veresterte a- oder ß-ständige Hydroxygruppe.
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Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daB man Verbindungen
der Formel
worin Rl, R2 und R3 Wasserstoff oder eine freie oder veresterte Hydroxygruppe, R4
Wasserstoff oder eine Methylgruppe und X ein Chlor- oder Fluoratom bedeuten und
die in 1(2)-Stellung eine weitere Doppelbindung aufweisen können, nach bekannten
Methoden der aeroben Einwirkung von Enzymen unterwirft, die Sauerstoff in die 11-Stellung
einzuführen vermögen, und in erhaltenen Verbindungen gegebenenfalls in an sich bekannter
Weise freie Hydroxygruppen verestert oder zu Oxogruppen dehydriert.
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Die verwendeten Enzyme können mikrobiologischer Herkunft sein, wobei
man die Ausgangsstoffe z. B. mit lebenden Mikroorganismen aerob inkubiert, die Sauerstoff
in 11-Stellung einzuführen vermögen. Die verwendeten Mikroorganismen sind z. B.
solche der Gruppen Mucorales, Penicillium, Actinomyceten, wie Streptomyceten, Aspergillus,
Cunninghamella, Curvularia, insbesondere Rhizopus nigricans, Curvularia lunata,
Cunninghamella blakesleana, Cunninghamella bainieri, Cunninghamella elegans, Cunninghamella
echinulata. Zur Durchführung des mikrobiologischen Verfahrens kann man die Ausgangsstoffe
mit Kulturen der genannten Mikroorganismen unter an sich bekannten aeroben Bedingungen
inkubieren. Das Wachstum erfolgt in Oberflächenkultur oder, technisch vorteilhaft,
submers, wobei man schüttelt oder rührt. Die Kulturen enthalten assimilierbaren
Kohlenstoff, insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebenenfalls `Z'uchsstoffe, beispielsweise
Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche,
synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. Das praktisch einfachste
Verfahren ist im folgenden geschildert, ohne daß die Erfindung durch diese Angaben
beschränkt sein soll: Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen
Bedingungen, wie sie bei der Antibiotikafabrikation als sogenannte Tieftankverfahren
bekannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die genannten Ausgangsstoffe
in -feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol,
zu und inkubiert weiter. Schließlich trennt man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat
und/oder die Mycelmasse und isoliert aus -dem Extrakt die 11-Hydroxyverbindungen
in an sich bekannter Weise, z. B. durch Entmischungsverfahren, Adsorption, Chromatographie,
Kristallisation, Überführung in funktionelle Derivate, wie Ester u. dgl. Dieselben
Umsetzungen lassen sich auch durchführen, indem man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden
aeroben Kulturen der genannten Organismen zuerst abtrennt und unter Ausschluß der
wachsenden
Kulturen verwendet. So kann man z. B. das von entsprechenden
aeroben Kulturen der genannten Organismen gebildete Mycel abtrennen, in Wasser oder
Pufferlösungen suspendieren, die genannten Ausgangsstoffe diesen Aufschlämmungen
zugeben und inkubieren.
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An Stelle von Enzymen mikrobiologischer Herkunft können auch z. B.
solche aus tierischen Organen, insbesondere Nebennieren von Rindern oder Schweinen,
Verwendung finden. Das hierzu einzuschlagende Verfahren, in erster Linie die Anwendung
von Homogenaten, ist ebenfalls an sich bekannt und wird in den Beispielen näher
beschrieben.
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Die erhaltenen Verbindungen lassen sich insbesondere in 21-Stellung
verestern. Für die Gewinnung der Ester dienen Anhydride, Halogenide oder Thiolderivate
von gesättigten oder ungesättigten aliphatischen oder cycloaliphatischen, von aromatischen
oder heterocyclischen Carbonsäuren, z. B. solchen mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen.
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Für die Überführung von 11a- und 11ß-Hydroxyverbindungen in die entsprechenden
11-Ketone verwendet man die üblichen Dehydrierungsmittel, z. B. Chromtrioxyd in
Eisessig oder den Chromtrioxyd-Pyridin-Komplex.
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Die Verfahrensprodukte zeichnen sich durch eine hohe biologische Wirkung
im Leberglykogen- und Granulomtest aus. Im Gegensatz zu manchen in 6a-Stellung nicht
halogenierten Corticosteroiden zeigen die neuen Verfahrensprodukte die Nebenwirkung
der Retention von Natrium nicht oder nur in untergeordnetem Maße.
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Die als Ausgangsstoffe dienenden d&-Pregnen- und d1>4-Pregnadienverbindungenlassen
sich z. B. auf folgende Weise erhalten: Verbindungen der folgenden Formel
worin. R1 bis R4 die oben gegebene Bedeutung besitzen, werden in die 3-Ketale übergeführt
und diese in einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. einem Alkohol, Keton oder
Äther, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 0 und 30°C, mit Fluorwasserstoff-
oder Chlorwasserstoffsäure behandelt, wobei je nach dem verwendeten Lösungsmittel
oder der Temperatur direkt d 4-3-Keto-6a-fluor bzw. Chlorverbindungen entstehen
oder 5a-Hydroxy-6ß-fluor-Verbindungen oder ein Gemisch dieser Verbindungen. Aus
den 5a-Hydroxy-6ß-halogen-Derivaten kann nachträglich Wasser abgespalten werden,
und die so erhaltenen d 4-6ß-Halogen-Derivate können durch Behandlung mit einer
starken Säure, z. B. Salzsäure in Eisessig, zu den A4-6a-Halogen-Derivaten isomerisiert
werden. In den so erhaltenen Verbindungen können dann freie Oxygruppen in funktionell
abgewandelte Oxygruppen oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppen nach
an sich bekannten Methoden in freie Oxy- oder Oxogruppen übergeführt werden. Ferner
kann nach an sich bekannten Methoden, z. B. durch Selendehydrierung, in 1,2-Stellung
eine Doppel-Bindung eingeführt werden. Die 5,6-Epoxyde können ihrerseits aus den
entsprechenden in 6-Stellung unsubstituierten d4-3-Keto-Pregnanverbindungen dadurchhergestellt
werden, daß man zunächst in 3-Stellung ketalisiert und im Ketal die 5,6-Doppelbindung
nach bekannten Methoden epoxydiert und das Ketal spaltet.
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Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher beschrieben.
Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. Beispiel 1 (M-317) 1 1 einer sterilisierten
Nährlösung, enthaltend 20 g Pepton und 5 cm3 Corn steep liquor, wird mit 30 cm3
einer wachsenden Kultur von Rhizopus nigricans, die durch Impfen mit Sporen des
genannten Pilzes (auf Agar gezüchtet) erhalten wird, vermischt. Die Mischung wird
24 Stunden bei 28° unter Belüftung gerührt. Am Ende der Inkubationszeit beträgt
das p$ der Kultur 3 bis 4, und das Wachstum des Pilzes ist gut entwickelt. 33 cm3
einer äthanolischen Lösung von d 4-6a-Chlorpregnen-17a,21-diol-3,20-dion, enthaltend
330 mg des Steroids, wird dann zur Kultur gegeben und die Mischung 24 Stunden bei
28° unter Belüftung gerührt. Die Inkubationsmischung wird mit Methylenchlorid extrahiert,
der Extrakt mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im
Vakuum vorsichtig konzentriert. Die eingeengte Lösung wird an Kieselsäuregel chromatographiert.
Elution mit Chloroform Ätherliefert das reine d4-6a-Chlor-pregnen-11a,17a,21-triol-3,20-dion;
@max : 238 m#L; log E = 4,11; [a]D = -f- 74°.
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Dasselbe Umsetzungsprodukt erhält man, wenn von einem 21-Ester, z.
B. einem solchen mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, von d4-6a-Chlor-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion
ausgegangen wird.
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1 g des erhaltenen Triols löst man in 5 cm3 Pyridin, kühlt auf 0°
ab, vermischt bei etwa 0° mit 0,28 cm3 Acetanhydrid (etwa 1,1 Äquivalente) und läßt
die Mischung 1 Stunde bei 0° und 4 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Dann wird
in Wasser gegossen und mit Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wird anschließend
mit verdünnter Salzsäure, 5 °/oiger Sodalösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat
getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Kristallisation des Rückstandes
liefert das reine 21-Acetat von d 4-6a-Chlor-pregnen-11a,17a,21-triol-3,20-dion;
@.max : 238 m#t; log E = 4,14; [a]D = --I- 6g°.
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Wird für die Veresterung an Stelle von Acetanhydrid Propionsäureanhydrid
verwendet, so erhält man als Endstoff das 21-Propionat von d4-6a-Chlor-pregnen-11a,17a,21-triol-3,20-dion;
@,max : 237 m#t; log e = 4,09; [a]D = + 66°.
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Beispiel 2 (M-317) Eine Lösung von 1 g des nach Beispiel 1 erhaltenen
21-Acetates von d4-6a-Chlor-pregnen-11a,17a,21-triol-3,20-dion in 30 cm3 Eisessig
wird unter Rühren tropfenweise mit 5 cm 3 einer 80 °/oigen Lösung von Chromsäure
in Eisessig vermischt, 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und in Wasser
gegossen. Das Oxydationsprodukt wird mit Essigester extrahiert, der Extrakt mit
Wasser, 5 °/oiger Sodalösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet,
filtriert und zur Trockne verdampft. Kristallisation des Rückstandes aus Aceton-Hexan
liefert das 21-Acetat von d4-6a-Chlor-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion; F. 197°;
[a]D = -I- 176°; @max : 233 mit; log s = 4,16.
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Beispiel 3 (M-317) 1 1 einer sterilisierten Nährlösung, enthaltend
20 g Pepton und 50 cm3 Cornsteep liquor, wird mit 30 cm3 einer wachsenden Kultur
von Curvularia lunata, die
durch Impfen mit Sporen des genannten
Pilzes (auf Agar gezüchtet) erhalten wird, vermischt. Die Mischung wird 48 Stunden
bei 28° unter Belüftung gerührt. Am Ende der Inkubationszeit beträgt das pH der
Kultur 3 bis 4, und das Wachstum des Pilzes ist gut entwickelt. Das Kulturmedium
wird dann mit 33 cm3 einer äthanolischen Lösung von d4-6a-Chlor-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion,
enthaltend 330 mg des Steroides, vermischt und48 Stunden unter Belüftung gerührt.
Das Umsetzungsprodukt wird mit Methylenchlorid extrahiert und der Extrakt gewaschen,
getrocknet, konzentriert und an Kieselsäuregel, wie im Beispiel lbeschrieben, chromatographiert,
wobei das d4-6a-Chlor-pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion erhalten wird; Amax: 236
bis 238 mu; log a = 4,14.
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Eine Lösung von 1 g des erhaltenen Triols in 5 cm3 Pyridin wird mit
1 cm3 Acetanhydrid vermischt, 4 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und in
Wasser gegossen. Anschließend wird mit Methylenchlorid extrahiert und der Extrakt
mit verdünnter Salzsäure, 5 °(oiger Sodalösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat
getrocknet, filtriert und im Vakuiun zur Trockne verdampft. Kristallisation des
Rückstandes aus Aceton-Hexan liefert das 21-Acetat von 44-6a-Chlor-pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion,
das mit einem authentischen Muster identisch ist; F. 174 bis 176°; [a]D = -I- 97°;
Amax: 238 mu; log a = 4,08.
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Wird an Stelle der freien Verbindung das 21-Propionat von 44-6a-Chlorpregnen-17a,21-diol-3,20-dion
eingesetzt, so erhält man ebenfalls das 44-6a-Chlor-pregnen-11ß, 17a,21-triol-3,20-dion,
das bei der Veresterung mit Propionsäureanhydrid das entsprechende 21-Propionat
liefert; Am"": 238 mu; log a = 4,12. Beispiel 4 (M-317) Das 21-Acetat von d 4-6a-Chlor-pregnen-1
lß,17a,21-triol-3,20-dion wird nach den Angaben im Beispie12 mit Chromsäure oxydiert.
Das erhaltene 21-Acetat von 44-6a-Chlor-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion ist mit
dem im Beispiel 2 beschriebenen Präparat identisch; F.197°; [ä_D = + 176°; Amdx:
233 mu; log a = 4,16.
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Ausgehend vom entsprechenden 21-Propionat, erhält man das 21-Propionat
von 44-6a-Chlor-pregnen-17a, 21-diol-3,11,20-trion. [a]D = -I- 168°; Am": 233 mu;
log a = 4,15.
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Beispiel 5 (M-339) 1 1 einer sterilisierten Nährlösung, enthaltend
20 g Pepton und 50 cm3 Corn steep liquor, wird mit 30 cm3 einer wachsenden Kultur
von Curvularia lunata, die durch Impfen mit Sporen des genannten Pilzes (auf Agar
gezüchtet) erhalten wird, vermischt. Die- Mischung wird dann 48 Stunden bei 28°
unter Belüftung gerührt. Am Ende der Inkubationszeit beträgt das pa der Kultur 3
bis 4, und das Wachstum des Pilzes ist gut entwickelt. Pro 1/21 der erhaltenen Kultur
gibt man 33 cm3 einer 1 °/jgen äthanolischen Lösung von dl>4-2-Methyl-6a-chlor-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion.
Die Mischung wird unter Belüftung 48 Stunden bei 28°' gerührt, mit Methylenchlorid
extrahiert und der Extrakt mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet,
filtriert und im Vakuum ohne Überhitzen auf ein kleines Volumen eingedampft. Die
konzentrierte Lösung aus verschiedenen einzelnen Inkubationen wird vereinigt und
an Kieselsäuregel chromatographiert. Elution der Säule mit Mischungen von Chloroform-Äther
liefert kristalline Fraktionen, die vereinigt und aus Aceton-Hexan umkristallisiert
werden, wobei das. 41,4-2-Methyl-6a chlorpregnadien -11ß,17a,21 - triol - 3,20 -
dion erhalten wird, Amdx: 248 mu; log a = 4,19; [a]D = + 70°.
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Diese Verbindung läßt sich, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben,
in ihre 21-Ester überführen. In analoger Weise wird das A4-2 a-Methyl-6 a-chlorpregnen-17a,21-diol-3,20-dion
in das 44-2a-Methyl-6a-chlor-pregnen-llß,17a,21-triol-3,20-dion übergeführt. [a]D
= ',- 103°; Amax: 238 mu; log a = 4,09. Beispiel 6 (M-325) Es wird eine Kultur
von Rhizopus nigricans durch Impfen eines wäßrigen Mediums, enthaltend 2 °/, Pepton
und 5 °/o Corn steep liquor, mit dem genannten Pilz und Inkubation während 24 Stunden
unter Belüftung und Rühren hergestellt. Zu jedem Liter der Kultur gibt man 30 cm3
einer äthanolischen Lösung von 44-6a-Fluorpregnen-17a,21-diol-3,20-dion, die 300
mg des Steroids enthält. Die Mischung .wird während 24 Stunden bei 20° unter Belüftung
gerührt. Das Inkubationsprodukt wird dann mit mehreren Portionen Methylenchlorid
extrahiert, der Extrakt mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet; filtriert
und im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt. Chromatographie des Konzentrates
an Kieselsäuregel liefert das 44-6a-Fluorpregnen-lla,17a,21-triol-3,20-dion; MD
= @-- 160°;Amax: 237 mu; log a = 4,22.
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Eine Mischung von 1 g der obigen Verbindung, 10 cm3 Pyridin und 1
cm3 Acetanhydrid läßt man über Nacht bei Raumtemperatur stehen, gießt dann in Wasser
und erhitzt 1/2 Stunde auf dem Dampfbad. Nach dem Abkühlen wird abgenutscht, der
Filterküchen gewaschen, getrocknet und durch Kristallisation aus Aceton-Hexan gereinigt,
wobei das 21-Acetat von 44-6a-Fluor-pregnen-11a,17a,21-triol-3,20-dion erhalten
wird; [a]D = 152°; Amax: 237 mu; log a = 4,23.
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1 g des obigen 21-Acetates wird in 50 cm3 Aceton gelöst, auf 0° gekühlt
und mit einer 8n-Chromsäurelösung, die durch Auflösen von 1,6 g Chromsäure in verdünnter
Schwefelsäure erhalten wird, versetzt. Die Mischung rührt man 5 bis 10 Minuten bei
0°, gießt in Wasser, extrahiert mit Äther, wäscht mit Wasser, trocknet den Äther
über Natriumsulfat und verdampft ihn im Vakuum. Aus dem Rückstand erhält man durch
Kristallisation aus Aceton-Hexan das 44-6a-Fluor-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion.
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Beispiel 7 (M-325) Wird im Beispiel 6 die Kultur von Rhizopus nigricans
durch eine solche von Curvularia lunata ersetzt, die unter ähnlichen Bedingungen
durch 48stündige Inkubation erhalten wird, so erhält man, ausgehend von d 4 - 6a
- Fluor - pregnen -17a,21 - diol - 3,20 - dion, nach 48stündiger Inkubation bei
29° und Aufarbeitung gemäß den Angaben im Beispiel 6 das 44-6a-Fluor-pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion
(F. 192 bis 201; [a]D = -E-127°), das sich nach den Angaben in den vorhergehenden
Beispielen in das 21-Acetat bzw. einen andern 21-Ester und durch Chromsäureoxydation
in das 21-Acetat bzw. einen anderen21-Estervond 4-6a-Fluor-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion
überführen läßt. Das 21-Acetat von d4-6a-Fluor-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion
schmilzt bei215bis216°; [a]D =-E-190°; Amax:233mu; loga=4,21. Beispiel 8 (M-340)
Es werden die Lösungen A, B und C in destilliertem Wasser wie folgt bereitet: Lösung
A durch Mischen von
425 cm3 einer 1,742°/@gen Dikaliumhydrogenphosphatlösungmit
75cm3 einer1,38°/oigenMononatriumdihydrogenphosphatlösung; Lösung B wird erhalten
durch Verdünnen von 1 1 einer 4,5°/jgen Natriumchloridlösung, 40 cm3 einer 5,750/@gen
Kaliumchloridlösung und 10 cm3 einer 19,1°/«igen Magnesiumsulfatlösung auf 51; Lösung
C wird erhalten durch Auflösen von 20,9 g Fumarsäure und 14,4 g Natriumhydroxyd
in 1 1 Wasser und Verdünnen auf 1,21. Dann werden 475 cm3 Lösung A, 4,321 Lösung
B und 1,21 Lösung C vermischt.
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Nebennieren von frisch geschlachteten Rindern werden vom Fett befreit
und dann in einer Fleischhackmaschine behandelt, bis eine homogene Masse erhalten
wird. 3 kg dieser Masse werden in 61 des obigen Gemisches der Lösungen A, B und
C gegeben und stark gerührt.
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Dann gibt man eine Lösung von 3 g des 21-Acetates von 44-6a-Chlor-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion
in 16 cm3 Propylenglykol zu und rührt die Mischung bei 28 bis 37° während 3 Stunden.
Darauf gibt man 401 Aceton zu und rührt noch 1 Stunde bei Raumtemperatur.
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Die feste Masse wird durch Filtration entfernt und zweimal mit je
10l Aceton gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum unter 30° auf etwa
51 eingeengt. Der wäßrige Rückstand wird nun dreimal mit 41 Hexan gewaschen. Die
so behandelte wäßrigeLösung wird zweimal mit j e 31 Methylenchlorid extrahiert,
der Extrakt mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum unterhalb
Raumtemperatur auf etwa 300 cm3 eingeengt. Die eingeengte Lösung wird auf eine Säule
aus einer Mischung von 90 g Kieselsäuregel und 90 g Diatomeenerde (bekannt unter
dem Handelsnamen »Celite«) gegeben. Die Säule wird nun mit einer Mischung von 900
cm3 Methylenchlorid und 100 cm3 Aceton und schließlich mit einer solchen von 1600
cm3 Methvlenchlorid und 400 cm3 Aceton gewaschen. Mit dem letzteren Lösungsmittelgemisch
wird das d 4-6a-Chlor-pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion eluiert, das durch Kristallisation
aus Äther gereinigt wird. Amax: 236 bis 238 m#t; log E = 4,14.
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1 g des Triols wird in 10 cm3 Pyridin gelöst und mit Acetanhydrid
vermischt. Die Mischung läßt man über Nacht bei Raumtemperatur stehen, gießt in
Eiswasser, rührt 1/2 Stunde und filtriert vom Niederschlag ab, wäscht und trocknet
ihn und kristallisiert aus Aceton-Hexan, wobei das 21-Acetat von d 4-6a-Cblor-pregnenllß,17a,21-triol-3,20-dion
erhalten wird. F. 174 bis 176°; [a]D = -I- 97°; Amax: 238 m#t; log s = 4,08.
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In analoger Weise lassen sich höhere 21-Ester von 44-6a-Chlor-pregnen-llß,17a,21-triol-3,20-dion
herstellen. Beispiel 9 (M-341) Analog den Angaben im Beispiel 8 werden 3 g d4-6a-Fluor-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion
in 16 cm3 Propylenglykol mit 3 kg Nebennierenbrei und 61 der Mischung der Lösungen
A; B und C umgesetzt und aufgearbeitet. Der Methylenchlorid-Extrakt wird im Vakuum
auf etwa 300 cm3 eingeengt und auf eine Säule aus 90 g Kieselsäuregel und 90 g »Celite«
gegeben. Die Säule wird dann mit 31 Methylenchlorid und einer Mischung von 900 cm3
Methylenchlorid und 100 cm3 Aceton eluiert. Das Umsetzungsprodukt wird mit Methylenchlorid-Aceton-(80
: 20 und 70: 30) -Mischungen eluiert. Durch Eindampfen dieser Eluate und
Kristallisation des Rückstandes aus Essigester erhält man das d 4-6a-Fluor-pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion;
F. 192bis201°; [a]D = -I-127°.
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Wird in analoger Weise das dl#4-6a-Fluor-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion
inkubiert, so erhält man das d 1, 4-6a-Fluor -pregnadien -11ß,17a,21-triol- 3,20
- dion ; F. 208 bis 213°; [a]D = + 92°.
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Die erhaltenen 11ß-Hydroxyverbindungen lassen sich nach den Angaben
im Beispiel 8 in 21-Stellung verestern, z. B. mit Säuren, die 2 bis 12 Kohlenstoffatomeenthalten.
Beispiel 10 (M-341) Eine gerührte Lösung von 500 mg des 21-Acetates von 44-6a-Fluor-pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion
in 300 cm3 Eisessig wird vorsichtig mit einer Lösung von 130 mg Chromsäure in 1
cm3 Wasser und 8 cm3 Eisessig versetzt. Die Mischung läßt man 2 Stunden bei Raumtemperatur
stehen, gießt in Wasser, nutscht ab, wäscht und trocknet den Rückstand und kristallisiert
ihn aus Aceton-Hexan, wobei das 21-Acetat von d 4-6a-Fluor-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion
erhalten wird. F.215 bis 216'; [a] D = -I-190° ; Amax: 233 m#t; log s = 4,21.
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In analoger Weise läßt man sich das 21-Acetat von 41,4-6a-Fluor-pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion
zum 21-Acetat von d1,4-6a-Fluor-pregnadien-17a,21-diol 3,11,20-trion oxydieren.
F. 228 bis 230°; [a]D = -I- 142°; amax: 237 m#t; log s = 4,23. Beispiel 11 (M-388)
Analog zu den Angaben im Beispiel 8 werden 2 g 44-2a-Methyl-6a-fluor-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion
in 16 cm3 Propylenglykol mit 3 kg Nebennierenbrei und 61 der Mischung der Lösungen
A, B und C inkubiert. Der Methylenchloridextrakt wird im Vakuum auf etwa 300 cm3
eingeengt und auf eine Säule aus 90 gKieselsäuregel und 90 g »Celite« gegeben. Die
Säule wird dann mit 31 Methylenchlorid, einer Mischung von 900 cm3 Methylencblorid
und 100 cm3 Aceton und schließlich mit einer Mischung von 1600 cm3 Methylenchlorid
und 400 cm3 Aceton eluiert. Durch Elution mit dem letzteren Gemisch erhält man das
d 4-2a-Methyl-6a-fluor-pregnen-11ß,17a, 21-triol-3,20-dion, das durch Kristallisation
aus Aceton-_Hexan gereinigt wird. (Amax 243 m#t; log e = 4,22). Es läßt sich nach
den Angaben in den vorhergehenden Beispielen in 21-Stellung verestern, z. B. in
das 21-Acetat (@max: 237 m#t; log s = 4,21) und 21-Cyclopentylpropionat ([a]D =
-I-- 152°) von d4 2a-Methyl-6a-fluorpregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion überführen.
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Durch Oxydation mit Chromsäure nach den Angaben im Beispiel 10 erhält
man daraus das 21-Acetat bzw. 21-Cyclopentylpropionat von d4-2a-Methyl-6a-fluorpregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion;
Xmax: 234 m#t; log s = 4,22. Beispiel 12 (M-388) Eine Kultur von Cunninghamella
bainieri (ATCC 9244) wird erhalten durch Impfen eines wäßrigen Mediums, enthaltend
2 °/o Pepton und 5 °/o Corn steep liquor, mit einer wachsenden Kultur des Pilzes
und Rühren bei 28° unter Belüftung während 24 Stunden. Pro Liter des Kulturmediums
fügt man 300 mg d4-2a-Methyl-6a-fluorpregnen-17a,21-diol-3,20-dion in 30 cm3 Äthanol
und rührt unter Belüftung 24 Stunden bei 28°. In dieser Weise werden insgesamt 3
g des Steroides eingesetzt. Nach der Inkubation werden die vereinigten Kulturmedien
mit Methylenchlorid extrahiert, der Extrakt mit Wasser -gewaschen, getrocknet und
eingedampft. Aus dem
Rückstand wird das 4 4-2a-Methyl-6a-fluor-pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion
erhalten, das mit dem Piodukt von Beispiel 11 identisch ist. @,maz: 243 mp.; log
a = 4,22.
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Werden in analoger Weise d 4 - 6a - Chlorpregnen-17a,21-diol-3,20-dion,
41,4-6a-Chlor- und 41#4-6a-Fluorpregnadien-17a-21-diol-3,20-dion sowie 41.4-2-Methyl-6a
- fluor - pregnadien -17a,21- diol - 3,20 - dion mit einer Cunninghamella-bainieri-Kultur
inkubiert, so erhält man nach der Aufarbeitung das 44-6a-Chlor-pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion
(@.maz: 236 bis 238 mp.; log a =4,14), das dl#4-6a-Chlor-pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion
(F. 195 bis 196', [a]D = -f- 61'; 242 m#t; log a = 4,19), das 41.4-6a-Fluor-pregnadien-11ß,17a,
21-triol-3,20-dion (F. 208 bis 213°; [a]D = + 92°) und das 41,4-2-Methyl-6a-fluor-pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion
(2m": 248 m#t; log a = 4,25; [a]D = 120°).
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An Stelle der Kultur von Cunninghamella bainieri läßt sich auch eine
solche von Cunninghamella blakesleana verwenden. Beispiel 13 (1M-376) Eine Kultur
von Cunninghamella bainieri 9244, ATCC, wird erhalten durch Impfen eines wäßrigen
Mediums, enthaltend 2 % Pepton und 5 % Corn steep liquor, mit dem genannten Pilz
und Rühren während 24 Stunden bei 28° unter Belüftung.
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Zu jedem Liter dieser Kultur gibt man 30 cm3 einer äthanolischen Lösung
von 44-6a-Chlor-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion, enthaltend 300 mg des Steroids, und
rührt die Mischung während 24 Stunden bei 28° unter Belüftung. Das Inkubationsprodukt
wird mit Methylenchlorid extrahiert und der Extrakt mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat
getrocknet und im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt. Auf diese Weise werden
total 3 g des Ausgangsstoffes umgesetzt.
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Die vereinigten eingeengten Extrakte werden nun zur Imprägnierung
einer mit Methylenchlorid gewaschenen Säule aus 60 g Kieselsäuregel und 60 g »Celite«
verwendet. Das 6a-Chlor-hydrocortison wird aus der Säule mit Methylenchlorid-Aceton
80:20 eluiert. Es läßt sich durch Kristallisation aus Methylenchlorid-Aceton reinigen;
@,maz: 236 bis 238 mp.; log a = 4,14.
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In analoger Weise läßt sich Q1,4-6a-Chlor-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion
in das 6a-Chlor-prednisolon überführen. F. 195 bis 196°; [a]D = + 61°; 242 m#t;
log a = 4,19.
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Für die 11ß-Hydroxylierung lassen sich an Stelle von Cunninghamella
bainieri die folgenden ATCC-Organismen verwenden: C. elegans 67956, 7929, 9246,
10028 a, 10028 b, C. blakesleana 86888 a, 8688 b, C. echinulata 1386. Beispiel 14
(M-377) Wird analog den Angaben im Beispiel 13 verfahren, mit dem Unterschied, daß
die dort verwendeten Ausgangsstoffe durch 44-6a-Fluor-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion
bzw. d1.4-6a-Fluor-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion ersetzt werden, so erhält man
als Endstoffe das 6a-Fluorhydrocortison (F. 192 bis 201°; [a]D = -E- 127°) bzw.
6a-Fluor-prednisolon (F. 208 bis 213°; [a]D = + 92°).