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Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation von Steroiden
Es ist bekannt, mit Hilfe von Mikroorganismen Steroidverbindungen mit der natürlichen Konfiguration zu oxygenieren bzw. dehydrieren, d. h. Hydroxyl-oder Oxogruppen bzw. Doppelbindungen einzuführen bzw. Hydroxyl- in Oxogruppen zu verwandeln. Es wurde nun die überraschende Beobachtung gemacht, dass d, l-Steroidverbindungen sich diesen Mikroorganismen gegenüber verschieden verhalten, indem im wesentlichen nur die d-Form, d. h. die enantiomorphe, den natürlichen Steroiden entsprechende Form oxydiert wird, und die 1-Form unverändert bleibt. Diese Beobachtung hat nun zu einem neuen Verfahren zur Racematspaltung geführt, wobei neben den oxydierten d-Steroiden die bisher nur in einzelnen Fällen bekanntgewordenen 1-Steroide erhalten werden.
Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man auf d, l-Steroide durch aerobe Kulturen von Mikroorganismen produzierte oxydierende Enzyme einwirken lässt und mindestens eine der enantiomorphen Formen isoliert. Oxydierende Enzyme sind solche, die entweder Sauerstoff in das Steroid-Molekül einzuführen oder daraus Wasserstoff zu entziehen vermögen.
Ausgangsstoffe für das neue Verfahren sind allgemein gesättigte und ungesättigte, beliebig substituierte d, l-Steroide, beispielsweise d, l-Verbindungen der Cholestan-, Koprostan-, Cholan-, Spirostan-, Furostan-, Butanolid-, Cardanolid-, Oestran-, insbesondere solche der Pregnan-, Androstan- und Testanreihe, sowie ihre höheren und niederen Homologen, beispielsweise entsprechende A-Nor-, D-Homo-und 19-Nor-verbindungen. Doppelbindungen befinden sich z. B. in 1- und/oder 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 11-, 14-, 15-und/oder 16-Stellung. Als Substituenten kommen besonders in Frage freie bzw. funktionell abgewandelte Hydroxyl-, Oxo- oder Carboxylgruppen, wie Ester-, Äther-, Thioester-, Thioäther-, Thiol- und Thionester-, Acetal-, Mercaptal-, Ketal-, Hydrazon-, Semicarbazon- und Enolgruppen, z.
B. in 2-, 3-, -6-, 7-, 11-, 12-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20- und 21-Stellung, ferner Halogenatome, insbesondere Chlor oder Fluor, z. B. in 9- und 17-Stellung. Von besonderem Interesse ist die Anwendung des neuen Verfahrens auf d, l-Pregnanverbindungen. Spezifische Ausgangsstoffe dieser Reihe sind unter anderem d, l-Progesteron, d, 1-17α-Progesteron, d,1-16α-Oxy-progesteron, d,1-17α-Oxy-progesteron, d,1-11-Oxo- - progesteron, d, 1-11α
- sowie -11ss-Oxy-progesteron, d,1-9,11- oder -11,12-Dehydro-progesteron, d, l-19-0xo-progesteron, d, l-11-0xo-17a-oxy-progesteron, d, l-11a- sowie-llss-0xy-17 < x-oxy-pro- gesteron, d, 1-9-Chlor- oder-9-fluor-11ss, 17α-dioxy-progesteron, d, 1-11ss,18-Dioxy-progesteron,
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-Oxy-18-oxo-progesteron, d, l-9-Chlor- oder -9-Fluor-d, l-Hydrocortison, d, 1-17α-Oxy-cortexon, d,1-Aldosteron, d,1-Pregnenolon, die entsprechenden l-Dehydrov erbindungen, z.
B. d, 1-1-Dehydro-progesteron, d,1-1-Dehydro-17α-oxy-progesteron, d, 1-1-Dehydro-11-oxo-, -11α-oxy- oder -11ss-oxy-progesteron, d,1-Androstendil, d,1-17-Me- thyl-androstendiol, d, 1-Dethydro-epiandrosteron, oder ihre funktionellen Derivate. Besonders wichtige
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hydroxylierten Verbindungen.
Das Verfahren wird vorteilhaft in der Weise durchgeführt, dass man auf den Ausgangsstoff die aerobe Kultur eines einzigen Mikroorganismenstammes einwirken lässt. Je nach dem verwendeten Mikroorganismus erhält man z. B. das d-Steroid mit einer Oxygruppe in 6ss-, -, 7a-, 7B -, 8-, 11a-, 11ss-, 14-, 15α-,
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15ss-, 16α-, 17α- oder 21-Stellung, oder mit einer Doppelbindung in 1, 2-und/oder 4, 5-Stellung, oder mit einer Ll"'-3-Keto- und/oder -17-Ketogruppierung. Es kann aber auch so vorgegangen werden, dass man in einem Arbeitsgang mehrere Kulturen auf den Ausgangsstoff einwirken lässt, wobei es sich als vorteilhaft erwiesen hat, die Einwirkung der einzelnen Kulturen zeitlich nacheinander vorzunehmen.
Alle diejenigen aeroben Kulturen von Mikroorganismen sind für das Verfahren geeignet, die Steroidverbindungen zu oxydieren, d. h. Hydroxylgruppen oder Doppelbindungen einzuführen oder Hydroxyl- in Oxogruppen zu verwandeln vermögen. Nachstehend sind z. B. einige Arten genannt, die für das Verfahren in Frage kommen.
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<tb>
<tb>
6ss-Stellung <SEP> : <SEP> Trichothecium <SEP> roseum
<tb> Lenzites <SEP> abietina
<tb> Rhizopus <SEP> arrhizus
<tb> Gliocladium <SEP> catenulatum
<tb> Gliocladium <SEP> deliquescens
<tb> 7C <SEP> (-Stellung <SEP> : <SEP> Curvularia <SEP> lunata
<tb> Curvularia <SEP> pallescens
<tb> Curvularia <SEP> falcata
<tb> Curvularia <SEP> fallax
<tb> Peziza <SEP> spec.
<tb>
7ss-Stellung <SEP> : <SEP> Rhizopus <SEP> arrhizus
<tb> Proaetinomyces <SEP> roseus
<tb> S-Stellung <SEP> : <SEP> Curvularia <SEP> pallescens
<tb> Pleospora <SEP> Gaeumanni
<tb> Helicostylum <SEP> piriforme
<tb> 11a-Stellung: <SEP> Rhizopus <SEP> nigricans
<tb> Rhizopus <SEP> arrhizus
<tb> Aspergillus <SEP> niger
<tb> Aspergillus <SEP> ochraceus
<tb> Penicillium <SEP> notatum
<tb> Penicillium <SEP> adametzi
<tb> Penicillium <SEP> janthinellum
<tb> Mucor <SEP> mucedo
<tb> Lenzites <SEP> sepiaria
<tb> Tilletia <SEP> tritici
<tb> Neurospora <SEP> sitophila
<tb> Neurospora <SEP> crassa
<tb> 118-Stellung <SEP> : <SEP> Curvularia <SEP> lunata
<tb> Curvularia <SEP> pallescens
<tb> Curvularia <SEP> fallax
<tb> Curvularia <SEP> brachyspora
<tb> Cunninghamella <SEP> Blakesleena
<tb> Streptomyces <SEP> fradiae
<tb> Stigmina <SEP> platani
<tb> 14-Stellung <SEP> :
<SEP> Sclerophoma <SEP> entoxylina
<tb> Parasitella <SEP> simplex
<tb> Helicostylum <SEP> piriforme
<tb> Mucor <SEP> griseocyanus
<tb> Mucor <SEP> parasiticus
<tb> 15C <SEP> (-Stellung <SEP> : <SEP> Gibberella <SEP> baccata
<tb> Nectria <SEP> cinnabarina
<tb> Hormodendrium <SEP> viride
<tb> 158 <SEP> -Stellung <SEP> : <SEP> Lenzites <SEP> abietina
<tb> Spicaria
<tb>
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<tb>
<tb> 16a-Stellung: <SEP> Didymella <SEP> Vodakii
<tb> Actinomyceten <SEP> ETH <SEP> A <SEP> 6246, <SEP> A <SEP> 7746, <SEP> A <SEP> 7747,
<tb> A <SEP> 7451, <SEP> A <SEP> 7486
<tb> 17cx-Stellung <SEP> :
<SEP> Trichothecium <SEP> roseum
<tb> Cephalothecium <SEP> roseum
<tb> Cucurbitaria <SEP> laburni
<tb> Lepthosphaeria <SEP> maculans
<tb> Trichoderma <SEP> lignorum
<tb> Trichoderma <SEP> glaucum
<tb> Acrospeira <SEP> levis
<tb> Lophotrichus <SEP> hartinii
<tb> Melanospora <SEP> parasitica
<tb> Thielavia <SEP> terricola
<tb> Dactylium <SEP> deadroides
<tb> 21-Stellung <SEP> : <SEP> Ophiobolus <SEP> herpotrichus <SEP>
<tb> Sc1erotinia <SEP> fructicola
<tb> Wojnowicia <SEP> graminis
<tb> Hendersonia <SEP> rubi
<tb> Hendersonia <SEP> abietus
<tb> Dilophospora <SEP> spec.
<tb>
Phoma <SEP> hibernica
<tb> Septoria <SEP> aesculi
<tb> Aspergillus <SEP> niger
<tb> 1, <SEP> 2-Dehydrierung <SEP> : <SEP> Fusarium <SEP> solani
<tb> Fusarium <SEP> caucasicum
<tb> Calonectria <SEP> decora
<tb> Alternaria <SEP> passiflorae
<tb> Ophiobolus <SEP> heterostrophus
<tb> Ophiobolus <SEP> Miyabeanus
<tb> Didymella <SEP> lycopersici
<tb> Corynebacterium <SEP> simplex
<tb> Bacillus <SEP> sphaericus
<tb> Bacillus <SEP> subtilis
<tb> Mycobacterien
<tb> 3-und/oder <SEP> 17-Stellung <SEP> :
<SEP>
<tb> Proactinomyces <SEP> erythropolis
<tb> Proactinomyces <SEP> aquosus
<tb> Proactinomyces <SEP> restrietus
<tb> Proaetinomyces <SEP> roseus
<tb> Azotobacter
<tb> Mycobakterien
<tb> Micrococcus <SEP> dehydrogenans <SEP>
<tb> Corynebacterium <SEP> mediolanam
<tb> Alcaligenes <SEP> faecalis
<tb> Hefe <SEP> und <SEP> oxydierende <SEP> Bakterien
<tb> Pseudomonas
<tb> Flavobacterium <SEP> androstenedionicum
<tb> Flavobacterium <SEP> carbonilicum
<tb> Actinomyces <SEP> albus
<tb> Aspergillus <SEP> niger
<tb> Phycomyces <SEP> blakesleeanus
<tb> Penicillium <SEP> chrysogcnum
<tb>
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Wie aus obiger Zusammenstellung hervorgeht, sind die genannten Mikroorganismen Pilze oder Bak- terien und gehören z. B. den Klassen der Phycomyceten, Ascomyceten, Basidiomyceten, Fungi imperfecti oder Actinomyceten an.
Zur Durchführung des Verfahrens kann man die Ausgangsstoffe mit Kulturen der genannten Mikroor- ganismen unter an sich bekannten aeroben Bedingungen inkubieren. Das Wachstum erfolgt in Oberflä- chenkultur oder, technisch vorteilhaft, submers, wobei man schüttelt oder rührt. Die Kulturen enthalten assimilierbaren Kohlenstoff, insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebenenfalls Wuchsstoffe, beispiels- weise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar.
Das praktisch einfachste Verfahren ist im folgenden ge- schildert, ohne dass die Erfindung durch diese Angaben beschränkt sein soll : Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotika-Fabrikation als sogenannte
Tieftankverfahren bekannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol zu und inku- biert weiter. Schliesslich trennt man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat und/oder die Mycelmasse und isoliert aus dem Extrakt die d-Steroide und/oder die 1-Steroide in an sich bekannter Weise, z.
B. durch
Entmischungsverfahren, Adsorption, Chromatographie, Kristallisation, Überführung in funktionelle Derivate, wie Girard-Verbindungen u. dgL Dieselben Umsetzungen lassen sich auch durchführen, indem man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden aeroben Kulturen der genannten Organismen zuerst abtrennt und unter Ausschluss der wachsenden Kulturen verwendet. So kann man z. B. das von entsprechenden aeroben Kulturen der genannten Organismen gebildete Mycel abtrennen, in Wasser oder Pufferlösungen suspendieren, die genannten Ausgangsstoffe diesen Aufschlämmungen zugeben und inkubieren.
Sollen in einem Arbeitsgang mehrere Mikroorganismen zur Einwirkung gelangen, so kann man beispielsweise wie folgt vorgehen : Nach Entwicklung der Kulturen des ersten Organismus gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol zu und inkubiert weiter, bis die maximale Reaktion erreicht ist. Dann gibt man, ohne vorher zu filtrieren oder das Oxydationsprodukt zu isolieren, zum Reaktionsgemisch eine ausgewachsene Kultur des zweiten Organismus und nötigenfalls entsprechende Nährsubstanzen und Wuchsstoffe zu und fährt mit der Inkubation fort. Gegebenenfalls wird diese Operation mit einem dritten Mikroorganismus wiederholt.
Der Verlauf der einzelnen Oxydationen kann papierchromatographisch verfolgt werden.
Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zu ihrer Herstellung dienen. Besonders wertvoll hat sich das neue Verfahren bei der Aldosteron-Synthese erwiesen.
So erhält man z. B. bei der Einwirkung einer aeroben Kultur von Ophiobolusherpotrichus aufd. l-A- - 3, 18, 20-Trioxo-llss-oxy-pregnen bzw. sein 18, l1-Cyclohalbacetal in einem einzigen Schritt in guter Ausbeute d-Aldosteron. Bei Anwendung rein chemischer Verfahren sind für diese Synthese, ausgehend vom gleichen Ausgangsstoff, etwa 7 Stufen erforderlich.
Allgemein ist die Racematspaltung nach dem neuen Verfahren besonders einfach, weil die hydroxylierten oder dehydrierten Derivate des einen Antipoden sich vom unveränderten andern Antipoden infolge ihrer höheren Polarität leicht abtrennen lassen.
Bereits seit den klassischen Untersuchungen von Pasteur hat man zwar gelegentlich eine mikrobiologische Methode zur Gewinnung des einen Antipoden aus Racematen angewendet. Dabei wurden gewöhnlich Pilze oder Bakterien verwendet, die die Ausgangsstoffe assimilierten, u. zw. den natürlichen (d) Antipoden rascher als den. unnatürlichen (l). Nach diesem Verfahren'musste also, um ein optisch reines Präparat zu erhalten, so lange mikrobiologisch behandelt werden, bis mindestens die eine Form, u. zw. meist die biologisch interessantere, völlig zerstört war. Demgegenüber liefert das neue Verfahren auch bei nur teilweiser Umsetzung den umgewandelten Antipoden, der meist den biologisch interessanteren darstellt, in optisch reiner Form, u. zw. als Derivat, das an sich oder für weitere Synthesenzwecke praktisch wertvoll ist und chemische Umwandlungen erspart.
Wird beim neuen Verfahren der eine Antipode völlig umgesetzt, so fällt auch der andere in optisch reiner Form an.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
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ge Bierwürze sterilisiert und mit Ophiobolus herpotrichus beimpft. Die Kolben werden bei 27 geschüttelt. Nach 4 Tagen gibt man zu den gut entwickelten Kulturen unter sterilen Bedingungen je eine Lösung von 30 mg d, l-Progesteron in 1, 5 cm* Aceton und lässt weiter bei der gleichen Temperatur schütteln.
Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen. Man schüttelt die vereinigten Filtrate viermal mit je 200 cms Essigester aus. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser
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gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand (160 mg) enthält gemäss papierchromatographischer Auswertung ungefähr gleiche Mengen von zwei Verbindungen, die sich wie Cortexon (11-Desoxy- - corticosceron resp. Progesteron) verhalten. Er wird mittels eines präparativen Papierchromatogramms mit dem System Bush B 3 aufgetrennt. Die dem Cortexon entsprechenden Zonen werden ausgeschnitten und mit 400 cm3 gem Methanol eluiert. Das Methanol wird darauf im Vakuum entfernt.
Man schüttelt die zurückbleibende wässerige Lösung viermal mit je 50 cm3 Chloroform aus und wäscht die vereinigten Extrakte mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Der Rückstand wird aus Aceton-Äther kristallisiert, wobei man das d-Cortexon vom F. = 140 - 1430 in reiner Form erhält.
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gramms werden in gleicher Weise aufgearbeitet. Man erhält 92 mg Rohextrakt, woraus man durch mehr- malige Kristallisation aus Aceton-Petroläthergemischen reines 1-Progesteron gewinnt. F. = 122 - 1250, Mo = -1900 (Aceton).
Beispiel 2 : In einem Schüttelgefäss werden 500 cm3 sterile Bierwürze mit Cunninghamella
Blakesleena beimpft und drei Tage bei 270 geschüttelt. Dann gibt man zur gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 150 mg d, l-Cortexon in 8 ems Aceton. Gleichzeitig beimpft man in einem zweiten Gefäss 500 cm sterile Bierwürze mit Trichothecium roseum. Beide Kulturen werden
3 Tage bei 270 geschüttelt und dann unter sterilen Bedingungen vereinigt, worauf weiter bei der gleichen
Temperatur geschüttelt wird. Nach drei Tagen trennt man das Mycel ab und wäscht es mit Wasser und
Essigester. Die vereinigten Filtrate werden wie in Beispiel 1 beschrieben extrahiert. Der erhaltene Rückstand (165 mg) besteht gemäss papierchromatographischer Auswertung zur Hauptsache aus drei Verbindungen, die dem Cortexon, Hydrocortison bzw. Cortison entsprechen.
Er wird an 8 g Silicagel nach der Durchlaufmethode chromatographiert, wobei zuerst mit Chloroform, dann mit Chloroform-Aceton (99 : 1) und schliesslich mit Chloroform-Aceton (1 : 1) eluiert wird. Die einzelnen Fraktionen (je 20 cm*) werden papierchromatographisch untersucht. Die mit Chloroform eluierten Anteile enthalten Verunreinigungen, während in den Chloroform-Aceton (99 : 1) -Fraktionen eine dem Cortexon entsprechende Verbindung vorhanden ist. Diese Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Durch Kristallisation aus Aceton-ÄtherGemischen erhält man das l-Cortexon. F. = 138 - 1420, [a]D = - 1750 (Äthanol).
Die weiteren, mit Chloroform-Aceton (1 : 1) eluierten Anteile bestehen zur Hauptsache aus d-Hydrocortison und d-Cortison. Sie werden vereinigt, eingedampft und mittels eines präparativen Papierchromatogramms (System Propylenglykol-Toluol) aufgetrennt. Die Aufarbeitung der das d-Hydrocortison bzw. das d-Cortison enthaltenden Papierzonen geschieht wie in Beispiel 1 beschrieben. Durch Kristallisation der beiden Extraktionsrückstände aus Aceton-Isopropyläther-Gemischen erhält man d-Hydrocortison vom F. = 205-2100, ILXID = +1650 (Äthanol) und d-Cortison vom F. = 210-216 , [ < x]D = +1950 (Dioxan).
Beispiel 3 : In einem Schüttelgefär werden 1 g Natriumnitrat, 0, 5 g prim. Kaliumorthophosphat, 0, 25 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0, 25 g Kaliumchlorid, 25 g Rohglukose und 0, 5 g Difco-Hefeextrakt in 500 cms Leitungswasser gelöst, auf PH 5 gebracht und sterilisiert. Diese Nährlösung wird mit Didymella lycopersici beimpft und 3 Tage bei 270 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 120 mg d, l-Cortison in 5 cm Methanol zu. Man lässt weitere 4 Tage bei 270 schütteln, nutscht dann das Mycel ab und wäscht es mit Wasser und Essigester. Die vereinigten Filtrate werden wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert.
Der Extraktionsrückstand besteht, wie die papierchromatographische Un- tersuchung ergibt, aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 1-Dehydrocortison.
Mittels präparativer Papierchromatographie (System Propylenglykol-Toluol) wird das Gemisch aufgetrennt. Durch Umkristallisieren aus Aceton erhält man das d, l-Dehydro-cortison vom F. = 231-234 , [a]D = +1700 (in Dioxan). Durch mehrmaliges Umkristallisieren aus Aceton-Isopropyläther wird das reine 1-Cortison vom F. = 211-217 erhalten. [ < x] p =-190 (Dioxan).
Beispiel 4 : Eine Nährlösung wird hergestellt, die auf einen Liter Leitungswasser 20 g Pepton, 5 cm* Maisquellwasser (Cornsteep-liquor) und 10 g Rohglukose enthält und deren PH auf 6,3 eingestellt wird. Davon werden je 120 cm3 in vier Erlenmeyerkolben von 500 cm3 Kapazität sterilisiert und mit Wojnowicia graminis beimpft. Die Kulturen werden 4 Tage lang bei 270 geschüttelt, worauf unter sterilen Bedingungen Lösungen von je 30 mg (18- > llss)-Lakton der d, 1-#4-3, 20-Dioxo-llss-oxy-pregnen- - 18-säure in 1, 5 cm3 Methanol zugegeben werden. Dann lässt man weiter bei der gleichen Temperatur schütteln. Nach 8 Tagen trennt man das Mycel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester und extrahiert die vereinigten Filtrate wie in Beispiel 1 beschrieben.
Der Extraktionsrückstand (140 mg) enthält gemäss papierchromatographischer Auswertung ein dem Ausgangsmaterial ähnliches Produkt sowie das (18- > llss)-Lakton der A-3, 20-Dioxo-llss, 21-dioxy-pregnen-18-säure. Er wird mittels präparativer Papierchromatographie (System Formamid-Benzol-Chloroform) aufgetrennt. Die beiden Komponenten
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werden wie in Beispiel 1 beschrieben aus dem Papier eluiert und extrahiert. Durch Kristallisation aus Aceton-Äther erhält man das (18- > llss)-Lakton der d-#4-3,20-Dioxo-11ss-21-dioxy-pregnen-18-säure vom F. = 205-2220, Ictl D = 1170 (Aceton).
Beispiel 5 : Vier Erlenmeyerkolben werden mit je 120 cms der in Beispiel 4 beschriebenen Nährlösung beschickt und sterilisiert. Man beimpft mit Ophiobolus herpotrichus und lässt die Kulturen 5 Tage
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Der Extraktionsrückstand enthält neben einem dem Ausgangsmaterial ähnlichen Produkt eine wie Aldosteron laufende Verbindung. Dieser wird mittels präparativer Papierchromatographie (System Bush C) gereinigt, wobei die Elution und Extraktion gemäss der Beschreibung in Beispiel 1 erfolgt. Aus Aceton- Äther erhält man kristallines d-Aldosteron, F. = 162-163 , M p = +1420 (Aceton).
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6 :sterilisiert und mit Wojnowicia graminis beimpft.
Nach viertätigem Schütteln hat sich die Kultur gut entwickelt und man gibt unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 50 mg d, l-Ä4-3, 18, 20-Trioxo- - llss-oxy-pregnen bzw. sein 18, 11-Cyclohalbacetal in 3 cm* Methanol zu. Gleichzeitig werden in einem zweiten Schüttelgefäss 300 cm* sterilisierte Bierwürze mit Trichothecium roseum beimpft. Man lässt beide Kulturen 4 Tage bei 270 schütteln, vereinigt sie dann unter sterilen Bedingungen und lässt weiter bei der gleichen Temperatur schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden wie in Beispiel 1 beschrieben extrahiert.
Der Extraktionsrückstand (55 mg) enthält neben einer Verbindung, die sich wie Ausgangsmaterial verhält, d-17a-Oxy-aldosteroll. Dieses wird nach präparativer Papierchromatographie (System PropylenglykolToluol) in einheitlichem Zustand erhalten, wobei die Elution und Extraktion der Papiere gemäss den Angaben in Beispiel 1 vorgenommen wird.
Beispiel 7 : In einem Schüttelgefäss werden 300 cms Bierwürze sterilisiert und mit Trichothecium roseum beimpft. Die Kultur wird 4 Tage bei 270 geschüttelt, worauf unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 60 mg d, l-Aldosteron in 3 cms Methanol zugegeben wird. Man lässt weitere 4 Tage bei 270 schütteln, trennt dann das Mycel ab und wäscht es mit Wasser und Essigester. Man extrahiert die vereinigten Filtrate wie in Beispiel 1 beschrieben. Der Extraktionsrückstand, der neben Ausgangsmaterial
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trennt. Das d-17a-Oxy-aldosteron wird durch Elution der entsprechenden Zonen der Papiere nach den Angaben in Beispiel l in einheitlicher Form gewonnen. Es kristallisiert aus einem Aceton-Äther-Gemisch.
Aus den dem Ausgangsmaterial entsprechenden Zonen erhält man durch Kristallisation aus Äther-Aceton das I-Aldosteron vom F. = 162-168 und der Drehung [a]D = -1420 (Aceton).
Beispiel 8 : In einem Schüttelgefär werden 300 cms sterile Bierwürze mit Ophiobolus herpotrichus beimpft und bei 27 geschüttelt. Nach 5 Tagen gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 60 mg d,1-#4-3,20-Dioxo-11ss,18-dioxy-pregnen in 4 cm3 Methanol zu und lässt weiter bei der gleichen Temperatur schütteln. Nach 6 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen.
Die vereinigten Filtrate extrahiert man wie in Beispiel 1 angegeben. Der Extraktionsrückstand besteht
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Ausgangsmaterial ähnlichen- pregnen kristallisiert aus Aceton-Äther-Gemisch.
Beispiel 9t In einem Schiittelgefäss werden 200 cms einer Nährlösung, die auf 11 Leitungswasser 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt (Oxo Lab. Lemco), 5 g Natriumchlorid und 10 g Calciumcarbonat enthält und auf PH 7, 5 gestellt wird, sterilisiert und mit einer Kultur eines Stammes von Streptomyces albus beimpft. Man lässt 2 Tage bei 270 schütteln und gibt dann unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 50 mg d, l-a-Oestradiolin2 cms Dioxan zu. Es wird weitere 3 Tage bei 270 geschüttelt, worauf das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat mit Methylenchlorid extrahiert wird. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung aus a-Oestradiol und Oestron entsprechenden Verbindungen.
Mittels präparativer Papierchromatographie wird das Gemisch aufgetrennt, und man erhält durch Kristallisation aus wässerigem Methanol einerseits l-a-Oestradiol, F. = 175-178 , [a]D = -810, und anderseits d-Oestron, F. = 257 - 2590. [aID = +1610.
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bei 270 schütteln, nutscht dann das Mycel ab und wäscht es mit Wasser und Essigester. Die vereinigten Filtrate werden wie in Beispiel 13 beschrieben extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht, wie die papierchromatographische Untersuchung ergibt, aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält und aus 1-Dehydro-17a-oxy-corticosteron.
Mittels präparativer Papierchromatographie (System Propylenglykol-Toluol) wird das Gemisch aufgetrennt. Durch Umkristallisieren aus Aceton erhält man einerseits das d-l-Dehydro-17a-oxy-corticosteron vom F. = 234 - 2360, [a]D = +980 (in Dioxan) und ander-
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Ict] D =-1680lycopersici her und gibt dann eine Lösung von 120 mg d, l-17a-Oxy-corticosteron-21-trimethylacetat in 5 cm Aceton zu. Nach viertägigem Schütteln bei 27 wird auf gleiche Weise aufgearbeitet. Der Ex- traktionsrückstand besteht auf Grund der papierchromatographischen Auswertung zur Hauptsache aus zwei Produkten, die sich wie Ausgangsmaterial bzw. wie 1-Dehydro-17a-oxy-corticosteron-trimethylacetat verhalten.
Mittels präparativer Papierchromatographie wird das Gemisch aufgetrennt und man erhält durch Kristallisation aus Essigester einerseits 1-17α-Oxy-corticosteron-21-trimethylacetat vom F. = 231 bis 2320, [a]D =-145 (in Dioxan) und anderseits d-1-Dehydro-17a-oxy-corticosteron-21-trimethylacetat vom F. = 23b-236 , [ < x]D = +103 (in Chloroform).
Beispiel 18 : 120 cms der in Beispiel 16 beschriebenen Nährlösung werden mit Didymella lycopersici beimpft und 2 Tage bei 270 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d, l-Aldosteron in 1, 5 cms Aceton zu und schüttelt weiter bei der gleichen Temperatur. Nach 3 Tagen trennt man das Mycel ab und wäscht es mit Wasser und Essigester. Die vereinigten Filtrate werden wie in Beispiel 13 beschrieben extrahiert. Wie die papierchromatographische Untersuchung zeigt, besteht der Extraktionsrückstand aus einem Produkt, das sich wie Aldosteron verhält, und aus 1-Dehydro- - aldosteron. Mittels präparativer Papierchromatographie (System Bush C) werden die beiden Substanzen getrennt und hierauf aus einem Aceton-Äther-Gemisch kristallisiert.
Man erhält 1-Aldosteron (F. = 1100/
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thanol gegeben. Man lässt 3 Tage bei 270 schütteln und trennt dann das Mycel ab. Dieses wird mit Wasser und Essigester gewaschen. Man extrahiert die vereinigten Filtrate wie in Beispiel 13 beschrieben. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung aus 1-Dehydro-cortison und aus einem Produkt, das sich wie Cortison verhält. Diese beiden Substanzen werden mittels präparativer
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Trichothecium roseum beimpft und 5 Tage bei 270 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d, l-Aldosteron in 1, 5 cms Aceton zu und schüttelt weiter bei der gleichen Temperatur. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen.
Die vereinigten Filtrate extrahiert man wie in Beispiell3 beschrieben. Gemäss der papierchromatographischen Untersuchung besteht der Extraktionsrückstand zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich wie Aldosteron
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ter bei 270 schütteln. Nach 6 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen. Man extrahiert die vereinigten Filtrate wie in Beispiel 13 beschrieben. Der Extraktionsrückstand besteht. gemäss papierchromatographischer Untersuchung aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial ver-
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impft und 3 Tage bei 270 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 40 mg d. l-Ä -3, 18, 20-Trioxo-llss-oxy-pregnen bzw. dessen 18, 11-Cyclohalbacetal in 1, 5 ems Aceton zu und lässt weiter bei 270 schütteln.
Nach 6 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester ge- waschen. Man extrahiert die vereinigten Filtrate wie in Beispiel 13 beschrieben. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmate- rial verhält, und aus Aldosteron. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die beiden Substan- zen getrennt und man erhält 1--3, 18, 20-Trioxo-llss-oxy-pregnen bzw. dessen 18,11-Cyclohalbacetal und d-Aldosteron (M D = +1420).
Beispiel 23 : 120 cm sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus be- impft und 3 Tage bei 270 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 40 mg d, l-19-Nor-progesteron in 1, 5 cama Aceton zu und lässt weiter bei 270 schütteln. Nach 3 Tagen wird das
Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen. Man extrahiert die vereinigten Filtrate wie in Beispiel 13 beschrieben. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersu- chung aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 19-Nor-cortexon. Mittels prä- parativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt und man erhält 1-19-Not-proge- steron ([ct]D = -1430) und d-19-Nor-cortexon.
Letzteres wird in üblicher Weise mittels Pyridin-Acet- anhydrid acetyliert. Das 21-Acetat zeigt ein [ct]D von +1450.
Beispiel 24 : 120 ems sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus be- impft und 3 Tage bei 270 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 40 mg d, 1-9α-Fluor-11ss-oxy-progesteron in 1, 5 cms Aceton zu und lässt weiter bei 270 schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen. Man extrahiert die vereinigten Filtrate wie in Beispiel 13 beschrieben. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 9α-Fluor-cortico- steron.
Mittels präparativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt und man erhält 1-9α-Fluor-11ss-oxy-progesteron ([α]D=-190 ) und 9a-Fluor-corticosteron. Letzteres wirdin übli- cher Weise mittels Pyridin-Acetanhydrid acetyliert. Das 21-Monoacetat zeigt ein MD von +1870.
Beispiel 25 : 120 cms sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Rhizopus species beimpft und 3 Tage bei 270 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,-1-Cortexon (11-Desoxy-corticosteron) in 1, 5 cms Aceton zu und lässt weiter bei 270 schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat wie in den vorherigen Beispielen beschrieben extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 6 ss-Oxy-cortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt. Man erhält 1-Cortexon ([ct]D = =-175 ) und d-6 ss-Oxy-cortexon ([ct] D = +1000).
Beispiel 26 : 120 cams sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Peziza sp., ETH M 26, beimpft und 3 Tage bei 270 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d, 1-Cortexon (11-Desoxy-corticosteron) in 1,5 cm3 Aceton zu und lässt weiter bei 270 schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat wie in den vorherigen Beispielen beschrieben extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 7α-Oxy-cortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt.
Man erhält 1-cortexon (MD = =-173 ) und d-7ct-Oxy-cortexon ([ct]D = +1550).
Beispiel 27: 120 cm3 sterile Bierwürze werden mit einer Kultur von Lenzites abietina beimpft und 3 Tage bei 270 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d, 1-Cortexon (11-Desoxy-corticosteron) in 1,5 cms Aceton zu und lässt weiter bei 270 schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat wie in den vorherigen Beispielen beschrieben extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 15ss-Oxy-cortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt.
Man erhält 1-Cortexon ([α]D=-170 ) und d-15ss-Oxy-cortexon ([α]D = +1410).
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Beispiel 28 : 120 cms sterile Czapek-Dox-Nährlösung werden mit einer Kultur von Gibberella baccata beimpft und 3 Tage bei 270 geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d, l-Cortexon (11-Desoxy-corticosteron) in 1, 5 cm* Aceton zu und lässt weiter bei 27 schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat wie in den vorherigen Beispielen beschrieben extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 15a-Oxy-cortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt.
Man erhält l-Cortexon
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4 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat wie in den vorherigen Beispielen beschrieben extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung zur Hauptsache aus einem Produkt, das sich wie Ausgangsmaterial verhält, und aus 14a-Oxy-cortexon. Mittels präparativer Papierchromatographie werden die beiden Substanzen getrennt. Man erhält I-Cortexon (MD =-174 ) und d-14a-Oxy-cortexon ([a]D = +179 ).
Beispiel 30 : 120 cm* einer Nährlösung, die auf 11 Leitungswasser 10 g Rohglukose, 5 g Pepton,
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gebracht wird, werden sterilisiert und mit einer Kultur des Streptomyces-Stammes Nr. 7747 (Institut für spezielle Botanik, ETH Zürich) beimpft. Man lässt 2 Tage bei 270 schütteln und gibt dann unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d, l-Cortexon in 1, 5 cm* Aceton zu. Man schüttelt weiter bei der gleichen Temperatur und trennt nach 2 Tagen das Mycel ab. Das Kulturfiltrat wird wie in Beispiel 13 beschrieben extrahiert. Der Extraktionsrückstand besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung
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ausgehend von den totalsynthetisch zugänglichen tetracyclischen Zwischenprodukten, z. B. der Cholestan-, Pregnan-oder Testanreihe, herstellen.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation von Steroiden durch Einwirkung von oxydierend wirkenden Enzymen aerober Kulturen von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass man als Steroidverbindungen d, l-Steroide verwendet und diese mit einem beliebigen oxydierend wirkenden Enzym inkubiert, wobei im wesentlichen nur die eine optisch aktive Komponente oxydiert wird, und mindestens eine der enantiomorphen Formen isoliert.