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Verfahren zur Herstellung von oxydierten Steroiden Die Erfindung bezieht
sich auf ein neues Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in ein Steroidmolekül.
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Es ist bereits bekannt, Sauerstoff in ein Steroid und auch in die
ii-Stellung eines solchen Steroides einzuführen, jedoch wurde dies nur durch technisch
hochentwickelte organische Synthesen mit vielen Zwischenstufen erreicht. Demzufolge
war die Gesamtausbeute von z. B. in der ii-Stellung oxydierten Steroiden viel zu
klein und die Unkosten einer solchen Erzeugung waren außerordentlich groß, wenn
nicht vollkommen untragbar. Dies stellte ein unüberwindliches Hindernis für die
Bestrebungen der pharmazeutischen Chemiker dar, gewisse in der ii-Stellung oxydierte
Steroide, die als Heilmittel äußerst wichtig sind, herzustellen. Unter den Heilmitteln,
welche aus in ii-Stellung oxydierten Steroiden bestehen, seien Corticosteron, ii-Dehydrocorticosteron,
ii-Dehydro-17-oxycorticosteron (Verbindung E, Cortison) und 17-Oxycorticosteron
(Verbindung F) erwähnt. Es ist daher von größter Wichtigkeit, eine zufriedenstellendere
Methode zu finden, um oxydierte Steroide zu erhalten, welche in der ii-Stellung
entweder eine Keto- (Oxo-) Gruppe (=C=O) oder eine Hydroxyl-(Oxy-) Gruppe (- OH)
enthalten, welche ebenfalls in vielen wertvollen Steroiden vorhanden und welche
außerdem leicht durch bekannte Oxydationsverfahren in eine Ketogruppe umwandelbar
ist. Bisher konnte diesbezüglich trotz größtem Aufwand an Mitteln und Zeit kein
nennenswerter Erfolg verzeichnet werden.
Gegenstand der Erfindung
ist nun ein neues Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in ein Steroidmolekül,
und die Erfindung besteht nun im wesentlichen darin, daß Steroide der Einwirkung
eines oxydierenden Stammes einer Pilzart der Ordnung Mucorales oder von aus derartigen
Pilzen erhältlichen oxydierenden Enzymen unterworfen werden, worauf die erhaltenen
oxydierten Steroide in bekannter Weise z. B. durch Extraktion abgetrennt werden
können. Vorzugsweise wird hierbei gemäß. der Erfindung ein ii-Desoxysteroid (die
Bezeichnung »ii-Desoxysteroida wird im folgenden für solche Steroide verwendet,
welche in der ir-Stellung ihres Ringsystems keinen Sauerstoff enthalten) mit guter
Ausbeute in ein in ii-Stellung oxydiertes Steroid durch die Einwirkung eines solchen
Pilzes (Fungus) der Ordnung Mucorales oder durch daraus erhältliche oxydierende
Enzyme umgewandelt. Die Oxydation der Steroide z. B. in der ii-Stellung kann insbesondere
durch Pilze der Familie Mucoraceae, welche der Ordnung Mucorales angehört, insbesondere
der Gattung Rhizopus, oder durch deren oxydierende Enzyme erfolgen. Außerdem können
durch das erfindungsgemäße Verfahren neue Verbindungen hergestellt werden, welche
durch kein anderes Verfahren erzeugt werden können, Es wurde nun gefunden, daß ii-Desoxysteroide,
welche das Cyclopentanopolyhydrophenanthrenringsystem enthalten, insbesondere 1o,
i3-Dimethylcyclopentano-polyhydröphenanthrene, leicht und mit hoher Ausbeute in
die entsprechenden oxydierten Steroide umgewandelt werden können, indem das Steroid
der Einwirkung eines Pilzes der Ordnung Mucorales oder den von diesen Pilzen gebildeten
oxydierenden Enzymen unterworfen wird. Mittels des. erfindungsgemäßen Verfahrens
ist eine wirksame, wirtschaftliche zufriedenstellende Methode zum Einführen von
Sauerstoff in die ii-Stellung -eines ii-Desoxysteroidmoleküls geschaffen. Dadurch
wird eine neue und einfache Herstellungsmöglichkeit von in ii-Stellung oxydierten
Steroiden als wichtigen Heilmitteln geschaffen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren besteht im. allgemeinen darin, ii-Desoxysteroide
der Einwirkung von oxydierenden Pilzen der Gattung Mucorales oder deren oxydierenden
Enzymen, welche fähig sind, ein Sauerstoffatom in die ii-Stellung des Ringsystems
eines Steroides einzuführen, zu unterwerfen.
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In vereinzelten Fällen können auch andere Stellungen des Steroidmoleküls
durch die Einwirkung der Pilze oder deren Enzyme Veränderungen erfahren, jedoch
sind solche Umwandlungen nicht als -nachteilig zu betrachten, da die Einführung
von Sauerstoff in andere Stellungen des Steroidmoleküls wertvolle therapeutische
,Stoffe oder Zwischenprodukte ergeben kann, z. B. solche, welche eine Hydroxylgruppe
in i7-Stellung besitzen. Im Falle, -daß die Einführung solcher zusätzlicher Gruppen
nicht erwünscht ist, können dieselben nach bekannten Methoden leicht wieder entfernt
werden. Die große Bedeutung der Erfindung ist jedoch darin zu suchen, daß ein ii-Desoxysteroid
mindestens in der ii-Stellung oxydiert wird, während ein ii-Oxysteroid weiteroxydiert
wird. Hydroxylgruppen, welche im Steroidmolekül, das in der x=-Stellung oxydiert
werden soll, schon vorhanden sind und selbst zu Ketogruppen oxydiert werden könnten,
können, falls es wünschenswert ist, außerordentlich hohe Ausbeuten von in ii-Stellung
oxydierten Steroiden anzustreben, durch Veresterung, Verätherung, Halogenierung
od. dgl. geschützt werden.
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Die verwendbaren Steroide sind nicht auf eine besondere Art oder Anzahl
der im Molekül anwesenden Substituenten beschränkt, vorzugsweise sollen sie aber
eine nicht oxydierte ii-Stellung aufweisen, also ein ii-Desoxysteroid sein. Solche
Verbindungen enthalten folgendes Ringsystem:
Dieses Ringsystem kann außerdem Substituenten in der i-, 2-,3-,4-,5-,6-,7-,8-, 9-,
1o-, i2-, i3-, i4-, I5-, 16- und bzw. oder der i7-Stellung haben, insbesondere 1ö,
i3-I)imethylgruppen, 3-, 7- oder i2-Keto-, Hydroxyl- oder Acyloxygruppen. Es können
Seitenketten in i7-Stellung vorhanden sein, wovon die Progesteron-und Corticosteron-
(Ketol-) Seitenketten besonders erwähnt werden sollen. -In der i7-Stellung kann
eine Ketogruppe vorhanden sein, oder es kann sich eine Hydroxylgruppe od. dgl. dort
befinden. Außerdem können Doppelbindungen in 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9 (1i)-, 1i (i2)-,
-16 (i7)- und anderen Stellungen vorkommen; auch Doppelbindungen, welche durch Anlagerung
von Halogenen oder Halogenwasserstoffen abgesättigt wurden, .ebenso Additionsprodukte
von dienophilen Verbindungen, wie Mäleinsäure, Maleinsäureanhydrid oder Maleinsäureester
mit Steroiden, welche eine konjugierte Doppelbindung, z. B. in 5, 7-Stellung besitzen.
Die Gegenwart oder Abwesenheit einer Doppelbindung an der 9 (1i)- oder ri (i2)-Stellung
des Ringsystems ist für das erfindungsgemäße Verfahren kein entscheidender Faktor.
Obwohl es vorgezogen wird, das Verfahren auf Steroide, welche eine ii-Methylengruppe
haben, d. h. Steroide, welche an der 9 (11)-oder ii (i2)-Stellung keine Doppelbindung
besitzen, anzuwenden, kann man aus wirtschaftlichen Gründen sowie, um unnötige Umwandlungen
von gesättigten in nichtgesättigte Verbindungen zu vermeiden, auch die biochemische
Oxydation mit gleichem Erfolg bei gesättigten oder ungesättigten Verbindungen durchführen.
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Steroide, welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren oxydiert werden
können, seien z. B. folgende: Progesteron, 9, 1i- oder ii, i2-Dehydroprogesteron,
7, 9 (ii)-Bisdehydroprogesteron, i7-Oxyprogesteron, Pregnenolon, Acyloxypregnenolone
wie Pregnenolonacetat, ii-Desoxycorticosteron, 4 9, 1o_ oder 4 1i, i2-Desoxycorticosteron,
ii-Desoxy-i7-oxycorticosteron und Acyloxyderivate, wie Acetoxyderivate, 2i-Oxypregnenolon,
und dessen 2i-Acylderivate; z. B. dessen
Acetylester, 17, 2i-Dioxypregnenolon
und dessen 17, 2i-Diacyloxyderivate, z. B. das Diacetoxyderivat, Androstendion,
Androstan-i7-ol, g, 11- oder 11, 12-Dehydroandrostendion, 3-Oxy-d 9"1- oder -d 11,12-pregnen-2o-on,
3, 2i-Dioxy-4 " 11- oder d 11, 12_pregnen-2o-on, 3, i7, 2i-Trioxy-d 9,11 - oder
-d 11,12-pregnen-2o-on, 5-Androsten-3-ol-i7-on und 3-Acylester, z. B. der Acetylester,
5-Androsten-3-ol-i7-on und dessen 3-Acylester, z. B. der Acetylester; Ergosterin,
Stigmasterin, Stigmastanol und dessen 3-Acylester, z. B. deren Acetylester; Ergostenon,
Stigmastenon, Stigmastanon, Cholestenon, Cholsäure, Desoxycholsäure, Lithocholsäure,
Cholansäure, Norcholansäure, Bisnorcholansäure, Cholensäure, Norcholensäure, Bisnorcholensäure
und die 3-Oxy-, 3-Keto-, 3, 7-Dioxy-, 3, 7-Diketo-, 3, 7, i2-Trioxy-, 3, 7, i2-Triketo-g,
ii-oder -ii, i2-ungesättigte Ester, Thiolester und andere Derivate der vorher erwähnten
Säuren.
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Die biochemische Oxydation wird mit Hilfe eines oxydierenden Pilzes,
welcher zur Ordnung der Mucorales gehört, oder mit daraus erhältlichen Enzymen durchgeführt.
Unter den zahlreichen Pilzen dieser Ordnung sind die Mucoraceae am besten zu gebrauchen
und Rhizopus- und Mucorarten am wertvollsten, z. B. folgende: die Rhizopusarten
microsporus, circinans, oligosporus, arrhisus, cohnii, oryzae und nigricans, und
synonyme Arten, welche mit diesen trotz anderer Benennung tatsächlich identisch
sind, ferner Mucor mucedo, griseocyanus, hiemalis, hiemalis v ar. albus, rouxi,
adventitius, christianiensis, circinelloides dubius, genevensis, javanicus, microcporus,
parasiticus u. dgl. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden als oxydierende Pilze
im allgemeinen aus wirtschaftlichen Gründen Arten der Gattung Rhizopus bevorzugt,
besonders die Art arrhisus, welche mit RH-i76 bezeichnet wird und mit der höchste
Ausbeuten erhalten werden, obwohl in manchen Fällen, unter besonderen Umständen,
andere Gattungen und Arten vorteilhaft benutzt werden können. Arten der erwähnten
Gattungen sind insbesondere reichhaltig an Enzymen.
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Auch andere Gattungen der Mucoraceae und ihnen angehörige Arten seien
genannt (vgl. H. Zycha, »Kryptogamenflora der Mark Brandenburg«, Bd. VIa, i bis
26q:, [19341): Parasitella (P. simplex), Zygorhynchus (Z. heterogamus), Circinella
(C. spinosa), Actinomucor (A. repens), Pirella (P. circinans), Absidia (A. reflexa),
Spinellus (S. sphaerosporus), Phycomyces (Ph. Blakeslecanus), Sporodinia (Sp. grandis),
Pilaira (P. anomal«), Pilobolus (P. crystallinus), Dicoccum (D. asperum); ferner
Thamnidiaceae: Thamnidium (Th. elegans), Dicranophora (D. fulva), Chaetostylum (C.
Fresenii), Heliostylum (H. piriforme), Chaetocladium (Ch. Brefeldii); Choanephoraceae:
Blakesleea (B. trispora), Choanephora (Ch. cucurbitarum), Rhopalomyces (Rh. elegans),
Cunninghamella (C. elegans), Thamnocephalis (Th. quadrupedata) ; Cepahdaceae Piptocephalis
(P. preseniana), Syncephalis (S. reflexa), Spinalia (Sp. radians), Syncephalastrum
(S. racemosum), Dispira (D. cornuta), Coemansia (C. pectinata), Kickxella (K. alabastrina);
Mortierellaceae: Mortierella (M. pusilla), Haplosporangium (H. bisporale), Dissophora
(D. decumbens) ; Endogonaceae : Endogone (E. reniformis), Sclerocytis (S. coromiodes),
Glaziella (G. vesiculosa).
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Unter den Arten der Rhizopusgattungen, welche im erfindungsgemäßen
Verfahren bevorzugt angewendet werden, sind nach Zycha, »Kryptogamenflora der Mark
Brandenburg«, Bd. VIa, iio bis i2o (i935) viele allgemein bekannte Arten synonym.
So ist Rhizopus microsporus z. B. auch unter den Namen Rh. Minimus, Mucor speciosus,
Rh. speciosus und Rh. equinus bekannt; Rhizopus circinans als Rh. reflexus; Rhizopus
oligosporus als Rh. Delamar oder Rh. Tamari; Rhizopus arrhizus als Rh. nodosus,
Rh. racemosus, Rh. maydis, Mucor arrhizus, Mucor norvegicus, Rh. pusillus, Rh. bovigus,
Rh. Cambodja, Rh. Chinensis und Rh. tritici; Rhizopus Cohnii als Rh. suinus; Rhizopus
Oryzae als Rh. japonicus oder Rh. tonkinensis; Rhizopus nigricans als Mucor stolonifer,
Rh. niger, Rh. artocarpi, Mucor niger, Rh. nigricans var. minor oder Rh. nigricans
var. luxurians; und Rhizopus echinatus wird als selbständige Art bezweifelt und
dürfte mit Rhizopus nigricans synonym sein.
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Die Gewinnung der Pilze aus natürlichen Quellen erfolgt nach bekannten
Verfahren. Die Pilze können aber auch aus Sammlungen bezogen werden. Mit der Organismenkultur
wird nun ein das Wachstum der Pilze fördernder bakteriologischer Nährboden beschickt.
Für diesen Zweck kann der Nährboden von Peterson und Murray mit gutem Erfolg verwendet
werden, und im folgenden wird, wenn nicht anders erwähnt, stets der Nährboden von
Peterson und Murray Anwendung finden. Ein solcher Nährboden enthält auf 11
Leitungswasser, das dazu dient, um Spuren von Elementen und anorganischen Salzen
zu liefern, folgende Zusätze: 5 cm3 Maisquellwasser, 2o g Lactalbuminauszug (bekannt
unter dem Namen »Edaminea) und 50 mg Dextrose. Der pH-Wert dieses Nährbodens
wird gewöhnlich vor dem Einimpfen der Pilzorganismen auf ungefähr 5,5 bis
5,9
eingestellt. Erhitzen unter Druck auf etwa o,7kg/cm2 während
30 Minuten bewirkt eine Erniedrigung des pH-Wertes von ungefähr 6,5 auf ungefähr
5,5 bis 5,9, und diese Verminderung des pH-Wertes muß bei der Einstellung des pH-Wertes
des Nährbodens vor der Erhitzung berücksichtigt werden, um nach Beendigung dieser
Maßnahme optimale Wachstumsbedingungen zu erhalten. Nach 24 Stunden Pilzwachstum
auf dem Nährboden kann man feststellen, daß der pH-Wert des Nährbodens stark gesunken
ist, gewöhnlich auf ungefähr 3,5 bis 4,2. Vorzugsweise in diesem Wachstumsstadium
der Pilze wird das zu oxydierende Steroid zugegeben oder die Pilzfermentationsflüssigkeit,
welche zur fermentativen Oxydation der Steroide benutzt wird, von den Pilzkulturen
getrennt.
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Das Impfen des Pilznährbodens mit ausgewählten Pilzen der Mucoralesordnung
kann in irgendeiner bekannten mikrobiologischen Weise erfolgen; z. B. mit den Sporen
der Organismen oder mit vegetativen Mycelien. Das Wachstum der Pilze wird unter
Aufrechterhaltung einer Impftemperatur, z. B. bei Zimmertemperatur, wie 2o bis 25°,
gut gefördert, auch Temperaturen von ungefähr 15 bis ungefähr q.5° sind für die
Zucht der Pilzorganismen anwendbar.
Die Zeitdauer des Pilzwachstums,
welche notwendig ist, bevor das zu oxydierende Steroid der Pilzeinwirkung oder der
Einwirkung der Pilzenzyme ausgesetzt wird, ist nicht entscheidend. Beispielsweise
kann das in der ii-Stellung zu oxydierende Steroid entweder gleichzeitig mit dem
Impfmaterial dem Nährboden oder zu irgendeiner Zeit, z. B. 24 Stunden später, zugesetzt
werden. Das zu oxydierende Steroid kann ohne nachteilige Wirkung- sogar 5 Tage nach
dem Impfen des Nährbodens mit ausgewählten Mucoralesarten den Pilzkulturen in der
Nährbodenlösung zugefügt werden. Vorzugsweise erfolgt die Zugabe des i'i-Desoxysteroids
zur Fermentationsflüssigkeit nach 16- bis 24stündigem Pilzwachstum, da dann das
Pilzwachstum seinen Höhepunkt erreicht hat. Auch im Falle, daß die Oxydation nur
mit der das oxydierende Enzym enthaltenden Fermentationsflüssigkeit vorgenommen
werden soll, muß mindestens dieses Wachsstadium erreicht sein, ehe die Fermentationsflüssigkeit
wie üblich und vorteilhaft abgetrennt wird.
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Die Art der Zugäbe der zu oxydierenden Steroide zu den oxydierenden
Pilzen, zum Pilznährboden oder zur Fermentationsflüssigkeit scheint nicht entscheidend
zu sein. Die Zugabe kann in irgendeiner entsprechenden Weise stattfinden, die eine
innige Berührung der Steroide mit den Pilzen und bzw: oder den Enzymen ermöglicht,
wie etwa durch Züchten der Pilzorganismen in Gegenwart von feinzerkleinerten Steroidkristallen,
durch Dispergierung der Steroide in der ganzen Nährbodenflüssigkeit oder in sonst
ähnlicher Weise. Zu diesem Zweck können oberflächenaktive Mittel, Dispergiermittel
oder Aufschwemmungsmittel, bekannt unter den Handelsnamen, Span, Tween, Aerosol,
Nacconol, verwendet werden. Das Steroid wird jedoch vorzugsweise in der Form einer
Lösung in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Alkohol
oder sogar Äther, welcher sich in Wasser nur wenig löst, den Pilzen, dem Nährboden
oder der Fermentationsflüssigkeit zugefügt, worauf die Nährbodenlösung mit dem Steroid
gut durchmischt wird, so daß sich eine Suspension oder Dispersion feiner Steroidteilchen
bildet und eine sehr große Berührungsfläche des zu oxydierenden Steroides mit den
oxydierenden Pilzen oder deren Enzymen hergestellt wird. Es können entweder Tauch-
oder Oberflächenkultürmethoden verwendet werden; Tauchkulturen werden jedoch vorgezogen.
Es kann auch dieFermentationsflüssigkeit einer Pilzzucht abgesondert, dem Steroid
oder dessen Lösung beigemischt und die Mischung aeroben Bedingungen unterworfen
werden, um die Oxydation der Steroide herbeizuführen.
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Die Temperatur, welche während der Oxydation eingehalten wird, braucht
notwendigerweise nicht eine andere zu sein, als Steroide noch nicht zugesetzt waren.
Sie soll sich lediglich innerhalb solcher Grenzen bewegen, in welcher das Leben
oder ein aktives Wachstum der Pilzorganismen aufrechterhalten bleibt. Die Inkubationstemperatur
während der oxydierenden Einwirkung der Pilze auf die Steroide kann demzufolge z.
B. zwischen ungefähr 15 und ungefähr 45° liegen, wobei Zimmertemperatur, z: B. 2o
bis 25°, wegen der hierbei auftretenden optimalen Wirkung der Pilzorganismen oder
deren Enzyme den Vorzug genießt.
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Die Pilzorganismen werden vorzugsweise unter aeroben Bedingungen gezüchtet,
wobei die Wachstumsstärke von der Belüftungsstärke abhängig ist: Trotzdem jede Art
einer aeroben Zucht zufriedenstellend ist, wird gewöhnlich eine starke Belüftung,
wie etwa durch Rühren und bzw. oder Durchblasen von Luft durch die Nährflüssigkeit,
vorgenommen, um maximales Pilzwachstum zu erlangen, wobei offenbar die Zeit, welche
zur Umwandlung der Desoxysteroide in in ii-Stellung oxydierte Steroide notwendig
ist, vermindert wird. Der Umwandlungsgrad des Desoxysteroides in ein in ii-Stellung
oxydiertes Steroid ergibt sich somit als abhängig entweder von der Belüftungsstärke
oder vom Pilzwachstum zur Zeit der Zugabe des Steroids, da festgestellt wurde, daß
Umwandlungen entweder mit Pilzkulturen oder mit Ferrnentationsflüssigkeit allein
schneller vor sich gehen, wenn die Belüftungsstärke größer ist, und auch dann, wenn
der Pilz vor dem Zusatz des zu oxydierenden Steroids sich 16 bis 24 Stunden entwickeln
konnte. Dies deutet darauf hin, daß die oxydierende Enzymwirkung nach 16- bis 24stündigem
Wachstum voll entwickelt ist und daß eine Belüftung entweder die Umwandlung bzw.
die Umwandlungsgeschwindigkeit durch Vergrößerung der Wachstumsgeschwindigkeit der
Pilzorganismen erhöht oder daß die Belüftung lediglich durch Vergrößerung der. Sauerstoffzufuhr
die Oxydation fördert.
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Die Zeit, welche zur Oxydation des Desoxysteroides notwendig ist,
kann nicht genau angegeben werden, da verschiedene Umstände in Betracht gezogen
werden müssen. Ungefähr i bis 72 Stunden wurden als ausreichend befunden. Es bestehen
jedoch Anzeichen dafür, daß die Oxydation des Steroides im wesentlichen sofort nach
dessen Zugabe zur Fermentationsflüssigkeit eines vollentwickelten Pilzes oder dessen
Enzymen beginnt, wobei eine Pilzzucht nach 4- bis 24stündigem Wachstum als voll
entwickelt bezeichnet wird, was in' gewissem Maße auch von der Belüftungsstärke
abhängt. Wenn das Steroid zum Nährboden gleichzeitig mit dem Impfmaterial zugegeben
wird, ist zwecks hohen Umsetzungsgrades der Desoxysteroide eine längere Fermentationsdauer
angezeigt, wobei dieser Umstand der Tatsache zuzuschreiben ist, daß die oxydierend
wirkenden Enzyme der Pilze erst nach einer gewissen Dauer des Pilzwachstums voll
entwickelt sind. Dementsprechend sind, falls das Steroid gleichzeitig mit dem Impfmaterial
dem Nährboden zugegeben wird, gewöhnlich Fermentationszeiten von 8 bis 72 Stunden
notwendig, wobei die Länge der Fermentationsdauer umgekehrt proportional der Belüftungsstärke
ist. Wird das Steroid den Pilzen, dem Nährboden oder den Enzymen der Fermentationsflüssigkeit
nach längerem Wachstum der Pilzorganismen z. B. nach 16 bis 24 Stunden ohne wesentliche
Belüftung oder nach 2 bis 4 Stunden bei starker Belüftung zugegeben, so beginnt
die Umwandlung des Desoxysteroids in ein in ii-Stellung oxydiertes Steroid sofort,
und im Laufe von i bis 72 Stunden oder je nach der Belüftungsstärke sogar in kürzeren
oder längeren Zeiten werden hohe Ausbeuten erzielt.
Es sei erwähnt,
daB bei längerer Einwirkungsdauer der oxydierenden Pilze oder von deren Enzymen
auf Desoxysteroide eine erhöhte Umwandlung auch in mehrfach oxydierte Abkömmlinge
stattfindet.
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Nach der Vollendung der Oxydation wird das in der ii-Stellung oxydierte
Steroid vom Fermentationsgemisch in irgendeiner zweckentsprechenden Weise getrennt.
Eine besonders vorteilhafte Art der Abtrennung besteht darin, das Gemisch der Fermentation
zu extrahieren, insbesondere die Fermentationsflüssigkeit und die Mycelien in den
Fällen, in denen das Steroid direkt zur Pilzkultur zugefügt wurde, und zwar mittels
mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie etwa halogenierten Kohlenwasserstoffen,
z. B. Methylenchlorid, Äthylenchlorid oder Chloroform, Äthern u. dgl. Die Extrakte
werden, nachdem sie zuerst mit Natriumbikarbonat und nachher mit destilliertem Wasser
gewaschen worden sind, vereinigt und das Lösungsmittel durch einen Luftstrom, im
Vakuum oder auf eine ähnliche Weise verdampft. Die festen Rückstände werden dann
aus etwas frischem Lösungsmittel, z. B. Methylenchlorid, umkristallisiert. Eine
zusätzliche Umkristallisierung kann, wenn erwünscht, z. B. aus Methanol erfolgen.
Die kristalline Substanz kann nach bekannten Methoden, wie durch Elementaranalyse,
durch den Schmelzpunkt, ein Infrarot- und Ultraviolettabsorptionsspektrum, durch
ein Röntgendiagramm und andere Methoden bestimmt werden. Man kann auch das kristalline
Material oder nicht kristalline Extrakte mit der Papierchromatogrammethode nach
Zaffaroni identifizieren.
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Besonders günstig erfolgt die Trennung der nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren hergestellten Oxydationsprodukte durch Chromatographie der Extrakte oder
festen Substanzen über Aluminiumoxyd (A1203) oder anderen Substanzen, wobei z. B.
Benzol als Lösungsmittel verwendet wird und verschiedene Lösungsmittel oder deren
Mischungen zum Entwickeln des Chromatogrammes dienen. Die festen Substanzenwerden
durch Verdampfen derExtraktionsflüssigkeit erhalten und können noch umkristallisiert
werden. Diese Methode ist zur Identifizierung der durch die Oxydation hergestellten
Stoffe besonders geeignet, da jede Fraktion der Säule nach der Methode von Zaffaroni
geprüft werden kann. Durch ein Papierchromatogramm nach Zaffaroni können so kleine
Mengen wie =o bis 40 y der Substanz identifiziert . und Fraktionen, die die gleichen
chemischen Stoffe enthalten, vereinigt werden.
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Die Methode von Z a f f a r o n i , soweit sie in der Beschreibung
und den Beispielen erwähnt wird, beruht zum Teil auf der verschiedenen Polarität
der zu prüfenden Stoffe (vergl. Burton, Zaffaroni und Keutmann, »A New Analytical
Method for Adrenal Cortical Hormones«, Science, Bd. iio [=9q.97, S. q.¢2, und Zaffaroni,
Burton und Keutmann, Science, Bd.111 [195o]), S.6. Daß verschiedene Stoffe verschiedene
Polarität aufweisen, ist seit langem bekannt, jedoch ist gegenwärtig die Methode
von Zaffaroni die einzige praktisch durchführbare, um Unterschiede in der Polarität
zur Identifizierung kleiner Mengen von Steroiden auszunutzen. Diese Methode erwies
sich als sehr große Hilfe bei den Untersuchungen der biochemisch oxydierten Steroide
sowie zur Identifizierung neuer und bisher unbekannter oxydierter Steroide.
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Die Methode von Zaffaroni und Mitarbeitern ist eine Abart der bekannten
»Papierstreifenchromatographie«.
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Zuerst wird ein Filterpapier entsprechender Sorte, 7,5 bis =o cm breit
und ungefähr 56 cm lang, an einer 7,5 cm von einem Ende abstehenden Stelle gefaltet.
An einer Stelle, welche sich q. cm unterhalb der Faltung befindet, wird eine Linie
quer über das Filterpapier gezogen, wodurch die Stelle angegeben wird, an welcher
die zu prüfenden Steroide auf das Filterpapier aufgetragen werden. Das Filterpapier
wird dann der Länge nach in ungefähr i cm breite Streifen geschnitten, und zwar
vom entgegengesetzten Ende, bezogen auf die Stelle, an der das zu untersuchende
Steroid aufgetragen wird. Es entstehen dadurch mehrere Papierstreifen, welche einen
gemeinsamen Kopf besitzen, welcher nicht durchgeschnitten ist. Auf j eden dieser
Streifen kann eine gesonderte »Spurenfolge« für jeden »Tüpfel« des zu prüfenden
Stoffes entstehen, wie aus den folgenden Ausführungen klarer ersichtlich wird. Das
Filterpapier braucht. auch nicht in Streifen zerschnitten zu werden, und man kann
einen einzelnen Streifen verwenden. In diesem Falle jedoch muß darauf geachtet werden,
daß die Tüpfel der zu prüfenden Stoffe nicht zu nahe aneinander, z. B. nicht näher
als ungefähr 2,5 cm auf den Filterpapierstreifen aufgetragen werden. Dann wird ein
Lösungsmittelgemisch gewählt, dessen bewegliche Phase aus einem urpolaren Lösungsmittel
und dessen ortsfeste Phase aus einem polaren Lösungsmittel besteht, z. B. Benzol
als urpolares und Formamid als polares Lösungsmittel oder Toluol als urpolares und
Propylenglycol als polares Lösungsmittel. Für manche Zwecke hat sich Diäthylenglykolmonoäthyläther
(bekannt als »Carbitol«) als ortsfeste, polare Phase und Methylcyclohexan als bewegliche,
urpolare Phase bestens bewährt.
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Das Filterpapier wird mit dem polaren Lösungsmittel, z. B. mit Propylenglykol,
getränkt, und der überSChuß wird mittels frischen Filterpapiers, einer Presse, einer
gewöhnlichen Wäschewinde oder in irgendeiner anderen Weise entfernt. Das urpolare
Lösungsmittel (auch »Entwickler« genannt), welches die bewegliche Phase bildet,
in diesem Falle Toluol, wird mit dem polaren Lösungsmittel gesättigt.
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Ein Glasgefäß, z. B. das eines galvanischen Elementes, mit entsprechenden
Ausmaßen, z. B. 30 X 45 cm, welches ioo cm3 des urpolaren Lösungsmittels
enthält, wird mit einem großen, mit dem zu verwendenden polaren Lösungsmittel, z.
B. Propylenglykol, getränkten Blatt Filterpapier- ausgekleidet. Ein innerhalb des
Glases befindlicher Ringständer trägt eine Entwicklerschale, welche 350 cm3
der beweglichen Phase, d. h. der Entwicklerflüssigkeit, z. B. Toluol, enthält, welches
mit der polaren Flüssigkeit, z. B. Propylenglykol, gesättigt ist. Der gemeinsame
Kopf des unterteilten Filterpapiers wird in den Vorratsbehälter der Entwicklerflüssigkeit,
z. B. urpolares Lösungsmittel, welches mit Propylenglykol gesättigt ist und die
bewegliche Phase bildet, eingetaucht.
Das zu prüfende Steroid, in
Methanol -oder Chloroform gelöst, wird mittels einer Mikropipette in einer Menge
von ungefähr io bis 300 y auf eine Stelle ungefähr. 4 cm unterhalb der Faltung
aufgetragen, nachdem die Filterpapierstreifen geschnitten und mit der stationären
Phase, z. B. Propylenglykol, getränkt wurden, jedoch bevor noch der gemeinsame Kopf
der Streifen in den Vorratsbehälter eingetaucht wird. Das Gefäß wird dann mit einem
Glasdeckel verschlossen und mit einem Glycerin-Stärke-Kitt abgedichtet, welcher
aus g g löslicher Stärke und 30 g Glycerin durch Erhitzen bei 14o° bis zum Erreichen
einer durchsichtigen Konsistenz hergestellt werden kann.
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Die Flüssigkeit, welche die bewegliche Phase bildet, fließt durch
Adsorption über das herabhängende Filterpapier und »entwickelt« dadurch den Streifen.
Diese Streifen werden je nach. dem verwendeten Lösungsmittelgemisch und dem zu untersuchenden
Steroid 4 bis 72 Stunden oder noch länger entwickelt. Nach beendeter Entwicklung
werden die Filterpapierstreifen bei Zimmertemperatur mittels eines Ventilators getrocknet
und dann mit einer Lösung von io cm3 1/1o n-Silbernitrat (AgN03), welcher io Tropfen
konzentriertes Ammoniak und 5 cm3 einer 5°/oigen Natriumhydroxydlösung zugegeben
wurden, behandelt. Die Stellen auf dem Filterpapierstreifen, welche Steroide enthalten,
erhalten dadurch eine braune bis schwarze Färbung. Das Waschen des Filterpapiers
mit einer io°/oigen Natriumthiosulfatlösung (Na. S203) verhindert eine weitere Einwirkung
des Silbernitrates und löst das- Silberoxyd (Ag20), wodurch ein erheblicher-Farbenkontrast
zwischen der Steroidspur und dem Filterpapiergrund entsteht. Die Silbernitratentwicklung
ist zur Identifizierung von Steroiden, welche reduzierende Gruppen, wie etwa eine
Ketolseitenkette enthalten, anwendbar, was z. B. bei den Adrenonebennierenrindenhormonen
der Fall ist. Andererseits können nach N ain e s und D r ak e, Fed. Proc. Soc. Biol.
Chem., Bd. g, S. 180 (195o) manche der Steroidflecken durch ihre Eigenschaft,
ultraviolettes Licht zu absorbieren, sichtbar gemacht werden. Diese Entwicklung
kann in den Fällen angewandt werden, wenn die Steroide ein System von konjugierten
Doppelbindungen, z. B: Progesteron, besitzen.
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Es wurde festgestellt" daß der Steroidtüpfel, welcher sich ursprünglich
an der Auftropfstelle befindet, mit der beweglichen Phase gewandert ist, und zwar
eine Strecke, welche umgekehrt proportional zu seiner Anziehung zu der ortsfesten
Phase ist, in Abhängigkeit von -seinem Verteilungskoeffizienten zwischen den beiden
Lösungsmitteln und dem Filterpapier und dem Adsorptions-Eluierungskoeffizienten.
Die Affinität der ortsfesten Phase, z. B. zum Propylenglykol, ist bei Steroiden
mit der größten Anzahl von Hydroxylgruppen am größten, und deshalb wandern die Spuren
dieser Stoffe langsamer von der Auftropfstelle weg als Steroide, welche eine kleinere
Anzahl von Hydroxylgruppen enthalten. Desoxycorticostergn mit 3 Sauerstoffatomen
wandert unter den bekannten Corticosteroiden am schnellsten, während Corticosteroide,
welche 4 Sauerstoffatome enthalten, langsamer wandern. Corticosteroide mit 5 Sauerstoffatomen
wandern unter den bekannten Corticosteroiden am langsamsten. Die folgende Tabelle
I enthält eine Aufstellung einiger bekannter Corticosteroide in einer Reihenfolge
in Abhängigkeit von der Anzahl ihrer Sauerstoffatome und ihrer Beweglichkeit:.
| Tabelle I |
| Bezeichnung |
| 2 O Progesteron |
| 3 O ii-Desoxycorticosteron |
| i7-Oxyprogesteron |
| 4 O ii-Dehydrocorticosteron |
| z7-Oxy-ii-desoxycorticosteron (S) |
| Corticosteron |
| O - i7-Oxy-ii-dehydrocorticosteron (E) |
| i7-Oxycorticosteron (F) |
Ein Vergleich einiger Lösungsmittelsysteme in bezug auf die Identifizierung einiger
Steroide, welche eine verschiedene Anzahl von Sauerstoffatomen enthalten, wird in
Tabelle II gemacht, aus welcher ersichtlich ist, daß ein Gemisch aus Diäthylenglykolmonoäthyläther
(bekannt unter der Handelsbezeichnung »Caxbitol«) als ortsfeste Phase und Methylcyclohexan
als bewegliche Phase fähig ist, Steroide; welche schwächer polar sind und daher
schneller wandern als Corticosteron, zu differenzieren und zu identifizieren, während
das Propylenglykol-Toluol-Lösungsmittelgemisch diesbezüglich nicht so wirksam ist.
| Tabelle II |
| Beweglichkeiten einiger Steroide in Papier- |
| chromätogrammen |
| (Absteigende Reihenfolge der Beweglichkeiten)i) |
| Propylenglykol-Toluol. »Carbitolcc-Methylcyclohexan |
| Progesteron |
| Androstendion |
| Testosteron |
| ii-Desoxycorticosteron ii-Desoxycorticosteron |
| i7-Oxyprogesteron i7-Oxyprogesteron |
| ,ii-a-Oxyproges'teron 2o a-2i-DiOxy-4-pregnen- |
| 3-on3) - |
| Corticosteron 2o ß-2i-Dioxy 4-pregnen- |
| 3-on3 |
| i7-Oxy-ii-desoxycorti- ii a-Oxyprogesteron |
| costeron (S)2) |
| 2o a-2i-Dioxy-4- i7-Oxy zi-desoxycorti- |
| pregnen-3-on2) costeron (S) 3) |
| 2o ß-2i-Diöxy-4- |
| pregnen-3-on |
| i) Reihenfolge der Beweglichkeiten OH > Ester > Ketone |
| an jeder Stelle und bei allen Verbindungen, |
| z) Nicht unterscheidbar in diesem System. |
| 3) Unterscheidbar in diesem System. |
| (Noch Tabelle II) |
| Propylenglykol-Toluol »Carbitolc@=Methylcyclohexan |
| i7-Oxy-ii-dehydrocorti- |
| costeron (E) |
| Dioxyprogesteron |
| 17-Oxycorticosteron (F) |
| (schneller wandernde (Steroide wandern schneller |
| Steroide am Anfang als in der linken Kolonne, |
| der Tabelle) schneller wandernde |
| Steroide am Anfang der |
| Tabelle) |
Jeder Tüpfel am Papierchromatogramm dient zur Identifizierung eines einzelnen Steroides,
wobei die schwächer polaren Stoffe sich schneller bewegen und zu einer Stelle wandern,
welche vom Auftropfpunkt weiter entfernt ist als die stärker polaren, weitgehender
oxydierten Steroide, welche im selben Versuch geprüft werden. Dadurch ist es nicht
nur möglich, die zu prüfenden Steroide qualitativ zu identifizieren, sondern man
ist auch in der Lage, durch Vergleich mit einem entsprechenden Kontrolltüpfel einer
bekannten Substanzmenge die ungefähre Menge des Stoffes zu bestimmen. Es ist somit
möglich, ungefähr den Umwandlungsgrad eines bestimmten Ausgangssteroides in verschiedene,
höher oxydierte Derivate zu bestimmen, da, zumal die Menge des Steroides, welche
ursprünglich auf den Filterpapierstreifen aufgetropft wurde, bekannt ist, lediglich
eine einfache Betrachtung der Anzahl der Spuren verschiedener höher oxydierter Steroide
und der Vergleich der relativen Helligkeit bzw. Dichte notwendig ist, um die Umwandlungsart
und die Ausbeuten der von den Steroiden durch Biooxydation oder anderswie erhaltenen
Umwandlungsprodukte erkennen zu können. Die folgenden Beispiele dienen der.Erläuterung
des Verfahrens. Beispiel i Oxydation von Progesteron Zu 41 einer 32 bis 48 Stunden
alten Zucht der Pilzkultur RH 176 (Rhizopus arrhizus) wurde i g Progesteron, gelöst
in
50 cm3 Aceton, gegeben und damit eine Suspension in der Nährbodenflüssigkeit
der Kultur hergestellt. Die Kultur wurde dann bei Zimmertemperatur 48 Stunden bebrütet.
Nach Verlauf dieser Zeit betrug der p$-Wert des Nährbodens ungefähr 3,5, und die
Fermentationsflüssigkeit und das Myzel wurden nacheinander dreimal mit 1
1,
einmal mit 2 1 und einmal mit 1 1 Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridextrakte
wurden vereinigt und zweimal mit je 400 cm3 einer 2e/oigen wäßrigen Natriumbikarbonatlösung
und dreimal mit je
500 cm3 destilliertem Wasser gewaschen. Das Methylenchlorid
wurde im Vakuum abdestilliert und der trockene Rückstand in 50 cm3 Methylenchlorid
aufgenommen. Die Lösung wurde in ein Becherglas von ioo cm3 gebracht- und mittels
eines Luftstromes verdampft. Der feste Rückstand, 1,585 g, wurde in 5 cm3 heißem
Methanol gelöst und langsam auf Zimmertemperatur abgekühlt. Es fielen 75 mg Kristalle
mit einem Schmelzpunkt von 245 bis 24g° aus. Die Kristalle wurden in 5 cm3 Methanol
gelöst, die Lösung filtriert und abgekühlt, wodurch 23 mg Kristalle mit einem F.
von 246 bis 248° erhalten wurden. Bei Anwendung der schon beschriebenen Papierchromatogrammethode
nach Z a f f a r o n i , unter Benutzung von Diäthylenglykohnonoäthyläther als ortsfeste
Phase und Methylcyclohexan als bewegliche Phase erhielt man nur einen einzigen Tüpfel.
-
Analyse
| Berechnet für Progesteron ....... C 80,23 H
9,55 |
| berechnet für Dioxyprogesteron . . C 72,8 H 8,7 |
| gefunden ..................... C 72,8 H 8,6 |
Die Infrarotanalyse zeigte mehr als eine Hydroxylgruppe neben der ursprünglichen
3-Keto-, d 4- und 2o-Keto-Struktur des Progesterons an.
-
Die Acetylierung von g mg mit 0,3 cm3 Pyridin und 0,3 cm3 Essigsäureanhydrid
ergab nach 16 Stunden bei Zimmertemperatur und nach Zusatz von 12,5 cm3 Wasser 6,7
mg kristallisiertes Diacetat mit einem F. = 154 bis 155°. Infrarotuntersuchungen
dieses Stoffes zeigten die Abwesenheit der Hydroxylgruppen und die Anwesenheit neuer
Acetoxygruppen an.
-
Die Mutterlauge des ersten kristallinen Stoffes, 1,5 g, wurde vom
Lösungsmittel befreit, in 50 cm3 Benzol gelöst und über Aluminiumoxyd (A1203)
chromatographiert, wie aus Tabelle III zu ersehen ist. 50 g mit Säure gewaschenes
Aluminiumoxyd, getrocknet bei 45°, wurden als Adsorbens verwendet, und die Säule
wurde mit Teilen von j e ioo cm3 Lösungsmittel entwickelt (s. Tabelle III). Auf
Grund von Untersuchungen mittels Papierchromatogramm nach Z a f f a r o n i wurde
gefunden, daß die Fraktion A nur eine Spur ergab und in den Fraktionen 2i bis 33
auftrat.
-
Die Fraktion A wurde in 2 cm3 heißem Methanol gelöst und filtriert.
Nach Kühlen über Nacht wurden 171 mg Kristalle eines Stoffes mit einem F. = 166
bis 167° erhalten. Nach einer Umkristallisierung aus 3 cm3 Methanol erhielt man
98,7 mg mit F. = 166 bis 167° und einer spezifischen Drehung [a]10
= -f- i75,9 (c = 1,o127 in Chloroform).
-
Analvse
| Berechnet für Monooxyprogesteron C 76,4 H g,io |
| gefunden ..................... C 76,66 H 8,g2 |
Infrarotuntersuchungen zeigten die Anwesenheit einer Hydroxylgruppe im ursprünglichen
Progesteron.
-
Die Hydroxylgruppe liegt in ii-Stellung, wie durch Oxydation einer
Lösung von
30 mg des Stoffes in 0,5 cm3 Eisessig mit 5. mg Chromoxyd (Cr03)
in i cm3 Eisessig und 5 mm3 Wasser nach istündigem Stehen bei Zimmertemperatur festgestellt
wurde. Einige Tropfen Methanol wurden dann zugefügt, und nach io Minuten wurde das
Methanol auf 45 cm3 mit Wasser verdünnt, die Lösung dreimal mit je 15 cm3 Methylenchlorid
extrahiert und schließlich das Methylenchlorid abgedampft. Der Rückstand wurde aus
0,5 cm3 Methanol in einer Ausbeute von ig mg umkristallisiert, und das erhaltene
Triketon besitzt einen F. = 172 bis i75° und eine spezifische Drehung von [a]
D = + 227°
(in
Chloroform). Die Struktur wurde durch Infrarotuntersuchungen
festgestellt, wobei sich herausstellte,
| Tabelle III |
| Ah 03 Chromatographie von auf biologischem Wege oxydiertem
Progesteron |
| Verwendung von Rhizopus arrhizus |
| Gewicht |
| Fraktion Lösungsmittel des . Papierchromatogramm- |
| Rückstandes untersuchung |
| in mg |
| i Benzol ............................ o |
| 2 Benzol ........................... 182,2 keine Spur |
| 3 Benzol -f- 50[, Äther .............. 123,0 |
| 4 Benzol + 50% Äther ............... 246,6 keine Spur |
| 5 Benzol + io0% Äther .............. 162,9 |
| 6 Benzol + io% Äther .............. 18,o |
| 7 Benzol + io% Äther .............. 11,2 |
| 8 Benzol + 50°/0 Äther .............. =28,2 keine Spur |
| 9 Benzol + 50°/o Äther .............. 33,6 |
| 10 Äther ............................ 16,1 |
| ii Äther ............................ 15,4 |
| 12 Äther + 5% CHC13 ................ 3,8 |
| 13 Äther -f- 5% CHCl3 ............... 2,0 |
| 14 Äther -f- io% CHC13 . . . . . . . . . . . . . . . 3,4 |
| 15 Äther + io% C H C13 ............... 3,6 |
| 16 Äther -f- 50% CHC13 ............... 3,5 |
| 17 Äther + 500% C H Cls ............... 2,1 ' |
| 18 CHC13 ..:............:........... 2,5 |
| i9 CHCl3 ........................... 222,6 |
| 20 CHCl3 -f- 5% .Aceton .............. 167,9 }A nur
eine Spur ist stärker polar als |
| 21 CHC13 + 5% Aceton .............. 23,5 Progesteron.
Eine Mischung zweier |
| Spuren. i ähnlich der Fraktion 2o, |
| die andere stärker polar als Frak- |
| tion 2o. |
| 22 CHC13 + io% Aceton .... . ........ 17,3 |
| 23 CHC13 -E- io% Aceton ... : ......... 8,7 ' |
| 24 CHCl3 + 50% Aceton ............. 30,9 nur die am
langsamsten wandernde |
| ' Spur |
| 25 CHC13 -E- 5o0/, Aceton ............. 6,1 |
| 26 . Aceton ........................... 13,0 nur die am langsamsten
wandernde |
| Spur |
| 27 Aceton ........................... 8,4 |
| 28 Aceton + 5% Methanol ........... 25,0 |
| 29 Aceton + 5% Methanol ........... 4,6 - |
| 30 Aceton + io% Methanol ........... 7,4 |
| 31 Aceton -E- io% Methanol ........... 1,4 |
| 32 Aceton + 50% Methanol ........... 8,1 |
| 33 Aceton -f- 50% Methanol ........... 5,3 |
daB die neuen Ketogruppen sich lediglich in 1-, 7-, ii- und i2-Stellung befinden.
Es ist kein natürliches oder synthetisches i-Ketosteroid bekannt. Die physikalischen
Konstanten des Oxyprogesterons stimmen mit jenen des i2 a-Oxyprogesterons nicht
überein {F. = Zoo bis 2o3°; [ä] D = -I- 205° (c = i,o in Aceton), . (Wettstein,
Helv. Chim. Acta, Bd. 31, S. 1963 [1945j) oder mit i2ß-Oxyprogesteron {F. = 164
bis 167°, nach Abkühlen Wiederschmelzen bei i95 bis 198°, [a] D = + 2o5°, (c = 0,502
in Aceton), (Reichstein, Helv. Chim. Acta, Bd. 36, S. 2261, [1942])., somit kommen
nur noch die 7- und ii-Stellung für die neue Ketogruppe dieses Stoffes in Frage.
-
Ein Vergleich der physikalischen Konstanten deutet darauf hin, daB
das Triketon ein ii-Ketoprogesteron ist. (F. = 172 bis 175°; [uA = -I- 238°
± 8° (c = o,9 in Aceton), (Reichstein, Helv. Chim. Acta, Bd. 23, S. 684, [i94o],
und Bd. 26, S. 721, [ig42j)@. Ein Vergleich mit reinem ii-Ketoprogesteron mittels
Infrarotanalyse (Fig. i), Röntgendiagramm (Fig. 2),
Papierchromatographie
(nach Z a f f ar o n i) und Schmelzpunktbestimmungen ergaben, daB der Stoff mit
reinem ii-Ketoprogesteron identisch ist.
-
Die physikalischen Konstanten des Stoffes mit F.= 166 bis z67°
stimmen mit denjenigen von iip-Oxyprogesteron nicht überein. Demzufolge muB er ein
ii a-Oxyprogesteron sein.
-
2o mg dieses Stoffes wurden mit o,6 cm3 Essigsäureanhydrid in o,6
cm3 Pyridin acetyliert. Nach 16stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wurden 24 cm3
Wasser zugefügt. Nach i Stunde wurde die Mischung gekühlt. Die entstandenen Kristalle
wurden mit Wasser gewaschen und getrocknet; die Ausbeute betrug 16,1 mg des Monoacetates
mit einem F. = 175 bis 177°. Die Infrarotanalyse zeigte die Abwesenheit der Hydroxylgruppe
und die Anwesenheit einer neuen Acetoxygruppe an.
| Berechnet für Monoacetoxypro- |
| gesteron ................... C 74,o H 8,85 |
| gefunden .................... C 7q.,33 H 8,78 |
Beispiel 2 Oxydation von Progesteron Einer 24 Stunden alten Zucht der Pilzkultur
RH 176 (Rhizopus-arrhizus-Stamm) in 41 Nährbodenlösung wurde i g Progesteron, gelöst
in 5o cm3 Aceton, zugefügt. Nach 24stündigem Bebrüten und Schütteln in Gegenwart
von Luft wurde die Fermentationsflüssigkeit wie im Beispiel i extrahiert. Die Methylenchloridauszüge
wurden zweimal mit je 3oo cm3 2%iger Natriumbikarbonatlösung und zweimal mit je
500 cm3 destilliertem Wasser gewaschen, die vereinigten Auszüge mit möglichst
wenig wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und 6 cm3 dieser Lösung, welche 2 mg
des ursprünglichen Progesterons entsprechen, für Papierchromatogrammuntersuchungen
nach Zaffaroni unter Benutzung derselbenLösungsmittel wie im Beispiel i verwendet.
Die Methylenchloridlösung wurde in einem Luftstrom zur Trockne abgedampft. Der feste
Rückstand (1,584'9) wurde in ioo cm3 Benzol gelöst und 145 mg unlöslicher Anteil
abfiltriert. Der Schmelzpunkt dieses Stoffes betrug 190 bis 23o°. Durch Lösen des
unlöslichen Anteiles unter Erwärmung in 2o cm3 Aceton, Eindampfen der Lösung auf
io cm3 und Abkühlung wurden go mg eines Stoffes vom F. = 23o bis 2q.0° erhalten.
Durch Papierchromatogramm und Schmelzpunktbestimmung wurden die Kristalle als eine
Dioxyverbindung identifiziert. Das Filtrat, welches 1,439 g gelöst enthielt,wurdeüber
eineAluminiumoxydsäule (TabelleIV) in der im Beispiel i angegebenen Weise chromatographiert.
Die Fraktion B der chromatographischen Trennung (Tabelle IV), welche 571 mg ii a-Oxyprogesteron
enthielt, wurde in 2o cm3 Methanol gelöst, 2o cm3 Wasser zugefügt und gekühlt.
| Tabelle IV |
| A1203 Chromatographie von auf biologischem Wege oxydiertem
Progesteron |
| Verwendung von Rhizopus arrhizus |
| Gewicht |
| Fraktion des Papierchromatogramm- |
| Nr. Lösungsmittel Rückstandes untersuchung |
| in mg |
| 1 Benzol............................ 2o8 |
| 2 Benzol............................ 12 |
| 3 Benzol -f- 50/0 Äther ............ 4 |
| 4 Benzol + 50% Äther ............ 14 |
| 5 Benzol + io0% Äther ............ 37 |
| 6 Benzol + io% Äther ............ ig |
| 7 Benzol + 5% Äther ............ 7 |
| 8 Benzol + 50% Äther ............ ig |
| g Äther ............................ 4 |
| io Äther ..:......................... 16 |
| 11 Äther -f- 50/a CHCl3 ............ 8 |
| 12 Äther -E- 50/, C H C1............. 4 |
| 13 Äther + io% C H C1............. o |
| 14 Äther -f- io% CHC1............. o |
| 15 Äther + 50% CHC1............. 4 |
| 16 Äther + 5o0/0 CHC1............. 2 |
| 17 CHC13 ........................... i1 |
| 18 C H C13 ........................... 265 einzige Spur
von 11 a-Oxypro- |
| gesteron mit Spuren von drei |
| ig CHC13 + 5% Aceton ............ 235 B anderen langsamer
wandernden |
| 20 CHC13 + 5% Aceton ............ 6o Stoffen. |
| 21 CHC13 + io% Aceton ............ 16 |
| Gewicht |
| Fraktion Lösungsmittel des Papierchromatogramm- |
| Nr. Rückstandes untersuchung |
| in mg - |
| 22 CHCl3 -E- io% Aceton ............. 22 Mischung von
Oxyprogesteron mit |
| 23 C H C13 + 50% Aceton ............. 27 zwei stärker
polaren Stoffen, F'rak- |
| 24 CHC13 -f-. 50% Aceton ............ 37 tion 24 dieselbe
wie Fraktion 22, |
| 25 Aceton ........................... 29 jedoch zwei
Spuren schwächer |
| 26 Aceton ......... . . . . . . . . . . . . . . . 43
und eine dritte und vierte stärker. |
| 27 Aceton -@- 5°/o Methanol.......... i6 Stoff schwächer
polar als- die zwei |
| Spuren in Fraktion 22, jedoch |
| 28 Aceton + 5% Methanol.......... 24 - stärker polar als iia-Oxypro- |
| 2g Aceton + io% Methanol.......... 4 gesteron. |
| 30 Aceton + io% Methanol.......... o . |
| 31- Aceton +5o0/, Methanol .......... 1 |
| 32 Aceton + 50% Methanol .......... 23 |
| 33 Methanol ......................... 9 |
Nach Zusatz von weiteren 2o em3 Wässer wurde weitergekühlt. Durch Kristallisation
erhielt man
300 mg iia-Oxyprogesteron mit F. = 165 bis i66°. Beispiel 3 Oxydation
von Progesteron Eine i-cmg Aufschwemmung von Sporen (conidia) einer 5 Tage alten
io-cm3-Pilzkultur einer Nährbodenplatte, bestehend aus Malz, Agar und Lactalbunninauszug
in einer sterilen physiologischen Salzlösung, wurde zum Impfen von 15o cm3 einer
sterilen Nährbodenlösung, bestehend aus 2%Lactalbuminauszug, 5 % Dextrose und 0,5
% Maisquellwasser in Leitungswasser, verwendet. Diese 150 cm 3 Pilzkultur wurden
24Stunden geschüttelt und belüftet, wodurch ein starkes vegetativesWachstum gefördert
wurde. ioo cm3 dieser vegetativen Pilzzucht wurden zu 41 steriler Näbrbodenlösung
zugefügt, diese 24 Stunden geschüttelt und belüftet, dann wurden 4 g Progesteron
in 40 cm3 Methanol zugefügt und die Belüftung fortgesetzt. Nach 24 Stunden 45 Minuten
wurde die Nährbodenlösung mittels Extraktion mit Methylenchlorid wie im Beispiel
i abgesondert, wobei insgesamt 4 1 Methylenchlorid verwendet wurden. Die Methylenchloridlösung
wurde konzentriert, wodurch 4,38 g Rückstand erhalten wurde. Dieses Material . wurde
nach der im Beispiel i beschriebenen Weise chromatographiert und ergab folgende
Fraktionen:
| Fraktionen Zusammensetzung Gewicht |
| (g) |
| Benzol unlöslich Dioxyprogesteron ..... o,635 |
| 14 bis 16 Progesteron .......... o,694 |
| 2o bis 22 ii a-Oxyprogesteron ... 1,994 |
| 23 bis 25 Nachzügler (Mono- und |
| Dioxyverbindungen). 0,437 |
Die das iia-Oxyprogesteron enthaltende Fraktion wurde in 15 cm3 warmem Methanol
gelöst, 2 cm3 Wasser zugefügt und die Lösung filtriert. Nach Abkühlen über Nacht
wurden 1,15 g eines kristallinen Stoffes mit F. = 163 bis i66° erhalten. Die Ausbeute
an kristallinem iia-Oxyprogesteron betrug 29%.
-
Beispiel 4 Oxydation von ii-Desoxy-i7-oxycorticosteron (Verbindung
S) Eine 16 Stunden alte Pilzkultur RH 176 (Rhizopus arrhizus), welcher i g der Verbindung
S in 50 cm3 Methanol zugegeben wurde, wurde 4 Stunden bei Zimmertemperatur
unter Luftzutritt bebrütet.
-
Die Fermentationsflüssigkeit mit einem pH-Wert von 3,8 wurde zuerst
mit 21 Methylenchlorid und dann noch dreimal mit je 11 Methylenchlorid extrahiert.
Die Extrakte wurden vereinigt und je zweimal mit 500 cm3 einer 2%igen Natriumbicarbonatlösung
gewaschen. Die Auszüge wurden vereinigt und dann zweimal mit j e 50o em3 destilliertem
Wasser gewaschen. Die gewaschenen Methylenchloridauszüge wurden mit möglichst wenig
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Luftstrom verdampft. Ein kleiner
Teil des Rückstandes wurde Papierchromatogranununtersuchungen unterworfen, wobei
sich herausstellte, daß eine neue, langsam wandernde Spur neben einer anderen erschien.
Der übrige Rückstand, 1,5286 g, wurde in Benzol gelöst und über A1203 chromatographiert,
wie aus Tabelle V zu ersehen ist. Die Fraktion C bildet den Hauptanteil.- des Chromatogrammes.
Die Fraktion C, 376,5 mg, wurde in 2 cm3 heißem Methanol gelöst und filtriert. Mittels
eines Stickstoffstrorxles wurde das Volumen, auf 1,5 Cm3 vermindert, wonach 152
mg Kristalle ausfielen mit dem F. = 198 bis 2io°. Nach Umkristallisierung in i cm3
heißem Methanol erhielt man 35,6 mg mit F. = 223 bis 226'; nochmaliges Umkristallisieren
ergab einen F. = 222 bis 225°. Diese Verbindung enthielt Sauerstoff in der ii-Stellung
des Steroidringsystems.
-
. Analyse:
| Berechnet für z7-Oxycorticosteron C 69,5 H 8,28 |
| gefunden ..................... C 69,66 11 8,2o |
| Tabelle V |
| A1203 = Chromatographie von auf biologischem Wege oxydiertem
ii-Desoxy-i7-oxycorticosteron (S) |
| Verwendung von Rhizopus arrhizus |
| Gewicht |
| Fraktion Lösungsmittel des Papierchromatogramm- |
| Nr. Rückstandes untersuchung |
| in. mg |
| i Benzol ........................... 281,5 |
| 2 Benzol ......................... 47,9 |
| 3 Benzol + 5 0% Athyläther ........ 78,4 |
| 4 Benzol + 5% Äthyläther ........ 58,5 |
| 5 Benzol + io 0% Äthyläther ........ 12,0 |
| 6 Benzol + io 0% Äthyläther ........ 0,8 |
| 7 Benzol + io % Äthyläther ........ 2,3 |
| 8 Benzol +5001, Äthyläther ........ 4,2 |
| g Benzol +5001, Äthyläther ........ 5,6 |
| 10 Äther ............................ 7,0 |
| 11 Äther ............................ 7,6 |
| 12 Äther + 5% CHC13 ............ 2i,6 keine Spuren |
| 13 Äther + 50% CHCl3 ............ 3g,9 A desgl. |
| 14 Äther + io% CHCls ............ 32,5 desgl. |
| 15 Äther + io% CHCls ............ 15,7 desgl. |
| 16 Äther +500/, CHCls ............ 7,9 |
| 17 Äther + 50% CHCls ............ 15,2 |
| 18 C H C13 ........................... 76,2 B keine
Spuren |
| ig CHC13 ........................... 53,3 desgl. |
| 20 CHCls + 50% Aceton ........... 20,1 desgl. |
| 21 C H C13 +. 50/, Aceton ........... 6,4 |
| 22 CHCls + io0% Aceton ........... 3,6 |
| 23 CHC13 + io% Aceton ........... 2,2 |
| 24 C H C13 + 500/, Aceton ........... 7,5 |
| 25 C H C13 +500/, Aceton ........... g,o |
| 26 Aceton ........................... 22,5 |
| 27 Aceton ........................... ig,i |
| 28 Aceton + 5)/, Methanol ......... 62,9 langsam
wandernde Spur |
| 2g Aceton + 501, Methanol ......... 43,7
C desgl. |
| 30 Aceton + io % Methanol ......... 46,1 desgl. |
| 31 Aceton + io % Methanol ......... 27,8 desgl. |
| 32 Aceton +5o0/, Methanol ......... 44,4 desgl. |
| 33 Aceton + 50% Methanol ......... 14,1 desgl. |
Beispiel 5 Oxydation von i7a-Oxyprogesteron Eine 24 Stunden alte Pilzkultur RH 176
(Rhizopus arrhizus), zu welcher
19 17a-Oxyprogesteron in
50 cms Methanol
gegeben wurde, wurde 48 Stunden bei Zimmertemperatur unter Luftzutritt bebrütet.
-
Die Fermentationsflüssigkeit (px = 3,6) wurde zuerst mit 21 Methylenchlorid
und dann noch dreimal mit je i l desselben Lösungsmittels extrahiert. Die Extrakte
wurden vereinigt und zweimal mit
500 cms 2 %iger Natriumbicarbonatlösung
gewaschen. Die Auszüge wurden vereinigt und zweimal mit je
500 cms destilliertem
Wasser gewaschen. Der gewaschene Methylenchloridauszug wurde sodann mit möglichst
wenig wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann das Methylenchlorid im Vakuum
abdestilliert. Ein kleiner Teil des Rückstandes zeigte bei Papierchromatogrammuntersuchungen
das Vorhandensein von drei Spuren an, welche nicht dem i7a-Oxyprogesteron zugeordnet
werden konnten. Der gesamte feste Rückstand, 1,8849 g, wurde in Benzol gelöst und
über A1203 chromatographiert, wie aus Tabelle VI zu ersehen ist. Es überwog die
Fraktion B, aus der
307 mg aus i cm3 heißem Methanol auskristallisiert
wurden.
Nach Abkühlung wurden 61 mg F. = 178 bis 2io° erhalten. Eine Umkristallisierung
aus 0,5 cm3 Methanol ergab 25 mg mit F. _ Zig bis 222°. Nochmaliges Umkristallisieren
lieferte reine Kristalle mit einem F. = 22o bis 223°. Diese Verbindung erwies sich
als iia, i7a-Dioxyprogesteron mit einer optischen Drehung [a]ö
= +76° (i1323
in Chloroform) und einer Ultraviolettextinktionk 243 von 46;67. Analyse
| Berechnet für |
| zia, i7a-Dioxyprogesteron ... C 72,8 H 8,6o |
| gefunden .................... C 73,oi H - 8,65 |
Die Oxydation des thermostabilen iia, i7ä-Dioxyprogesterons in Eisessig mit Chromtriöxyd
ergab i7a-Oxy-4-pregnen-3, ii, 2o-trion.
| Tabelle VI |
| A1203 Chromatographie von auf biologischem Wege oxydiertem
17a-Oxyprogesteron |
| Verwendung von Rhizopus arrhizus |
| Gewicht |
| Fraktion des Papierchromatogramm- |
| Nr. Lösungsmittel Rückstandes untersuchung |
| in mg |
| i Benzol ........................... .357,8 keine Spuren |
| 2 Benzol ......................... ... 46,o |
| 3 Benzol + 504 Athyläther ........ 5,0 |
| 4 Benzol + 5% Äthyläther -........ 14,0 |
| 5 Benzol -f- io % Äthyläther ........ ig,o |
| 6 Benzol + io % Äthyläther ........ 1717 |
| 7 Benzol + io % Äthyläther . . ...... 12,2 |
| 8 Benzol + 500/, Äthyläther ........ 414 |
| g Benzol + 50% Äthyläther ........ 58,7 |
| 10 Äther ............................ 72,3 i7a-Oxyprogesteron |
| i1 Äther ............................ 72,2 A |
| 12 Äther -f- 5% CHCl3 ........... 47,9 |
| 13 Äther + 50/, C H C13 ........... 28,2 |
| 14 Äther + io % CHC13 ........... 13,5 |
| 15 Äther + io % CHC13 ........... 1o,5 _ |
| 16 Äther -f- 5o0/, CHCl3 ........... 8,6 |
| 17 Äther + 5o0/, CHC13 ............ 12,9 |
| 18 CHCl3 ...................:....... 54,2 |
| ig CHC13 ........................... 144,3 eine Spur
und geringe Mengen |
| 20 CHCl3 -[- 5% Aceton............ 87,9 B 17a-Oxyprogesteron |
| 21 C:HC13 + 5% Aceton..... ..... 20,2 |
| 22 CHCl3 + io% Aceton............ 32,6 |
| 23 CHCl3 + io0/p Aceton............ 16,2 |
| 24 CHC13 + 50% Aceton............ 54,0 |
| 25 CHC13 +501)/() Aceton............ 45,0 |
| 26 Aceton............................ 126,1 zwei Spuren enthaltend |
| 27 Aceton............................ 61,9 C |
| 28 Aceton + 5 % Methanol.......... 61,2 |
| 29 Aceton -E- 50/, Methanol.......... 27,8 |
| 30 Aceton + io % Methanol.......... 21,3 |
| 31 Aceton .-E- io % Methanol.......... : io,g |
| 32 Aceton + 5o % Methanol.......... 25,4 |
| 33 Aceton -f- 50% Methanol.......... 6,8 |
Beispiel 6 Oxydation von ii-Desoxycorticosteron Eine 64 Stunden alte Pilzkultur
RH 176 (Rhizopus arrhizus), zu welcher i g ii-Desoxycorticosteron in 41 Nährsubstrat
gegeben wurde, wurde 54 Stunden bei Zimmertemperatur bebrütet. Die Färmentationsflüssigkeit
samt Mycel wurde zuerst einmal mit 21 Methylenchlorid und dann dreimal mit je 1
1 Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridauszüge wurden vereinigt, zweimal
mit je 5oo cm3 20%iger Natriumbikarbonatlösung und schließlich zweimal mit je 5oo
cm3 destilliertem Wasser gewaschen. Der Methylenchloridauszug wurde mittels eines
Luftstromes zur Trockene verdampft und der feste Rückstand in
50 cm3 Methylenchlorid
aufgenommen. Die Lösung
wurde in ein ioo cm3 fassendes Becherglas
gegossen und im Luftstrom verdampft. Der feste Rückstand, 1,4218 g, wurde in Benzol
gelöst und über A1203 chromatographiert, wie ausTabelle VII ersichtlich ist. Die
Fraktion B ließ auf die Bildung dreier langsam wandernder Verbindungen schließen,
wobei eine Spur die stärkste war. Ein Teil dieser Fraktion besaß eine biologische
Wirksamkeit, welche eine ungefähr 5 o/oige Umwandlung in bezug auf Corticosteron
anzeigte, gewertet nach der Rattenleberglykogenprobe von Pabst und Mitarbeitern,
Endocrinology, Bd.41, S. 55, (1947). 2oomg davon wurden aus i cm3 Methanol umkristallisiert
und lieferten 26 mg Kristalle mit F. = i8o bis 18g°. Zweimaliges Umkristallisieren
ergab 8 mg Kristalle mit F. = igo bis 1g2°. Infrarotuntersuchungen ließen auf die
Einführung einer neuen Hydroxylgruppe in ii-Desoxycorticosteron schließen.
| Tabelle VII |
| A1203 Chromatographie von auf biologischem Wege umgewandeltem
ii-Desoxycorticosteron |
| Verwendung von Rhizopus arrhizus |
| Gewicht |
| Fraktion des Papierchromatogramm- |
| Nr. Lösungsmittel Rückstandes untersuchungen |
| . |
| in mg |
| 1 Äther ............................ 230,3 |
| 2 Äther ............................ 155,0 |
| 3 Äther ............................ 15,8 |
| 4 Äther + ioo/o CHCl3 ............ .. 8,0 |
| 5 Äther + ioo/o CHC13 ............... 2,5 - |
| 6 Äther -f- ioo/o CHC1................ 1,5 |
| 7 Äther -j- 5o0/, CHCl3 . . . . . . . . . . . . . . . 2,1 |
| 8 Äther -f- 50% CHC1................ 2,8 |
| g Äther + 50% CHCl3 ............... 3.9 A |
| io CHC13 ........................... 5,8 |
| 11 CHC13 ........................... 228,6 |
| 12 CHCl3 ........................... 114,2 |
| 13 C H C13 -f- 50/, Aceton .............. 42,7 |
| 14 CHCl3 -f- 50% Aceton .............. 1719 |
| 15 CHC13+ 5% Aceton .............. 14,6 |
| 16 CHC13 + ioo/o Aceton ............. io,8 |
| 17 CHCl3 + ioo/o Aceton ............. 7,4 |
| 18 CHC13 -f- ioo/o Aceton ............. 5,9 |
| 1g CHCl3 -[- 50°/o Aceton ............. 15,8 |
| 20 CHC13 -f- 5o0/() Aceton ............. 8,7 |
| 21 CHCl3 -f- 50°/o Aceton ............. 24,5 |
| 22 Aceton ........................... 32,1 |
| 23 Aceton ........................... 14,4 |
| langsam wandernde Kompo- |
| drei |
| 24 Aceton ........................... 919 B nenten I |
| 25 Aceton + 5% Methanol ............ 34,0 |
| 26 Aceton + 5% Methanol ............ 22,3 |
| 27 Aceton -f- 5% Methanol ............ 13,8 |
| 28 Methanol ......................... 73,8 |
| 29 Methanol ......................... 25,6 |
| 30 Methanol ......................... 15,6 |
Beispiel 7 Oxydation von Progesteron 15o mg Progesteron in ungefähr 3 cm3 Aceton
wurden zu 15o cm3 - Nährbodenlösung (wie vorher beschrieben) gleich mit dem Impfmaterial
gegeben. Nach 72 Stunden hatte die vollständige Umwandlung des Progesterons stattgefunden,
und eine 3oo/oige Umwandlung in iia-Oxyprogesteron wurde durch ein Papierchromatogramm
festgestellt. Beispiel 8 Oxydation von Progesteron Eine 5 Tage alte aerobische Zucht
von RH 176 in 150 cm3 Nährbodenlösung wurde nach Zugabe von 150 mg Progesteron in
3 cm3 Aceton bebrütet, wobei die Konzentration i mg je cm3 betrug. Nach 32 Stunden
war kein Progesteron mehr nachweisbar. Die Umwandlung in ii a-Oxyprogesteron betrug
ungefähr 50°/o, wie durch ein Papierchromatogrammfestgestellt werden konnte.
Beispiel
9 Oxydation von Progesteron . In ähnlicher Weise wurde eine 41 Stunden alte Pilzzucht
von RH 176, welcher i g Progesteron in 4o cm3 Aceton zugesetzt wurde,
30 Stunden belüftet, wodurch ii a-Oxyprogesteron in einer Ausbeute von 470/,
durch Extrahierung der Fermentationsflüssigkeit und des Mycels erhalten wurde. Die
Ausbeute an der Dioxyverbindung betrug ungefähr 25,5 °/o. wobei die Ausbeute nach
chromatographischer Trennung vor der Umkristallisierung bestimmt wurde. Die erhaltenen
Substanzen wurden in der im Beispiel i angegebenen Weise umkristallisiert.
-
Beispiel io Oxydation von Progesteron Zu 150 cm3 einer 24 Stunden
alten RH-i76-Kultur wurden 300 mg Progesteron, in 3 em3 Aceton, gegeben und
24 Stunden belüftet. Die Umwandlung von Progesteron in ii a-Oxyprogesteron betrug
ungefähr 6o °% bei einer Gesamtausbeute von ungefähr 37 °/o. Beispiel ii Oxydation
von Progesteron Das obige Beispiel wurde mit 150 cm3 Nährbodenlösung wiederholt,
wobei wieder mit RH 176 geimpft wurde und 3oo mg Progesteron in 3 cm3 Aceton zugegeben
wurden. Die Konzentration betrug 2 g Progesteron je i Nährboden. - Auch nach 72
Stunden konnte mittels Papierchromatogramm nachgewiesen werden, daB ein erneut zugefügtes
Progesteron noch immer umgewandelt werden kann, jedoch waren die Ausbeuten kleiner
als üblich.
-
In ähnlicher Weise wurde Progesteron zum Nährboden a) gleichzeitig
mit dem Impfmaterial, b) 24 Stunden nach dem Impfen und c) 5 Tage nach Jem Impfen
des Nährbodens zugefügt, ohne daB dabei eine wesentliche Änderung der Arten der
gebildeten Stoffe festgestellt werden könnte, es wurden immer Dioxyprogesteron und
ii a-Oxyprogesteron gebildet.
-
Beispiel 12 Oxydation von ii-Desoxycorticosteron Der Arbeitsgang von
Beispiel i wurde mit einer 24 Stunden alten Kultur von RH 176 wiederholt, und einige
neue, in ii-Stellung oxydierte Verbindungen wurden gewonnen, wie aus dem Papierchromatogramm
nach Zaffaroni mit Diäthylenglykolmonoäthyläther und Methylcyclöhexan ersichtlich
war.
-
Beispiel 13 Oxydation von 3-Oxypregnan-2o-on In der gleichen Weise
wie bei der oben angegebenen Oxydation der m-Stellung des Steroidringsystems von
17 a-Oxyprogesteron wird 3-Oxypregnan-2o-on in der ii-Stellung des Ringsystems durch
Einwirkung einer Kultur von RH 176, einem Rhizopus-arrhizus-Stamme, oxydiert.
-
Beispiel 14 Oxydation von Steroiden in der zi-Stellung
300
cm3 der üblichen, aus 20/, Läctalbuminauszug, 5 °/o Dextrose und Maisquellwasser
bestehenden Nährbodenlösung mit einem p$ = 6,5 wurde mit Sporen der Organismen RH
176 (Rhizopus arrhizus) geimpft und 24 Stunden unter Lüftung geschüttelt. Von diesem
Nährboden wurden j e 2o cm3 in sterile, ioo cm3 fassende Kolben gefüllt, und jedem
Kolben wurden ungefähr 6 mg in der Tabelle VIII genannter Steroide, gelöst in höchstens
0,3 cm3 Aceton, zugefügt. Nach 24 Stunden wurde der Inhalt der Kolben extrahiert.
| Tabelle VIII |
| Steroide lpH-Endwerti) |
| i. Androstendion .................. 3,75 |
| 2. Cholestenon .................... 4,12 |
| 3. Ergosteron......................- 3,90 |
| 4. Ergosterin ..................... 3,6o |
| 5. 2i-Acetoxypregnenolonacetat ...... 3,75 |
| 6. Pregnenolonacetat .............. 3,90 |
| 7. Stigmastadienon ................ 3,001) |
| B. Dehydroergosteryldioxydomalein- |
| säureanhydrid-addulzt ........... . 3,85 |
| 9. 3-Acetoxy-5, 7, 9-(ii)-pregnatrien- |
| 2o-on-maleinsäureanhydrid-addukt 3,8o |
| i) knapp vor der Extraktion. |
Alle diese Verbindungen wurden in der ii-Stellung des Steroidringsystems oxydiert.
-
Beispiel 15 . Oxydation der ii-Stellung in Progesteron Zum Impfen
von i5o cm3 eines üblichen, aus Lactalbuminauszug, Glukose, Maiseinweichwasser und
Leitungswasser bestehenden Nährbodens wurde i cm3 einer aus zo eins bestehenden
Kochsalzlösungsaufschwemmung von Sporen einer Schrägkultur von RH 176 (Rhizopus
arrhizus) aus der Sammlung verwendet. Nach 24stündigem Schütteln wurden 5 cm3 davon
verwendet, um i5o cm3 eines sterilen Nährbodens folgender Zusammensetzung zu impfen:
0,3 g primäres Kaliumphosphat (KH@P04), 1,5 g Ammoniumnitrat (NH4N0g), 0,25
g Magnesiumsulfatheptahydrat (Mg S 04 ' 7 H2 O) mit Leitungswasser auf z 1 gebracht.
Nach Sterilisierung des Nährbodens bei igo° betrug der pa-Wert des Nährbodens 4,3.
-
Nach einer 24stündigen Lüftungsdauer; wodurch ein starkes Wachstum
hervorgerufen wurde, wurde eine Lösung von 6o mg Progesteron in 3 cm3 Methanol zur
Pilzkultur gegeben. Nach weiteren 24 Stunden Lüftung wurde die Fermentationsflüssigkeit
mit Methylenchlorid extrahiert. Wie aus papierchromatographischen Untersuchungen
ersichtlich wurde, war der Umwandlungsgrad. in iz a-Oxyprogesteron und weiter oxydierten
Derivaten hoch. Die extrahierte
Substanz war kristallin und schwächer
gefärbt als bei komplizierter zusammengesetzten Nährböden.
-
Beispiel 16 Oxydation von Steroiden in der ir-Stellung Die verwendeten
Organismen wurden in einer Nährbodenlösung folgender Zusammensetzung gezüchtet:
2o g Lactalbuminauszug, 5 cm3 Maisquellwasser, 50 g Dextrose, mit Leitungswasser
auf 11 aufgefüllt, auf p$ = 6,5 eingestellt und dann bei i2o° 2o Minuten
st_ erilisiert.
-
Die Kulturen wurden mittels stark sporenbeladener Schrägkulturen beimpft,
die io °/o getrockneten Malzextrakt und 2 °/o Agar enthielten. Alle Kolben enthielten
durchschnittlich je 30 cm3 Nährboden.
-
Die Kolben wurden unter Luftzutritt 24 Stunden bei Zimmertemperatur
geschüttelt. Die Steroide wurden als 2°/oige Acetonlösung (Substanzgewicht je Volumteil
Lösungsmittel) zugefügt und der Kolben weitere 24 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt.
Auf 30 cm3 kamen 6 mg Steroide.
-
Das Fermentationsgemisch wurde dreimal mit Methylenchlorid extrahiert,
und zwar mit einem Lösungsmittelvolumen, das dem der wäßrigen Lösung entsprach.
Der Auszug wurde mit 2°/oiger Natriumbicarbonatlösung und destilliertem Wasser gewaschen.
Das Lösungsmittel wurde bis zur Trockne abgedampft und der Rückstand durch Papierchromatographie
geprüft. Alle verwendeten Steroide wurden in der ii-Stellung oxydiert.
-
In der nachfolgenden Tabelle IX sind die verwendeten Organismen und
die Steroide angegeben.
| Tabelle IX |
| Progesteron |
| Steroid: |
| Organismen: |
| i. Mucor rouxi |
| 2. Mucor griseo cyanus (-@-) |
| 3. Mucor griseo cyanus (-) |
| q.. Mucor hiemalis var. albus |
| 5. Mucor hiemahs |
| 6. Mucor mucedo |
| 7. Mucor mucedo |
| B. Mucor mucedo |
| g. Rhizopus nigricans |
| io. Rhizopus nigricans |
| ii. Rhizopus nigricans (-@-) |
| 12. Rhizopus nigricans (-) |
| 13. Rhizopus chinensis (-) |
| 1q.. Rhizopus japonicus |
| 15. Rhizopus oryzae |
| 16. Rhizopus oryzae |
| ii-Desoxycorticosteron |
| Steroid: |
| Organismen: |
| 17. Mucor rouxi |
| i8. Mucor griseo cyanus (-@-) |
| ig. Mucor griseo cyanus (-) |
Die Papierchromatogramme zeigen, daß das ii-Desoxycorticosteron durch die Organismen
Nr. 17 und Nr. 18 in die Verbindungen E und F übergeführt wurde.
-
In ähnlicher Weise wird bei Einwirkung der im folgenden aufgezählten
Pilzorganismen auf Progesteron, ii-Desoxycorticosteron, ii-Desoxy-i7-oxycorticosteron
und i7-Oxyprogesteron dasselbe Ergebnis erhalten: Mucor genevensis, plumbeus, parasiticus,
dubius, javanicus, adventitius, microsporus, rouxianus, racemosus; Rhizopus reflexus,
shanghaiensis, tritici, cohnii, delamar, tonkinensis, kazanensis; Phycomyces blakeslecanus,
theobromatus; Absidia glauca; Zygorhynchus moelleri, heterogamus und Syncephalus
nodosa.
-
Beispiel 17 Oxydation von Progesteron unter Verwendung von Filtraten
der Fermentationsflüssigkeit von RH 176. Eine 72 Stunden alte Kultur wurde filtriert
und daraus 16o cm3 Filtrat der Fermentationsflüssigkeit mit einem p$-Wert von 4,1
erhalten. Das Myzelium wurde in einem sogenannten »Waring«-Mischer unter Zusatz
einer Kochsalzlösung 15 Minuten zerkleinert und zentrifugiert, wobei ioo cm3 Flüssigkeit
abgetrennt wurden und welche in zwei gleiche Teile geteilt wurden. Ein Teil wurde
bei p$ 4,65 belassen, der andere mit halbmolarer Na2HP04 Lösung auf p$ 6,76 gestellt.
Der Myzelrückstand wurde zusammen mit etwas zugegebener Kochsalzlösung in einen
eigenen Kolben geschüttet. Zu jedem Kolben wurde Progesteron (3o mg je cm3 Aceton)
in der im folgenden angegebenen Weise gegeben:
| Fraktion Progesteron- |
| menge |
| S I =überstehendeFlüssigkeitpH6,76 30M9 |
| S II = überstehende Flüssigkeit p$4,65 30 mg |
| R = Myzelrückstände ............ 6o mg |
| BF = unverdünnte Fermentations- |
| flüssigkeit Pu 4,1 ........... 30M9 |
Die mit Wattebauschen verschlossenen Kolben wurden 17 Stunden bei Zimmertemperatur
geschüttelt und in der im Beispiel i angeführten Weise mit Methylenchlorid extrahiert.
Die Papierchromatogramme zeigten, daß S I eine sehr geringe Umwandlung in höher
oxydierte Substanzen ergab, S II eine beachtliche und BF eine noch größere Umwandlung
hervorriefen, daß aber die Myzelrückstände eine vollständige Umwandlung ergaben.
-
Beispiel 18 Oxydation von ii a-Oxyprogesteron Zu 150 cm3 einer 48
Stunden alten Kultur von RH 176 (Rhizopus arrhizus) in einem üblichen Nährboden,
bestehend aus Dextrose, Lactalbuminauszug und Maisquellwasser, wurden 2o mg ii a-Oxyprogesteron
gegeben und 22 Stunden belüftet. Die Materialien wurden dann mit Methylenchlorid
in der im Beispiel i angeführten Weise extrahiert. Die Papierchromatogramme zeigen
eine Dioxyverbindung und eine zweite Verbindung, welche auch durch Umwandlung von
Progesteron selbst erhalten wird und anscheinend
eine weitgehende
oxydierte Verbindung vor ii a-Oxyprogesteron darstellt.
-
Beispiel. ig Oxydation von ii-Desoxycorticosteronacetat In einem 5
1 fassenden, mit Rührwerk versehenem Glaskolben wurden 3 1 Nährboden (5o g Dextrose,
5 g Maisquellwasser, 2o g Caseinpepton, iooo ccm destilliertes Wässer) mit Sporen
des Pilzes Rhizopu: nigricans Ehrenberg (bestimmt nach H. Z ych a, Kryptogamenflor_a
der Mark Brandenburg, Bd. VI ä [Pilze II, Mucorineae], Leipzig, 1939, und G. Lindau,
Die mikroskopischen Pilze, Berlin 1922) geimpft. Die Ausgangskulturen für die Impfung
waren jeweils 5 Tage alt und wurden auf Malzextrakt mit Maisquellwasser (Schrägagar)
vorgezüchtet. Durch den - beimpften Nährboden wurde bei 24° unter Rühren sterile
Luft mit einer Geschwindigkeit von 5oo 1 je Minute geleitet. Zur Schaumverhütung
wurden 6 cm3 Spermöl zugegeben. Nach 24stündigem Wachstum wurden 1,5 g Desoxycorticosteronacetat,
gelöst in 7,5 cm3 Benzylalkohol, zugegeben, und es wurde danach weitere 24 Stunden
bei gleicher Belüftung gerührt. Zur Gewinnung des Reaktionsproduktes wurde der Inhalt
des Kolbens dreimal mit insgesamt 41 Methylenchlorid ausgeschüttelt. Das Methylenchlorid
wurde zweimal mit jeweils 500 cm3 20%iger Natriumbicarbonatlösung und danach zweimal
mit je 11 Wasser gewaschen. Es wurde nun einer Destillation unterworfen, wobei ein
öliger Rückstand zurückblieb. Um Wasserreste zu entfernen, wurde der Destillationsrückstand
nochmals mit Methylenchlorid versetzt und dieses wieder abdestilliert.
-
Zur Bestimmung der Ausbeute der Räaktionsprodukte wurde der Gesamtrückstand
gewogen. Ein abgewogener Teil wurde in einem bekannten Volumen Chloroform gelöst.
Ein gleicher Teil wurde mit einer Pipette auf mit Propylenglykol getränktes Papier
(Schleicher & Schüll Nr. 2o43b) aufgetragen und mit Toluol einer absteigenden
Papierchromatographie unterworfen. Das unveränderte Desoxycorticosteronacetat wandert
auf dem Papier sehr schnell aus (etwa an der Toluolgrenze), während Oxydationsprodukte
sehr nahe dem Ausgangsfleck verbleiben. Die Sichtbarmachung und Bestimmung der Substanzen
in den Flecken erfolgte durch Behandlung des getrockneten Papiers mit alkalischem
Triphenyltetrazoliumchlorid (2°/°ige Lösung mit gleichem Volumen i n-Natronlauge)
und nachfolgendem Erwärmen bei 45° im Trockenschrank. Danach wurde das Papier mit
Wasser gespült und wieder getrocknet. Die roten Flecke, welche unter der Einwirkung
reduzierender Substanzen gebildet wurden, konnten nun herausgeschnitten, mit Methylenglykol
eluiert und kolorimetriert werden. Zum Vergleich wurde eine Eichkurve mit Desoxycorticosteronacetat
in der Weise aufgenommen, daß verschiedene Mengen dieser Substanz auf Papier aufgetragen
und der gleichen Behandlung unterworfen wurden wie das Papier mit der Analyse. Die-EXtinktion
von Flecken, die mit Corticosteron erhalten wurden, war etwa die gleiche wie die
des Desoxycorticosteronacetats, deshalb genügte es, dieses als ,Eichsubstänz zu
verwenden. Zur Sicherheit wurde jedes Papierchromatogramm dreimal gemacht und der
Mittelwert aus den Ergebnissen genommen.
-
Nach dieser Methode vorgenommene Bestimmungen des oxydierten Produktes
ergaben eine Ausbeute von 6o bis 7o °/° des verwendeten Desoxycorticosteronacetats.
-
Die Reaktionsprodukte wurden nun präparativ isoliert. Zu diesem Zwecke
wurde das erhaltene Öl mit einem Gemisch von Benzol-Petroläther (i: i) gelöst und
die Lösung an 25 g saurem A1203 chromatographiert. Mit Benzol, Äther und Chloroform
als Eluierungsmittel wurden in üblicher Weise die einzelnen Fraktionen gewonnen.
-
Die Hauptfraktion befand sich im Chloroform. Das Rohprodukt war bereits
kristallisiert und wog rund o,6 g; daraus ließ sich durch Kristallisation aus Essigester
und Äther (1,5: 5) das ii-epi-Corticosteron gewinnen; Schmelzpunkt 159° (korr:);
[a] ö = -f- i49° (in Essigester). Die Substanz gab keine Schmelzpunktdepression
mit synthetisch hergestelltem epi-Corticosteron. Die Ultrarotspektren beider Substanzen
waren identisch..
-
Unter den anderen Mikroorganismen, welche zur Oxydation von Steroiden,
die ii-Desoxysteroide mitinbegriffen, Verwendung finden, trotzdem sie nicht unbedingt
zu denselben Ergebnissen führen wie die Pilze der Ordnung Mucorales, sind verschiedene
Stämme von Penicillium, z. B. P = ioo, aspergilli, z. B. Aspergillus niger, Naurospora
sitophila, Neurospora crassa, Oospora lactis, Polyoporus abietinus und ähnliche
Arten.