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Verfahren zur Herstellung von 17-Ketotestanen, 17-Ketoandrostanen
und 20-Oxypregnanen Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zum fermentativen
Abbau der 17-Ständigen Seitenkette von 2o-Ketapregnanen und 2o-Ketoallopregnanen
unter Bildung von 17-Ketotestanen (normale Form), 17-Ketoandrostanen und 2o-Oxypregnanen.
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Der Abbau der Seitenkette in 17-Stellung von Steroidverbindungen mit
chemischen Mitteln unter Bildung von 17-Ketostaraiden, insbesondere von 17-Kertoandrostanen
und 17-Ketotes.tanen, ist wohl bekannt, doch erfordert diese Arbeitsweise in der
Regel eine Anzahl von Maßnahmen, wie die Bildung einer 17 (2o)-Ständigen Doppelbindung
und Oxydation dieser Doppelbindung. Bei einem solchen oxydativan Abbau wird der
Steroidkern oft an anderen Stellungen, insbesondere Doppelbindungen angegriffen,
was zu hohen Verlusten führen kann. Um diese Verluste zu vermeiden, werden solche
Stellungen oder Gruppen in bekannter Weise geschützt, was wiederum mindestens zwei
zusätzliche Maßnahmen erfordert. So beschreiben z. B. Bergmann und Stevens (Journ.
Org. Chem., Bd. 13, A948, S. io) die Ozonolyse des 22-Enolacetats des 5, 7-Bisnorcholadien-3
ß-ol-22-al-3-acetats, das durch eine 5, 8-Ständige Maleinsäureanhydridadduktgruppe
geschützt ist, wobei man das Madeinsäureanhydridaddukt des 5, 7-Androstadien-3ß-ol-i7-on-3-acetats
erhält.
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein 2o-Keto,-pregnan oder
2o-KetoallopTegnan durch Einwirkung eines Pilzes der Gattung Penicil.lium in ein
i7-Ketoandrostan oder i7-Ketotestan übergeführt. Die erhaltenen i7-Ketoandrostäue
und 17-Ketotestane sind wertvolle Arzneimittel oder wertvolle Zwischenprodukte zu
deren Herstellung.
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Das erfindungsgemäße Verfahren liefert eine Anzahl von wertvollen
Produkten, so gibt z. B. Progesteron, wenn man es der Einwirkung von Penicillium
lilacinum aussetzt, 4-Androsten-3, 17-dion, das bekanntermaßen androgene Eigenschaften
besitzt. 4-Androsten-3, 17-diom kann in Testosteron übergeführt werden (Stavely,
USA.-Patentschrift Nr. 2:288 85q.) und letzteres durch Hydrierung in das therapeutisch
wertvolle Dihydrotestosteron (Symposium an Steroids in Experimental and Clinicai
Practice, The Blakiston Company, New York, 1951, S.375).. In analoger Weise ergibt
die Fermentation von ii-Ketoprogesteron das bekannte 4-Androsten-3, 11, 17-trion
(Adrenos.te ron), das ein wertvolles Ausgangsmaterial für die Herstellung von 11
ß-Oxytestosteron ist.
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Die Ausgangsverbindungen für das vorliegende Verfahren sind 2o-Ketopregnane
und 2o-Ketoallopregnan- Der Cyclopentaopolyhydrophenanthrenkern mit einer Seitenkette
in 17-Stellung kann in anderen Stellungen auch: Keto- oder Hydroxylgrup= pen tragen,
insbesondere in den Stellungen 3, 6, 7, 8, 11, 12, 14, 17 und 21, und kann in verschiedenen
Stellungen, insbesondere in Stellung 4 und 5, Doppelbindungen enthalten.
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Typische Ausgangsmaterialien sind folgende: Pregnan-3a(oderß)-ol-2o-on,
5-Pregnen-3a-(oderß)-ol-2o-on, Pregnan-3 a (oderß)-ol.-ii, 2o-dion, Pregnan-3
a, 11 a (ader3 ß, 11 ß oder 3 ß, 11 a-oder 3a, i i ß)-diol-2o-on,
Progesteron, 17 a-Oxyprogesteron, ii-Ketoprogesteron, 11 a-Oxyprogesteron, 11 a,
17a-Dioxyprogesteron, i i-Keto-I7 a-Oxyprogesteron, 11 a-Aaetoxyprogesteron, 11
ß-Oxyprogesteron, 14 a-Oxyprogesteron, 4-Pregnen-14 a, 17a, 21-triol-3, 2o-dion,
14 a-Oxy-Ii-desoxycorticosteron; 4-Pregnen-17 a, 2i-diol-3, 2o-dion (»Reichsteins
Verbindung S«), Corticosteron, Cortison, Cortisonacetat, Hydrocortison (»Kendalls
Verbindung F«) und 4 - Pregneh - 11 a, 17 a, 21 - firiol -3, 2o-dion (»ir-EpiverbindungF«)
Pregnan-3, II-2o-trion, Pregnan-17 a-01-3, i i, 2o-tri.on, Pregnan-3, 12, 2o-trion,
Pregnan-I7 a-01-3, 2o-dion, Allopregnan-3, ii-2o-trion, Allopregnan-3, 2o-dion,
5-Pregnen-3 a-ol-2o-on, Allopregnan-3 a (oder ß)-ol-2o-on, Pregnan-3 a, 12a, 2I-triol-2o-on,
Pregnan-3 a, 17 a-diol-2o-on, 6 a- und: 6 ß-Oxy-Progesteron, Pregnan-3, 6,
2o-trion.
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Zur Durchführung des erfindungsgernä$en Verfahrens wird das gewählte
2o-Ketopregnan oder -Allopregnan zweckmäßigerweise in einem Lösungsmittel, wie Aceton,
der Kultur eines Pilzes der Gattung Penicilliu.m ausgesetzt: Die Klassifizierung
und Definition von Penicillium, wie sie hier verwendet wird, entspricht derjenigen
von K. B. R a p e r und C. T h o m »A Manual of the Penicillia«, Williams anal Wilkins
Company, Baltimore, 1949. Von den Species -der Gattung' Penicillium, die sich für
die Fermentation von Steroiden eignen, seien diejenigen der Unterklassen Monoverticillate,
Asymmetrica-divaricata, Asymmetrica-velutina, Asymmetrica -. Janata, Asymmetrica
- funiculosa, Asymmetrica-fas.ciculata, Biverticillata-symmetriea und Polyverticillata,
z. B. Penicillium adametzi, brevi-compactum, camemberti, canescens, capsulatum,
charlesii, citrinum, claviforme, commune, cyclopium, decumbens, digitatum, duclauxi,
expansum, frequentans, funiculosum, fascum, gladioli, granulatum, herquei, implicatum
janthinellum, lavendulum, levitum, lilacinum, luteum, nigricans; notatum, no@vae-zeelandiae,
ochraceum oxalicum, pallidum., purpurogenum, purpurogenum var. rubrisclerotium,
raistrickii, roqueforti, roseo, purpureum, rugulosum, terres.tre, thomi, urticae
und- viridncatum genannt.
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Die Kultur der Pilze für die Zwecke der vorliegenden Erfindung erfolgt
in oder, auf einem Nährboden, der für deren Entwicklung günstig ist. Man kann feste
Nährböden verwenden, doch bevorzugt man diejenigen, die eine Massenzucht unter aeroben
Bedingungen ermöglichen.
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Feuchte, feste, kleinteilige Nährböden, wie Kleie, Cerealienkörner,
Cerealiengrieß, Holzschnitzel, Späne, Sägemehl, Maishülsen, Faserstoffe, wie Kopra,
Kastanien oder Lupinensamen, können verwendet werden. Man kann sie mit Alkohol,
Äther oder anderen organischen Lösungsmitteln extrahieren, um vor der Fermentation
unerwünschte Verunreinigungen und wachstumshemmende Stoffe zu entfernen. Die Träger
können gewünschtenfalls zugesetzte Wachstumsfaktoren und Nährstoffe enthalten und
können in Schichten oder Schalen mit oder ohne Hilfsbelüftung, in Türmen, wie bei
der Essigherstellung, oder unter Bewegung, z. B. in einer rotierenden Trommel, verwendet
worden. Flüssige Nährböden, wie, Bierwürze, eignen sich gut -für aerobe Schichten
und noch besser für aerobe submerse Fermentationsbedingungen. Zweckmäßigerweise
sollten die Nährböden Stoffe enthalten, die Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralien
zur Verfügung stellen, obschon natürlich auch unter weniger als optimalen Bedingungen
ein beträchtliches Wachstum auftreten kann.
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Verfügbarer Kohlenstoff kann aus Kohlehydraten, Stärken, gelatinisierten
Stärken, Dextrin, Zuckern, Melassen von Rohr-, Rüben- und Sorghumzucker, Glukose,
Fructose, Mamose, Galactose, Maltose, Suerose, Lactose, Pentosen, Aminosäuren, Peptonen
oder Proteinen stammen. Kohlensäure, Glycerin, Alkohole, Essigsäure, Natriumacetat,
Zitronensäure, Natriumcitrat, niedere Fettsäuren, höhere Fettsäuren oder Fette sind
Beispiele für andere Materialien, die assimilierbaren Kohlenstoff für den Energiebedarf
der Pilze liefern können. Manchmal sind Mischungen von verschiedenen Kohlenstoffquellen
von Vorteil.
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Assimilierbarer Stickstoff kann von löslichen oder unlöslichen pflanzlichen
oder tierischen Proteinen, Sojamehl, Lactalbumin, Casein, Eialbumin, Peptonen, Polypeptiden
oder Aminosäuren,
Harnstoff, Ammonsalzen, an Basemaustauschharze
oder Zeolite_gebundenem Ammoniak, Ammoniumchlorid, Natriumnitrat, Kaliumnitrat oder
Morpholin stammen, Molke, lösliche Rückstände der Brennereien, Maiseinweichwasser
oder, Hefeextrakt haben sich auch als sehr geeignet erwiesen..
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Als mineralische Bestandteile der Nährböden können. von Natur aus
vorhandene oder zugesetzte Substanzen dienen, die Aluminium, CaJCium, Chrom, Kobalt,
Kupfer, Gallium, Eisen, Magnesium, Molybdän, Kalium, Scandium, Uran und Vanadium
liefern. Schwefel kann durch Sulfate, Alkylsulfonate, Sulfoxyate, Sulfamate, Sulfinate,
freien Schwefel, Hyposulfite, Persulfat, Thiosulfat, Methionin, Cystin, Cystein,
Thiamin oder 'Biotin geliefert werden. Phosphor, vorzugsweise in fünfwertiger Form,
zweckmäßig in Konzentrationen von etwa o,oor- bis o,o7molar und vorzugsweise von
etwa 0,015- bis o,o2molar; kann als Ortho-, Meta- oder Pyrophosphatsalze
oder -ester, Phytin, Phytinsäure, Phytate, Glycerophosphate, Natriumnuoleinate und/oder
Maiseinweichwasser, Casein oder Ovovitellin zugegen sein. Es ist erwünscht, Bor,
Jod und Selen in Spuren zugegen zu haben. Das Bor wird vorzugsweise in Form von
Borsäure oder Natriumborat zugesetzt, insbesondere nach der Keimung und während
dem ersten Wachstum des Pilzes.
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Je nach Bedarf oder Wunsch känn man noch weitere zusätzliche Wachstumsfaktoren,
Vitamine, Auxine und Wachstumsstimulantien vorsehen.
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Obgleich man feste wie flüssige Nährböden verwenden kann, wird ein
flüssiger Nährboden bevorzugt, dä er das Mycelwachstum begünstigt.
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Zur Erleichterung der Fermentation, Belüftung und Filtration. kann
man Suspendiermittel oder Mycelträger, wie Filtererden, FilteThilfsmittel, feinzerteilte
Cellulose, Holzschnitzel, Bentonit, Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, Kohle, Aktivkohle
oder andere suspendierbare _ feste - Stoffe, Methylcellulos,e, Carboxymethylcellulose
oder Alginate zusetzen,. Die gewählte Pilzgattung wird auf einem Nährboden gezogen,
der zweckmäßigerweise assimilierbaren Kohlenstoff, z. B. Kohlehydrate, wie Zucker,
Stärken, assimilierbaren Stickstoff, z. B. lösliche oder unlösliche Proteine, Peptone
oder Aminosäuren, und minerälische Bestandteile, beispielsweise Phosphate und Magnesiumsulfat,
sowie andere bekannte erwünschte Zusätze enthält. Der Nährboden kann zweckmäßig
ein pg von etwa q. bis 8 oder weniger oder mehr vor der Beimpfung besitzen. Für
die Kultur von Penicillium wird ein pA zwischen etwa q. und 6 bevorzugt.
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Die Beimpfung des Kulturmediums mit dem gewählten Pilz der Gattung
Penicillium kann in jeder geeigneten Weise durchgeführt werden. Penicillium entwickelt
sich in einem Temperaturbereich von etwa 20 bis 38°, wobei Temperaturen von etwa
25 bis 32° bevorzugt werden.
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Die Entwicklungsperioden des Pilzwachstums vor dem Zusatz des zu fermentierenden
Steroids scheint nicht kritisch zu sein. So kann man beispielsweise des Steroid
vor der Sterilisation, die durch Wärmeeinwirkung oder auf anderem Wege erfolgen
kann, dem Nährboden zusetzen oder im Moment, wo der Nährboden geimpft wird; oder
auch einige Zeit, z. B. 24 oder 48 Stunden, später. Das zu fermentierende Steroid
kann in jeder geeigneten Konzentration zugesetzt werden, doch ist aus praktischen
Gründen eine Konzentration des Steroidsubstrats von etwa oder bis zu o,6 g/1 oder
sogar o,8 g/1 Nährboden befriedigend, und 2 g/1 sind anwendbar, obschon auch höhere
Konzentrationen je nach dem speziellen Steroid zulässig sind, wenn man eine gewisse
Hinderung der Entwicklung des Myceliu.ms in Kauf nehmen will. Der Zusatz des zu
fermentierenden Sterroidsubstrats kann in irgendeiner beliebigem Weise erfolgen.,
und zwar insbesondere derart, daß zwischen Steroidsubstrat und, Pilz eine möglichst
große Berührungsfläche entsteht. Dazu kann man das Steroidsubstrat entweder allein,
mit einem Dispergiermittel oder in einem organischen Lösungsmittel gelöst im Pilzmedium
dispergieren oder suspendieren.. Man kann sowohl eine Oberflächen- als auch eine
submerse Kultur anwenden, doch wird letztere bevorzugt. Man kann auch die bei der
Kultur des Pilzes gebildeten fermentierenden Enzyme vom Pilz oder vom Nährboden
abtrennen, mit. dem. Steroid oder einer Lösung der Dispersion desselben vermischen.
und die Mischung aeroben Bedingungen aussetzen, um die Fermentation des Steroids
zu *bewirken.
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Die Temperatur während der Fermentation des Steroids kann die gleiche
sein, wie sie sich für, die Pilzkultur als- geeignet erwies. Sie ruß nur in einem
solchen Bereich gehalten werden, daß das Leben, das aktive Wachstum oder die Enzymaktivität
des Pilzes erhaltenbleibt.
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Obgleich jede Form der aeroben Bebrütung für das Wachstum des gewählten
Pilzes und die Fermentation des Steroidsubstrats geeignet ist, ist der Wirkungsgrad
der Steroidfermentation abhängig von der Belüftung. Deshalb wird die Belüftung in
der Regel kontrolliert, sei es durch Schütteln und/ oder Einblasen von Luft in das
Ferrnentationsmedium. Die Belüftung kann durch Oberflächen, kultur oder unter submersen
Fermentationsbedingungen erfolgen. Aerobe Bedingungen umfassen nicht nur die Verwendung
von Luft zwecks. Einführung von Sauerstoff, sondern auch andere Quellen oder Mischungen,
die Sauerstoff in freier oder freüsetzbarer Form enthalten. Bei Verwendung von Luft
als Belüftungsmedium ergibt sich als geeigneter Belüftungsgrad etwa 4 bis 2o Mildmol
und vorzugsweise etwa 6 Millimol Sauerstoff je Stunde je Liter, bestimmt nach der
Methode von Cooper, Fernstrom und Mille, (Ind. Eng. Chem., Bd. 36, 1944, S.504).
Die Belüftung kann. durch Anwendung von Über- oder Unterdruck, z. B. 0,7 bis 2,1
kg/cm2 abs., eingestellt werden. Die Sauerstoffaufnahme kann durch Anwesenheit verschiedener
Stoffe, wie Ascorbinsäure, Glutaminsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Tyrosin oder
Tryptophan, erleichtert werden.
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Die für die Fermentierung des Steroids erfarderl.iche Zeit wechselt
je nach der Arbeitsweise
etwas. Wenn das Steroidsubstrat bei der
Beimpfung des Nährbodens vorhanden ist, kann -sie -8 bis 72 Stunden dauern. Setzt
man jedoch das Steroid. dem Pilz zu, nachdem er bereits wesentlich gewachsen ist,
z. B. nach 16 bis 24 Stunden bei der günstigsten Temperatur, so beginnt die Umwandlung
des Steroidsubstrats sogleich, und man erhält im Laufe von I bis 72 Stunden hohe
Ausbeuten. In der Regel ist das Ergebnis von 24 Stunden befriedigend.
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Nach Beendigung dar Steroidfermentation wird das erhaltene fermentierte
Steroid aus dem Reaktionsgemisch isoliert. Eine besonders. günstige Isolierungsmethads
bestellt in der Extraktion des Fermentationsgernisches einschließlich des Mycels
mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für das Steroid,
wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylen-! chlorid, Trichloräthylen,
Äther, Amylacetat oder Benzol u. dgl. Man kann die Fermentationsflüss.igkeit von
Mycelium trennen und einzeln mit geeigneten Lösungsmitteln extrahieren. Die Mycelien
können entweder mit wasservermischbaxen oder wasserunmischbaren Lösungsmitteln extrahiert
werden, wobei sich Aceton als wirksam erwiesen hat. Die vom Myeelium befreite Fermentationsflüssigkeit
kann mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden.. Man
kann die Extrakte entweder vor oder nach dem Waschen mit alkalischen Lösungen, beispielsweise
Natriumbicaebonat, vereinigen, in geeigneter Weise z. B. über wasserfreiem Natriumsulfat
trocknen und durch Umkristad1isieren aus organischen Lösungsmitteln oder Chromatbgraphie
das erhaltene gereinigte 17-Kotosteroid von deal anderen Fermen tierungsprodukten
trennen.
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Die .folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren noch
näher erläutern. Beispiel s Fermentation; von Progesteron und Isolierung von 4-Androsten
3, 17-dion und 4-Pregnen-2oß-ol-3-on Man stellt einen Nährboden her, der 2o g enzymatisch
verdautes Lactalbumin (Edamine), 3 g Maiseinweichwasser und
50 g technische
Dextrose mit Leitungswasser auf I 1 verdünnt enthält, - und stellt das p$ auf 5,85.
12 1 dieses sterilisierten Mediums werden mit Penicillium lilaeinum thom (American
Type Culture Collection NO- Io1I4) geimpft und 48 Stunden bei 26° bebrütet, wobei
man derart belüftet und rührt, daß die Sauerstoffaufnahme 6,3 bis 7 Millimol je
Stunde und Liter Na. 2S 03, bestimmt nach der Methode von C oop er, Fernstrom und
Miller (Ind. Eng. Chem., Bd.36, 1944, S.504), beträgt. In diesem Nährboden, der
eine 48stündige Zucht von Penicillium lilacinum thom enthält, suspendiert man 6
g Progesteron, in
50 cm3 Aceton gelöst. Nach weiteren 24 Stunden Bebrütung
unter den gleichen Temperatur- und Belüftungsbedingungen werden Flüssigkeit und
Mycelium getrennt. Das Mycelium wird abfiltriert, zweimal mit je etwa seinem Volumen
Aoeton gewaschen und dann zweimal mit je seinem Volumen Methylenchlorid extrahiert.
Die Aceton-und Methylenchloridextrakte enthaltenden Lösungsmittel werden denn Filtrat
zugesetzt. Dann extrahiert man die Lösung zweimal mit je ihrem halben Volumen Methylefichlorid
und dann zweimal mit je einem Viertel ihres Volumens Methylenchlorid. Die vereinigten
Methylenchloridextrakte werden zweimal mit je einem Zehntel ihres Volumens 20/miger
wäßriger Natriumbicarbonatlösung und hernach zweimal mit je einem Zehntel ihres
Volumens Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen des Methylenchloridextraktes über etwa
3 bis 5 g wasserfreiem Natriumsulfat j e Liter Lösungsmittel und Filtrieren wird
das Lösungsmittel abdestilliert. Der so erhaltene Rückstand wiegt 5,88 g und wird
wieder gelöst und über 15o g Tonerde chromato@ graphiert, wobei man je 6oo cms Lösungsmittel,
wie in Tabelle I angegeben, verwendet.
| Tabelle I |
| Fraktion |
| Lösungsmittel JFestesEluat |
| in mg |
| I Benzol 98,2 |
| 2 Benzol 47,6 |
| 3 Benzol-Äther i9: I 18,8 |
| Benzol---Äther i9 : I 132,8 |
| Benzol-Äther 9:1 154,2 |
| 6 Benzal-Äther 9:1 27,5 |
| 7 Benzol-Äther I :I 30217 |
| 8 Benzol-Äther I :I I267,0 |
| 9 Äther 116o,6 |
| 10 Äther - 402,2 |
| II Äther-Chloroform 19 : I 97,9 |
| 12 Äther-Chloroform 19 : I 69,4 |
| 13 Äther-ChlorofoTrn, 9:1 180,7 |
| 14 Äther-Chlorofomm 9:1 356,1 |
| 15 Äther-Chlorofonm I:1 101,1 |
| 16 Äther-ChlorofoTm I :I 95,3 |
| 17 Äther-Chloroform I:1 32,6 |
| 18 Äther-Chloroform I:1 1229 |
| 19 bis. 22 Chloroform 34,9 |
| 23 Chloroform-Aoeton19 : i ,.5.,8 |
| 24 Aceiton 24,6 |
| 25 Methanol 210,3 |
| 26 Methanol 7,2 |
Die Fraktionen 9 bis i i werden vereinigt und eingedampft. Man erhält 1,66g Feststoffe,
die zweimal mit je 5 cms Hexan. (bekannt unter dem Handelsnamen »Skellysolve B«)
gewaschen werden. Die verbleibenden Kristalle, 458 g, F. = 172 bis 175°, werden
in io cms heißem Aceton gelöst, die Lösung filtriert und auf 5 cms eingeengt. Nach
Stehenlassen über Nacht im Kühlschrank erhält man 1,2 g Kristalle vom F. = 175 bis
177°. Diese Kristalle werden aus 4 bis 5 cms Aceton und 3,5 cms »Skellysolve B«
umkristallisiert,. wobei man 899 mg kristallines 4-Androsten-3, 17-dion vom F. =
175 bis 176,5°; [a] ö -f- 194 (c = o,981 in Chloroform).
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Analyse für C18 H28 O3 berechnet . . . . . . . . . . . . . . C, 79,69,
H, 9,15; gefunden . . . . . . . . . . . . . . C,
79,53, H, 8,94.
Die
Fraktionen, 13 und 14, die 537 mg feste Substanz enthalten, werden vereinigt, in
50 cm3 Benzol gelöst und nochmals über 25 g Tonerde chromatographiert. Man fängt
Fraktionen von
50 cm3, wie in Tabelle II gezeigt, auf.
| Tabelle II |
| Fraktion Lösungsmittel |
| Festes Eluat |
| in mg |
| 1 Benzol-Äther i : 1 7,0 |
| 2 Benzol-Äther i :1 5,2 |
| 3 Äther 2,1 |
| 4 Ätherr 24,8 |
| 5 Äther-Chld@ro,form i9 : i 48,1 |
| 6 Äther=Chloro,form 19 :1 80,3 |
| 7 Äther-Chloro-form 9 :1 87,6 komb. |
| 8 Äther-Chloroform 9:1 70,4 |
| 9 Äther-Chloroform i :1 51,0 |
| 10 Äther-Chlo-roform i :1 - 37,5 |
| il .Äther-Chloroform i :1 19,7 |
| 12 Chloroform 9,1 |
| 13 Chloroform 24,8 |
| 14 Chloroform 5,0 |
| 15 Chloroform-Aceton 19 :1 4,8 |
| 16 Aceton 4,0 |
| 17 und 18 Methanol 13,3 |
Die Fraktionen 4 bis i i werden vereinigt und zweimal aus 3 cm3 Methylenchlorid
und i cm3 »Skellysolve B« umkristallisiert, wobei man 114 mg Kristalle vom F. =
151 bis 152o erhält, die durch Infrarot- und Mikroanalyse als 4-Pregnen-2o a-ol-3-on
identifiziert werden.
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Beispiel e Fermentation von i i-Desoxycorticosteronacetat Aus 0,5%
Pepton, 2% Dextrose, 0,5% Sojamehl, 0,5% einbasischem Kaliumphosphat, 0,50/0 Natriumchlorid
und 0,3% Hefeextrakt stellt man durch Verdünnen mit Leitungswasser auf 1 1 einen
Nährboden her, dessen p$ nach dem Sterilisieren auf 5,9 gestellt wird. 3 1 dieses
Nährbodens werden finit Penicillium canescens (ATCC Nr. 10419) beimpft und 24 Stunden
bei 28° bebrütet, wobei man mit einer Geschwindigkeit von 7 Millimol je Liter Nag
S 03 und Stunde, bestimmt nach der Methode von Fernstrom und M i 11 e r (Ind. Eng.
Chem., Bd.36, 1944, S.504), belüftet. In diesem Nährboden, der eine 24 Stunden alte
Kultur von Penicillium canescens enthält, suspendiert man i g i i-Desoxycorticosteronacetat,
in 2o cm3 absolutem Äthanol gelöst. Nach weiteren 24 Stunden Bebrütung unter den
gleichen Temperatur- und Belüftungsbedingungen werden die Lösung und das Mycelium
extrahiert und wie im Beispiel i chromatographiert, wobei man 4-Androsten-3, 17-dion
und 4-Pregnen-2oa, 2i-di01-3-on erhält.
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Beispiel 3 Fermentation von 14 a-Oxyprogesteron Man stellt einen Nährboden
her, indem man 2o g Maiseinweichflüssigkeit, 2o g Dextrose, i g einbasisches Kaliumphosphat,
2 g Natriumnitrat, 0,5 g Magnesiumsulfat, o,2 g Kaliumchlorid, o,oi g Ferrosulfat
und 2 g Natriumacetat mit Leitungswasser auf 1 1 verdünnt. Nach dem Sterilisieren
werden 21 dieses Nährbodens in je ioo cm3 betragenden Anteilen in 2o Schüttelflaschen
verteilt und mit Penicillium lilacinum beimpft. Zu einer 24stündigen Kultur dieses
Pilzes bei 26° gibt man in jede Flasche io mg i4a-Oxyprogesteron, hergestellt nach
dem Verfahren des Patents 955 058.
Nach d.8stündiger Bebrütung unter Schütteln
mit der umgebenden Luft bei 26° wird der Inhalt der Flaschen vereinigt und mit M.ethylendichlorid
extrahiert; die Extrakte werden eingedampft, wobei man 785 mg festen Rückstand erhält.
Dieser wird in 35 cm3 Benzol gelöst und über 4o g Tonerde chromatographiert. Die
Fraktion 24 (Chloroform) wiegt i03 mg und enthält 221/o 4-Androsten-14 a-ol-3, 17-dion.
Fraktion 25 (Aceton) wiegt i16,5 mg und enthält 160/a 4-Androsten-14a-o1-3, 17-dion.
Diese Fraktion wird in i cm3 Äthylacetat gelöst und bei Zimmertemperatur verdampfen
gelassen. Nach mehrmaliger Wiederholung dieses Vorgangs tritt Kristallisation ein.
Die Fraktion wird dann mit 2 em3 Äther und wenigen Tropfen Aceton verrieben, wobei
man io mg 4-Androsten-i4a-01-3, i7-dion vom F. = 252 bis 258° erhält.
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In gleicher Weise wie im Beispiel 3 erhält man durch Fermentation
von 14 a-Oxy-i i-desoxycorticosteron oder 4 - Pregnen - i4 a, i7
a, 21 - triol -3.20-dlion mit Penicillium lilacinum 4-Androsten-14a-01-3,
17-dion (gonadal aktiv).
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Beispiel 4 Fermentation von i i-Desoxycorticosteronacetat mit Penicillium
nigricans In gleicher Weise wie im Beispiel i erhält man bei Verwendung von Penicillium
nigricans (ATCC Nr. 10115) und i i-Desoxycorticosteronacetat als Ausgangssteroid
4-Androsten-3, 17-dion und 4-Pregnen-2o a, 21-di01-3-on.
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Beispiel s Fermentation von i i-Desoxycorticosteronacetat mit Penicillium
charlesii In gleicher Weise wie im Beispiel i erhält man bei Verwendung von Penicillium
charlesii (ATCC Nr. 8730) und i i-Desoxycorticosteronacetat 4-Androsten-3,17-dion
und 4-Pregnen-20 a, 21-diol-3-on. In gleicher Weise geben die 2i-Acyloxyester des
i i -Desoxycorticosterons, z. B. das Propionat, Butyrat, Isobutyrat, Valeriat, Hexanoat,
Benzoat, Phenylacetat und andere Ester des i i-Desoxycorticosterons bei Behandlung
mit einem Pilz der Gattung Penicillium 4-Androsten-3, i7-dion und das entsprechende
4-Pregnen-2o a, 2i-diol-3-on. Beispiel 6 Fermentation von Progesteron mit Penicillium
brevi compactum In gleicher Weise wie im Beispiel 2 erhält man unter Verwendung
von Penicillium brevi compactum
(ATCC Nr.9o5.6) aus Progesteron
das 4-Androsten-3, 17-dion und 4-Pregnen-2oa, 2i-diol-3-on.
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Beispiel ? Fermentation von i 1-Desoxycorticosteronacetat mit Penicillium
lividum In gleicher Weise wie im Beispiel i erhält man bei Verwendung von Penicillium
lividum (ATCC Nr. fofo2) und ii-Desoxycorticosteronacetat, 4-Androsten-3,17-dionund
4-Pregnen-2o a, 2 i-diol-3-on. In analoger Weise ergeben andere 2i-Ester des i i-Desoxycorticosterons,.
wie das Propionat, Butyrat, Isobutyrat, Valeriat, Hexanoat, Benzoat oder Phenylacetat,
bei Behandlung mit einem Pilz der Gattung Penicillium 4-Androsten-3, 17-dion und
das entsprechende 4-Pregnen-2o a, 21-diol-3-on-2 i=acylat.
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Beispiel 8 Fermentation von i i-Ketoprogesteron mit Penicillium expansum
Nach der gleichen Arbeitsweise wie im Beispiel i erhält man bei Verwendung von Penicillium
expansum (ATCC Nr. 7861) und i i-Ketoprogesteron das 4-Androsten-3, 1i, 17-trion
(Adrenosteron).
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. Beispiel 9 Fermentation von Progesteron Man arbeitet gleich wie
im Beispiel :2 unter Verwendung von Penicillium frequentans (ATCC Nr. io 444) und
Progesteron und erhält 4 Androsten-3, 17-dion. Beispiel io Fermentation von i7a-Oxyprogesteron
Man arbeitet gleich wie im Beispiel i unter Verwendung von Penicillium lilacinum
(ATCC Nr. fo i i4) und 17 a-Oxyprogesteron und erhält 4-Androsfen-3, 17-dion.
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Beispiel ii Fermentation von i 1 a, 17 a-Dioxyprogesteron Man arbeitet
gleich wie im Beispiel :2 unter Verwendung von Penicilliuin thomii (ATCC Nr. f0
5o6) und 11 a, 17 a-Dioxyprogesteron und erhält 4-Androsten-i i a-01-3, 17-dion.
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Beispiel 12 Fermentation von Pregnan-3, 6, 2o-trion Man arbeitet wie
im Beispiele unter Verwendung von Penicillium novae zeelandiae (ATCC Nr. 10473)
und Pregnan-3, 6, 2o-trion und erhält Testan-3, 6,17-trion. Testan-3, 6,17-trion
gibt beim Bromieren 4-Bromtestan-3, 6, 17-trion, das durch Bromwasserstoffabspaltung
in das 4-Andxosten-3, 6, 17-trion mit oestrogener Wirkung übergeht (Buten,andt,
Ber. d. dtsch. chem. Ges., Bd.69, 1936, S. 1163).
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Beispiel 13 Fermentation von 6 ß-Oxyprogesteron In gleicher Weise
wie im Beispiel i erhält man bei Verwendung von Penicillium citrinum (ATCC Nr. 101o5)
und 6ß-Oxyprogesteron das 4-Androsten-6ß-01-3, 17-dion.
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Beispiel 14 Fermentation von Pregnan-3, 2o-dion Man arbeitet gleich
wie im Beispiel :2 unter Verwendung von Penicillium canescens (ATCC Nr. 1o419) und
Pregnan-3, 2o-dion und erhält Testan-3, 17-dion, das durch Reduktion mit Natrium-Borhydrid
in; Testahn 3 a (oder ß) -o1 übergeht, das anästhetische Wirkung besitzt.
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Beispiel 15
Fermentation von Allopregnan-3, i i, 2o-trion Man
arbeitet wie im Beispiel i unter Verwendung von Penicillium lilacinum thom und Allopregnan-3,
i i, 2o-trion und erhält Androstan-3, 11, 17-trion (männliche Hormonwirksamkeit).
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Beispiel 16 Fermentation von Reichsteins Substanz S (4-Pregnen-17a,
2i-diol-4-3, 2o-diont) Man arbeitet wie im Beispiel i unter Verwendung von Penicillium
lilacinum (ATCC Nr. fo 114)
und Reichsteins Substanz S und erhält 4-Androsten-3,
17-dion und 4-Pregnen-17 a, 2o a, 2 i-triol-3-on. Beispiel 17 Fermentation von Cortison
In gleicher Weise wie i erhält man ,durch Einwirkung von Penicillium lilacinum (ATCC
Nr. io 114) auf Cortison das 4-Androsten-3, 11, 17-trion (Adrenosteron).
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Beispiel 18 Fermentation von Cortisonacetat Man arbeitet gleich wie
im Beispiel i und erhält durch Einwirkung von Penicillium lilacinum (ATCC Nr. fo
114) auf Cortisonacetat 4-Androsten-3, 11, 17-trion.
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Beispiel i9 Fermentation von 4-Pregnen-i i a, 17 a, 2 i-tri"31-3,
2o-dion Man arbeitet wie im Beispiel i und erhält durch Einwirkung von Penicillilirn
iilacinum (ATCC
Nr. io iiq:) und q.-Prwegnem.-iia, 17a, 2i-triol-3,
2o-dion das q.-Androsten-i i a-01-3, 17-dion.
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Beispie,12o Fermentation von Pregnan-3 a, 11 a, 17 a-triol-2o-on Man
arbeitet wie im Beispiel i und erhält durch Einwirkung von Penicillium lilacinum
(ATCC Nr. io 11q.) auf Pregnan-3 a, 11 a, 17 a-triol-2o-on das Testan-3
a, i i a-diol-17-on.
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Beispiel 21 Fermentation von Pregnan-3, 12, 2o-trion Man arbeitet
wie im Beispiel i und erhält durch Einwirkung von Penicillium lilacinum (ATCC Nr.
io 114) auf Pregnan-3, 12, 2o-trion das Testan-3, 12, 17-trion.