DE1240522B

DE1240522B - Verfahren zur Herstellung von 11alpha-Hydroxyprogesteron

Info

Publication number: DE1240522B
Application number: DEU10802A
Authority: DE
Inventors: Frederick Rueben Hanson; William Densmore Maxon
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1963-06-17
Filing date: 1964-06-09
Publication date: 1967-05-18
Also published as: BE649398A; GB1006818A; CH460759A; US3201324A; NL6406865A

Description

UNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

C07c

Deutsche Kl.: 12 ο-25/05

Nummer: 1240 522

Aktenzeichen: U 10802IV b/12 ο

Anmeldetag: 9. Juni 1964

Auslegetag: 18. Mai 1967

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur mikrobiologischen 11 «-Hydroxylierung von Progesteron unter Verwendung des Mikro-Organismus Rhizopus nigricans.

Der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugte Stamm ist Rhizopus nigricans ATCC 6227b, der von der American Type Culture Collection Washington, D₁C., bezogen werden kann. Es eignen sich jedoch auch andere Stämme von Rhizopus nigricans zur Durchführung der vorliegenden Erfindung.

Bei den bisherigen Versuchen zur Anwendung hoher Konzentrationen an verhältnismäßig unlöslichen Steroidsubstraten, wie 'Progesteron, in Kontakt mit Mikroorganismen ergaben sich zahlreiche Schwierigkeiten. Wird beispielsweise das Steroid als Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel:, wie Propylenglykol, Dimethylformamid, Aceton oder Alkohol, verwendet, so ist die Verwendung hoher Konzentrationen durch die Toxizität des Lösungsmittels beschränkt. Laut USA.-Patentschrift 3 019 170 wurde die physikalische Zerstörung von Pilzzellen bei hohem Substratgehalt festgestellt, falls feinteilige oder mikronisierte Substrate in Zusammenhang mit Aspergillus ochraceus zur Verwendung kamen. Um hohen Substratgehalt anwenden zu können, wurde es laut der genannten Patentschrift für notwendig erachtet, spezielle Zerkleinerungstechniken anzuwenden, um Teilchen zu erhalten, die gegenüber den Mikroorganismen im Gärmedium relativ unschädlich sind.

Die ÜÄ-Hydroxylierung von Progesteron unter Verwendung von Rhizopus nigricans war bisher auf relativ niedrige Substratgehalte beschränkt, wobei Maximalwerte bei etwa 4 g Substrat pro Liter Medium lagen.

Es wurde gefunden, daß feinteiliges. Progesteron mit nachstehend definierter Teilchengröße, hergestellt in einer handelsüblichen Mahlvorrichtung, ζ. B. in einem »Sturtevant-Micronizer«, bei wesentlich erhöhter Substratkonzentration zur !!«-Hydroxylierung mit Rhizopus nigricans unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen verwendet werden kann, vorausgesetzt, daß bestimmte Materiahen als Stickstoffquelle zum Einsatz gelangen. Hohe Ausbeuten (85 bis 90% und mehr) an Ua-Hydroxyprogesteron werden dabei erhalten, und die gebildete Menge an 11« - Hydroxyprogesteron pro Charge wird wesentlich erhöht, im allgemeinen um das Fünffache des bei üblichen Verfahren erzielbaren Betrages.

Das erfinduttgsgemäße Verfahren weist wesentliche wirtschaftliche Vorteile auf. Diese bestehen in

Verfahren zur Herstellung von
lla-Hydroxyprogesteron

Anmelder:

The Upjohn Company,

Kalamazoo, Mich. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr. W. Beil, A. Hoeppener, Dr. H. J. Wolff
und Dr. H. Chr. Beil, Rechtsanwälte,
Frankfurt/M.-Höchst, Adelonstr. 58

Als Erfinder benannt:
Frederick Rueben Hanson,
William Densmore Maxon,
Kalamazoo, Mich. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

V. St, v. Amerika vom 17. Juni 1963 (288 520)

1. wesentlich erhöhter Produktmenge pro Charge, wodurch die Herstellungseinrichtungen wesentlieh verkleinert werden können,

2. niedrigeren Kosten pro Kilogramm Produkt,

3. keiner spezialen Zerkleinerungsvorrichtung oder keinen anschließenden Zerkleinerungsverfabren.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man feinteiliges Progesteron, das im wesentlichen vollständig in einer Teilchengröße von unter 20 μ vorliegt, in einer Substratkonzentration zwischen 15 und 40 g/l und ein Nährmedium verwendet, das als Stickstoffquelle Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Fischmehl, Kokosnußmehl, handelsübliche Hefen, Lactalbumjn- Hydrolysate oder Gemische dieser Produkte enthält.

Die Teilchengröße des Progesterons ist beim vorliegenden Verfahren von entscheidender Bedeutung. Man bevorzugt ein Ausgangsmaterial, bei welchem im wesentlichen alle Teilchen kleiner als 20 μ sind; eine Größenverteilung mit 90% (bezogen auf dös Gewicht) an Teilchen, die kleiner als 10 μ sind, ist zur Erzielung optimaler Ausbeuten und Reaktionsgeschwindigkeiten besonders vorteilhaft. Das Progesteron kann dem Medium als trockenes Pulver oder

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3 4 \^-

in Form einer wäßrigen Suspension entweder unter bedingungen sind 30 bis 36 Stunden im allgemeinen⁴

einmaligem Zusatz oder vorzugsweise unter all- befriedigend. Der Fortschritt der Bioumwandlung und

mählichem langsamem Zusatz während der Umwand- die Beendigung dieser Reaktion werden im allgemeinen

lung zugegeben werden. Aus praktischen Gründen durch Papierchromatographie, Dampfphasen- oder

wird vorzugsweise mit einer wäßrigen Suspension 5 Dünnschichtchromatographie (Textbook, Chromato-

gearbeitet. Bsi der Herstellung der wäßrigen Suspen- graphy, Heftman [1961], Reinhold Publishing Co.,

sion empfiehlt sich die Verwendung von Dispergier- New York, New York) bestimmt,

oder Suspendiermitteln. Geeignete derartige Mittel Nach Beendigung der Fermentierung wird das

sind z. B. die handelsüblichen »Spans« (Hexitanhydrid- resultierende lli*-Hydroxyprogesteron in an sich

ester langkettiger Fettsäuren), »Tweens« (Polyoxy- ίο bekannter Weise aus dem Fermentationsgemisch

alkylenäther von Hexitanhydridlangkettigen Fettsäure- isoliert. Speziell vorteilhaft ist die Aufarbeitung des

estern), »Nacconole« (Alkylarylsulfonate) oder »Ultra- Produkts durch Extraktion des Fermentationsge-

wets« (Alkylbenzol-natriumsulfatc). misches (Brühe und Mycel) mit einem mit Wasser

Es ist wichtig, daß die das oxydierende Enzym nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für

herstellenden Kulturen unter solchen Bedingungen 15 Steroide, beispielsweise Methylenchlorid, Chloroform,

gezüchtet werden, die ein reichliches Zellwachstum Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthy-

verursachen. Die Quelle für die stickstoffhaltigen, len, Äther, Amylacetat, Benzol, Toluol u. dgl. Auch

wachstumsfördernden Faktoren ist daher von wesent- können Gärbrühe und Mycel zunächst in üblicher

licher Bedeutung. Zur Wachstumsförderung bei hoher Weise voneinander getrennt werden, z. B. durch

Substratkonzentration werden verwendet 20 Filtrieren oder Zentrifugieren, und dann gesondert

xo-uu ui j· · τ? IJ "υ* geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Das

a) Sojabohnenmehle, die in Form verschiedener Mycel kann entweder mit mit Wasser mischbaren oder Handelsprodukte erhalthch sind z. B- »Protein- _mit ^ _{w nicht} mischbaren Lösungsmitteln Sojabohnenmehl« der Central Soja Co Fort _{exttaWert werden Dje yom M d befreite} <§_ärbrühe Wayne Indiana und Archer-Darnels Midland _kaQn ^ _{mU Wasser} ^u/^uu^ _Lö

Co., Decatur Illinois, »Sojabohnenkeimmehl« ^_{1n extrahiert werden- Man kann sodann die}

der Decatur Elevator Co., Decatur, Illinois, Extrakte vereinigen, das Lösungsmittel entfernen und

^u· ^s ' gereinigtes lla-Hydroxyprogesteron durch Umkristalli-

b) übliche Hefen, z. B. Bräuhefe und insbesondere _si_eren des Rückstands aus organischen Lösungs-Torulahefe, ₃„ mitteln erhalten.

c) Fischmehle, Beispiel 1

d) Baumwollsaatmehl,

e) Kokosnußmehl oder . ^Ei?. Fermentationsgefäß wurde mit einem Medium ,. , - 1 ..,,., τ 1· · TT j 1 χ /1 1 χ beschickt, das aus 150 Teilen Sojabohnenmehl, 135 Tel-

f) handelsublicheLactalburnin-Hydrolysatetbekannt _{35 len DeXtrose (bekannt unter} ^J _{dem H}andelsnamen

unter dem Handelsnamen »Edamme«) oder Ge- »Cerelose«) und 4000 Teilen Leitungswasser bestand,

mische ans diesen Produkten. _{Der pH}._{Wert wurde mit Schwefe)saure auf 5(0 e}in-

Als Stickstoffquelle wird im vorliegenden Verfahren gestellt. Eine minimale Menge an Specköl wurde zum

Sojabohnenmehl bevorzugt. Verhindern des Schäumens zugegeben. Das Medium

Die vorteilhafteste Konzentration an stickstoff- 40 wurde unter Druck bei 122°C 15 Minuten sterilisiert,

haltigem wachstumsfördernden Faktor im Medium auf etwa 28° C abgekühlt und mit 225 Teilen einer

hängt vom Stickstoffgehalt des verwendeten Materials 24stündigen vegetativen Kultur von Rhizopus nigricans

ab. Bei Verwendung von Sojabohnenmehl liegt die ATCC 6227 b beimpft, wobei das Volumen nach der

Stickstoffkonzentration im Medium vorzugsweise Impfung 4500 Teile betrug. Das Medium wurde dann

zwischen 1 und 5 g/l. 45 mit etwa 67 UpM gerührt und mit steriler Luft in

Als Energiequelle kommen übliche kohlenstoff- einer Menge von 8% des gesamten Volumens pro

haltige Materialien, wie Kohlehydrate, in Frage, z. B. Minute durchspült. Nach etwa 17- bis 18stündiger

Glycerin, Glukose, Fructose, Dextrose, Sucrose, Züchtung bei etwa 28 ⁰C wurden 72 Teile (16 g/I)

Lactose, Maltose, Dextrine, Stärken und Molke. Diese Progesteron, das zu 90 Gewichtsprozent aus Teilchen

Materialien können entweder in gereinigtem Zustand 50 kleiner als 10 μ bestand, in folgender Weise versetzt:

oder als Konzentrate, wie z. B. in Form von Molken- 3,6 Teile Progesteron (5 % des Gesamtgewichts)

konzentrat, Maisquellwasser, Getreidemaische u. dgl., wurden als trockenes Pulver zugegeben, worauf die

oder entsprechenden Gemischen verwendet werden. Inkubation während 5 Stunden fortgesetzt wurde,

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfiuti- ehe die allmähliche Beschickung mit dem restlichen

dungsgemäßen Verfahrens liegt der pH-Wert des 55 Substrat in Form einer wäßrigen Aufschlämmung

Mediums während der Umwandlung zwischen 3,5 erfolgte.

und 6,5. Bei Verwendung von Sojabohnenmehl als Die Substrataufschlämmung wurde hergestellt, in-

Stickstoffquelle wird der pH-Wert mit Vorteil unter dem man 227 Teile entionisiertes Wasser in einen

4,5 gehalten. Die Temperatur ist in solchen Grenzen sterilisierten Tank filtrierte, der mit einem Rührwerk

zu halten, daß Lebensfähigkeit, aktives Wachstum 60 versehen war, sodann 2,2 Teile einer 25%igen wäßrigen

oder Enzymaktivität des Pilzes aufrechterhalten wer- Lösung von Alkylbenzolnatriumsulfat (bekannt unter

den. Teinperattiren zwischen etwa 25 und etwa 32⁰C dem Handelsnamen »Ultrawet 30 DS«) zugab und den

werden bevorzugt, wobei speziell bevorzugte Terape- pH-Wert mit Citronensäure auf 5,0 einstellte. Das

raturen bei etwa 28° C liegen. restliche Progesteron (68,4 Teile) wurde unter be-

Die zur 11 «-Hydroxylierung von Progesteron 65 ständigem Rühren in den Behälter zugegeben. Sobald

benötigte Zeit kann beträchtlich schwanken, wobei das gesamte Progesteron benetzt war, wurde der

der allgemeine Bereich zwischen etwa 20 und 60 Stun- pH-Wert wiederum mit Citronensäure auf 5,0 ein-

den liegt; bei Anwendung der bevorzugten Reaktions- gestellt. Sobald eine Aufschlämmung gebildet war,

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genügte gelegentliches Rühren, um die Suspension von Rhizopus nigricans ATCC 6227b beimpft. Nach

aufrechtzuerhalten. der Beimpfung betrug das Gesamtvolumen 2501. Das

Die Aufschlämmung wurde sodann mit solcher Medium wurde mit 280 UpM gerührt, mit 20 l/Min. Geschwindigkeit in das Gärgefäß gepumpt, daß die an steriler Luft belüftet und 18 Stunden bei etwa langsame Zugabe innerhalb 36 Stunden beendet war. 5 28 ⁰C gehalten. Dann wurden 4 kg Progesteron (90 Ge-Während der Fermentation wurde der pH-Wert wichtsprozent der Teilchen kleiner als 10 μ) langsam zwischen 4,0 und 4,4 gehalten; in regelmäßigen in kleinen Teilmengen im Laufe der 44stündigen Intervallen wurden Proben entnommen und papier- Bioconversion zugegeben, wobei der pH-Wert zwischen chromatographisch auf llat-Hydroxyprogesteron unter- 3,5 und 4,5 gehalten wurde. Die Fermentation wurde sucht. 3 Stunden nach Zugabe des letzten Substrats io nach Zusatz des Substrates weitere 5 Stunden fortzeigte die papierchromatographische Analyse eine geführt. In regelmäßigen Abständen wurden während Ausbeute von 70,6 Teilen (94,3 %) !!«-Hydroxy- der Fermentation Proben entnommen und papierprogesteron an. chromatographisch untersucht, um den Fortgang

Das so erhaltene lla-Hydroxyprogesteron wurde der Fermentation zu verfolgen. Am Ende der an-

aus dem Gärmedium durch Extraktion mit Methylen- 15 gegebenen Fermentationszeit zeigte die papierchroma-

chlorid und übliches Umkristallisieren gewonnen, tographische Analyse eine Ausbeute von 3,4 kg (81,0%)

wobei man 62,78 Teile (83,9 %) ™ wesentlichen lla-Hydroxyprogesteron an.

reines lla-Hydroxyprogesteron vom Schmp. 164 bis Das so erhaltene Produkt wurde in der im Beispiel 2 168°C, [x]d — +178,9° (Chloroform), erhielt. Weitere beschriebenen Weise aufgearbeitet, wobei man 3,5 kg 3,6 bis 4,3 Teile (5 bis 6%) lla-Hydroxyprogesteron ao (83,3%) im wesentlichen reines lla-Hydroxyprolagen in den Mutterlaugen vor, womit sich die Ge- gesteron erhielt; unter Berücksichtigung der Muttersamtausbeute auf etwa 90% erhöht. laugen erhöht sich dieser Wert um 5 bis 6%·

Beispiel 2 Beispiel 4

Aus 8,25 kg Sojabohnenmehl, 7,5 kg Dextrose 35 Aus 8,25 kg Sojabohnenmehl, 7,5 kg Dextrose (»Cerelose«) und 2001 Leitungswasser wurde ein (»Cerelose«) und 2001 Leitungswasser wurde ein Medium hergestellt, dessen pH-Wert mit Schwefel- Medium hergestellt, dessen pH-Wert mit Schwefelsäure auf 5,0 eingestellt wurde; um Schäumen zu ver- säure auf 5,0 eingestellt wurde; eine geringe Menge hindern, wurde eine kleine Menge Specköl zugesetzt an Specköl wurde zugegeben, um Schaumbildung zu Das Medium wurde 15 Minuten bei 122⁰C sterilisiert, 30 vermeiden. Das Medium wurde bei 122⁰C 15 Minuten auf etwa 28 ° C abgekühlt und mit 15 1 einer 24stündigen sterilisiert, auf etwa 28 ° C abgekühlt und mit 151 einer vegetativen Kultur von Rhizopus nigricans ATCC 24stündigen vegetativen Kultur von Rhizopus nigricans 6227b beimpft. Das Volumen betrug nach der Be- ATCC 6227b beimpft. Das Volumen betrug nach der impfung etwa 2501. Das Medium wurde dann mit Beimpfung 2501. Das Medium wurde sodann mit 280 UpM gerührt, mit steriler Luft in einer Menge 35 280 UpM gerührt und mit 201 steriler Luft pro Minute von 20 l/Min, belüftet und 16 Stunden bei etwa 28⁰C belüftet. Nach 17stündiger Reaktionszeit bei 28° C stehengelassen. Dann wurden 5 kg Progesteron (zu wurden 4 kg (16 g/l) Progesteron mit 90 Gewichtspro-90 Gewichtsprozent Teilchengröße unter 10 μ) zu- zent der Teilchen kleiner als 10 μ in folgender Weise gesetzt, worauf der pH-Wert auf 4,0 bis 4,4 eingestellt zugegeben:

wurde; die Fermentation wurde weitere 49 Stunden 40 200 g Progesteron (5% des Gesamtgewichts) wur-

fortgesetzt, wobei der pH-Wert im selben Bereich den zunächst als trockenes Pulver zugesetzt, worauf

gehalten wurde. Tn regelmäßigen Intervallen wurden noch 5 Stunden bebrütet wurde, ehe das restliche

während der Fermentation Proben entnommen und Substrat in Form einer wäßrigen Aufschlämmung

papierchromatograpbisch untersucht. Nach der an- mit 1 % »Ultrawet 30 DS« (25,5%ige wäßrige Lösung

gegebenen Fermentationszeit zeigte das Papierchroma- 45 von Alkylbenzol—Natriumsulfat) zugesetzt wurde;

togrammeine Ausbeute von 4,25 kg (81,0%) Ha-Hy- der pH-Wert wurde mit Citronensäure auf 5 ein-

droxyprogesteron an. gestellt. Die Progesteronaufschlämmung wurde mit

Das so erhaltene Produkt wurde aus dem Fermen- solcher Geschwindigkeit in das Gärgefäß eingepumpt, tationsmedium gewonnen durch Zusatz von Methylen- daß die gesamte Beschickung in 47 Stunden beendet Chlorid in einer Menge, die etwa einem Drittel des 50 war. Während der Fermentation wurde der pH-Wert Gesamtvolumens entsprach; das Mycel wurde ab- zwischen 4,0 und 5,0 gehalten; es wurden regelmäßig filtriert, worauf die Methylenchloridschicht abgetrennt Proben entnommen und papierchromatographisch auf und mit Wasser gewaschen wurde. Dann wurde das lla-Hydroxyprogesteron untersucht. 3 Stunden nach Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand um- Beendigung des Substratzusatzes zeigte das Papierkristallisiert, wobei man 3,98 kg (65,8 %) im wesent- 55 chromatogramm eine Ausbeute von 3,69 kg (88,7%) liehen reines lla-Hydroxyprogesteron erhielt; weitere lla-Hydroxyprogesteron an.

5 bis 6% lla-Hydroxyprogesteron können aus den Das Produkt wurde aus dem Gärmedium in der im Mutterlaugen erhalten werden. Beispiel 2 beschriebenen Weise isoliert, wobei man _R . -Ii 3,4 kg (81,0%) lla-Hydroxyprogesteron erhielt; weiße 1 s ρ 1 e 5 60 tere 5 bis 6% sind aus den Mutterlaugen erhältlich.

Aus 8,25 kg Sojabohnenmehl, 7,5 kg Dextrose .

(»Cerelose«) und 2001 Leitungswasser wurde ein B e 1 s ρ 1 e 1 5

Medium hergestellt, dessen pH-Wert mit Schwefel- Aus 12,5 kg Bräuhefe, 13,75 kg Dextrose (»Cere-

säure auf 5,0 eingestellt wurde. Sodann wurde eine lose«) und 2001 Leitungswasser wurde ein Medium

geringe Menge an Specköl zugegeben, um das Schau- 65 hergestellt, dessen pH-Wert mit Schwefelsäure auf 5,0

men zu unterbinden. Das Medium wurde bei 122⁰C eingestellt wurde; zur Verhinderung der Schaum-

15 Minuten sterilisiert, auf etwa 28⁰C abgekühlt und bildung wurde eine geringe Menge an Specköl zu-

dann mit 151 einer 24stündigen vegetativen Kultur gegeben. Das Medium wurde bei 122⁰C 25 Minuten

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sterilisiert, auf etwa 28°C abgekühlt und mit 151 einer 24stündigen vegetativen Kultur von Rhizopus nigricans ATCC 6227b beimpft. Das Gesamtvolumen betrug nach der Beimpfung etwa 2501. Das Medium wurde dann mit 280 UpM gerührt und mit 12,51 steriler Luft pro Minute belüftet; die Fermentation wurde 12V₂ Stunden bei etwa 28° C geführt. 5 kg Progesteron (Teilchengröße zu 90 Gewichtsprozent kleiner als 10 μ) wurden dann zugesetzt, worauf der pH-Wert auf 4,0 bis 4,4 eingestellt und die Fennentation weitere 73 Standen fortgesetzt wurde. In regelmäßigen Abständen wurden während der Fermentation Proben entnommen und papierchromatographisch untersucht, um den Fortschritt der Reaktion zu verfolgen. Nach der angegebenen Fermentationszeit zeigte die papierchromatographische Analyse eine Ausbeute von 4,15 kg (79,1 %) ΙΐΛ-Hydroxyprogesteron an.

Beispiel 7 Beispiel 8

»o

Beispiel 6

100 ml eines 5,0 g Baumwollsaatöl und 5,5 g »Cerelose« enthaltenden Mediums, das sich in einem Schüttelkolben befand, wurden auf einen pH-Wert von 5 eingestellt, sterilisiert und mit einer 24stündigen Kultur von Rhizopus nigricans ATCC 6227b beimpft. »5 Der Kolben wurde in eine Schüttelvorrichtung gebracht und 15¹/,; Stunden bei etwa 28²C belassen. Dann wurden 2,0 g Progesteron (90 Gewichtsprozent des Materials mit einer Teilchengröße unter 10 μ) zugesetzt, der pH-Wert wurde auf 4,0 bis 4,4 eingestellt und die Fermentation 48 Stunden bei. etwa 28° C fortgeführt. Die papierchromatographische Analyse zeigte eine Ausbeute von 83,2% bzw. 1,68 g lla-Hydroxyprogesteron an.

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100 rol eines wäßrigen, 3,7 g Fischmehl und 5,5 g Dextrose (»Cerelose«) enthaltenden Mediums, das sich in einem Schüttelkolben befand, wurden auf pH-Wert 4,0 eingestellt, sterilisiert und mit einer 24stündigen Kultur von Rhizopus nigricans ATCC 6227b beimpft. Der Kolben wurde in eine Schüttelvorrichtung gebracht und 12 Stunden bei etwa 28° C belassen. Dann wurden 2,0 g Progesteron (90 Gewichtsprozent davon mit einer Teilchengröße unter 10 μ) zugegeben, und es wurde weitere 48 Stunden bei etwa 28⁰C fermentiert. Die papierchromatographische Analyse zeigte danach eine Ausbeute von 75,6% bzw. 1,53 g lla-Hydroxyprogesteron an.

100 ml eines wäßrigen, 3,4 g handelsübliches Lactalbumin-Hydrolysat (bekannt unter dem Handelsnamen »Edamine«), 5,5 g Dextrose (»Cerelose«), 0,5 g Maisquellwasser und 0,5 g Bräuhefe enthaltenden Mediums wurden auf pH 5 eingestellt, sterilisiert und in einem Schüttelkolben mit einer 24stündigen Kultur von Rhizopus nigricans ATCC 6227 b beimpft. Der Kolben wurde in eine Schüttelvorrichtung gestellt und Stunden bei 28⁰C dort belassen. Dann wurden 2,0 g Progesteron (90 Gewichtsprozent davon mit einer Teilchengröße unter 10 μ) zugesetzt, und die Fermentation wurde 48. Stunden bei etwa 28° C fortgesetzt. Die papierchromatographische Analyse zeigte eine Ausbeute von 93,5% bzw. 1,89 g lla-Hydroxyprogesteron an.

Bei Wiederholung des obigen Verfahrens mit der Hälfte der obigen Menge an »Cerelose« (2,5 g) erhielt man im wesentlichen identische Ergebnisse.

Ebenso kann die Bräuhefe im vorstehenden Beispiel durch Torulahefe ersetzt werden, wobei man ebenso hohe Ausbeuten an lla-Hydroxyprogesteron erzielt.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von ll«-Hydroxyprogesteron durch oxydative Hydroxylierung von Progesteron mittels Rhizopus nigricans unter submersen aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man feinteiliges Progesteron., das im wesentlichen vollständig in einer Teilchengröße von unter 20 μ vorliegt, in einer Substratkonzentration zwischen 15 und 40 g/l und ein Nährmediurn verwendet, das als Stickstoflfquelle Sojabohnenmehl, Baunwollsaatroebl, Fischmehl, Kokosnußmehl, handelsübliche Hefen, Lactalbumin-Hydrolysate oder Gemische dieser Produkte enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Progesteron in einer zu 90 % unter 10 μ liegenden Teilchengröße verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium als Stickstoffquelle Brauerei- oder Torulahefe enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium den Stickstoff in einer Konzentration zwischen 1 und 5 g/l enthält.

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